ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN – ĐHQGHN
K57 - KHMT

Đề tài

QUÁ TRÌNH ANAMMOX
VÀ ỨNG DỤNG
Nhóm thực hiện:
1. Trần Mai Liên
2. Lê Thị Thùy Linh
3. Nguyễn Hồng Nhung
4. Trần Anh Thư


Các vấn đề cần tìm hiểu
I. Quá trình oxy hóa kỵ khí ammonium (anammox)
1. Sự phát hiện phản ứng anammox
2. Hóa sinh học của anammox
3. Các yếu tố kiểm soát quá trình anammox
4. Định danh và phân loại vi khuẩn anammox
5. Sinh học phân tử của vi khuẩn anammox

II. Các ứng dụng của quá trình anammox


I.QUÁ TRÌNH OXY HÓA KỴ KHÍ AMMONIUM (ANAMMOX)

I.1. Sự phát hiện phản ứng Anammox
Năm 1995, một phản ứng chuyển hóa Nitơ mới chưa từng được biết
đến trước đó, cả về lí thuyết lẫn thực nghiệm đã được phát hiện. Đó là
phản ứng oxy hóa kỵ khí Ammonium (Anaerobi Ammonia Oxidation, viết

tắt là Anammox) trong đó ammonium được oxy hóa bởi nitrit trong điều
kiện kỵ khí, không cần chất hữu cơ, để tạo thành nitơ phân tử.

Trên cơ sở tính toán nhiệt động học, Broda đã dự báo sự tồn tại của
các vi khuẩn tự dưỡng hóa năng có khả năng oxy hóa ammonium bởi
nitrat, nitrit và thậm chí về mặt năng lượng còn dễ xảy ra hơn sự oxy
hóa bởi oxy phân tử
NH4+ + NO2-  N2 + 2H2O
5NH4+ + 3NO3-  4N2 + 9H2O + 2H+
NH4+ + 1.5O2  NO2- + 2H+ + H2O

G0= -357kJ/mol
G0= -297kJ/mol
G0= -275kJ/mol

(1)
(2)
(3)


Trên cơ sở phát hiện vi khuẩn và phản ứng Anammox, chu trình
chuyển hóa Nitơ tự nhiên có trong sách giáo khoa từ lâu đã được
bổ sung một mắt xích mới.

Chu trình nitơ mới có thêm mắt xích Anammox


Cơ chế sinh hóa:
•


Cơ chế sinh hóa của anammox được đề nghị như hình dưới đây
NR: enzyme khử nitrit (sản phẩm
giả thiết là NH2OH);
HH: hydrazine hydrolase, enzyme
xúc tác tạo hydrazine (N2H4) từ
amoni và hydroxylamine (NH2OH);
HZO: enzyme oxy hóa hydrazine;
Cytoplasm: tế bào chất

Cơ chế sinh hóa quá trình Anammox

Anammoxosome: một thể nằm trong
tế bào chất, bao bọc bởi màng cấu
tạo từ lipid ladderane

Quá trình đi qua sản phẩm trung gian là N2H4. HZO sẽ xúc tác cho sự oxy hóa
N2H4 thành nitơ phân tử (G0= -288kJ/mol). Các điện tử từ quá trình oxy hóa này
(4e-) sẽ được vận chuyển đến cho sự khử nitrit thành NH2OH với một enzyme tạm
gọi là NR (G0= -22.5kJ/mol). NH2OH sẽ tạo ra phản ứng ngưng tụ với ammonium
tạo ra hydrazine mới (xúc tác bởi enzyme HH) (G0= -46kJ/mol).
Chu trình xúc tác cứ thế sẽ được lặp lại.


Sơ đồ phân khoang tế bào anammox
Cell wall: Thành tế bào
Intracytoplasm: Màng trong tế bào chất
Cytoplasmic membrane: Màng tế bào chất
Nucleoid: Thể nhân



I.2. Hóa sinh học của Anammox:

 Phương trình phản ứng:
•

Phản ứng Anammox là sự oxy hóa amonium bởi nitrit, phản ứng hóa học
đơn giản với tỷ lệ mol NH4+ : NO2- = 1:1 như ở phương trình (1).
Trên cơ sở cân bằng khối lượng từ thí nghiệm nuôi cấy làm giàu với kỹ
thuật mẻ liên tục (SBR), có tính đến sự tăng trưởng khối, phản ứng
Anammox được xác định với các hệ số tỉ lượng như sau:
NH4+ + NO2-

Anammox

N2 + 2H2O

Cụ thể là:

NH4+ + 1.32 NO2- + 0.066 HCO3- + 0.13 H+

1.02 N2 + 0.26 NO3-

+ 0.066 CH2O0.5N0.15 + 2.03 H2O

Trong đó sự tạo thành lượng nhỏ nitrat từ nitrit được giả thiết là để sinh ra các
đương lượng khử khi đồng hóa CO2.


Nhiệt độ
Các chất

khoáng và
dinh dưỡng

pH
Các yếu tố kiểm
soát quá trình
Anammox
Ái lực giữa
ammonium
và nitrate

Nồng độ
Oxy
Nồng độ
nitrite


Anammox hoạt động ở điều kiện nhiệt độ từ
20 –
43oC (tối ưu ở 40oC); pH từ 6.7 – 8.3 (tối ưu ở pH =
8)
Ở điều kiện tối ưu, tốc độ tiêu thụ cơ chất riêng cực đại
là 55 µmol NH4/g protein/phút (59.4 mgNH4/g
protein/h)
Ái lực giữa ammonium lên tới 1.4 g/l và nitrate khoảng
6.2 g/l cũng chưa làm ức chế quá trình anammox.


• Nồng độ nitrite cao hơn 0.92 g/l thì quá trình bị ức chế ; ở
nồng độ nitrite cao hơn 0.23 g/l trong thời gian dài

(khoảng 12 h) thì hoạt tính anammox biến mất. Nhưng có
thể hồi phục quá trình bằng cách thêm một lượng nhỏ bất
kỳ lượng trung gian nào trong 2 loại hydroxylamin hoặc
hydrazine.
• Hoạt tính anammox bị ức chế hoàn toàn ở nồng độ oxy
trên 0.5% bão hoà không khí.
• Các chất khoáng và chất dinh dưỡng cũng làm tăng hoạt
tính của anammox. Các chất đó là KHCO3, KH2PO4,
FeSO4, EDTA, Na2CO3. ngoài ra còn bổ sung thêm một
lượng muối canxi và magine với nồng độ 120 – 180 mg/l.


I.4. Định danh và phân loại vi khuẩn anammox

• Đến nay đã có 3 chi của vi khuẩn anammox được phát hiện,
gồm Brocadia, Kuenenia và Scalindua. Về mặt phân loại, các
vi khuẩn anammox là những thành viên mới tạo thành phân
nhánh sâu của ngành Planctomycetes, bộ Planctoycetales.
• Ở trường hợp phát hiện đầu tiên, trong bùn kỵ khí phát hiện
thấy vi khuẩn thuộc vào phân nhánh Planctomycete sâu và vi
khuẩn đã được đặt tên là Candidatus Brocadia anammoxidans
• Năm 2000, các vi khuẩn anammox được phát hiện ở hệ thống
xử lý RBC ở Stuttgart (Đức) được xác định là mới (độ tương
tự dưới 90% so với B. Anammoxidans) và được đặt tên là
Candidatus Kuenenia stuttgartiensis.


Lần đầu tiên, vi khuẩn anammox được phát hiện trong hệ sinh
thái tự nhiên là vùng nước nghèo oxy ở Biển Đen. Kết quả phân
tích cho thấy vi khuẩn phát hiện được là một chi khác, và đã được

đặt tên là Candidatus Scalindua sorokinii.
Các loài anammox khác đã được phát hiện tại một nhà máy xử lý
nước thải ở Pitsea ( Anh). Kết quả mô tả và phân tích cho thấy
chúng thuộc cùng chi Scalindua, và đã được đặt tên là Candidatus
“Scalindua brodae”, Candidatus “Scalindua wagneri”.
Một vấn đề tồn tại đang được tiếp tục nghiên cứu là mặc dù giữa
3 chi anammox đã biết có chung tổ tiên, nhưng hơi xa nhau về
mặt tiến hóa ( độ tương tự nhỏ hơn 85% dựa trên 16S rDNA);
trong khi chúng có những tương đồng về mặt tuýp (phenotype).


I.5 Sinh học phân tử của vi khuẩn
Anammox
Để nghiên cứu về mặt sinh học phân tử của vi
khuẩn anammox, người ta dùng phương pháp xác
định cấu trúc DNA và RNA

Thí nghiệm được tiến hành dựa trên các mẫu lấy ra
từ một hệ thống SBR. Nhận thấy hơn 70% sinh khối
trong hệ thống được cấu tạo bởi một loại vi khuẩn
có thể dễ dàng nhận ra về mặt hình dáng.


Thí nghiệm
Xác định cấu trúc phân tử của vi khuẩn
bằng phương pháp vật lý, theo phương
pháp này vi khuẩn được phân tích từ hỗn
hợp bằng cách ly tâm mẫu.

Kết quả cho thấy trình tự DNA của mẫu đem đi

xác định rất giống với trình tự cấu trúc di truyền
của Planctomycete. Loại vi khuẩn mới được tìm
thấy có khả năng oxy hóa được ammonium trong
điều kiện yếm khí này được đặt tên là
Candidatus Brocadia Anammoxidans.


Nhóm Planctomycete cho đến nay bao gồm 4 bộ với 7 loài đã
được ghi nhận.
Rất nhiều trình tự DNA được ghi nhận, thực tế đã chỉ ra rằng
có thể có những loại khác thuộc về nhóm Planctomycete này,
một trong những loại đó là vi khuẩn anammox.

Trên thực tế cũng một loại vi khuẩn anammox có tên là
K.struttgartiensis vừa được tìm thấy lại được cho vào một nhóm
riêng biệt, vì theo cấu trúc DNA của nó có sự giống nhau vể mặt
di truyền ít hơn 90% so với Brocadia Anammoxidans đã nói ở
trên, điều này chứng tỏ sự khác nhau ở mức độ bộ giữa 2 loại vi
khuẩn này.


II.Các ứng dụng của quá trình anammox
Phản ứng Anammox xảy ra giữa amoni và nitrite với tỷ lệ mol
là 1:1,32. Như vậy, để áp dụng Anammox vào xử lý Nitơ về
nguyên tắc có 2 cách

Bổ sung nitrite vào

Chuyển hóa nửa amoni
ban đầu thành nitrite

rồi chính nitrite sinh ra
phản ứng với một nửa
amoni còn lại

Hướng thứ hai chính là nguyên lý cho các ứng
dụng thực tế của Anammox. Như vậy, các công
nghệ xử lý Nitơ mới sẽ bao gồm nitrite hóa bán
phần theo sau là Anammox


SHARON và quá trình kết hợp
SHARON-Anammox

SHARON là hệ thống được phát triển để xử lý Nitơ trong
nước loại ra khi ép bùn, kết hợp nitrite hóa và khử nitrite.
Dựa vào đặc điểm là ở nhiệt độ cao (trên 300oC), các vi
khuẩn oxy hóa amoni (AOB) sẽ sinh trưởng nhanh hơn các vi
khuẩn oxy hóa nitrite (NOB), nguyên tắc của hệ thống này là
lựa chọn thời gian thủy lực (HRT) đủ ngắn và vận hành ở
nhiệt độ cao để cho NOB bị rửa trôi khỏi bể phản ứng và quá
trình oxy hóa amoni chỉ dừng ở nitrite.


Metanol được dùng làm nguồn carbon cho khử nitrite.
So sánh quá trình SHARON với quá trình khử nitơ thông
thường thông qua quá trình nitrate hóa và khử nitrate
Nitrate hóa:
NH4+ + 2O2 = NO3- + H2O + 2H+
NH4+ + 1.5O2 = NO2- + H2O + 2H+
Tiết kiệm 25% Oxy

Denitrate hóa :
6NO3- + 5CH3OH + 3 CO2 = 3N2 + 8HCO3- + 6H2
6NO2- + 3CH3OH + 3 CO2 = 3N2 + 6HCO3- + 3H2
Tiết kiệm 40% Methanol


Sau đó,SHARON đã được sử dụng chỉ với
chức năng nitrite hóa để kết hợp với
Anammox thành một quá trình xử lý hai giai
đoạn.
So với hệ thống Nitrate hóa-khử nitrate
truyền thống, quá trình SHARON-Anammox
tiết kiệm 50% nhu cầu oxy và 100% nhu cầu
bổ sung nguồn carbon hữu cơ.


CANON –Quá trình loại nitơ hoàn toàn tự dưỡng qua nitrite

Bước 1:

Bể phản ứng kiểu SBR được nạp bùn Anammox và vận hành ở điều
kiện kỵ khí với các nước thải tổng hợp chứa cả amoni và nitrite

Bước 2:

Oxy được cung cấp ở nồng độ giới hạn để phát triển các vi khuẩn
nitrite hóa với nước thải tổng hợp chỉ chứa amoni và không chứa nitrite

Kết quả là khoảng 85% Nitơ amoni được chuyển hóa thành khí Nitơ và
15% còn lại thành Nitrate.



Phân tích mẫu bùn CANON bằng kỹ thuật FISH phát hiện sự có
mặt của các vi khuẩn AOB thuộc chi Nitrosomonas và vi khuẩn
oxy hóa amoni kỵ khí. Từ đó, cơ chế vận hành của CANON
được giả thiết là sự kết hợp phản ứng nitrite hóa bán phần và
phản ứng Anammox trong cùng một bể phản ứng

CANON với bể phản ứng có lớp bùn nâng bởi dòng khí có
thể vận hành với tải trọng Nitơ lên đến 3,7 kg-N/m3/ngày,
với hiệu suất loại Nitơ là khoảng 40%. Nghiên cứu chi tiết
cho thấy rằng bùn CANON đã tạo thành các hạt tập hợp và
các vi khuẩn Anammox thì phân bố bên trong các hạt này.
Các hạt tập hợp có kích thước khác nhau có thành phần
khuẩn AOB và anammox khác nhau.


oland
Oland
Oland cũng là một hệ xử lý Nitơ hoàn toàn tự dưỡng, có tên đầy đủ là
hệ thống nitrate hóa-khử nitrate tự dưỡng trong điều kiện giới hạn
oxy.
OLAND được phát triển trên hệ thống SBR, theo con đường gần như
ngược lại với CANON. Bùn nitrate hóa hoạt tính được cấy vào bể SBR
vận hành ở điều kiện giới hạn oxy và nạp nước thải tổng hợp chứa 1000
mg NH+-N/l ở các tải trọng khác nhau.
Sau một thời gian, vi khuẩn NOB được phát hiện giảm dần (cỡ 107 lần),
sự mất Nitơ dưới dạng khí N2 xuất hiện và tăng dần (40% với tải trọng
0,13 kg-N/m3/ngày). (Cơ chế loại Nitơ được giả thiết do sự oxy hóa
NH4+ thành N2 bởi NO2- với một enzym tương tự Hydroylamine

oxidoreductase (HAO) của vi khuẩn nitrate hóa thông thường.)


SNAP:
SNAP
Cũng là quá trình xử lý Nitơ trên cơ sở kết hợp nitrite hóa
bán phần và Anammox trong một bể phản ứng, SNAP sử
dụng vật liệu sợi tổng hợp acrylic làm vật liệu bám cho vi
khuẩn AOB và Anammox.
Bùn hoạt tính được dùng để cấy ban đầu, sau thời gian
dài vận hành qua các giai đoạn nitrite hóa thì vi khuẩn
Anammox sinh trưởng và kết hợp với vi khuẩn AOB cùng
bám trên vật liệu chuyển hóa phần lớn amoni ban đầu
thành khí Nitơ.


Với vật liệu bám rất nhẹ, bề mặt
riêng lớn (146.5 m2/m3) và khả
năng bám cao (0.5 – 0.6 g-SS/gvật liệu), SNAP có ưu thế trong
việc đưa vào xây dựng và áp dụng
thực tế. Kết quả phân tích 16s
rDNA cho thấy bùn SNAP chứa
các vi khuẩn AOB có mức độ
tương tự cao với Nitrosomonas
europaea, vi khuẩn anammox rất
gần với dòng KU-2 và vi khuẩn
NOB tương tự Nitrospira sp.

Kết quả nghiên cứu trong
phòng thí nghiệm với bể

phản ứng 5 lít và trên nước
thải tổng hợp cho thấy SNAP
có thể đạt hiệu suất loại bỏ
Nitơ 80% với tải trọng đến 1
kg-N/m3/ngày.