CHƯƠNG 2
NGUYÊN LÝ VÀ KỸ THUẬT
TÁCH DÒNG


Cách tiến hành dòng hóa
- Bước 1: Tách chiết và xử lý các đoạn DNA cần
tạo dòng.
- Bước 2: Chọn và xử lý vector.
- Bước 3: Tạo vector tái tổ hợp (DNA tái tổ hợp),
bản thiết kế vector-DNA nhân dòng.
- Bước 4: Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào vật
chủ.
- Bước 5: Nuôi cấy, tạo dòng và xác định dòng
cần tìm.
- Bước 6: Kiểm tra và thu nhận sản phẩm của
gen tái tổ hợp.


2.3: Tạo vector tái tổ hợp
• Vector tái tổ hợp được tạo ra bằng việc nối (tạo
liên kết hóa trị bền vững) vector đã qua xử lý với
đoạn DNA ngoại lai (insert).
• Phản ứng nối các phân tử DNA cần enzyme DNA
ligase.
DNA ligase xúc tác quá trình tạo liên kết
phosphodiester giữa nhóm 5′-phosphate của 1
nucleotide của 1 đoạn DNA và nhóm 3′-hydroxyl
của đoạn DNA kia.
Enzyme DNA ligase thường được dùng nhất là T4
DNA ligase (thu từ bacteriophage T4).

2.3: Tạo vector tái tổ hợp
Phản ứng nối các phân tử DNA dùng DNA ligase:

(a) 2 phân tử DNA tạo ra từ phản ứng cắt với EcoRI; (b) Liên kết
hydrogen giữa các base tương hợp làm 2 phân tử tạm thời dính
với nhau; (c) 2 phân tử được tạo liên kết hóa trị ở nhánh trên bởi DNA
ligase, phần hở ở nhánh dưới có thể được nối lại bởi DNA ligase hoặc
bằng cơ chế sửa chữa DNA của tế bào chủ.


2.3. Tạo vector tái tổ hợp
• Phản ứng dùng DNA ligase đòi hỏi ATP là nguồn
năng lượng hóa học.
• T4 DNA ligase cũng có thể giúp nối các phân tử
DNA có đầu tù, nhưng hiệu suất phản ứng thấp
Æyêu cầu nồng độ enzyme lớn hơn trong các
phản ứng in vitro.
• Chú ý cần làm mất hoạt tính hay loại bỏ enzyme
giới hạn trước khi thực hiện phản ứng nối DNA.
• Trong phản ứng nối của plasmid và phân đoạn
DNA cần tạo dòng xúc tác bởi DNA ligase có các
trường hợp sau xẩy ra:


2.3. Tạo vector tái tổ hợp

(c) 1 đoạn DNA cần tạo dòng nối vào vector- kết quả mong đợi;
(d) 2 đầu dính của vector được nối lại và không có đoạn DNA mới

được gắn vào; (e) các đoạn DNA được gắn với nhau ngẫu nhiên
và không gắn vào vector.


2.3. Tạo vector tái tổ hợp
Quá trình tạo vector tái tổ hợp với vector khác plasmid
a/ với bacteriophage λ
Cụm gene
trung tâm

Tay λ

Tách λ DNA

DNA ngoại lai

Cắt vector và DNA ngoại
lai bằng 1 enzyme giới hạn
Nối DNA (ligation)
Nạp vector mới vào áo
phage in vitro


2.3. Tạo vector tái tổ hợp
Quá trình tạo vector tái tổ hợp với vector khác plasmid
b/ với YAC vector
DNA ngoại lai

Nối DNA (ligation)



2.4. Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào vật
chủ (biến nạp vector -transformation).
• Các loại tế bào chủ có năng lực cao trong thu
nhận DNA từ bên ngoài gọi là tế bào chịu biến
nạp hay tế bào khả biến (competent cell). Hiện
tượng một tế bào tiếp nhận DNA ngoại lai gọi là
hiện tượng chịu biến nạp (competency) của tế
bào.
• Tế bào chủ thường dùng trong kỹ thuật tạo dòng
và DNA tái tổ hợp là tế bào vi khuẩn E.coli.
• E.coli không có khả năng khả biến tự nhiên
(khác với 1 số vi khuẩn khác) nên nó cần được
xử lý đặc biệt để di nạp DNA bên ngoài. Có 2
phương pháp biến nạp chính.


2.4.1. Biến nạp DNA bằng ph. pháp hóa học
E.coli được nuôi cấy và thu nhận ở giai đoạn phát triển
log; tế bào được ly tâm và rửa vài lần dd lạnh chứa ion
hóa trị 2, thường là CaCl2; sau đó các tế bào khả biến này
được hòa trong 1 lượng nhỏ dd đệm để tiếp nhận DNA.
Thêm plasmid
4oC 30 phút

Sốc nhiệt
42oC 1 phút

Tế bào khả biến


Phục hồi
37oC 30 phút

Trải trên đĩa thạch
chọn lọc, 37oC 16 giờ

Thêm dịch nuôi cấy


2.4.1 Biến nạp DNA bằng ph. pháp hóa học
• Cơ chế: DNA từ bên ngoài kết nối với
lipopolysaccharide ở màng tế bào của tế bào
khả biến và các DNA được đưa vào tế bào qua
sự “dò dỉ” của màng tế bào bởi tác dụng của
Ca2+ và sốc nhiệt.
• Hiệu suất của tế bào chịu di nạp phụ thuộc vào
nhiều yếu tố trong đó, quan trọng nhất là chủng
E.coli được sử dụng.
• Nhược điểm: hiệu suất biến nạp thấp, tốn thời
gian ( xử lý với CaCl2), mỗi loại tế bào cần 1 quá
trình riêng, và thường không dùng cho tế bào
động vật, thực vật được.


2.4.1 Biến nạp DNA bằng ph. pháp hóa học
•

Ví dụ của quy trình xử lý E.coli bằng pp hóa học:

1) Nuôi cấy 1 ml vi khuẩn E. coli đã nuôi qua đêm vào 100 ml môi trường SOC.

SOC: Tryptone 20g, yeast extract 5g, NaCl 10mM, KCl 2,5mM, MgCl2 10mM,
MgSO4 10mM, glucose 20mM
2) Ủ ở 370C cho đến khi đủ mật độ tế bào, lắc nhẹ nhàng khi ủ.
3) Chuyển sang ống đã tiệt trùng. Để trên nước đá 10 - 15 phút.
4) Quay li tâm 1.000 ×g trong 15 phút ở 40C.
5) Đổ bỏ nước mặt, chỉ để lại chút nước không thể rót bỏ hết được, lật úp ống, gõ
nhẹ lên mặt giấy thấm một số lần cho hết nước mặt thì tốt.
6) Cho vào ống 30 ml dung dịch CPG đã làm lạnh, trộn đảo nhẹ.
Dung dịch CPG chứa CaCl2.2H2O 50mM, KCl 100mM, glycerol 10% (w/v) và
CH3COOK (pH 7,5) 10mM, điều chỉnh pH cuối cùng đến 6,2, hấp cao áp tiệt
trùng (hoặc lọc qua lọc vi khuẩn 0,2 µm).
7) Để trên nước đá khoảng 30 phút.
8) Quay li tâm 1.000 ×g ở 40C trong 15 phút.
9) Bỏ nước mặt, chỉ để lại ít giọt dịch không thể rót bỏ hết.
10) Hòa vào 8 ml CPG đã làm lạnh. (Glycerol có trong thành phần dung dịch CPG
là chất chống đóng băng, ngăn trở sự hình thành các tinh thể nước đá càng
lạnh sâu càng tăng thể tích và có khả năng chọc thủng tế bào vi khuẩn).
11) Rót khoảng 0,2 - 1,0 ml vào ống có nắp (cryo vial, ống Eppendorf 1,5 hay 2,0
ml), đậy kín rồi làm lạnh nhanh trong nitơ lỏng. Bảo quản trong nitơ lỏng hoặc ở
−700C.


2.4.2 Biến nạp DNA bằng pp điện biến nạp
(electroporation)
• Các tế bào vi khuẩn được thu hoạch và rửa như
trong pp trước nhưng với nước cất lạnh hoặc dd
đệm với nồng độ ion rất thấp. 1 mẫu nhỏ của dịch
huyền phù đặc chứa các tế bào được trộn với
DNA ngoại lai trong 1 cuvette đặc biệt và 1 xung
điện ngắn với điện thế (voltage) rất cao được đưa

qua dịch huyền phù đó.
• Ưu điểm: hiệu suất biến nạp cao hơn pp hóa học;
có thể sử dụng cho tế bào động vật và thực vật.
• Tuy vậy hiệu suất biến nạp nhìn chung vẫn rất
thấp.


Các tế bào chủ và DNA ngoại lai được tạo
thành dịch huyền phù và cho vào trong một
cuvette. nhựa có điện cực.

Edit your company slogan

Cuvet nhựa với hai điện cực
alluminum bên trong.
Có 3 kích thước:
Các cuvette của máy xung gen
Dung tích 100µl (độ rộng của khe
Electroporator 2510
giữa hai điện cực là: 1mm)
Dung tích 400µl (độ rộng của khe
giữa hai điện cực là 200)
Dung tích 800µl (độ rộng của khe
giữa hai điện cực là 4mm).
Đóng gói riêng từng chiếc và được
khử trùng bằng tia gamma.
Multiporator với các cuvette
Thành cuvet được cấu tạo dưới dạng
và đệm chuyên dụng cho
nhám, dễ dàng ghi chú hoặc đánh dấu

biến nạp (transfection).


Ðể tạo ra xung điện cao thế trong
một thời gian ngắn người ta sử
dụng một thiết bị gọi là máy xung
gen (gene pulser).
Chức năng chính
- Biến nạp bằng xung điện vi khuẩn, nấm
hay các vi sinh vật khác. - Dung hợp tế
bào với các tế bào động vật, thực vật,
Multiporator – Máy xung điện
nấm ...
đa năng của Eppendorf
Các thông số kĩ thuật
• Nặng khoảng 5,5 kg,
• Kích thước chỉ 25x35x12 cm (chỉ lớn
hơn trang giây A4 một ít)
• Xung điện cao trong thời gian cực ngắn
(tới 1200 V trong 5µs). Với khoảng thời
gian cực ngắn, tế bào đủ để nhận được
DNA/RNA/Protein ... ngoại lai mà khả
năng sống lớn.


Hiệu suất của điện biến nạp
Từ 109 đến 1010 tế bào biến nạp cho 1mg DNA tái tổ
hợp, tuy nhiên, lượng tế bào biến nạp bị chết nhiều
thường lên tới 70-90%.
Hiệu suất của phương pháp này phụ thuộc vào các yếu

tố sau:
- Nồng độ tế bào chủ.
- Nồng độ DNA tái tổ hợp.
- Giai đoạn phát triển của tế bào (tế bào quá già hoặc quá
non đều không thích hợp).
- Môi trường dung dịch đệm.
- Cấu trúc màng tế bào.
- Độ mạnh của điện trường tác động khác nhau đối với
các loại tế bào khác nhau.
- Độ dài của thời gian (thời gian ngắt xung - ms).