I.

Khái niệm

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) là một phương pháp chia tách
trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân
chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một
chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ.
Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có
độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc
dễ phân hủy nhiệt.
Bản chất chính của sự tách trong loại sắc ký này là dựa trên sự hấp phụ bề mặt của
pha tĩnh. Cơ chế tách là cơ chế hấp phụ. Vì thế tất cả các tính chất động học hấp
phụ của bề mặt pha tĩnh đều có ảnh hưởng đến kết quả của sự sắc ký một hỗn hợp
chất mẫu.
II.

Cấu tạo

Các bộ phận cơ bản của một máy HPLC được mô tả trong sơ đồ nguyên tắc chung:

1


Hình 1. Sơ đồ máy HPLC
1.

Bình chứa dung môi và pha động

Bình đựng dung môi thường làm bằng thủy tinh thể tích thay đổi từ 100ml - 2l.
Bình làm bằng thủy tinh màu nếu chứa những chất nhạy với ánh sáng, bình phải

thật kín nếu pha động là những chất bay hơi. Ví dụ như aceton, methanol,…Nếu
không nồng độ sẽ bị thay đổi.
Đôi khi phải có hệ thống khử khí vì vài dung môi có thể hòa tan khí trong khí
quyển nhất là oxygen, người ta cũng có thể khí bằng siêu âm hay bằng cách sục khí
Helium vào (He ít tan trong dung môi nhưng có thể đẩy các khí khác ra khỏi dung
môi).
Pha động là dung môi để rửa giải chất tan (chết phân tích) ra khỏi cột tách để thực
hiện quá trình sắc ký. Pha động trong HPLC có thể là dung môi hữu cơ đơn như
methanol, acetonitrile, benzene, n-hexene, water, hay cũng có thể là hỗn hợp của
hai hoặc ba dung môi được trộn vào nhau theo những tỉ lệ phù hợp. Ví dụ như: hỗn
hợp methanol với nước theo tỉ lệ 70 methanol/ 30 nước, acetonitrile với nước theo
tỉ lệ 80/20… Nó cũng có thể là dung môi nước có chứa các chất đệm pH, chất tạo
phức, chất làm chậm… với nồng độ nhất định.
Nói chung với mỗi loại sắc ký sẽ có các hệ dung môi (pha động) rửa riêng thích
hợp với nó, để có thể thu được kết quả tốt nhất. Sau pha tĩnh thì pha động là yếu tố
thứ hai quyết định hiệu suất tách sắc ký của một hỗn hợp mẫu. Nghĩa là trong một
hệ pha, thì pha động và pha tĩnh là hai yếu tố chính của quá trình sắc ký. Hai yếu tố
này giữ vai trò quyết định thời gian lưu giữ của các chất mẫu và hiệu quả sự tách
sắc ký.
Nói chung, pha động có thể ảnh hưởng đến những vấn đề sau của sự tách sắc ký
của các chất:
-

Độ chọn lọc của hệ pha
Thời gian lưu giữ của các chất tan
Hiệu lực của cột tách
Độ phân giải của chất trong pha tĩnh
2



-

Độ rộng của peak sắc ký

Do đó, với một pha tĩnh đã chọn rồi, nếu như chúng ta lại chọn được một dung môi
có thành phần phù hợp, thì ta sẽ có hiệu tách sắc ký của một hỗn hợp mẫu là tốt
nhất đối với một pha tĩnh đã chọn.
Vì vậy, pha động là một yếu tố linh động và phải thỏa mãn một số điều kiện sau
đây:
-

Pha động phải trơ đối với pha tĩnh, không làm hỏng pha tĩnh theo bất kì một
tính chất nào trong quá trình sắc ký. Không có sự tương tác phụ với pha tĩnh

-

để sinh ra những sản phẩm khác làm phức tạp cho quá trình sắc ký.
Pha động phải hòa tan được chất mẫu. Có như thế mới làm cho chất mẫu
được vận chuyển tốt từ đầu cột đến cuối cột tách khi thực hiện quá trình rửa

-

giải.
Pha động phải bền vững theo thời gian, nghĩa là không bị phân hủy hay thay

-

đổi không theo ý muốn khi chạy sắc ký.
Pha động phải có độ tinh khiết cao, để đảm bảo không bị nhiễm bẩn phân
tích gây sai số cho kết quả phân tích. Nghĩa là các chất để pha chế pha động


-

phải có độ tinh khiết cao.
Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký, như cân bằng hấp phụ, phân

-

bố, trao đổi ion, tùy theo bản chất từng loại sắc ký.
Phải phù hợp với loại detector dùng để phát hiện các chất phân tích. Ví dụ
detector UV-Vis thì pha động phải trong suốt vùng phổ đó, hay detector

-

huỳnh quang thì pha động phải không có tính chất huỳnh quang.
Điều kiện cuối cùng là pha động phải có tính kinh tế, không hiếm, không quá
đắt.

Đó là yêu cầu cần thiết đối với một hệ pha động trong kỹ thuật tách HPLC cho
phân tích hỗn hôp mẫu nhất định.
2.

Pha tĩnh

Pha tĩnh trong HPLC chính là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách sắc ký một hỗn
hợp chất phân tích.
3


Nó là những chất rắn xốp và có kích thước hạt nhỏ. Song dù ở dạng nào thì pha tĩnh

trong HPLC cũng phải thỏa mãn những yêu cầu cơ bản sau đây:
Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký, không có phản ứng
hóa học phụ với dung môi rửa giải hay với chất phân tích, để đảm bảo cơ chế của
sự tách là đúng theo bản chất chính của pha tĩnh, hay không mất chất phân tích cần
tách.
Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều kiện sắc ký
nhất định.
Tính chất bề mặt phải ổn định, đặc biệt là có đặc trưng độ xốp của nó và không bị
thay đổi hay biến dạng trong quá trình sắc ký, không bị phân rả dưới áp suất cao
của quá trình sắc ký.
Cân bằng động của quá trình sắc ký phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt. Có như thế
mới đảm bảo thu được kết quả tách tốt.
Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất, nghĩa là đường kính của các hạt lớn nhất so với
các hạt nhỏ nhất không chênh lệch nhau quá 10% và trên 85% số hạt phải nằm
trong vùng có kích thước trung bình. Có như thế cột tách mới có hiệu quả cao.
Đó là yêu cầu chung của pha tĩnh trong kỹ thuật HPLC.
Trong sắc ký hấp phụ pha đảo, pha tĩnh thường là các silica đã alkyl hóa, do đó nó
ít phân cực hay không phân cực. Pha động là hệ dung môi phân cực.
3.

Bơm

Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký. Bơm phải
đạt được áp suất cao khoảng 250 - 600bar và tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ
0,1 đến 10ml/phút.
Gồm các bộ phận như sau:
-

Đầu bơm có hai van điều tiết, mỗi van có một lỗ nhỏ với một bi. Các van này


-

đảm bảo cho việc hút pha động từ thân bơm vào cột sắc kí được an toàn.
Thân bơm có một pittông để chuyển động đi lại. Khi pittông tiến tới, một bi
đóng lỗ phía cột lại và bi khác nhấc ra để pha động đi vào than, khi pittông
4


lùi lại một bi đóng bình đựng dung môi và mở lỗ ở phái cột để pha dao động
vào cột sắc ký.
4.

Bộ phận tiêm mẫu

Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng dòng chảy . Với
dung tích của l bóp là 5 - 100µl .
Có 2 cách lấy mẫu vào trong cột :
-

Tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng tay)
Tiêm mẫu tự động (Autosample) .

5.

Cột sắc ký

Cột dùng trong sắc ký lỏng thường là một ống làm bằng thép không rỉ hoặc làm
bằng thủy tinh đặc biệt (chỉ dùng khi áp suất khoảng 60psi).
Cột là trái tim của một quá trình sắc ký, cột là một yếu tố quan trọng quyết định
đến kết quả của quá trình sắc ký của một hỗn hợp mẫu. Cột tách có nhiều kích

thước khác nhau thường có chiều dài từ 10-25 cm, đường kính trong 2-5 mm.
6.

Đầu dò (detector) trong sắc ký lỏng hiệu năng cao

Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc
ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo tính chất của các chất phân tích
mà người ta lựa chọn lọai đầu dò phù hợp.
Tín hiệu đầu dò thu được có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ
điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,…

5


Khi cho chất tan đi ngang qua tế bào đo, đầu dò sẽ tạo nên những tín hiệu điện. Mọi
sự thay đổi về độ lớn vật lý của chất tan sẽ được chuyển đổi thành xung điện và có
thể đọc được trên máy ghi.
Sự giải đáp của đầu dò tỉ lệ với lượng chất tan hay nồng độ chất tan trong tế bào,
lặp lại và độc lập với chất rửa giải (trừ trường hợp rửa giải với gradient đổi với vài
loại đầu dò). Đầu dò tốt là phải cho kết quả bền, nhanh, lặp lại. Nó cũng phải có độ
nhạy tốt với cùng nồng độ và không biến đổi chất lượng tách.
Dựa vào tính chất của mẫu chất cần phân tích mà ta có các loại detector sau:
Detector UV-Vis
Detector huỳnh quang
Detector điện hóa: đo dòng, cực phổ, độ dẫn.
Detector khối phổ
Detector diode phát quang và diode mảng…
Detector UV-Vis:
-


•

Đây là loại phổ biến nhất trong HPLC. Nguyên tắc của nó là cho pha động từ cột
được chảy qua một ống đo (flowcell) nhỏ có một chùm bức xạ đơn sắc UV/VIS
chiếu qua. Sự hấp thu bức xạ của chất tan là một hàm phụ thuộc tuyến tính vào
nồng độ C của nó theo định luật Lambert - Beer:
D = εlC
Ở đây:
D là đại lượng mật độ quang;
l là chiều dài của cell;
ε là hệ số hấp thu phân tử và là hằng số cho một chất tan và bước sóng.
Đơn vị của ε phụ thuộc vào thứ nguyên của l và C. Trong hê SI thứ nguyên của C
là mol m-3, l là mét nhưng trong thực tế C được đo với mol dm -3 còn l là cm nên ε là
dm3 mol-1 cm-1.
Định luật Lambert – Beer chỉ đúng khi chùm sáng bị hấp thu là đơn sắc, nhưng hệ
thống detector thường không cung cấp chùm tia đủ đơn sắc mà chỉ một dải hẹp các
chùm tia quanh giá trị bước sóng được chọn. Một ống đo (flow cell) trong UV
6


detector có đường kính trong khoảng 1 mm và chiều dài ánh sáng đi qua khoảng 10
mm, như vậy thể tích chứa khoảng dưới 8 µl.
7.

Hệ thống thu nhận và xử lý số liệu

Đó là các trạm dữ liệu hiện đại tiếp nhận và lưu giữ các tín hiệu phát ra từ các
detector và in các sắc ký đồ hoàn chỉnh với chiều cao, diện tích các đỉnh, các thông
số định tính mẫu và các biến số của phương pháp. Chúng còn được sử dụng để lập
chương trình sắc ký, kiểm soát hầu hết các biến số và theo dõi thường xuyên trong

thời gian vận hành dài không có người trông coi.
Với tiến bộ của công nghệ thông tin, hiện nay bộ phận thu nhận và xử lý số liệu cùa
các hệ thống HPLC thường là các máy vi tính hiện đại có khả năng ghi nhận, lưu
giữ, biên tập, xử lý thông tin hết sức hiệu quả.
Nhờ các phần mềm cài đặt tương thích với các chương trình của các detector khác
nhau, các máy vi tính hỗ trợ rất hiệu quả cho việc định tính, định lượng các chất
phân tích dựa vào các cơ sở dữ liệu được cài sẵn.
Nguyên tắc hoạt động của hệ thống bơm cao áp bơm liên tục qua cột với tốc độ
dòng được điều chỉnh. Khi mẫu được tiêm vào loop và theo dòng dung môi đi vào
cột. Quá trình tách sắc ký xảy ra trong cột. Sau khi mẫu chất được tách ra khỏi cột
thì được đầu dò ghi nhận tín hiệu và chuyển thành tín hiệu điện thể hiện từng peak
lên sắc ký đồ.
III.

Nguyên tắc hoạt động

Mẫu chất lỏng được hòa tan trong một dung môi thích hợp, đưa vào buồng bơm
mẫu sau đó được bơm tự động vào cột tách. Quá trình tách xảy ra ở đây.
Do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển dọc
trên cột với tốc độ khác nhau.
Sau khi các cấu tử tách ra khỏi nhau và thoát ra khỏi cột sẽ lần lượt đi vào detector,
ở đây tín hiệu được ghi lại, chuyển thành tín hiệu điện. Tín hiệu này được khuyếch
đại rồi chuyển sang bộ phận ghi. Các tín hiệu được xử lý và chuyển ra ngoài một
sắc kí đồ.
7


Trên sắc ký đồ nhận được, sẽ có các tín hiệu ứng với các cấu tử được tách gọi là
peak.
•

-

Quá trình tách trong sắc ký:
Là sự vận chuyển và phân bố liên tục của chất phân tích từ đầu cột đến cuối

-

cột.
Quá trình tách dựa vào tính chất hóa học, vật lý và hóa lý của các chất. Dựa

-

trên 2 quá trình là hấp phụ và giải hấp phụ.
Xảy ra liên tục giữa 2 pha: pha tĩnh là chất lỏng hoặc chất rắn có nhiệm vụ
giữ chất phân tích, pha động là chất lỏng (1 chất hoặc hỗn hợp nhiều chất) có

-

nhiệm vụ hòa tan và di chuyển chất phân tích.
Chất phân tích luôn phân bố giữa 2 pha, trong đó pha động luôn chảy qua cột

-

tách với một tốc độ nhất định.
Hiệu quả của quá trình tách phụ thuộc rất nhiều vào tương tác giữa các chất
trong pha tĩnh và pha động.

Ví dụ: Tách một hỗn hợp gồm hai chất A và B:
Mẫu chứa A và B được tiêm vào cột. Khi cho một chất rửa giải bắt đầu chảy qua
cột, phần của mẫu được hòa tan trong pha động được di chuyển tại phần đầu của

cột. Ở đây các cấu tử A và B tự phân bố giữa hai pha. Tiếp tục cho pha động đi qua
cột thì nó sẽ đẩy phần hòa tan này chạy xuống dưới và một sự phân bố mới giữa
pha động và pha tĩnh sẽ xảy ra. Đồng thời sự phân bố giữa dung môi mới và pha
tĩnh cũng diễn ra tại vị trí của mẫu lúc đầu. Việc thêm tiếp dung môi sẽ mang các
phân tử hòa tan chạy xuống cột trong một loạt liên tiếp các chuyển biến giữa hai
pha. Bởi vì sự di chuyển của chất tan chỉ xảy ra trong pha động, nên tốc độ trung
bình của sự di chuyển chất tan phụ thuộc vào phần thời gian chất tan ấy nằm trong
pha đó. Phần thời gian này là nhỏ đối với chất tan bị lưu giữ mạnh bởi pha tĩnh (cấu
tử B trong ví dụ trên) và lớn đối với chất tan (cấu tử A) có sự lưu giữ trong pha
động mạnh hơn. Sau một thời gian các phân tử chất A và B dần dần được tách khỏi
nhau.

8


Phân loại

IV.

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia
HPLC thành 4 loại:
1.

Sắc ký phân bố hiệu năng cao (Partition chromatography).
Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao (Sắc kí lỏng - rắn LSC).
Sắc ký trao đổi ion hiệu năng cao (IEC).
Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography).
Sắc kí loại theo cở (Size Exclusion Chromatography)
Sắc kí phân bố hiệu năng cao


Gồm hai loại phương pháp sắc ký lỏng – lỏng và sắc kí pha liên kết.
a)

Sắc kí lỏng lỏng (LLC)

Pha tĩnh là chất lỏng được phủ trên bề mặt của các hạt chất mang (support).
Pha tĩnh thường bị dung môi hòa tan và mất dần làm cột dần mất hiệu lực nên
phương pháp này ngày càng ít được sử dụng.
b)

Sắc kí pha liên kết (Bonded phase Chromatography)
9


Pha tĩnh được gắn hóa học (liên kết) với chất mang (hạt silicagen) tạo nên hợp chất
cơ siloxan.
Nếu R là một nhóm ít phân cực như octyl (C8), octadecyl (C18) hay phenyl và pha
động là dung môi phân cực như H 2O, methanol, acetonitril thì có sắc kí pha đảo
(hay sắc kí pha ngược). Ở đây pha tĩnh ít phân cực hơn pha động, trái với truyền
thống của sắc kí trước đây là pha tĩnh phân cực hơn pha động. Nếu R là nhóm khá
phân cực như alkylamin –(CH2)nNH2 hay alkylnitril –(CH2)n-CN và pha động là
dung môi ít phân cực như hexan thì ta có sắc kí pha thuận. Hiện nay sắc kí pha đảo
được dùng rộng rãi vì những lí do sau:



-

Các phân tử không phân cực, ít phân cực, ion, hoặc có thể ion hóa có thể


-

được tách một cách hiệu quả.
Pha tĩnh có một khoảng phân cực rất rộng để có thể chọn lựa.
Nó cho phép chọn một khoảng rộng chất rửa giải.
Các chất dung môi rửa giải rất thông dụng và không đắt (nước, methanol và

acetonitril).
- Kỹ thuật rửa giải gradient có thể được sử dụng mà không sợ hỏng pha tĩnh.
- Không có hạn chế về áp suất pha động đi vào cột.
- Nó cho kết quả tách tốt với rất nhiều đối tượng tách.
Chọn các pha: thường chọn pha tĩnh có tính phân cực giống với các chất cần tách
và khác với pha động. Các chất hữu cơ có độ phân cực tăng theo thứ tự sau:
Hydrocacbon no, ôlefin, hydrocacbon thơm, halogenua, sunfua, ête, dẫn xuất nitro,
este = andehit = xeton, ancol = amin, sunfon, sunfoxit, amit, axit cacboxilic, nước.
Thứ tự rửa giải trong sắc kí pha thuận là các chất không phân cực ra trước rồi đến
các chất phân cực mạnh hơn. Trong sắc kí pha đảo các chất phân cực ra trước rồi
đến các chất ít và không phân cực lần lượt ra sau.
 Ứng dụng
Sắc kí lỏng phân bố hiệu năng cao được dùng trong việc tách các chất thuộc nhiều
lĩnh vực như:
-

Thuốc kháng sinh, an thần, giảm đau, steroid
Axit amin, protein, hydrat cacbon, lipid…
Đường nhân tạo, chất chống oxi hóa, chất phụ gia, aflatoxin…
10


2.


Chất thơm, chất điện hoạt, chất màu, hóa chất công nghiệp…
Thuốc trừ sâu, diệt cỏ, phenol và các dẫn xuất phenol…
Thuốc, chất độc, cồn trong máu…
Sắc kí hấp phụ hiệu năng cao (sắc kí lỏng – rắn LSC)

Là phương pháp phát triển sớm nhất và được dùng rất phổ biến. Trong phương
pháp này, chất tan bị giữ trên bề mặt pha tĩnh tức là chất hấp phụ và bị dung môi
đẩy ra (phản hấp phụ)


Pha tĩnh: pha tĩnh là chất rắn mà trên bề mặt có chứa các nhóm hidroxil phân cực
như những bột mịn, silicagen và nhôm oxit. Ở đây các chất càng bị phân cực càng



bị lưu giữ mạnh và ra chậm khi rửa giải.
Pha động: là một dung môi không phân cực bảng dưới cho ta một dãy các dung
môi với sức rửa giải tăng dần từ trên xuống (thông số sức dung môi tăng dần). Dãy
này được xếp theo khả năng đẩy các chất ra khỏi nhôm oxit. Nhưng với silicagen ta
cũng có dãy tương tự. Muốn có dung môi có vị trí trung gian không có trong bảng
thì ta dùng hỗn hợp dung môi theo tỉ lệ thích hợp.
Dung môi
Ete dầu hỏa
Hexan
Heptan
Xiclohexan
Tetraclocacbon
Ete propylic
Toluene

Benzene
Ete etylic
Clorofom
Clometylen
Dicloetan
Aceton
Dioxan
Butanol
Etyl acetat
Acetonitril
Pyridin
Dimetylsunfoxit

0,01
0,01
0,01
0,04
0,18
0,28
0,29
0,32
0,38
0,40
0,42
0,49
0,56
0,56
0,56
0,58
0,65

0,71
0,75
11


Rượu isopropylic
Rượu etylic


0,82
0,88

Ứng dụng: Sắc kí hấp thụ được dùng nhiều để tách các chất tương đối ít phân cực,
các chất hữu cơ không tan trong nước có phân tử lượng nhỏ hơn khoảng 5000.
Phương pháp này mạnh hơn hẳn các phương pháp khác trong việc tách đồng phân.
3. Sắc kí trao đổi ion hiệu năng cao (IEC)
Pha tĩnh chứa các nhựa trao đổi lớn dưới dạng bột mịn, pha động thường là dung
dịch nước.
Pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác
với các phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng. Cụ thể, nếu hạt mang
điện âm tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ tương tác với những
phân tử mang điện tích dương. Ngược lại, nếu hạt mang điện tích dương gọi là sắc
ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm. Vì thế, những
protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ
lại cột. Để phóng thích những protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động, những
ion này sẽ thế phân tử protein tương tác với các hạt mang điện tích. Ví dụ, trong sắc
ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác trong dung dịch
tách giải bởi vì ion natri sẽ tranh bám vào cột với các protein có điện tích dương,
do đó, những protein mang điện tích dương được phóng thích ra ngoài cột lần lượt
theo độ lớn về điện tích.



Ứng dụng

Phương pháp này được dùng để tách các ion vô cơ và hữu cơ. Ví dụ khi cho dung
dịch hỗn hợp các ion Ba2+, Ca2+, Zn2+, Mg2+ đi qua cột cationit axit mạnh thì các ion
này bị lưu giữ trên cột . Khi dùng một dung dịch axit loãng để rửa giải thì lần lượt
các ion đi ra khỏi cột là Mg 2+ , Zn2+ , Ca2+ và Ba2+ . Có thể phát hiện các ion được
rửa giải ra khỏi cột nhờ detector đo độ dẫn điện.
4.

Sắc kí cặp ion (Ion pair chromatography- IPC)
12


Phần lớn sắc kí cặp ion (IPC) nảy sinh do những hạn chế của sắc kí trao đổi ion
như:
-

Các cột có khuynh hướng ít hiệu quả hơn các cột LC khác.
Các cột thường không cho kết quả lặp lại ở một mức độ nào đó.
Các cột thường ít bền.
Độ chọn lọc kém.

Trong ICP ta có thể sử dụng cả sắc kí pha thuận lẫn sắc kí pha đảo, mỗi loại có mặt
thuận lợi riêng của nó. Pha tĩnh của sắc kí pha đảo có thể gồm có cả pha tĩnh silic
được silan hóa được sử dụ ng bình thường ví dụ pha liên kết C18 hoặc C8.
Pha động trong ICP gồm một dung dịch đệm trong nước (cộng với một dung môi
hữu cơ như methanol hoặc acetonitril cho phép tách trong pha tĩnh liên kết) và một
ion đối có điện tích ngược dấu với ion phân tử mẫu.

Ví dụ, giả sử cần tách một số các axit hữu cơ, pha động được đệm ở pH =7 để tất cả
các hợp chất trong mẫu nằm dưới dạng RCOO -. Ion đối trong trường hợp này có
thể dùng ion tetrabutyl amoni (TBA+). Cột dùng trong ICP được chuẩn bị giống
như trong sắc kí pha liên kết và pha thuận.


Pha phân bố

Bảng sau tóm tắt vài hệ thống ICP được báo cáo trong các tài liệu với mỗi ứng
dụng chỉ rõ pha động, pha tĩnh, ion đối.
pH của nước

Pha động

Ion đối
N,Ndimethyl
protrilylin
e

Loại mẫu

pH 9

Cyclohexan/CHCl3

0,1 MHClO4

Các hỗn hợp của tributyl
phosphate, ethyl acetate,
butanol, CH2Cl2, và/hoặc

hexan

ClO4-

Các amin

Đệm
HPO42-/PO43-

Butanol/ CH2Cl2/Hexan

(Butyl)4N+

Các axit
cacboxylic

Picrate

Các amin

(Butyl)4N+

Các sunfoamit

pH 5-6
pH 6-8,5

Pentanol/ CH2Cl2 và/hoặc
CHCl3
Butanol / Heptane


Các axit
cacboxylic

13


0,2-0,25M
Butanol/ CH2Cl2/Hexane
HClO4
0,1M methaneButanol/ CH2Cl2/Hexane
sunfonic acid
pH 8,3

Butanol/ CH2Cl2/Hexane

ClO4-

Amin và các
amin bậc 4

CH3SO3-

Các amin

(Butyl)4N+

Các axit
cacboxylic


Bảng. Các hệ thống sắc kí cặp ion pha thuận
Những nguyên tắc chung trong việc kiểm soát sự tách trong ICP tương tự như trong
sắc kí pha đảo và pha thuận.


Vai trò của ion đối: Trong sắc kí pha đảo, lực dung môi được thay đổi bởi thay đổi
ion đối hoặc thay đổi nồng độ của nó.
Sự tăng nồng độ của ion đối dẫn đến sự tăng hệ số dung lượng k’ trong ICP pha
đảo.
Trong sắc kí ICP pha thuận và pha đảo thì k’ có thể được thay đổi bởi thay đổi loại
ion đối trong (ví dụ thay thế pentasulfonat bằng heptansunfonat chẳng hạn). Sự
cộng thêm một nhóm –CH2- dẫn đến k’ tăng lên khoảng 2.5 lần (ảnh hưởng sẽ lớn
hơn nếu nồng độ của ion đối thấp).
Phân tử ion đối càng lớn thì giá trị k’càng lớn trong sắc kí pha đảo và càng nhỏ
trong sắc kí pha thuận.


Độ phân cực của dung môi

Lực dung môi trong ICP pha thuận và pha đảo có thể được thay đổi bởi thay đổi
độ phân cực của pha động.
Trong các hệ thống pha đảo, hỗn hợp nước với methanol hoặc acetonitril nói
chung được sử dụng là pha động. Khi phần trăm của nước giảm xuống thì dung
môi trở nên mạnh hơn và k’ của mẫu giảm xuống. o Các hỗn hợp giữa butanol và
pentanol với CH2Cl2, CHCl3 có hoặc không thêm hexan là những pha động thường
dùng trong sắc kí pha thuận ICP.


Ảnh hưởng của pH


Giá trị k’ của mẫu sẽ chịu tác động nhiều trong ICP bởi thay đổi pH hoặc thay đổi
dung môi này bằng dung môi khác (ví dụ từ acetat etyl thay bằng butanol).
14


Nếu chúng ta biết giá trị pKA của các axit hoặc pKB của các bazơ đang tách thì ta có
thể dự đoán được sự lưu giữ tương đối của mỗi hợp chất sẽ thay đổi theo pH.
Nói chung pH của pha động được duy trì như thế nào để cho các hợp chất mẫu
được ion hóa hoàn toàn, còn sự tạo thành ion đối thì đạt cực đại.
Ví dụ khi tách các axit nếu pH của pha động thấp thì anion mẫu X - sẽ nằm dưới
dạng HX dẫn đến số lượng mẫu nằm ở dạng ion đối trên pha tĩnh sẽ thấp.


Ứng dụng

ICP được ứng dụng trong những mẫu phân cực như các bazơ, các ion, và các hợp
chất có các nhóm ion hóa. Các mẫu nước, bao gồm các dịch sinh lí, cũng nhận
được sự quan tâm của ICP.
5.

Sắc kí loại theo cở (Size Exclusion Chromatography)

Sắc kí loại theo cở hay còn gọi là sắc kí trên gel là một công cụ mạnh cho phân tích
các chất có khối lượng phân tử lớn. Chất nhồi cột cho sắc kí này là các hạt nhỏ (cở
10 micromet) polime hoặc silica chứa mạng lưới các lỗ đồng nhất trong đó các chất
tan và dung môi có thể khuếch tán vào. Trong các lỗ đó các phân tử bị bẫy một
cách hiệu quả và bị tách từ dòng chảy của pha động. Thời gian cư ngụ trung bình
trong các lỗ phụ thuộc vào kích thước hiệu dụng của các phân tử. Các phân tử có
kích thước lớn hơn so với kích thước trung bình của các lỗ của chất nhồi thì không
bị lưu giữ. Còn các phân tử có đường kính nhỏ hơn đáng kể kích thước lỗ thì thâm

nhập càng sâu vào trong sâu lỗ và như vậy cần nhiều thời gian hơn để ra khỏi lỗ,
dẫn đến bị rửa giải ra sau cùng. Nằm giữa hai loại này là các phân tử có kích thước
trung bình sẽ xâm nhập vào trong các lỗ nhiều hay ít tùy thuộc đuồng kính của
chúng. Chú y rằng trong sắc kí loại theo cở thì khác với các trường hợp xét trước
đây, ở đây không có sự tương tác hóa học hoặc vật lí giữa các phân tử chất tan và
pha tĩnh.


Chất nhồi cột

Có hai loại: Các hạt polime và silica có đường kính từ 5 đến 10 micromet. Loại sau
cứng hơn nên dễ nhồi cột, bền hơn, cho phép sử dụng một khoảng rộng các dung
15


môi bao gồm cả nước, cân bằng thiết lập nhanh hơn trong những dung môi mới, và
bền ở nhiệt độ cao hơn. Những nhược điểm của hạt silica là có khuynh hướng lưu
giữ chất tan bởi sự hấp phụ và có thể có tiềm năng xúc tác cho các phản ứng phân
hủy các phân tử chất tan. Hầu hết sắc kí loại theo cở đầu tiên được thực hiện trên
chất nhựa đồng trùng hợp giữa divinyl benzene với styrene. Kích thước lỗ của loại
polime này được kiểm soát bởi sự mở rộng liên kết ngang và vì thế liên quan đến
phần trăm divinylbenzen sử dụng để sản xuất nhựa. Vì vậy có nhiều loại gel với
kích cỡ lỗ khác nhau.
Lúc đầu, các nhựa đồng trùng hợp này là kỵ nước và chỉ được sử dụng với pha
động là các dung môi không nước. Hiện nay, các gel ưa nước là có sẵn (ví dụ
poliacrylamide) dẫn dến có thể sử dụng dung môi nước cho các phép tách các phân
tử chất tan trong nước ví dụ các loại đường. Các loại silica và hạt thủy tinh có kích
thước lỗ trung bình của khoảng 40 đến 2500 Ao hiện có sẵn trên thị trường. Để
giảm sự hấp phụ, bề mặt của những chất này thường được chuyển hóa bởi những
chất thế hữu cơ.

V.
1.

Một số đại lượng cơ bản trong phân tích sắc ký
Hệ số phân bố

Cân bằng của một cấu tử X trong hệ sắc ký có thể được mô tả bằng phương trình
như sau:
Hằng số cân bằng K cho cân bằng này được gọi là tỉ lệ phân bố hay hằng số phân
bố (partition coefficient) và được tính như sau:
Với CS : nồng độ cấu tử trong pha tĩnh.
CM : nồng độ cấu tử trong pha động.
Hệ số K tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh, pha động và chất phân tích.
2.

Thời gian lưu

tR : thời gian lưu của một cấu tử từ khi vào cột đến khi tách ra ngồi cột.
tO : thời gian để cho chất nào đó không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột; đó cũng là
16


thời gian pha động đi từ đầu cột đến cuối cột và còn gọi là thời gian lưu chết.
tR' : thời gian lưu thật của một cấu tử.
tR’=tR-to

Hình 2. Thời gian lưu của cấu tử phân tích
3.

Hệ số dung lượng k’


k’ được định nghĩa theo công thức sau:
Với VS : thể tích pha tĩnh
VM : thể tích pha động
Nếu k’~ 0, tR~ tO: chất ra rất nhanh, cột không có khả năng giữ chất lại.
Nếu k’ càng lớn (tR càng lớn): chất ở trong cột càng lâu, thời gian phân tích càng
lâu, mũi có khả năng bị tù.
Khoảng k’ lý tưởng là 2 - 5, nhưng khi phân tích một hỗn hợp phức tạp, k’ có thể
chấp nhận trong khoảng rộng 1 - 20.
4.

Hiệu năng

Hiệu năng hay số đĩa lý thuyết N của cột đặc trưng cho khả năng tách mũi sắc ký
của các cấu tử trên cột. N càng lớn, hiệu năng tách càng cao.
Số đĩa lý thuyết có thể đo trên sắc ký đồ. Người ta chứng minh được:
17


Hay
Với W1/2 là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí ½ chiều cao mũi (phút)
W là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí đáy mũi (phút)
5.

Độ chọn lọc

Đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột.
6.

Độ phân giải


Đây là đại lượng biểu thị rõ cả ba khả năng của cột sắc ký: sự giải hấp, sự chọn lọc
và hiệu quả tách. Nó được xác định qua phương trình sau:
Hay
VI.

Ứng dụng

HPLC được xem là phương tiện để định tính, định lượng có độ nhạy cao, chính
xác, giảm thời gian sắc ký, ít tốn mẫu, có thể áp dụng cho hầu hết các chất như: các
chất dễ bị phân hủy bởi nhiệt độ, các acid amin, protein, acid nucleic, cacbohydrat,
kháng sinh, thuốc trừ sâu, các chất vô cơ,…
Thiết bị HPLC cũng ngày càng phát triển và hiện đại hơn nhờ sự phát triển nhanh
chóng của ngành chế tạo và sản xuất thiết bị phân tích.
Để đảm bảo chất lượng kết quả phân tích nhiều loại chỉ tiêu trên các nền mẫu khác
nhau, đáp ứng được nhu cầu phân tích đa dạng của khách hàng, CASE cũng đã đầu
tư các hệ thống HPLC hiện đại của các hãng nổi tiếng trên thế giới trong sản xuất
thiết bị phân tích như Shimadzu (model 10A, 20A), Agilent (LC 1200), Dionex
(UltiMate 3000), Thermo, Mehtrom…với hầu hết các đầu dò như quang phổ tử
ngoại khả kiến (UV-VIS), huỳnh quang (RF), khúc xạ (RI), đo độ dẫn (sắc ký ion
18


-IC), khối phổ (MS),… Các hệ thống HPLC này đều có gắn các bộ chích mẫu tự
động nhằm nâng cao tính chính xác và có thể phân tích đồng thời nhiều mẫu.
Hệ thống HPLC 10A :
Hệ thống HPLC 20A

Tài liệu tham khảo
1.

2.
3.
4.

Bài giảng Phân tích thực phẩm
/> /> />
19