SẮC ký lớp MỎNG TLC Thin layer chromatography
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (4.5 MB, 28 trang )
SẮC KÝ LỚP MỎNG – TLC
THIN LAYER CHROMATOGRAPHY
I- LỊCH SỬ- ĐỊNH NGHĨA
A. LỊCH SỬ
Thời gian
1938
1958
1965
Nhân vật
Sự kiện
Izmailov và Schraiber SKLM (Al2O3, bản thủy tinh)
hoàn thiện và chuẩn hóa phƣơng pháp SKLM (silicagel, CaSO4,
Stahl 0.25mm, cách phát hiện)
điều chế thành công bản mỏng tráng sẵn…
hãng Merck chuẩn hóa bản mỏng sắc ký.
B. ĐỊNH NGHĨA
SKLM là một phƣơng pháp sắc ký mà trong đó một dung dịch mẫu thử được chấm trên
một lớp mỏng chất hấp phụ (silica gel, nhôm oxyt) tráng trên nền phẳng (kính, kim loại, chất
dẻo) đóng vai trò là pha tĩnh.
Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo bản mỏng sẽ làm di chuyển các
cấu tử của mẫu thử theo một vận tốc khác nhau do sự hấp phụ, phân bố … tạo thành một sắc ký
đồ gồm nhiều vết có Rf khác nhau.
II- CƠ CHẾ TÁCH
Các chất cần tách trong SKLM có thể khuếch tán theo cả
chiều dọc và chiều ngang.
1-
Hấp phụ (NP-TLC) – cơ chế chính
Sự tách chủ yếu dựa vào ái lực hấp phụ khác nhau
của các chất đối với chất hấp phụ rắn (pha tĩnh) và đƣợc
biểu thị thông qua hằng số hấp phụ.
2-
Phân bố (RP-TLC)
Dựa trên sự phân bố khác nhau của mỗi chất với pha động và pha tĩnh thông qua hệ số
phân bố.
Trong SKLM, pha tĩnh của sắc ký phân bố là chất lỏng được tẩm trong giá mang (chất
rắn tạo lớp mỏng).
3-
Trao đổi ion
4-
Rây phân tử
Trong loại sắc ký này, chất rắn làm pha tĩnh là nhựa trao đổi ion.
Sự phân tách xảy ra do ái lực khác nhau của các ion trong dung dịch cần tách với các gốc
ion có trong pha tĩnh.
Sự trao đổi ion đƣợc đặc trƣng bằng hằng số trao đổi ion.
Sự tách dựa trên kích thước phân tử chất tan để lọt sâu vào trong các hốc của pha tĩnh và
bị giữ lại đó sẽ ra sau.
Các chất có kích thước phân tử lớn sẽ nằm ngoài các hốc và ra trước.
Hóa phân tích 2
Trần Trung Trực
1
III- PHA TĨNH TRONG SKLM
Pha tĩnh hay sử dụng trong SKLM là chất hấp phụ rất mịn.
Các chất hấp phụ có trộn thêm chất kết dính như CaSO4 5-15%, tinh bột 2-5%, dextrin, … hay
không dùng chất kết dính.
A. SKLM PHA THUẬN (NORMAL PHASE-TLC)
1-
Silicagel= Kieselgel= Gel của acid silicic (SiO2 .nH2O ) 90%
a. Tính chất
Chất hấp phụ đƣợc sử dụng rộng rãi nhất hiện nay.
Kích thƣớc hạt 10-40m, đƣợc loại Fe bằng cách đun HCl đậm đặc, dùng nƣớc rửa sạch ion
clorid và lắng gạn loại các hạt nhỏ lơ lửng, sấy ở 120o C trong 48h. Hoạt hóa trong 2h ở 105oC.
Hoạt tính do các nhóm OH trên bề mặt quyết định. Hàm ẩm tăng làm giảm hoạt độ.
Chất phân cực, trung tâm hấp phụ là các nhóm -OH silanol (-Si-OH, HO-Si-OH, -Sitrihydroxyl) có tính acid. -OH silanol có Pka 9,5 và pH 5 -7 MP: pH < 8.5 (dùng 5
Tỉ lệ silanol tự do/geminal silanol # (2:1), diện tích bề mặt 200-400m2 /g
Mật độ nhóm silanol càng cao (hạt càng mịn) khả năng hấp phụ càng lớn
Tan ít trong MeOH
Khả năng hấp phụ tùy thuộc tình trạng ngậm nƣớc hàm ẩm tăng.
Tùy theo việc chọn dung môi thích hợp có thể dùng silicagel để tách sắc ký các hợp chất
base (alkaloid) và các hợp chất ưa dầu.
Tăng khả năng phân chia của silicagel khi tẩm nó với:
AgNO3 10-12%.
Amoniac.
Dung dịch acid boric.
Đệm phosphate.
Hóa phân tích 2
Trần Trung Trực
2
Nhiệt độ
Ngậm nước
0
Khả năng hấp phụ
(n H20)
Tính chất
Tình trạng
3
Rất kém
Hoạt hóa được
Bị hút ẩm
2
Kém
Hoạt hóa được
Bị hút ẩm
100-120 C
1
Tối ưu
Hấp phụ tốt
Được hoạt hóa
200-450
0
Mạnh, không giải hấp được
Phục hồi được
Bắt đầu trơ
450-1100
-1
Mất hoàn toàn khả năng hấp phụ
Hết phục hồi
Hết sử dụng
<70 C
0
=70 C
0
b. Sự hấp phụ mẫu phân tích lên bề mặt pha tĩnh
Mẫu thử càng có nhiều cực hấp phụ lực hấp phụ càng lớn càng phân cực.
c. Sự giải hấp phụ bằng dung môi
Silica gel = silica gel pha thuận= silica gel NP hay Kieselgel= si-gel= silica gel= gel de
silice= silicic acid= SiO2.n H2O # Kieselgurh
Hóa phân tích 2
Trần Trung Trực
3
Hạt thô
63-200µm
FC, VLC
Hóa phân tích 2
Hạt vừa hay trung bình
40-63
FC, VLC,CC
Trần Trung Trực
Hạt mịn
15-40
TLC
4
2-
Nhôm oxyd 5%
a. Tính chất
O
OH
Al
O
OH
Al
O
OH
Al
O
OH
Al
O
Al
O
O
Kích thƣớc hạt thƣờng thô hơn so với silica gel
Là chất hấp phụ phân cực mạnh (hơi kém hơn Silica gel),
S bề mặt 100m2 /g, bề dày lớp mỏng 0,1-0,15mm
Có ba loại Alumina trên thị trường
Loại trung tính (7,3 ± 0,5):
Al-OH + -Al-O- tách các chất trung tính
Loại acid (4,0 ± 0,5) :
-Al-OH
Loại base (9,0 ± 0,5 ):
-Al-Osắc ký acid amin có tính base
Nhưng cũng có thể chuyển đổi pH của oxid nhôm nếu cần
Hoạt tính giảm khi hàm lượng nước gia tăng
Hoạt hóa: 120oC /1h.
Có nhiều cỡ hạt 40-63, 63-200μm
Nhiều dạng hình thù khác nhau: α (xoang 90A), є (60A) thƣờng sử dụng trong CC.
Rất ít sử dụng oxyt nhôm pha đảo (Aluminai RP-18)
Có thể hấp phụ mạnh các chất phân cực:
Flavonoid,
Tannin,
các Polyphenol..
Có thể phản ứng với nhóm C=O trong aldehyd, ceton amid…
Để tăng khả năng chia tách, xử lý nhôm oxyd với dung dịch kiềm hay acid.
b. Bản Brockman phân chia hoạt tính của oxyd nhôm
Bậc hoạt tính I
% nước
Hóa phân tích 2
Trần Trung Trực
II III IV V
0 3 6
10 15
5
c. Xác định bậc hoạt tính của oxid nhôm dựa vào giá trị Rf của các chất
màu chuẩn
II
Chất màu
Aminoazobenzen
Sudan đỏ
Sudan vàng
V
0,95
0,56
0,78
So sánh silica và oxyd nhôm:
Thông dụng
pH bề mặt
Hấp phụ mạnh
Nạp mẫu
Tương tác với mẫu
3-
0,59
0,00
0,01
III
IV
Gía trị Rf
0,74 0,85
0,10 0,33
0,25 0,57
Silicagel
++++
#5
Các chất kiềm
Nhiều hơn
+
Nhôm oxyd
+
#12
Các chất acid
Ít hơn
+++
Than hoạt
a. Than graphit
Nung than thực vật/100030000C không còn nhóm chức tự
do
c. Than hoạt
Nung than thực vật/7000C
Chất hấp phụ có độ phân
cực yếu dùng dƣới dạng bột
cho SKC
Diện tích bề mặt nhỏ 6 Diện tích bề mặt lớn
Diện tích bề mặt lớn 3002
2
30m /g
1000m /g
1000m2/g
Dùng dƣới dạng hạt cỡ 30μm Dùng làm:
Dùng trong:
làm:
lọc loại bỏ khí trong LC, loại các sắc tố tạp khỏi
giá hấp phụ trong GC.
dịch chiết dược liệu
loại tạp trong GC
giá mang trong GC
để tinh chế các chất ít bị
than hoạt hấp phụ.
4-
b. Than xốp
Polyamid – đất tẩy trắng
Là hợp chất cao phân tử của (-CONH-) tạo mạng cấu trúc 3 chiều.
Một chất hấp phụ yếu hơn nhiều so silica gel và nhôm oxyd, dùng tách các chức phenol.
Sự hấp phụ do sự tạo thành những liên kết
hydro thuận nghịch giữa các nhóm chức của mẫu
với oxy của –CO trong polyamid.
Ngoài cơ chế hấp phụ còn có cơ chế phân bố
nhờ các xoang rỗng của polyamid đây cũng đƣợc
xem là cơ chế tách của polyamid (alkaloid, acid
amin…)
Hóa phân tích 2
Trần Trung Trực
6
5-
Kieselguhr
6-
Thạch cao
Là loại bột nhẹ, màu vàng xám chứa khoảng 70 – 95% SiO2, phần còn lại gồm các oxid
nhôm, sắt, Mg, Ca, P, S…
Các tính chất, thành phần, hoạt độ và kích thƣớc hạt của kieselguhr thay đổi tùy theo hãng
sản xuất.
Kieselguhr là một chất hấp phụ yếu, dùng tách các chất phân cực như cetoacid, lacton,
… thƣờng đƣợc dùng làm chất mang cho pha tĩnh trong sắc ký phân bố.
kieselguhr – thạch cao
Đôi khi ngƣời ta còn sử dụng hỗn hợp
với tỷ lệ 1:1.
kieselguhr – silicagel
Đƣợc điều chế bằng cách trộn dung dịch CaCl2 và H2SO4 với tỷ lệ đồng phân tử, đun 70–
o
80 C, gạn lấy CaSO4, rửa tới trung tính, sấy 115 -120 oC/48 giờ.
Chất hấp phụ yếu
Hiện nay ít sử dụng
B. SKLM PHA ĐẢO (RP: REVERSE PHASE-TLC )
1-
Silica gel- ghép (Silicagel boned phase)
Chất mang là các hạt silica đồng nhất, xốp, bền cơ học có d= 3,5,10 μm đƣợc thủy phân hoàn toàn bằng
HCl 0.1M ở nhiệt độ cao /1 ngày để tạo thành các nhóm Silanol va gem- silanol
Các nhóm Silanol va gem- silanol đƣợc cho phản ứng với clorosilane để tạp thành các -Si-O-Si-R, Si-R.
Pha thuận (NP)
Pha đảo (RP)
Phân cực kém đến vừa
Phân cực mạnh
Mẫu nghiên cứu
Hấp phụ+phân bố
Phân bố
Cơ chế chính
Phân cực tăng dần
Giảm dần
Dung môi
SKLM, SKC, VLC
HPLC
Thông dụng trong
Dài đến 60cm
Ngắn <25cm
Cột khai triển
Chấp nhận
Rất đắt
Giá thành
NP (hay không ghi)
RP, ODS, silanized
Ký hiệu
Hóa phân tích 2
Trần Trung Trực
7
Hóa phân tích 2
Trần Trung Trực
8
2-
Cellulose
Là chất cao phân tử thiên nhiên [(C6H7O2(OH)3]n,
Dạng sợi mịn, không cần chất kết dính thƣờng dùng cho PC (giấy Whatman, FN…)
Cellulose vi tinh thể: xử lý cellulose bằng tẩm methanol, acid formic và nƣớc hoặc bằng
isopropanol, acid acetic và nƣớc tạo hỗn dịch để chạy SKC pha đảo.
Cellulose có cơ chế phân bố là chính thƣờng dùng tách các hợp chất phân cực mà không
thể tách bằng sắc ký hấp phụ (polysaccaride, acid amin, acid nucleic..) các vết thu đƣợc khá
tròn, ít biến dạng và thời gian phân tách ngắn.
Nhựợc điểm chính của cellulose là không thể phát hiện vết sắc ký bằng các thuốc thử
mạnh nhƣ NaOH, H2SO4, …
Trong sắc ký phân bố hay dùng silicagel, kieselguhr, cellulose, thạch cao để làm chất
mang dung môi pha tĩnh.
[khó chọn dung môi vì làm hỏng giấy].
345-
Polyamid
Diaion HP-20
Nhựa trao đổi ion loại ionit vô cơ-hữu cơ
Là loại silicagle đƣợc sunfon hóa (hay gắn các gốc có khả năng trao đổi ion), đó là cationit
có nhóm – SO3H nên có thể sử dụng trong môi trƣờng acid mạnh.
Pha tĩnh có chất kết dính: silicagel G, kieselguhr G, oxyd nhôm G, đã trộn sẵn 5% thạch
cao.
Pha tĩnh không có chất kết dính: silicagel H, oxyd nhôm H.
Pha tĩnh có chất chỉ thị huỳnh quang: silicagel GH254 và HF254, …
Bản sắc ký tráng sẵn với giá đỡ là tấm thủy tinh, giấy nhôm hay polymer có nhiều ƣu điểm
hơn bản mỏng tráng thủ công:
Thao tác đơn giản và dễ dàng hơn do có độ ổn định cơ học cao hơn.
Thích hợp định lƣợng do có tính đồng nhất cao.
Độ phân tách tốt hơn.
Hóa phân tích 2
Trần Trung Trực
9
Tính chất
Pha tĩnh
Độ acid
Hoạt tính
Silicagel
Dẫn chất siloxan
Acid
Có hoạt tính
Oxyd nhôm
Base
Có hoạt tính
Cát biển
Kieselguhr
Magie diphosphat
Magie trisilicat
Calci hydroxid
Calci phosphat
Tác dụng
phân chia
Hấp phụ
Phân bố
Hấp phụ
Phân bố
Trung tính
Không có hoạt tính
Phân bố
Base
Base yếu
Hoạt tính yếu
Hoạt tính yếu
Hoạt tính yếu
Hoạt tính yếu
Hấp phụ
Hấp phụ
Hấp phụ
Hấp phụ
Hoạt tính yếu
Hấp phụ
Có hoạt tính
Hấp phụ
Có hoạt tính
Hấp phụ
Có hoạt tính
Hấp phụ
Calci sulfat
Silicagel + oxyd nhôm
Acid + base
(1:1)
Sắt hydroxid
Than
Cellulose
Thực tế trung tính
Không có hoạt tính
Phân bố
Polyamid
Trung tính
Không có hoạt tính
(Trao đổi ?)
(Trao đổi,
phân bố ?)
Polyacrylonitril
Nhựa trao đổi ion
Trung tính
Không có hoạt tính
Acid + base
Không có hoạt tính
Gel sephadex
Trao đổi
Rây phân tử
Các chất được
dùng để phân tích
Hầu hết tất cả
Các chất ít phân cực
Hydrocarbon,
alcaloid,
chất màu thực phẩm,
lipid
Đƣờng, acid béo
Đƣờng,
các triglycerid,
các acid bậc cao
Carotinoic, tocopherol
Carotinoic, tocopherol
Carotinoic, tocopherol
Carotinoic, tocopherol
Carotinoic,
tocopherol,
các acid béo,
glycerid kỵ nƣớc
Các chất màu, các
acid barbituric
Các chất phân cực
Các chất không phân
cực
Acid amin,
carbohydrat,
nucleotid
Các flavon
Các antoxyan
Acid nucleic,
nucleotid,
ion kim halogenic
Polymer,
protein,
phức kim loại
IV- PHA ĐỘNG TRONG SKLM
A. ĐẶC ĐIỂM
Là yếu tố quan trọng trong quá trình sắc ký
Trong sắc ký rất ít khi pha động là 1 dung môi
Thƣờng pha động là 1 hỗn hợp 2 hay nhiều hơn 2 thành phần đƣợc gọi là hệ dung môi.
Để cải thiện khả năng tách của hỗn hợp, 1 lượng nhỏ kiềm, acid … có thể đƣợc thêm vào hệ dung môi
Độ tinh khiết của dung môi: có 1 kết quả tốt, lặp lại
Để đánh giá khả năng rửa giải của 1 dung môi ngƣời ta thƣờng dùng khái niệm “độ phân cực” của
dung môi, đƣợc dự đoán bằ ng moment lƣỡng cực, hằ ng số điện môi, thực nghiệm v.v…
Hóa phân tích 2
Trần Trung Trực
10
B. ĐỘ PHÂN CỰC VÀ SỨC RỬA GIẢI CỦA DUNG MÔI
Polar: Water > Acetic acid> Ethyleneglycol >Methanol >Ethanol >Isopropanol >Pyridine
>Acetonitrile >Nitromethan >Diethylamine >Aniline >Dimethylsulfoxide >Ethylacetate
>Dioxane >Acetone >Dichloroethane >Tetrahydrofuran >Dichloromathane >Chloroform
>Diethylether >Benzene >Toluene >Xylene >Carbontetrachloride >Cyclohexane >Petroleum
ether >Hexane >Pentane: Non-polar.
Nhiệt độ sôi
Boiling point
Tỉ trọng Density
P’
(dãy Snyder)
F
(dãy Halpaap)
69 °C
80 °C
111 °C
35 °C
61 °C
40 °C
0.655 g/ml
0.879 g/ml
0.867 g/ml
0.713 g/ml
1.498 g/ml
1.3266 g/ml
0.1
2.4
2.7
2.8
4.1
3.1
01
29
32
38
40
42
101 °C
56 °C
77 °C
82 °C
1.033 g/ml
0.786 g/ml
0.894 g/ml
0.786 g/ml
4.8
5.1
4.4
5.8
5.6
56
58
65
118 °C
82 °C
97 °C
66 °C
0.810 g/ml
0.785 g/ml
0.803 g/ml
0.886 g/ml
3.9
3.9
4.0
4.0
70
82
82
82
0.789 g/ml
0.791 g/ml
1.049 g/ml
1.21 g/ml
1.000 g/ml
0.944 g/ml
4.3
5.1
6.0
88
95
Lớn
H-O-H
H-C(=O)N(CH3)2
79 °C
65 °C
118 °C
101 °C
100 °C
153 °C
10.2
Rất lớn
CH3-S(=O)-CH3
189 °C
1.092 g/ml
Dung môi
CTCT
Hexane
Toluene
Benzene
Diethyl ether
Chloroform
Dichloromethane
(DCM)
1,4-Dioxane
Acetone
Ethyl acetate
Acetonitrile
(MeCN)
n-Butanol
Isopropanol (IPA)
n-Propanol
Tetrahydrofuran
(THF)
Ethanol
Methanol
Acetic acid
Formic acid
Water
Dimethylformamide
(DMF)
Dimethyl sulfoxide
(DMSO)
CH3-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3
C6H6
C6H5-CH3
CH3CH2-O-CH2-CH3 CHCl3
CHCl3
CH2Cl2
/-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-\
CH3-C(=O)-CH3
CH3-C(=O)-O-CH2-CH3
CH3-C≡N
CH3-CH2-CH2-CH2-OH
CH3-CH(-OH)-CH3
CH3-CH2-CH2-OH
/-CH2-CH2-O-CH2-CH2-\
CH3-CH2-OH
CH3-OH
CH3-C(=O)OH
H-C(=O)OH
Độ phân cực (polarity) của một số dung môi hữu cơ thường gặp:
PE
→ Ước
Dãy Halpaap (F): được sắp xếp theo thứ tự khả năng rửa giải tương đối (F) tăng dần
lượng độ phân cực của một dung môi.
P’S= (a%x P’A+ b% P’B)
Ví dụ: S = Bz- EtOAc (80:20) P’S= 0.8x2.7+ 0.2x4.4= 3,04 (sấp xỉ DCM).
Hóa phân tích 2
Trần Trung Trực
11
Để so sánh và phân biệt 2 dung môi trong 1 hệ dung môi, người ta phân biệt:
Dung môi mạnh: là dung môi có ái lực mạnh với chất phân tách, làm cho chất phân tách
di chuyển nhanh hơn.
Dung môi yếu: là dung môi có ái lực với chất phân tách không mạ nh bà ng dung môi
mạnh.
Dung môi mạnh hay yếu là xét trên 1 hệ cụ thể
SKLM pha thuận: dung môi phân cực mạnh là dung môi mạnh
SKLM pha đảo: dung môi ít phân cực hơn là dung môi mạnh.
Khi viết 1 hệ dung môi, thông thường người ta viết
Dung môi yếu trước – Dung môi mạnh sau
Tỉ lệ của các dung môi (dung môi yếu:dung môi mạnh)
Ví dụ:
Sắc ký pha thuận
Sắc ký pha đảo
+ n-hexan – ethyl acetat (8:2)
+ nước – methanol (80:20)
+ chloroform – aceton (75:25; lớp dưới)
+ nước – acetonitril (45:55)
C. YÊU CẦU CHO MỘT DUNG MÔI SẮC KÝ TỐT
Hòa tan tốt mẫu thử
Không phản ứng với mẫu thử
Linh động, độ nhớt thấp
Nhiệt độ sôi không quá thấp, không
quá cao
Không có mùi khó chịu
An toàn, không độc hại,
Rẻ tiền, dễ kiếm
Thân thiện với môi trƣờng
D. LỰA CHỌN DUNG MÔI CHO SKLM
*Qui tắc tam giác Stahl (1960’)
Mẫu thử
Chất hấp phụ (SP)
Hệ dung môi khai triển (MP)
Phân cực kém
Phân cực mạnh
(silica gel, oxyd nhôm..)
Phân cực cực kém
(PE, n-hexan, Tol, BZ, Cf, EtOAc…)
Phân cực mạnh
Phân cực kém
(silica gel RP…)
Phân cực mạnh
(ACN, Me, H2O)
Tham khảo hệ dung môi của các chất cần phân tích trên các textbook, các tạp chí uy tín.
Tham khảo dãy (Snyder, dãy Halpaap) để chọn ra loại dung môi tinh khiết có “độ mạnh” phù hợp
Tổ hợp dung môi hai thành phần ví dụ (A-B); (A-C); (A-D); (B-C), ... theo hướng tăng dần độ phân cực
sau đó chấm lên một loạt bản, mỗi bản khai triển với một trong các hệ dung môi này, sơ bộ ghi nhận các hệ dung
môi nào tách tốt (soi UV hay phun thuôc thử thích hợp)
bằng cách soi đèn UV và phun thuốc thử phù hợp
Hóa phân tích 2
Trần Trung Trực
12
Có thể thêm thành phần thứ 3 vào hệ 2 dung môi này để cho các vết tách rõ hơn, sắc gọn
hơn nhƣ là acid (acid formic, acid acetic..) nếu SKLM chất có tính acid nhƣ Flavonoid, hoặc
kiềm (NH3, Dietylamin.. ) khi SKLm chất có tính kiềm nhƣ Alkaloid với tỉ lệ <1% (chất điều
chỉnh: modifier)
Bên cạnh tác dụng điều chỉnh pH cũng có thể làm tăng đáng kể độ phân cực của hệ dung
môi vừa chọn.
Tuy nhiên lựa chọn tối ƣu hóa sắc ký thƣờng dựa chủ yếu vào kinh nghiệm
Việc lựa chọn dung môi không theo 1 qui tắc cụ thể mà phải sắc ký sơ bộ để thăm dò dung
môi thích hợp. Hệ dung môi càng đơn giản càng tốt và phải dùng dung môi tinh khiết.
E. MỘT SỐ YẾU TỐ GIÚP LỰA CHỌN PHA TĨNH VÀ PHA ĐỘNG CHO TLC
Tính chất của hỗn hợp chất cần phân tách
độ hòa tan,
số lượng
độ phân cực,
đặc tính các nhóm chức hóa học
Cơ chế sắc ký của pha tĩnh
Độ bay hơi, độ nhớt, sự phân lớp và độ tinh khiết của hỗn hợp DM
Cần điều chỉnh sức rửa giải của pha động để 0,2< Rf <0,8 đạt độ phân giải cực trị
Chất phân tích dạng ion đƣợc rửa giải tốt với dung môi phân cực rất mạnh nhƣ hỗn hợp
n-butanol:nước
Thêm một ít acid acetic hoặc ammoniac vào nƣớc sẽ làm tăng độ tan của acid hoặc base
tương ứng.
Khi dùng silicagel hoặc các chất chất hấp phụ phân cực khác, độ phân cực của pha động sẽ
quyết định tốc độ di chuyển của chất phân tích và trị số Rf của chúng. Nếu thêm một ít dung
môi ít phân cực nhƣ ether ethylic vào dung môi không phân cực nhƣ methyl benzene làm tăng
đáng kể trị số Rf.
Một số nhóm chức có khả năng hấp phụ [khả năng đẩy chất ra khỏi oxyd nhôm hay
silicagel] theo thứ tự tăng dần:
CH=CH<-OCH3
Hóa phân tích 2
Trần Trung Trực
13
V1-
DỤNG CỤ CHO TLC
Bình triển khai
Tròn
Vuông
Chữ nhật
2-
Đƣờng kính 12cm, cao 30cm
24 x 24cm
24x30cm
:
:
:
Bản mỏng tráng sẵn (precoated TLC plate)
a. Bản mỏng dính chắc
b. Bản mòng không dính chắc
3-
Các phụ kiện khác
Hóa phân tích 2
Trần Trung Trực
14
VI- TIẾN HÀNH TLC
A. CÁC BƯỚC THỰC HIỆN
1
Bão hòa hệ dung môi
SOP/ Kết quả TLC đẹp
Thể tích các dung môi
Lắc đều
Giấy lọc bảo hòa DM
Thời gian
2-
Chuẩn bị bản mỏng Silica gel
a. Chuẩn bị bản
mỏng phân tích
b. Chuẩn bị bản
mỏng chế hóa
Dày: 0.1-0.25mm.
Dày 0.5-2mm (đến
10mm)
Phân tích các thành
phần của hỗn hợp.
Tách lƣợng nhỏ đơn
chất (mg).
c. Chuẩn bị lớp mỏng hiệu
năng cao, lớp mỏng pha đảo
-i- Lớp mỏng
pha đảo
Hay gặp loại
silicagel RP18, khai
triển ngắn <10cm.
Sử dụng dung môi
phân cực (ACN,
MeOH, H2O), có thể
kèm dung dịch đệm
-ii- Lớp mỏng
hiệu năng cao
Dùng bản mỏng
tráng sẵn Silicagel F254,
Silicagel RP-2, RP-8,
RP-18.
Khác về kích thƣớc
hạt, độ đồng đều của
các hạt và bề dày của
pha rắn.
Cắt bản mỏng
Kích thƣớc
Kẻ bản mỏng:
bút chì
qui định khoảng cách
ghi chú trên bản mỏng…
Hóa phân tích 2
Trần Trung Trực
15
3-
Chuẩn bị mao quản
Kéo mao quản từ ống TT có d=1-2mm
Mao quản có khắc thể tích
4-
Chấm mẫu thử
Mẫu thử: DM hòa tan mẫu thử
Chấm điểm hay vạch (3mm)
Theo dõi CC: vết sát nhau hơn
P-TLC: chấm băng liên tục dày 1-2mm, mao quản 1-10µl
Với lớp mỏng dính chắc: đánh dầu đƣờng xuất phát cách mép dƣới 1-2cm.
Với bản mỏng phân tích: chấm dạng vết.
Dùng mao quản hay micropipette chấm dung dịch lên bản mỏng cách 2 mép bên của bản 12cm, các vết cách nhau >= 1cm.
Chấm không làm thủng lớp mỏng, vết chấm gọn, nhỏ chứa lƣợng chất thử khoảng 1-10g.
Lƣợng chất chấm có ảnh hƣởng đến sự di chuyển của vết, làm thay đổi vị trí của nó trên sắc
ký đồ.
Hóa phân tích 2
Trần Trung Trực
16
5-
Khai triển TLC
Là quá trình cho pha động chạy, kéo mẫu phân tích di chuyển trên pha tĩnh.
Đặt bản mỏng đã chấm vào bình:
Vết chấm không chạm trực tiếp vào pha động trong bình.
Cách bề mặt dung môi 0.5-1cm.
Sau khi dung môi chạy đến cách đầu trên của bản khoảng 1-2cm thì lấy ra, đánh dấu mức
dung môi trên kính, để khô hay sấy khô.
Đặt bản mỏng vào bình dung môi:
tránh dựa lưng vào giấy lọc
tránh hai biên tiếp xúc DM
nghiêng góc 45o
Không di chuyển bình sắc ký hay có rung động
Khai triển một hay nhiều lần (F254)
Khai triển theo hai chiều thẳng góc nhau
6-
Phát hiện vết
a. Soi đèn UV (365, 254nm)
Các vết chất hữu cơ trên sắc ký đồ trở nên tối hoặc phát quang sáng khi soi dƣới đèn UV có
bƣớc sóng 254nm hay 365nm.
Thêm chất huỳnh quang không tan vào pha tĩnh: cả bản mỏng sẽ phát sáng (huỳnh quang)
khi soi đèn tử ngoại, nơi có chất tối hoặc huỳnh quang màu khác với nền trắng của bản mỏng.
Hóa phân tích 2
Trần Trung Trực
17
b. Phun thuốc thử hiện màu hoặc nhúng bản mỏng.
Có thể dùng nhiệt độ làm tăng phản ứng tạo màu và cường độ vết màu.
Thuốc thử
THUỐC THỬ
CHUNG
THUỐC THỬ
CHỌN LỌC
Màu của vết
Ứng dụng phân tích
Acid phosphomolypdic
Xanh tối
Nhiều chất hữu cơ
Acid sulfuric đặc
Nâu – đen
Tất cả các chất hữu cơ
Hơi iod
Nâu
Nhiều chất hữu cơ
Ninhydrin
Hồng – tím
Acid amin, các nhóm chức amin
2,4-dinitrophenylhydrazon Da cam, đỏ
Các hợp chất carbonyl
Xanh hoặc lục
bromocresol
Vàng
Các acid hữu cơ
2,7 fluorescein
Vàng – lục
Nhiều chất hữu cơ
Vanilin/acid sulfuric
Xanh – lục – hồng
Alcol, ceton
Rhodamin B
Huỳnh quang đỏ
Anisaldehyd/SbCl3
Nhiều màu
Các chất lipid
Các chất steroid
Cac chất bảo vệ thực vật.
Nhiều màu
Diphenylamin/Zn2+
c. Densitormeter
Đo cƣờng độ tia phản xạ từ bề mặt bản mỏng khi soi dƣới đèn UV-Vis.
Chất hấp phụ bức xạ đƣợc ghi lại thành pic sắc ký.
7
Báo cáo kết quả
Ghi điều kiện của TLC
Loại bản mỏng , kích thước
Mẫu thử, dung môi hòa tan mẫu
DM khai triển và số lần khai triển
Điều kiện hiện màu
Hóa phân tích 2
Trần Trung Trực
Tính Rf hoặc Rx
2 số lẻ
Theo thứ tự Rf nhỏ dần
SKĐ đính kèm
18
B. CÁC HIỆN TƯỢNG NGOẠI Ý THƯỜNG GẶP TRONG TLC
Nguyên nhân
Hiện tượng
Vết di chuyển không hoàn toàn
Mẫu còn nhiều tạp phân cực
Vết trải dài không tách
Chọn dung môi sắc ký chƣa tốt
DM chiết không chuyên biệt
Vết di chuyển xéo
Bản mỏng bỉ mẻ ở hai bờ, thành
bản mỏng tiếp xúc dung môi
Hở bình sắc ký
Vết hình móng ngựa
Vết chấm hình tròn quá lớn
Các vết lân cận trùng vào nhau
Chấm các vết quá gần
Vết hình ngọn lửa nhiều đầu
Chấm vết không trùng nhau
Vết loang
Hóa phân tích 2
Vết khuyếch tán do bay hơi vì để
lâu hoặc nhúng thuốc thủ quá lâu
Trần Trung Trực
Khắc phục
Loại tạp kỹ hơn trƣớc khi
tiến hành TLC
Thăm dó lại hệ
Chọn DM chiết mẫu
chuyên biệt hơn
Thay bản mỏng khác
Thay bình sắc ký khác
Chấm nhỏ hơn với nồng độ
cao hơn hoặc chấm vạch
Chấm khoảng cách vết
theo đúng qui định
Chấm kỹ lại trên bản mỏng
khác
Vẽ, chụp hình ngay sau khi
hiện màu xong
19
VII- CÁC THÔNG SỐ SẮC KÝ ĐẶC TRƯNG
1-
Hệ số lưu giữ Rf ( Retardation factor)
a. Công thức
Là đại lượng đặc trưng cho mức độ
tách.
Rf = dR/ dM = v/ V0 => 0 < Rf < 1
dR : khỏang di chuyển được của chất cần
tách
dM : khoảng di chuyển được của dung môi.
v : vận tốc di chuyển của chất cần tách.
V0 : vận tốc di chuyển của dung môi.
Rf=1: chất tan di chuyển cùng vận tốc
dung môi.
Rf=0 chất tan không di chuyển, nằm tại
điểm xuất phát.
OX
OX
R( X )
OF
Rf ( A) OA OA
OF
Rf (X )
b. Các yếu tố ảnh hưởng của Rf
Chất lƣợng và hoạt tính của chất hấp phụ
Chiều dày của lớp mỏng, quảng đƣờng chạy sắc ký, lƣợng chất chấm
Vị trí và số lƣợng chất cần tách trên bản mỏng
Thành phần và độ tinh khiết của pha động
Phƣơng pháp khai triển sắc ký
Độ bão hòa của dung môi trong bình sắc ký ( “hiện tƣợng bờ”, hình B)
Ảnh hƣởng của các cấu tử khác có trong thành phần hỗn hợp cần tách
Độ ẩm, nhiệt độ, và pH, ...
Hóa phân tích 2
Trần Trung Trực
20
2-
Độ phân giải Rs ( Resolution factor)
Rs đặc trưng cho việc tách một chất hơn Rf.
Trong SKLM, nếu giá trị Rs > 1.0: các chất phân tích tách ra khỏi nhau
Để cải thiện Rs, thay đổi lực rửa giải của dung môi để tối ưu hóa các giá trị Rf
Biến đổi thành phần của hệ dung môi để mà các thành phần ái lực (hòa hợp) với pha
động vừa đủ.
Thay đổi 0, tất cả các chất bị ảnh hưởng tương tự.
Việc thay đổi bản chất hóa học của hệ thống dung môi nhƣ thay đổi dung môi có thể liên
kết hydro bằng dung môi không thể cho liên kết hydro với chất phân tích thƣờng có hiệu quả
nhất.
Cải thiện Rs bằng việc giảm đƣờng kính của các vết chất phân tích chấm vết nhỏ hơn và
với nồng độ loãng hơn.
Hai chất giống nhau đƣợc chấm nhƣ nhau và đƣợc triển khai torng cùng điều kiện sắc ký
phải có Rf và Rs bằng nhau.
3
Hệ số dung lượng
t R t M d M d R 1 R f
k'
tM
dR
Rf
Quãng đường di chuyển của chất trong mẫu là dR và của dung
môi là dM.
tM và tR là thời gian tương ứng để pha động và chất tan di
chuyển được một quãng đường là dR.
Thời gian chất tan lưu giữ trong pha động bằng quãng đường dR
chia cho tốc độ thẳng của pha động u: tM = dR/u.
4-
Chiều cao đĩa lý thuyết
𝐍=
Hóa phân tích 2
𝐝𝐑 𝟐
𝐖
Trần Trung Trực
21
VIIICÁC KỸ THUẬT TRIỂN KHAI SKLM
A. KỸ THUẬT SẮC KÝ MỘT CHIỀU
Dùng dung môi chạy cùng chiều từ đầu dƣới lên đầu trên bản mỏng.
B. KỸ THUẬT SẮC KÝ HAI CHIỀU
Trong trƣờng hợp mẫu phân tích có nhiều chất nếu sự tách kỹ thuật sắc ký một chiều
không đủ độ tin cậy thì tiến hành thêm kỹ thuật sắc ký hai chiều để kết quả tách đƣợc rõ ràng hơn.
Dùng loại kình 20x20cm. Chấm chất phân tích ở góc kính, cho vào bình sắc ký chạy hệ
dung môi I, quay một góc 90oC, cho vào bình sắc ký chạy hệ dung môi thứ II.
C. KỸ THUẬT SRS (SEPARTION-REACTION-SEPARATION)
Sau lần triển khai I, dùng tác nhân vật lý X, UV, , … tác động các chất đã tách đƣợc trên
phiến kính rồi triển khai chiều thứ II hay chạy lần II.
D. KỸ THUẬT SẮC KÝ CHẾ HÓA (PREPARATIVE CHROMATOGRAPHY)
Tách các chất với lƣợng nhỏ trong trƣờng hợp không thể tách bằng các phƣơng pháp khác.
Dùng kỹ thuật sắc ký 1 chiếu trên bản 20x20cm, bề dày chất hấp phụ 0.75-1mm.
Sau khi triển khai sắc ký, phát hiện vết tách bằng cách soi UV hay phun thuốc thử phát
hiện 2 vết chấm ngoài cùng (che toàn bộ các vết bên trong lại).
Đánh dấu vùng phát hiện, cạo riêng từng vùng.
Phản hấp phụ: dùng dung môi thích hợp lấy riêng từng chất ra khỏi chất hấp phụ.
Hóa phân tích 2
Trần Trung Trực
22
IX- ỨNG DỤNG TLC TRONG PHÂN TÍCH DƯỢC
A. ĐỊNH TÍNH VÀ THỬ TINH KHIẾT
1
Nguyên tắc
Dựa vào Rf
Sắc ký so sánh chất thử X với chất đối chiếu A trên cùng một sắc đồ
Điều kiện X là A: Rf(X) = Rf(A) với các hệ dung môi khác nhau
Chất thử đƣợc coi là tinh khiết khi trên sắc ký đồ không có vết lạ.
2-
Các lưu ý
SKLM cho khả năng tách và định tính từng chất riêng biệt có chứa trong hỗn hợp.
Trong việc các thành phần có trong hỗn hợp thuốc phải chọn dung môi thích hợp để:
tách các chất có hoạt chất sinh học khỏi tá dược.
Sử dụng dung môi hoặc hỗn hợp dung môi trung tính hay hỗn hợp dung môi có độ sôi thấp để tránh
làm biến đổi các chất cần tách sắc ký trong quá trình chiết và chấm lên bản mỏng.
tá dược chiết không gây cản trở cho việc tách sắc ký.
Vì hỗn hợp các chất thuốc đã biết trước nên cần chấm một lƣợng sao cho khi triển khai sắc
ký có thể xác định đƣợc rõ ràng đối với những chất khó tách nhất.
Nếu tỉ lệ số lƣợng các chất <1:10 thì nên chấm vài mẫu thử với những nồng độ khác nhau.
Thể tích dung môi để hóa tan hợp chất có hoạt tính sinh học phải là 0.002-0.01ml.
B. BÁN ĐỊNH LƯỢNG – ĐỊNH LƯỢNG
Spic hay cường độ màu các vết xuất hiện trên bản mỏng (Bản mỏng điều chế, hiệu năng cao) nếu có mẫu
chuẩn có thể bán định lƣợng một chất hay một nhóm chất có trong mẫu thử tự động hóa bởi thiết bị chuyên
dùng.
Tách chiết chất phân tích trong vết sắc ký bằng dung môi thích hợp làm sạch dịch chiết định lƣợng
bằng kỹ thuật thích hợp (phổ hấp phụ, huỳnh quang, cực phổ, …): ít dùng, tốn thời gian
Định lượng trực tiếp trên bản mỏng: đo diện tích hay cường độ màu vết sắc ký
Dùng máy đo mật độ quang (Densitometer): chiếu chùm tia vào vết sắc ký và đo cường độ hấp thụ
hoặc huỳnh quang
Xử lý ảnh với camera kỹ thuật số độ phân giải cao:
+ quét bản mỏng với hệ thống phân tích thu nhận hình ảnh của vết sắc ký.
+ Xử lý dữ liệu ảnh bằng máy tính.
SKLM hiệu năng cao
Tăng độ phân giải và độ nhạy:
Sử dụng bản mỏng tráng sẵn có bề dày 0,1mm
+ Vết sắc ký nhỏ hơn
+ Thời gian sắc ký ngắn hơn
Pha tĩnh silica và pha liên kết siloxan 5m
+ Lượng dung môi dùng ít hơn
Tăng độ tin cậy của kết quả phân tích
Sai số của phương pháp: 5 – 10% chủ yếu
do đưa mẫu lên bản mỏng
Hóa phân tích 2
Trần Trung Trực
23
C. THĂM DÒ DUNG MÔI CHO CC
Hóa phân tích 2
Trần Trung Trực
24
X-
LƯU Ý TRONG THỰC NGHIỆM
Chọn bản mỏng có độ dày đồng đều.
Các bản mỏng sau khi đƣợc hoạt hóa cần đƣợc bảo quản trong bình hút ẩm có silicagel, calci clorid để
tránh hơi ẩm không khí làm thay đổi khả năng hấp phụ.
Chọn dung môi tinh khiết và có độ lặp lại tốt; mỗi hệ dung môi chỉ nên triển khai 3-4 lần.
Hệ dung môi chứa các chất dễ bay hơi (ether, ammoniac) phải pha lại dung môi khác để tránh dung môi bị
thay đổi làm kết quả không lặp lại.
Khi các vết tách không rõ, kéo vệt nên pha loãng mẫu thử hay chấm dạng vạch.
XI- ĐÁNH GIÁ SKLM
1-
Ưu điểm
Phương pháp đơn giản:
thử tinh khiết,
xác định giới hạn tạp chất,
phát hiện các chất lạ,
định tính,
bán định lượng và định lượng.
Sử dụng phổ biến để nghiên cứu, sàng lọc.
Kỹ thuật và thiết bị đơn giản.
Sử dụng linh hoạt: dễ thay đổi chất hấp phụ, dung môi khai triển, thuốc thử phát hiện, kể
cả các loại thuốc thử ăn mòn mà sắc ký giấy không dùng đƣợc.
Thời gian tiến hành nhanh (15 - 30 phút, tối đa vài giờ) và độ nhạy cao hơn sắc ký giấy
Là một phƣơng pháp vi phân tích.
Có thể dùng để tìm các điều kiện tối ưu cho sự tách bằng sắc ký lỏng trên cột
Phạm vi ứng dụng rộng rãi: kiểm tra hiệu quả chiết tách của các phƣơng pháp khác nhƣ
sắc ký cột, chiết xuất, chƣng cất, tái kết tinh,…
Phát hiện tất cả các chất kể cả các chất không di chuyển theo pha động
Thực hiện tách dễ dàng các mẫu có nhiều thành phần.
Có thể thực hiện sắc ký đồng thời >=10 mẫu thử, so sánh trực tiếp mẫu thử với mẫu chuẩn.
Hóa phân tích 2
Trần Trung Trực
25
