w — 8 M
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
• • • •
TRẦN KIỂU DUYÊN
XÂY DỤNG ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
• • • •
BẰNG HPLC NHẰM ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG
VIÊN KETOPROFEN 200mg TÁC DỤNG KÉO DÀI
KHOÁ LUẬN TÓT NGHIỆP Dược sĩ KHOẢ1998 - 2003
tùêễt h ư íutíi íLỖlìv \ PGS.TS TRẦN TỬ AN
TH.S NGUYỄN THỊ KIÊU ANH
Q te ith ự e h iụ i : Bộ MÔN PHÂN TÍCH
Cĩliài g ian thựe hiên. : 3-5/2003
H À NỘI - 2003
LỜI CẢM ƠN
Tôi xỉn chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới
THS . NGUYỄN THỊ KlỀư ANH
PGS . TS TRẦN TỬ AN
đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành khoá luận này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô trong bộ
môn hoá phân tích đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi
trong quá trình thực hiện khoá luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn
Hà nội, ngày 20/5/2003.
Sinh Viên
TRẦN KIỀU DUYÊN
1
3
3
3

5
‘T
9
9
9
10
12
14
14
14
14
15
16
17
18
18
18
18
24
25
25
25
PHỤ LỤC
Đặt vấn đề
TỔNG QUAN
Đại cương
Vài nét về Ketoprofen
Các phương pháp định lượng
Một số khái niệm về sinh khả dụng ự
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao l

Lịch sử
Phương pháp sắc ký
Đặc điểm của phương pháp
Sơ lược vè chương trình tối ưu Modde 5.0
ĐÔÌ TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u l
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Thiết bị
Phương pháp nghiên cứu
Khảo sát lựa chọn dung môi ckiết
Xăy dựng phương pháp định lượng trong huyết tương
Phương phấp xử lý kết quả
KẾT QUẢ THựC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN
V
Chọn dung môi chiết
Khảo sát điều kịên chạy sắc ký
Chọn pha động
Chọn cột
Tìm chuẩn nội
Bước sóng
Thẩm định phương pháp
3.3.1 Xây dựng đường chuẩn trong huyết tương 25
3.3.2 Khảo sát tính chính xác 26
3.3.3 Khảo sát tính đúng 27
3.4 Sơ bộ đánh giá sinh khả dụng của viên ketoprofen 200mg 29
TDKD
Phần 4 k ế t l u ậ n v à đ ề x u ấ t 31
CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT.
AUC :
Diện tích dưới đường cong.
ACN :

Acetonitril.
AcOH :
Acid Acetic
IS :
Chất chuẩn nôi.
•
KET :
Ketoprofen.
R :
Tỷ số diện tích píc.
T
Amax
Thời điểm đạt nồng độ cực đại.
c
^max
Nồng độ cực đại trong huyết tương.
TE :
Triethinlamin.
ĐẶT VẤN ĐỂ
Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, song song với nghiên cứu tìm ra
thuốc mói thì việc nghiên cứu bào chế dạng thuốc sao cho đạt sinh khả dụng
cao, dùng tiện lợi đơn giản và đưa ra cách hướng dẫn sử dụng thuốc đạt hiệu
quả và an toàn trong điều trị là vấn đề quan trọng của ngành Dược .
Do đó việc đánh giá sinh khả dụrig tương đương sinh học , dược động
học của thuốc là một đòi hỏi hết sức cấp thiết .Để đạt được điều này,thì vấn đề
phân tích thuốc trong dịch sinh học , đặc biệt là trong huyết tương là một khâu
quyết định.
Các phương pháp phân tích thường dùng để xác định nồng độ thuốc
trong huyết tương là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký khí (GC), sắc
ký khí gắn vói khối phổ(GC- MS) phóng xạ miễn dịch, điện đi mao quản

Trong đó, phương pháp HPLC được sử dụng nhiều do nó có tính ưu viêt nổi
trội như độ chính xác đảm bảo, tách chất trong mẫu rất tố t, vừa có khả năng
tách vừa định tính, định lượng , có thể ứng dụng với nhiều loại chất khác nhau
Ketoprofen là thuốc giảm đau,chống viêm có nhu cầu lớn ở nước ta .
Nhưng nhược điểm của nhóm thuốc này là hay gây kích ứng dạ dày và phải
dùng nhiều lần trong ngày [1], [6]. Để hạn chế tác dụng phụ, tăng khả năng
điều trị và tiện lọi cho người sử dụng, người ta đã và đang nghiên cứu, sản
xuất các dạng thuốc tác dụng kéo dài (TDKD) của nó. Chưa có sản phẩm
thuốc TDKD nào do các cơ sở trong nước sản xuất. Dạng bào chế này mói
đang ở giai đoạn nghiên cứu và thử nghiệm. Đây là một trong những hướng
nghiên cứu quan trọng tại Trường Đại học Dược Hà Nội. Trong Dược điển
Việt Nam in năm 2002 vẫn chưa có chuyên luận thuốc tác dụng kéo dài
1
[2].Để đóng góp một phần nhỏ vào sự nghiệp phát triển chung của ngành
Dược tôi đã chọn đề tài khoá luận tốt nghiệp là:
“ Xây dựng ứng dụng phương pháp định lượng bằng HPLC
nhằm đánh giá sinh khả dụng của vỉên Ketoprofen 200 mg
TDKD ”
❖ Đề tài nhằm hai muc tiêu sau :
> Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Ketoprofen
trong huyết tương bằng HPLC.
> Bước đầu đánh giá sinh khả dụng invivo của viên Ketoprofen 200
mg TDKD.
2
PHẦN 1
TỔNG QUAN
c h 3
o
CH


COOH
1. ĐẠI CƯƠNG
1.1. Vài nét về Ketoprofen
. 1.1.1. Tính chất [8], [9],[10]
- Công thức phân tử
- Phân tử lượng: 254,29
- Tên khoa học: acid 2 (- benzoyl phenyl) propionic
- Tính chất vật lý:
Bột kết tinh trắng, không mùi. Thực tế không tan trong nước ở 20° c tan hoàn
toàn trong kiềm mạnh, ethanol 96%, aceton, cloroform và ether. pKa = 5,94 trong
hỗn hợp methanol - nước (3:1). Hệ số phân bố trong n- octanol - nước là 0,97 (pH =
7,4). Cực đại hấp thụ trong methanol ở bước sóng 255 nm. Nhiệt độ nóng chảy
khoảng 95°c.
1.1.2. Tác dụng dược lý và dược động học [3],[6], [10].
- Tác dụng: ketoprofen là thuốc chống viêm phi steroid có tác dụng hạ
nhiệt, giảm đau, chống viêm; do co khả năng, ức chế quá trình tổng hợp
prostaglandin và leukotriene; ức chế sự kết dính tiểu cầu.
- Dược động học:[7][17].
+ Hấp thu: dạng viên qui ước và viên TDKD khác nhau ở đặc tính giải phóng
hoạt chất. Viên qui ước ketoprofen giải phóng hoạt chất nhanh ở dạ dày, còn viên
TDKD điều khiển sự giải phóng hoạt chất ở pH cao hơn (trong ruột).
Dạng viên qui ước, ketoprofen được hấp thu tốt và nhanh, thòi gian đạt nồng
độ cực đại trong máu là từ 0,5 đến 2 giờ. Sau khi uống viên ketoprofen 200mg
TDKD thời gian đạt nồng độ cực đại trong máu khoảng 7 giờ, nồng độ cực đại trung
bình khoảng 3 - 4 mg/1; nồng độ duy trì ở ở mức khá cao sau khi uống 24 giờ.
Khoảng điều trị khoảng 0,4 - 6 mg/1
3
- Chuyển hoá: chủ yếu, liên kết vói acid glucuronic tạo thành acyl - glucuronic
không ổn định. Một nửa chất chuyển hoá có thể chuyển lại thành dạng hợp chất ban
đầu do đó chuyển hoá cung cấp dạng chất có hiệu lực.

- Thải trừ. Sau khi uống viên ketoprofen, 50 - 90% được thải trừ qua nước tiểu, 1 -
8 % thải trừ qua phân. 80% thải trừ qua thận ở dạng liên kết glucuronic; thời gian
bán thải của dạng viên qui ước là 2 - 4 giờ, dạng viên TDKD là từ 4 -7 giờ. Đối vói
người lớn tuổi, hấp thu không thay đổi, thời gian bán thải kéo dài và giảm sự thanh
thải toàn phần. Ở ngưòi suy gan và thận, giảm độ thanh thải huyết tương và tăng
thời gian bán thải.
1.1.3 Chỉ định [3].[6],:
- Thấp khớp mãn tính, đặc biệt viêm đa khớp dạng thấp
- Dạng viên nang còn dùng để giảm đau.
1.14. Chống chỉ định :[3]. [6],
- Dị ứng vói ketoprofen, aspirin và các thuốc chống viêm phi steroid cùng loại.
- Loét dạ dày - tá tràng tiến triển.
- Suy thận nặng, suy gan tế bào nặng.
- Phụ nữ có thai (3 tháng cuối) và cho con bú.
1.1.5. Tác dụng không mong muô'n[3][6],
- Đường tiêu hoá, khó chịu vùng dạ dày ruột, đau dạ dày, buồn nôn, nôn mửa,
tiêu chảy; nặng thì loét dạ dày, xuất huyết đường tiêu hoá, thủng ruột.
- Nhức đầu, chóng mặt, buồn ngủ.
1.1.6. Liều dùng[3]. [6]
- Viên nang: Viên 75 mg, 1 viên/lần X 3 lần/ngày. Viên 50 mg, 1 viên/lần X 4
lần/ngày. Uống trong bữa ăn.
- Viên TDKD: Viên 200 mg, lviên/ngày. Uống vào bữa ăn.
1.1.7. Dạng bào chế[3][6]:
- Viên nang 25 mg; 50 mg; 75 mg.
- Viên nén 100 mg; 150 mg.
- Viên bao tan ở ruột 50 mg.
- Viên bao TDKD 200mg.
4
- Viên nang TDKD 100 mg; 150 mg; 200mg.
- Thuốc tiêm 100 mg.

- Thuốc mỡ 2,5%.
1.2. Các phương pháp định lượng. [11]. [13].
* Phương pháp định lượng ketoprofen dạng nguyên liệu và dạng bào chế:
- Phương pháp acid - base: [13], [14], [20].
Nguyên tắc : Ketoprofen là một acid yếu, ta có thể định lượng ketopofen trong
bằng phương pháp acid - bazơ phát hiện điểm tương đương bằng phương pháp đo
điện thế hoặc bằng chỉ thị đỏ phenol. Phương pháp này thường áp dụng định lượng
ketoprofen nguyên liệu.
Phương pháp HPLC pha đảo: [11], [12], [13], 15].
Sắc ký HPLC pha đảo có đặc điểm pha tĩnh ít phân cực hơn pha động. Ketoprofen
ít phân cực nên cần chọn pha động phân cực mạnh để rửa giải, pha tĩnh phải có tính
chất gần giống ketopofen. Vì vậy lựa chọn HPLC pha đảo là hợp lý để định tính,
định lượng chất. Áp dụng định lượng ketoprofen trong huyết tương [7], [10], [12],
[14], [15], và xác định tạp chất trong nguyên liệu [9], [11],
- Phương pháp quang phổ: [12], [13]
Trong công thức cấu tạo của Ketoprofen có nhân phenyl, nhiều liên kết đôi nên có
khả năng hấp phụ ánh sáng tử ngoại. Nó có cực đại hấp thụ ở 255 ran trong
Methanol 75%. ứng dụng điều này để định lượng ketoprofen trong chế phẩm bào
chế và đánh giá độ hòa tan của viên [9]
- Phương pháp điện di mao quản và điện di mao quản kết hợp với khối
phổ (CE - MS): Định lượng ketoprofen trong huyết tương, trong nước tiểu và tách
đồng phân của ketoprofen [12], [13].
* Phương pháp HPLC định lượng ketoprofen trong huyết
tương[ll],[15].
Để đánh giá sinh khả dụng viên ketoprofen, chúng ta phải xác định được nồng
độ thuốc trong máu ngưcã sau khi uống thuốc trong một khoảng nồng độ nào đó. Do
5
đó phương pháp được lựa chọn phải vừa có khả năng định tính, định lượng, có độ
nhậy cao, đồng thòi đáp ứng được độ chính xác và tin cậy cho định lượng. Có nhiều
tác giả đã nghiên cứu và đã sử dụng các điều kiện để định lượng ketoprofen trong

huyết tương bằng phương pháp HPLC.
Dung môi chiết và các điều kiện sắc ký định lượng ketoprofen trong huyết tương .
được trình bày ở bảng 1.1.
Bảng 1.1. Các điều kiện định lượng KET trong huyết tương
Tài
liệu
Dung môi
chiết
Pha động
Cột Chuẩn nội
Bước
sóng
(nm)
12
ACN
ACN - amoni
acetat 20 mM pH
7,0 (20:80)
Econosphere CN
150 X 4,6 mm. 10
|j,m
Isobutyl
methylxan
- thin
254
10
Nước
(Siêu ly tâm)
ACN - Acid
acetic 1%

(38 : 62)
C18 jxBondapak
300 X 3,9 mm. 10
|4.m
Isopropyl
phenazon
254
22
Diethyl ether
ACN - Đệm
phosphat 50 mM
pH 7,0 (10 : 90)
C18 ịaBondapak
300 X 3,9 mm. 10
|0.m
Naproxen 263
7
Diethyl ether
ACN - KH2P04
10 mM pH 3,5
(40:60)
C18 Utrasphere
250 X 4,6 mm.
5 |j,m
Calci
fenoprofen
254
15
Ethyl acetat
ACN - Đệm

phosphat pH 3,2
(40: 60)
Spherisorb ODS
250 X 4,6 mm.
5 ỊXIĨ1
Flurbiprof
en
258
20
Diethyl ether ACN -MeOH
-
N^HPO* 10 mM
pH 6,5 (50 : 10 :
135)
Spherisorb ODS
200 X 4,6 mm.
5 |im
Acid 2 (4 -
benzoylph
enyl
butyric)
260
6
r
1.3 Một số khái niệm về sinh khả dụng [7], [17].
Để đánh giá được chính xác chất lượng của thuốc, người ta phải nghiên cứu sự giải
phóng của dược chất ra khỏi dạng thuốc, sự hấp thu dược chất khi vào cơ thể, tức là
nghiên cứu sinh khả dụng của thuốc.
1.3.1. Các khái niệm cơ bản [7], [17].
Sinh khả dung

Sinh khả dụng là mức độ và tốc độ hấp thu của hoạt chất từ dạng bào chế của
nó vào đại tuần hoàn.
- Mức độ hấp thu được xác định bằng diện tích dưói đường cong (Area Under
Curve, AUC) của đường biểu diễn nồng độ dạng hoạt tính trong máu biến đổi theo
thời gian.
AUC thường được tính theo phương pháp hình thang:
Auc = \ ỵ ợ u, -7-)x(c,
^ /=0 £
Trong đó:
C i: là nồng độ dược chất trong huyết tương ở thời điểm Ti.
c t : là nồng độ dược chất trong huyết tương đo được tại thời điểm cuối cùng,
k : là hằng số tốc độ thải trừ.
0,693
-^1/2
T1/2 là thời gian bán thải của thuốc (thòi gian cần thiết để nồng độ thuốc trong
máu giảm 50%) được xác định bằng đồ thị bán logarit của nồng độ dược chất trong
máu của pha thải trừ theo thòi gian.
Thông thường thòi gian lấy mẫu > 10 T1/2tùy theo từng thuốc.
7
Việc theo dõi nồng độ thuốc trong máu rất quan trọng vì giữa nồng độ thuốc
trong máu và hiệu lực điều trị có liên quan chặt chẽ vói nhau. Ta phải biết được
nồng độ thuốc trong máu để đảm bảo thuốc nằm trong khoảng phát huy hiệu lực
điều tri và dưói mức độc để chỉ định liều dùng và tần xuất sử dụng thuốc hợp lý.
+ Tốc độ hấp thu của thuốc được xác định bằng nồng độ cực đại ( Cmax) thuốc
trong máu và thời gian đạt được nồng độ cực đại (Tmax).
Thuốc tác dụng kéo dài thường nằm trong đường tiêu hóa trong thời gian dài,
vì vậy môi trường hấp thu (dịch trong đường tiêu hóa) có ảnh hưởng lớn tới các giá
trị SKD.
1.3.2. Xác định SKD in vivo của thuốc.[7],[17].
Đối tương thử:

- Động vật: Thuốc mói, thuốc đang nghiên cứu thường được thử sơ bộ trên
động vật như chó, khỉ, thỏ, chuột tuỳ theo dạng bào chế trước khi thử trên người.
- Người tình nguyện khoẻ mạnh:
+Tuổi: 18-50. Nếu là nữ phải kiểm tra để đảm bảo họ không mang thai khi
tham gia nghiên cứu.
+ Kiểm tra sức khoẻ: thể trạng, tiền sử bệnh tật, các phép thử lâm sàng (huyết
áp, nhịp tim, )
+ Không được hút thuốc, không uống rượu, không dùng thức ăn và đồ uống
chứa xanthin trước khi thử ít nhất 48 h và đến khi phép thử hoàn tất.
+ Không được chụp X- quang trước khi thử ít nhất 2 tuần và đến khi phép thử
hoàn tất.
Mỏ hình thử thuốc :
- Người thử phải nhịn 10 giờ trước và 4 giờ sau khi dùng thuốc. Uống thuốc
với 240 ml nước.
- Nước có thể được dùng ít nhất là trước và sau khi dùng thuốc 1 giờ.
- Thức ăn được tiêu chuẩn hoá và cho các cá thể thử dùng với lượng như nhau.
- Thòi gian giữa hai lần thử thuốc phải đủ để thuốc được thải trừ hoàn toàn
khỏi cơ thể. Thời gian tối thiểu là 10 lần thời gian bán thải của thuốc .
8
- Nếu là đánh giá tương đương sinh học: Thử theo mô hình chéo ngẫu nhiên
(two treatments, two periods, two sequences crossover).
Lấv mẫu
Mẫu máu được lấy từ mạch máu tại thời điểm 0 và ít nhất là 4 lần ở pha hấp
thu và 6 lần ở pha thải trừ sau khi dùng thuốc. Máu được để lạnh ngay sau khi lấy
mẫu, sau đó ly tâm và để lạnh -30° c tói khi phân tích.
Theo dối các cá thể
Các cá thể được đo huyết áp, đếm nhịp tim llần/ giờ.
Phân tích mẫu máu
Dùng các phương pháp phân tích thích hợp để định lượng hoạt chất trong mẫu
thử. Đường chuẩn dùng để tính kết quả phải được xây dựng theo từng ngày phân

tích.
Các số liêu nghiên cứu
Tính AUC, tmax, c max.
2. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NÃNG CAO
(HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY)
2.1 Lịch sử
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được phát triển mạnh vào năm 60 của thế kỷ
.Ngày nay cùng vói sự phát trển của khoa học kỹ thuật phương pháp này đã đóng
một vai trò quan trọng trong định lượng thuốc với ưu điểm phát hiện được ở nồng
độ rất nhỏ và có khả năng tách tốt, độ lặp lại cao .
2.2 Các phương pháp săc ký
Sắc ký phân bố hiệu năng cao
+ Sắc ký lỏng lỏng
+ Sắc ký liên kết
Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao
Sắc ký trao đổi ion hiệu năng cao
9
sắc ký lỏng - lỏng
Mỗi một loại sắc ký có những ưu điểm khác nhau, vì vậy ứng với mỗi một yêu
cầu của mục đích sử dụng mà ta chọn phương pháp nào cho thích hợp.
Trong lĩnh vực phân tích sinh dược học và kiểm nghiệm thuốc thì phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao được ứng dụng nhiều .
2.3 Đặc điểm của phương pháp.
Trong sắc ký lỏng phân bố pha liên kết, pha tĩnh được gắn hoá học( liên kết)
vói chất mang (silicagel), pha tĩnh là chất nhồi cột là các hạt có kích thước cực nhỏ,
có diện tích tiếp xúc lớn .
*Điều kiện chọn pha tĩnh :
Trơ và bền vững với điều kiện chạy sắc ký , không phản ứng với dung môi
rửa giải hay chất phân tích .
Có khả năng tách chọn lọc vói các chất có trong mẫu thử.

Quá trình cân bằng động học khi tách phải nhanh và có sự lặp lại tốt.
Cấu tạo của pha tĩnh;
Thường dùng hạt thủy tinh nhỏ chất bao phủ bề mặt là silicagel vì có ưu điểm
chịu áp lực tốt, độ trương nở nhỏ , bền vững vói nhiệt độ .
CH3 , CH3
I _ I _ 1 1
— Si—OH + Cl—Si—R

► — Si—o —Si—R + HC1
1 U 1 CH3
Nhóm silanol Dẫn chất Dẫn chất
của silicagel clorosilan siloxan
- Nếu R là một nhóm ít phân cực như octyl (Cg), octadecyl (C18) hay phenyl và dung
môi phân cực như methanol, acetonitril thì có sắc ký pha đảo (sắc ký pha ngược).
- Nếu R là nhóm khá phân cực như alkylamin -(CH2)n- NH2 hay alkyl nitril
-(CH2)n - CN và dung môi là ít phân cực như hexan thì ta có sắc ký pha thuận.
- Cách chọn pha: thường chọn pha tĩnh có tính phân cực giống các chất cần tách
và khác với pha động.
* Điều kiện chọn pha động.
10
Phải hòa tan hoàn toàn chất phân tích
Trơ với pha tĩnh và các điều kiện thực hiện sắc ký
Nếu pha động là hỗn hợp thì các thành phần phải tan hoàn toàn vói nhau.
Độ nhớt nhỏ, tinh khiết ít ảnh hưởng tói độ chính xác, độ nhạy của Dectector
Nhanh đạt được trạng thái cân bằng động học khi chạy sắc ký .
* Môt sô' thône số đăc trưns của HPLC.
- Thòi gian lưu tp (phút) là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký
đến lúc xuất hiện đỉnh của pic. So sánh thòi gian lưu của mẫu thử và mẫu chuẩn làm
trong cùng điều kiện ta sẽ định tính được chất đó.
- Thời gian chết tx£ (phút) là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ (tức là

chất có tốc độ bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phân tử dung môi khi đi
qua cột).
- Thừa số dung lương k’: dùng để mô tả tốc độ di chuyển của một chất.
f t —t
ỵ _ l_R_ _ lR lM
- Thừa số chon loc : Mô tả tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất.
Jr’ t'
K » _ 1 R,B
a =
k' t'
K A R,A
Quy ước B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A nên a >1. Để tách riêng 2 chất thì
col, thường là từ 1,05- 2,0.
- Số đĩa lý thuyết N : Biểu thị hiệu lực cột sắc ký.
N = l6x
hoặc N = 5,54 X
\WB) • \WU2J
Trong đó : WB : chiều rộng pic ở đáy pic
W1/2 : chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh
- Đô phân giải R,: là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc ký.
R s ~
Ír,b *r,a
v . + i * ', )
11
Để tách riêng 2 chất, Rs phải >1,5 (khi hai sắc đồ có độ lớn cùng cỡ).
- Chiều cao pic hay diện tích pic là đại lượng đặc trưng cho định lượng của
chất. Khi so sánh chiều cao pic hay diện tích pic của mẫu thử và chuẩn trong cùng
điều kiện làm ta tính được hàm lượng hoạt chất trong mẫu thử.
* Cách tính kết quả trone phươns pháp HPLC
- Phương pháp chuẩn ngoại (External Standard method):

Nồng độ chất cần định lượng được xác định bằng cách so sánh đáp ứng (diện
tích hoặc chiều cao pic) của dung dịch thử với đáp ứng thu được của dung dịch
chuẩn.
- Phương pháp chuẩn nội ịInternal Standard method):
Hòa tan chất cần định lượng (chuẩn hoặc thử) và chất chuẩn nội với một lượng
bằng nhau. Nồng độ chất thử được xác định bằng cách so sánh tỉ số giữa chiều cao
hay diện tích pic của chất cần định lượng và chuẩn nội của dung dịch thử và dung
dịch chuẩn.
- Phương pháp chuẩn hóa (Normalisation procedure):
Hàm lượng phần trăm chất định lượng được tính bằng cách bằng % diện tích
pic của chất đó chia cho tổng diện tích các pic, trừ pic dung môi, thuốc thử và pic
thấp hơn giới hạn phát hiện.
- Phương pháp đường chuẩn ịCalibration procedure):
Lập mối quan hệ giữa đáp ứng (diện tích hoặc chiều cao pic) y và lượng chất X
trong dãy dung dịch chuẩn. Tính kết quả của chất phân tích dựa trên đồ thị của mối
quan hệ giữa y vào X. Yêu cầu đáp ứng của dung dịch định lượng phải nằm trong
khoảng đáp ứng của dãy dung dịch chuẩn.
Trong phân tích sinh dược học ta hay sử dụng cách tính kết quả dựa theo chất
chuẩn nộivà việc xây dựng đường chuẩn .
2.4 Sơ lược về chương trình tối ưu Modde 5.0 (Mô hình bậc 2)
2.4.1. Lựa chọn các thông sô' và khoảng biến thiên.
Thông số có hai loại:
12
Đầu vào là biến độc lập.
Đầu ra là biến phụ thuộc
Xác định khoảng biến thiên của biến độc lập theo các mức : dưới ,cơ sở, trên. Bố
trí thí nghiệm thêo mô hình toán học bậc hai đầy đủ (tâm trực giao) có số thí
nghiệm :N = 2 n-q+2n + N0
Tiến hành thí nghiệm theo mô hình đã lựa chọn ta xác định được biến phụ thuộc
Phân tích kết quả thu được. Nếu kết quả thu được có ý nghĩa, dựa trên mặt mục

tiêu của biến phụ thuộc,vói sự trợ giúp của chương trình tối ưu Modde5.0 , chương
trình sẽ thực hiện phép tối ưu bằng phương pháp đơn hình, sẽ dự đoán được điều
kiện tối ưu cho biến độc lập và cho kết quả tối ưu của biến phụ thuộc.
Tiến hành thực hiện tối ưu của các biến độc lập, tính kết quả của biến phụ thuộc
so sánh vói dự đoán của chương trình tối ưu từ đó đưa ra được điều kiện hợp lý nhất
cho thí nghiệm.
13
PHẦNH
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN củ u
2.1. Đối tượng - Nguyên vật liệu
Ketoprofen 99,3% (Chất đối chiếu đạt theo USP 24).
Viên nén ketoprofen TDKD 200 mg (SKS: 1297 của Công ty Dược phẩm
nước ngoài).
Acetonitril, methanol (HPLC grade - Merck),diclaromethan;
Kali dihydrophosphat, natri hydroxyd (PA grade - Merck).
Và tất cả các nguyên liệu và hoá chất khác đều đạt tiêu chuẩn yêu cầu, PA,
HPLC, do các nguồn tin cậy cung cấp.
Người tình nguyện khỏe mạnh.
2.2. Thiết bị
- Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao
+ Bơm cao áp của Merck - Hitachi L - 6000 Pump.
+ Detectơ u v của Merck - Hitachi L - 4000 u v detector.
+ Máy tích phân của Merck - Hitachi D - 2500 chromato
+ Van tiêm mẫu Rheo dyne 1725 (Mỹ).
- Máy quang phổ Beckman DU 640 Spectrophotometer (Mỹ)
- Máy ly tâm Jouan (Pháp).
- Tủ lạnh sâu (-50°C) Frigor (Đan mạch)
- Máy lắc (Labinco - Hà Lan).
- Máy siêu âm Branson.
- Cần phân tích Mettler AB 204 Toledo (Thuỵ Sỹ).

- Máy đo pH Jenway (Anh).
- Máy khuấy từ Ikamag.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
14
2.3.1. Khaỏ sát chọn phương pháp chiết ketoprofen trong huyết tương
Thực hiên chiết ketoprofen trong huyết tương bằng một số dung môi như ACN,
acid tricloroacetic 5% , diclomethan . Quan sát sắc đồ vào dựa vào các chỉ tiêu hiệu
suất chiết, thời gian làm mẫu, hiệu quả kinh tế để lựa chọn dung môi,thấy chiết
Dicloromethan là hợp lý
0.2ml H3P041 M
4ml Dỉcloromethan
0.25ml pha động
Tiêm mẫu Sơ đồ 1.1. Quá trình chiết ketoprofen
bằng dung môi Dicloromethan
15
2.3.2 Xây dựng phương pháp định lượng Ketoprofen trong huyết tương
2.3.2.I. Thực hiện chạy tối ưu hoá dung môi:
Thay đổi tỉ lệ thành phần các chất trong hệ pha động thực hiện chạy các hệ dung
môi này , thu kết quả, xử lý thông số đầu ra để lựa chọn pha động tối ưu nhất ( pha
động này có các yêu cầu sau , khả năng tách tốt, píc sắc nét, không bị ảnh hưởng
bởi các píc nhỏ , thời gian chạy một mẫu không quá dài).
2.3.2.2 . Điều kiện sắc ký:
Pha động, thành phần dung môi, tỷ lệ dung môi, lưu lượng dòng, bước sóng
phân tích, các loại cột sắc ký, tôi đã tìm được điều kiện phù hợp để định lượng
ketoprofen trong huyết tương.
Sắc ký phân bố pha đảo:
Cột: Nucleosil C18 AB ( 250 X 4,6 mm) 5 ỊJ.IX1
Pha động: Acetonitril - acid acetic - triethylamin - nước = (38.5:0.5: 0,3 : 60,7)
Bước sóng: 253 nm.
Lưu lượng dòng: 0.9ml/phút

Thể tích mẫu tiêm: 50 fxl.
2 3 23 Thẩm định phương pháp
s Xây dựng đường chuẩn trong pha động, trong huyết tương
S Xác định tính chính xác của phương pháp
■S Xác định tính đúng của phương phá
2.3.3 Đ ánh giá sinh khả dụng invivo :
Ba người tình nguyện khỏe mạnh, nhịn lOgiờ trước khi uống thuốc sau uống
thuốc 4 giờ ăn, thức ăn được chuẩn hóa. Mỗi người uống một viên ketoprofen 200
mg TDKD, sau đố lấy máu ra định lượng nồng độ thuốc trong huyết tương .
2.4. Phương pháp xử lý kết quả
Chương trình Excel, để tính toán và xử lý kết quả
Photoshop 5.5 đo độ rộng đáy píc
Modde 5.0 để phân tích kết quả tối ưu hoá dung
16
PHẦN III
KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN
3.1. Khảo sát phương pháp chiết ketoprofen trong huyết tương
Khả năng chiết hoạt chất được biểu thị bằng hiệu suất chiết và sự loại tạp cản
trở, ảnh hưởng tói sự phát hiện ketoprofen trong mẫu phân tích.
Chúng tôi đã tiến hành chiết ketoprofen từ huyết tương theo các quy trình chiết
khác nhau như, dung môi ACN, acid tricloroacetic 5%, dicloromethan.
So sánh các sắc đồ sau:
1VLAXJ C H I E T B A N O A C N C H U A N N O I L A r a U P B E N
l' 1;
I
N
I I I I
I I I I I I I I
CfflET ACID TRI 5Vo , s Ẩ bư PRO
PHA DONG :S0:0.5:0.3

%
M»u c MAYT KgTOrrtOrgN:
♦ ♦
m »
ị ị
5 -
* • ọ
» » »
jn J>
Ị Ị
Ề Ế
; yJL
I I I I I I » I I •« I I I _ I i i i i i i i i i t i i
* n s ■ n *
ac -4 i X *-*
•_» u
MftUTRANQ ■mONOHUVBTTUOHO MfcUCHIgT
__

teCTOPBOPCN*ne*(til^lAPHOXEN
17
Bảng 3.1. So sánh ba quỉ trình chiết ketoprofen từ huyết tương
Dung môi
ACN
CCI3COOH - MeOH
CH2Q 2
Thời gian (phút)
150
30
40

Hiệu suất chiết (n = 6)
69,8%
89,6%
91.77%
RSD %
5,95
0,90 0.98
Nhận xét: Theo của tác giả [11], chiết bằng dung môi ACN thời gian xử lý
mẫu lâu, píc của ketoprofen cũng chưa tách ra khỏi tạp cản trở . Theo tác giả [12].
chọn acid tricloroacetic 5% làm dung môi chiết , để rút ngắn thòi gian làm mẫu,
nhưng do acid chiết làm đông vón prôtein trong huyết tương nên khi tiêm mẫu chạy
sắc ký làm cho hiệu lực cột giảm đi cụ thể làm chẻ píc, cột nhanh hỏng và píc của
ketoprofen cũng chưa tách ra khỏi tạp cản trở.
Để quá trình sắc ký dược tốt hơn chúng tôi đã thêm H3PO4I M chuyển
ketoprofen về dạng phân tử, và dùng dicloromethan chiết KET ở dạng phân tử , bay
hơi dung môi bằng nhiệt độ, chạy sắc khí cho sắc đồ không bị nhiễu bởi tạp chất mà
hiệu suất chiết cao. Chính vì lý do này tôi đã lựa chọn dung môi chiết là
Dicloromethan.
3.2.Khảo sát điều kiện định lượng ketprofen trong huyết tương
3.2.1Pha động:
Việc lựa chọn thành phần pha động hợp lý cùng với tỷ lệ các thành phần pha động
chính xác là bước quyết định của quá trình chạy sác ký HPLC,
Các hệ pha động đã khảo sát
+ ACN - Đệm phosphat 0,05 M p H 7,0
+ Amoni acetat 1% - MeOH - ACN điều chỉnh về pH = 6,5 bằng CH3COOH
băng
+ MeOH - AcOH - H20
+ ACN- AcOH- TE -H 20
Các hệ pha động trên được khảo sát với các tỷ lệ thành phần khác nhau, pha dung
môi hữu cơ từ 30 - 50%, pha nước từ 50 - 70% (trong hệ 3 và 4 AcOH chiếm 1%),

18
Từ kết quả thu được cho thấy hệ 1, 2, 3 cho kết quả tách không tốt, píc tù, chân
píc chưa gọn hoặc thòi gian làm mẫu quá lâu, (ACN - AcOH - TE - H20)
Cho kết quả ổn định, píc sắc nét tuy nhiên để thu dược hệ pha động hợp lý nhát
chúng tôi quyết định tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ thành phần dung môi
trong pha động tới a, Rs ,t vói sự trợ giúp của chương trình tối ưu Modde 5,0
• Lựa chọn các thông số và khoảng biến thiên :
Các thông số khảo sát gồm 2 lọai:
Thông số đầu vào : Tỉ lệ các thành phần trong pha động gọi các biến độc lập
Thông số đầu ra : tr, a, Rs,gọi là các biến phụ thuộc
Quy ước: x t: % ACN
x 2: % AcOH
x 3: % TE
Bảng 3.2 Các mức và khoảng biến thiên của biến độc lập
Biến
Các mức
Khoảng biến thiên
Mức duới Mức cơ sở
Mức trên
X,
33,5
38,5 43,5
5
x 2
0,25 0,50
0,75 0,25
x 3
0,10
0,30
0,50 0,20

*Lựa chọn mô hình toán học.
Mô hình bậc hai: Y = ao + axx + a2x2
Cách bổ trí thí nghiệm Tâm trực giao: số thí nghiệm: N = 2n'q+2n + N0
2 n'q : số thí nghiệm ở ma trận gốc cơ sở là đỉnh của hình hộp 8 đỉnh.
2n: số thí nghiệm ở điểm sao, tâm mỗi ô.
N0: là số thí nghiệm ở tâm hình hộp
*Khảo sát ảnh hưởng của các thông số thí nghiệm đến a, Rs, t.
Pha các pha động với tỷ lệ theo bảng tối ưu và tiến hành làm sắc ký .
Từ kết quả thu được ta thu được hệ dung môi tối ưu bằng cách sử dụng phần
mềm Modde 5
19
Bảng 3.3 Kết quả chạy tối ưu hoá dung môi
Số thí
nghiệm
Thông số đầu vào
Thông số đầu ra
Thứ tự
tiến
hành
ACN AcOH TE
H2Ovđ
oc
Rs T
1
13
33,5
0,25
0,1
100,
1,14 1,954 25

2
2
43,5 ỏ,25
0,1
100
1,15
1,443 5,13
3
10 33,5
0,75
0,1
100
1,11
1,485
25,59
4 3
43,5 0,75
0,1
100 1,07 0,804 8,09
5
1 33,5 0,25 0,5
100 1,25 1,805
8,30
6
12 43,5
0,25 0,5 100
1,19
1,099
7,37
7

8 33,5 0,75 0,5
100 1,15 2,100
22,86
8
4 43,5
0,75 0,5 100
1,10
1,259
9,19
9
5 33,5 0,5 0,3
100 1,16 2,245
18,76
10 16
38,5 0,50 0,3 100
1,12 1,644 9,56
11
9
38,5 0,25 0,3 100
1,20 1,805
8,31
12
6
38,5 0,75 0,3 100 1,14 1,691
10,14
13
15 38,5 0,5
0,1
100
1,11

1,308 12,86
14
14 38,5
0,5
0,5
100 1,18 1,623
10,98
15
11 38,5
0,5 0,3 100
1,14
1,934 12,96
16
17 38,5 0,5 0,3 100
1,15
1,816
13,51
17
7 38,5 0,5 0,3
100 1,14 2,094
13,38
20