BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC




PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN HIẾU KHÍ
PHÂN GIẢI CELLULOSE TỪ VỎ TRÁI CA CAO





CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
Th.S HUỲNH XUÂN PHONG LÊ THỊ VÂN AN
MSSV: 3096805
LỚP: CNSH TT K35


Cần Thơ, Tháng 12/2013
PHẦN KÝ DUYỆT



CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

Huỳnh Xuân Phong Lê Thị Vân An



DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
Cần Thơ, ngày tháng 12 năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)


LỜI CẢM TẠ


Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần
Thơ, Ban giám đốc Viện NC và PT Công nghệ Sinh học, cùng Quý Thầy Cô đã tạo
mọi điều kiện tốt nhất để em thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp này.
Xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Th.S Huỳnh Xuân Phong đã tận tình
hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp em rèn luyện trong suốt quá
trình học tập và hoàn thành luận văn.
Xin chân thành cảm ơn anh Nguyễn Ngọc Thạnh, anh Phạm Hồng Quang– cán
bộ quản lý phòng thí nghiệm CNSH Thực phẩm, quý Thầy Cô, Anh Chị quản lý phòng

thí nghiệm của Viện NC và PT CNSH đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn
thành tốt luận văn tốt nghiệp này. Em xin được gửi lời cảm ơn đến các Anh Chị học
viên cao học, các bạn sinh viên của phòng thí nghiệm CNSH Thực phẩm đã giúp đỡ
em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ và ủng hộ em trong
suốt quá trình học tập để em có kết quả như ngày hôm nay
Kính chúc Quý Thầy Cô, các Anh Chị và các bạn được dồi dào sức khỏe, hạnh
phúc và thành đạt.
Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp
đỡ quí báo đó!
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
TÓM LƢỢC
Đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn hiếu khí phân giải cellulose từ vỏ trái
ca cao” được tiến hành với các nội dung bao gồm phân lập, khảo sát hoạt tính và
chọn lọc chủng vi khuẩn có khả năng thuỷ phân vỏ trái ca cao, từ đó tiến hành đánh
giá khả năng lên men từ dịch thủy phân. Tổng cộng có 23 chủng vi khuẩn hiếu khí
được phân lập từ vỏ trái ca cao, trong đó có 20 chủng vi khuẩn có khả năng tạo vòng
tròn thủy phân trên môi trường CMC. Hai chủng vi khuẩn PD2 và PD5 tạo vòng tròn
thủy phân trên môi trường thạch có đường kính lớn nhất (11,33mm và 11mm). Kết
quả khảo sát cho thấy chủng vi khuẩn PD5 thủy phân vỏ ca cao hiệu quả nhất với hàm
lượng đường khử là 2,244 mg/mL sau 5 ngày ủ lắc ở nhiệt độ phòng (28- 32
o
C). Hàm
lượng protein thu được tương thích với thời gian tối ưu là 226,19 µg/mL. Kết quả
phân tích PCR cho thấy chủng PD5 thuộc Klebsiella variicola. Nghiên cứu cũng cho
thấy quá trình lên men dịch thủy phân bằng chủng Saccharomyces cerevisiae đạt hiệu
suất tốt, đạt đến 85%.
Từ khoá: cellulase, đường khử, Saccharomyces cerevisiae, vỏ trái ca cao, vòng tròn
thủy phân.

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
MỤC LỤC

Nội dung Trang
PHẦN KÝ DUYỆT
LỜI CẢM TẠ
TÓM LƢỢC i
MỤC LỤC ii
DANH SÁCH BẢNG iv
DANH SÁCH HÌNH v
TỪ VIẾT TẮT vii
CHƢƠNG I. GIỚI THIỆU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu 2
CHƢƠNG II. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1. Tổng quan về cây ca cao và thành phần chính trong vỏ trái ca cao 3
2.1.1. Giới thiệu cây ca cao 3
2.1.2. Các thành phần chính trong vỏ trái ca cao 4
2.2. Tổng quan về cellulose 8
2.2.1. Giới thiệu về cellulose 8
2.2.2. Giới thiệu các nhóm vi sinh vật phân giải cellulose 10
2.3. Ứng dụng enzyme cellulase trên thị trƣờng 12
2.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc 13
CHƢƠNG III. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
3.1 Phƣơng tiện thí nghiệm 15
3.1.1. Địa điểm và thời gian thực hiện 15
3.1.2. Nguyên vật liệu 15
3.1.3. Hóa chất và môi trường 15
3.1.4. Thiết bị - dụng cụ 16

3.2 Phƣơng pháp thí nghiệm 16
3.2.1. Phân tích hàm lượng cellulose trong vỏ trái ca cao 16
3.2.2. Phân lập các chủng vi khuẩn từ vỏ trái ca cao có khả năng phân
giải cellulose trên môi trường CMC. 17
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
3.2.3. Tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính thủy phân cellulose. 18
3.2.4. Khảo sát khả năng phân giải vỏ trái ca cao. 19
3.2.5. Định danh chủng vi khuẩn phân giải cellulose bằng kỹ thuật
sinh học phân tử 19
3.2.6. Khảo sát khả năng lên men ethanol 20
3.2.7. Xử lý số liệu, phân tích thống kê 20
CHƢƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21
4.1. Kết quả phân tích hàm lượng cellulose trong vỏ trái ca cao 21
4.2. Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn từ vỏ trái ca cao có khả năng phân
giải cellulose trên môi trường CMC. 22
4.3. Tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính thủy phân cellulose. 25
4.4. Khả năng phân giải vỏ trái ca cao. 27
4.5. Định danh chủng vi khuẩn phân giải cellulose bằng kỹ thuật sinh học phân
tử 32
4.6. Khả năng lên men ethanol 33
CHƢƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35
5.1. Kết luận 35
5.2. Đề nghị 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO 36
PHỤ LỤC 42
Phụ lục 1. Phƣơng pháp vi sinh-sinh hóa
Phụ lục 2. Hình ảnh các thiết bị sử dụng trong phòng thí nghiệm
Phụ lục 3. Số liệu kết quả thí nghiệm
Phụ lục 4. Kết quả phân tích thống kê

Phụ lục 5. Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

DANH SÁCH BẢNG

Tên bảng Trang
Bảng 1. Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ liệu nông
nghiệp phổ biến 6
Bảng 2. Thành phần môi trường CMC 15
Bảng 3. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (M1) 16
Bảng 4. Kết quả phân tích hàm lượng cellulose trong vỏ trái ca cao 21
Bảng 5. Hình dạng và đặc tính vi khuẩn, khuẩn lạc của 23 chủng vi khuẩn
phân giải vỏ trái ca cao 23
Bảng 6. Kết quả quá trình lên men dịch thủy phân vỏ trái ca cao 33

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

DANH SÁCH HÌNH

Tên hình Trang
Hình 1. Cấu tạo phân tử cellulose (dạng mạch thẳng) 4
Hình 2. Cấu trúc sợi cellulose 5
Hình 3. Các loại đường cấu thành Hemicellulose 7
Hình 4. Các đơn vị cơ bản của lignin 8
Hình 5. Cơ chế quá trình thủy phân cellulose 9
Hình 6. Trichoderma 10
Hình 7. Streptomyces 11
Hình 8. Clostridium 12

Hình 9. Quy trình xác định hàm lượng cellulose vỏ trái ca cao 17
Hình 10. Đường kính vòng tròn thủy phân sau 3 ngày của chủng
PD2, PD5, PD6, PD8 và PD21 25
Hình 11. Đường kính vòng tròn thủy phân của 23 chủng vi khuẩn hiếu khí 26
Hình 12. Hàm lượng protein sinh ra theo thời gian tương ứng với
5 chủng vi khuẩn 27
Hình 13. Đường tăng trưởng của dòng PD2 28
Hình 14. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng glucose sinh ra 28
Hình 15. Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn đến hàm lượng glucose sinh ra 29
Hình 16. Hàm lượng glucose sinh ra theo thời gian tương ứng với
5 chủng vi khuẩn 30
Hình 17. Hiệu suất thủy phân vỏ trái ca cao của 5 chủng vi khuẩn 31
Hinh 18. Kết quả tra cứu trên BLAST N của dòng PD5 32
Hình 19 . Kết quả so sánh trên BLAST N của chủng PD5 so với dòng
Klebsiella variicola 33
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
mL milliliter
YEP Yeast extract-Peptone
v/v volume/volume
w/v weight/volume
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC và PT Công nghệ Sinh học
CHƢƠNG I. GIỚI THIỆU
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt nam có tiềm năng phát triển cây ca cao rất lớn, cây ca cao có ưu thế nổi trội là
có thể trồng xen với nhiều loại cây khác, đồng thời có khả năng chịu hạn, chống xói
mòn đất nên rất thích hợp với điều kiện tự nhiên và thổ nhưỡng. Tính đến tháng 5 năm

2013, cả nước có khoảng 25.000 ha ca cao, chủ yếu được trồng tại Tây Nguyên, Đông
Nam bộ và một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long. Dự kiến, đến năm 2015 diện tích
trồng ca cao sẽ lên đến 60.000 ha và đạt 80.000 ha vào năm 2020. Sản lượng ca cao dự
đoán sẽ đạt được khoảng 52.000 tấn vào năm 2015 và 108.000 tấn vào năm 2020
(, 18/07/2013). Tuy nhiên sau khi thu hoạch trái ca cao, ngoài phần
hạt được người nông dân thu lấy thì phần vỏ ít được sử dụng tới. Một phần vỏ trái ca
cao này sẽ được chế biến thành phân bón hữu cơ và thức ăn bổ sung cho bò, số ít khác
được phơi khô và sử dụng để làm nhiên liệu đốt. Tuy nhiên, đối với những hộ trồng ca
cao ở quy mô lớn, người ta thường bóc quả tại chỗ, chỉ đưa hạt đóng bao về xưởng xử
lý, phần vỏ thường không được dùng tới và để hoại mục tự nhiên tại vườn. Việc này có
lợi là giảm công vận chuyển nhưng mặt trái của nó là tạo môi trường dinh dưỡng cho
nhiều loại sâu hại gây bệnh phát triển vì vỏ trái ca cao khá giàu dinh dưỡng. Vỏ trái ca
cao không gây sức ép nghiêm trọng đối với môi trường xung quanh nhưng nếu được tận
dụng triệt để thì đây có thể được xem là một nguồn nguyên liệu sinh học mới đầy hứa
hẹn.
Tuy vậy, việc sử dụng nguồn nguyên liệu này còn phụ thuộc rất lớn vào sự thủy
phân của nó cho ra những loại đường đơn có thể tận dụng được. Cellulose có thể được
chuyển đổi thành glucose bằng nhiều phương pháp khác nhau: phương pháp hóa học,
vật lý hoặc enzyme thủy phân. Trong đó, phương pháp xử lý cellulose bằng enzyme có
ưu thế hơn so với phương pháp xử lý bằng acid. Phản ứng thủy phân cellulose với acid
cần một lượng bazơ để trung hòa, điều này làm hao tốn chi phí lên nhiều lần đồng thời
phương pháp này còn giải phóng ra các sản phẩm phụ không có lợi cho môi trường. Bên
cạnh đó, nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy rằng enzyme cellulase hoạt động rất có
hiệu quả trong việc thuỷ phân mạng lưới cellulose này và giải phóng ra những gốc
đường glucose đơn giản. Nhờ đó mà lượng đường sinh ra có thể được chuyển đổi thành
những sản phẩm có giá trị như butanol, acid amino hay nhiên liệu sinh học như ethanol.
Ngoài ra enzyme cellulase được sử dụng rất có hiệu quả trong việc chuyển đổi những
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC và PT Công nghệ Sinh học
chất thải trong các ngành công nghiệp thực phẩm và trong nông nghiệp thành sản phẩm

có giá trị (Bothast và Saha, 1997). Một số nghiên cứu đã cho thấy, tại nơi tiến hành thu
hoạch nguyên liệu, nơi mà nguyên liệu tự rã mục và tiếp xúc với đất đã tạo điều kiện
thuận lợi cho vi khuẩn phân giải cellulose phát triển tốt (Baig et al., 2003). Đây cũng
chính là tiền đề cho nghiên cứu “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn hiếu khí phân giải
cellulose từ vỏ trái ca cao”.
1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn hiếu khí có khả năng tổng hợp cellulase trên cơ
chất là vỏ trái ca cao và khảo sát khả năng lên men ethanol từ nguồn nguyên liệu này.


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện NC và PT Công nghệ Sinh học

CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về cây ca cao và thành phần chính trong vỏ trái ca cao
2.1.1. Giới thiệu cây ca cao
Cây ca cao (Theobroma cacao) có nguồn gốc hoang dại trong các khu rừng nhiệt
đới Trung và Nam châu Mỹ. Ca cao là loại cây thường xanh ở tầng trung, cao từ 4-8 m,
ưa bóng rợp, có khả năng chịu bóng tốt nên thường được trồng xen dưới tán cây khác.
Nguồn gốc của cây ca cao là từ Trung Mỹ và Mexico, được những người Aztec và Maya
bản xứ khám phá. Các loài ca cao được trồng rộng rãi trên thế giới là Crillo và Forastero
nhưng thường gặp nhất là Trinitario là loài được lai tạo từ 2 loài trên.
Hạt ca cao sử dụng làm nguyên liệu chế biến ra các sản phẩm cao cấp như Sô cô
la. Ca cao còn là đồ uống thông dụng vì có chất kích thích nhưng lượng caffein thấp hơn
cà phê rất nhiều. Vỏ trái sau khi lấy hạt có thể phơi khô xay làm thức ăn cho gia súc.
Cây không cạnh tranh về đất nhiều vì có thể trồng xen trong các vườn cây có sẵn giúp
tăng hiệu quả sử dụng đất.
Ở Việt Nam, ca cao được du nhập vào rất sớm, theo chân các nhà truyền giáo
phương Tây. Hiện tại, cây được trồng rộng rãi ở nhiều nơi, vùng Tây Nguyên vẫn được
đánh giá là có điều kiện lý tưởng nhất cho phát triển cây ca cao. Ở đây, theo nghiên cứu

thống kê thì cây ra hoa cho quả quanh năm, sản lượng bình quân đạt 3 kg hạt khô / 1
cây 5 năm tuổi.
Việt Nam có nhiều tiềm năng phát triển cây ca cao do cây ca cao có ưu thế nổi trội
là có thể trồng xen với nhiều loại cây như dừa, điều, hồ tiêu, cà phê, chuối, đồng thời có
khả năng chịu hạn, chống xói mòn đất nên rất thích hợp với điều kiện tự nhiên và thổ
nhưỡng ở các tỉnh phía Nam và Tây Nguyên. Đến cuối năm 2006, diện tích trồng xen
cây ca cao đạt hơn 7.300 ha, chủ yếu tập trung ở các tỉnh Bến Tre, Tiền Giang, Bà Rịa -
Vũng Tàu, Đắc Lắc, Đắc Nông và Bình Phước. Hiện tại, Bộ Nông nghiệp và Phát triển
Nông thôn Việt Nam đã thay đổi kế hoạch trồng ca cao lên đến 60.000 ha vào năm 2015
và 80.000 ha vào năm 2020. Chính phủ đã cam kết đầu tư 40 tỉ đồng để phát triển thị
trường ca cao. Sản lượng ca cao dự đoán sẽ đạt được khoảng 52.000 tấn vào năm 2015
và 108.000 tấn vào năm 2020. Kế hoạch này sẽ giúp Việt Nam trở thành một trong
những nước sản xuất ca cao lớn nhất ở khu vực Đông Nam Á với tổng thu nhập hàng
năm xấp xỉ 120 triệu USD vào khoảng năm 2020 (
24/11/2009).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện NC và PT Công nghệ Sinh học
2.1.2. Các thành phần chính trong vỏ trái ca cao
Cellulose
Cellulose là hợp chất cao phân tử phổ biến nhất trên trái đất, được tìm thấy chủ yếu
ở vách tế bào thực vật (Wyman et al., 1993). Các hợp chất cao phân tử cellulose có cấu
trúc tinh thể, không phân nhánh và mức độ polymer hóa rất cao từ 2.000 đến 27.000 đơn
vị glucose/phân tử, và được nối với nhau bằng liên kết ß-1,4-glycoside (Sjostrom,
1993). Cellulose không tan trong nước ngay cả khi đun nóng và các dung môi hữu cơ
thông thường. Tan trong một số dung dịch acid vô cơ mạnh như: HCl, HNO
3
, một số
dung dịch muối: ZnCl
2
, PbCl

2
(www.vi.wikipedia.org, 06/08/2013).
Trong gỗ chứa khoảng 50% cellulose, trong sợi bông vải 97-98%; sợi lanh, sợi gai
81-90%, sợi đay 75%, thân cây họ Cói và họ Lúa khoảng 30-40%.

Hình 1. cấu tạo phân tử cellulose (dạng mạch thẳng)
(*Nguồn: , ngày 06/08/2013)
Cellulose có cấu tạo dạng sợi, các sợi này liên kết lại với nhau để hình thành một
cấu trúc phức tạp gọi là protofibril, các phân tử protofibrin lại kết hợp tạo thành bó
microfibril, sau đó các bó microfibril kết hợp với nhau để tạo thành các sợi fiber (Brown
và Saxena, 2000). Các phân tử cellulose trong các protofibril liên kết chặt chẽ với nhau
nhờ có rất nhiều liên kết hydro nên cấu trúc phân tử cellulose rất cứng. Vì vậy cellulose
là một hợp chất rất khó phân giải (Miettinen-Oinnen, 2004; Pizzi và Eaton, 1985).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 5 Viện NC và PT Công nghệ Sinh học

Hình 2. Cấu trúc sợi cellulose
(*Nguồn: ngày 06/08/2013)
Trong tự nhiên, hàm lượng cellulose trong các chất khác nhau thì rất khác nhau,
không giống như tinh bột, cellulose có cấy trúc dạng tinh thể (Lynd et al., 2002). Các vi
sợi cellulose thường không đồng nhất, chúng chia thành 2 vùng chính: vùng kết tinh và
vùng vô định hình. Vùng kết tinh là vùng có cấu trúc trật tự rất cao và rất bền vững với
tác động của điều kiện bên ngoài. Enzyme cellulase chỉ tác dụng lên bề mặt hệ sợi vùng
này. Ngược lại, vùng vô định hình lại có cấu trúc không chặc và dễ bị tác động bởi các
yếu tố bên ngoài. Khi gặp nước, chúng dễ bị trương phồng lên, enzyme cellulase rất dễ
tác động làm thay đổi toàn bộ cấu trúc của vùng này. Bên cạnh dạng cấu trúc tinh thể và
vô định hình, cellulose còn ở dạng sắp xếp không đồng đều. Khi đó, sợi cellulose sắp
xếp không theo hình dạng nhất định, như thắt nút, xoắn hay tạo ra những lỗ nhỏ làm cho
diện tích bề mặt chúng lớn hơn (Lynd et al., 2002; Miettinen-Oinonen, 2004).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện NC và PT Công nghệ Sinh học

Bảng 1. Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ liệu nông nghiệp
phổ biến (Betts et al., 1991; Sun và Cheng, 2002).
Nguồn lignocellulose
Cellulose (%)
Hemicellulose (%)
Lignin (%)
Thân gỗ cứng
40-55
24-40
18-25
Thân gỗ mềm
45-50
25-35
25-35
Vỏ lạc
25-30
25-30
30-40
Lõi ngô
45
35
15
Giấy
85-99
0
0-15
Vỏ trấu
32,1

24
18
Vỏ trấu của lúa mì
30
50
15
Rác đã phân loại
60
20
20
Lá cây
15-20
80-85
0
Hạt bông
80-95
5-20
0
Giấy báo
40-55
25-40
18-30
Giấy thải từ bột giấy hóa học
60-70
10-20
5-10
Chất rắn nước thải ban đầu
8-15
-
24-29

Chất thải của lợn
6
28
-
Phân bón gia súc
1,6-4,7
1,4-3,3
2,7-5,7
Cỏ ở bờ biển Bermuda
25
35.7
6.4
Cỏ mềm
45
31.4
12.0
Các loại cỏ (trị số trung bình
cho các loại)
25-40
25-50
10-30
Bã thô
33,4
30
18,9

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 7 Viện NC và PT Công nghệ Sinh học

Hemicellulose

Hemicellulose là polysacaride thường gặp trong vách tế bào thực vật. Thông
thường, hemicellulose chiếm tỷ trọng khoảng 11-37% trong lượng khô (Sjostrom,
1993). Khác với cellulose, mức độ polymer hóa của hemicellulose thường thấp hơn,
khoảng 200 gốc đường nối với nhau, bao gồm β- D glucan, polygalacturonan và một số
loại đường đa như galactose, mannose, arabinoglucurono và xylose (Howard et al.,
2004). Các loại đường có trong hemicellulose gồm đường 6 carbon: D- glucose, D-
galactose, D- glucuronic, acid 4-O-methyl-d-glucuronic, acid D- galacturonic và
mannose; đường 5 carbon gồm xylose và L- arabinose, L-rhamnose, L- fucose và các
loại đường có nhóm O-methyl (Howard et al., 2004; Obembe et al., 2006; Ohgren et al.,
2006; Richard, 1996).

Hình 3. Các loại đƣờng cấu thành hemicellulose
(
Do không ở dạng cấu trúc tinh thể, độ polymer thấp, phân nhánh và hỗn hợp nhiều
đường nên hemicellulose không có cấu trúc chặt chẽ như ở cellulose và độ bền hóa lý
cũng thấp hơn. Chính vì vậy mà hemicellulose dễ dàng bị thủy phân bằng acid và base
loãng hơn cellulose (Howard et al., 2003).
Lignin
Lignin chiếm khoảng 30% lượng carbon trong khí quyển và là hợp chất polymer
sinh học lớn thứ hai trên trái đất. Lignin là một phức hợp chất hóa học phổ biến được
tìm
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện NC và PT Công nghệ Sinh học

thấy trong hệ mạch thực vật, chủ yếu là giữa các tế bào, trong thành tế bào thực vật
(Boerjan et al., 2003; Dam et al., 2008). Lignin có chức năng là nâng đỡ thành tế bào,
giữ cho chúng khỏi bị sụp đổ. Số lượng và thành phần của lignin trong tế bào phụ thuộc
nhiều vào mức độ tiến hóa, loại tế bào, giai đoạn phát triển và môi trường xung quanh
(Howard et al., 2003; Lewis và Yamonoto, 1990).
Lignin có cấu trúc không gian 3 chiều, phức tạp, vô định hình (McCrady, 1991;

Richard, 2008). Lignin là polymer, được cấu thành từ các đơn vị phenylpropene nối với
nhau bởi liên kết C-C. Các đơn vị cấu trúc điển hình của lignin là: guaiacyl (G), trans-
coniferyl alcohol; syringyl (S), trans-sinapyl alcohol; p-hydroxylphenyl (H), trans-p-
courmary alcohol (Lewis và Yamonoto, 1990; Howard et al., 2003).
Cấu trúc của lignin đa dạng, tùy thuộc vào loại gỗ, tuổi của cây hoặc cấu trúc của
nó trong gỗ (Howard et al., 2003; Lewis và Yamonoto, 1990). Ngoài việc được phân
loại theo lignin của gỗ cứng, gỗ mềm và cỏ, lignin có thể được phân thành hai loại
chính: guaicyl lignin và guaicyl-syringyl lignin. Ở cây hai lá mầm, những loài gỗ mềm
chứa chủ yếu là guaiacyl, loài gỗ cứng chứa chủ yếu guaiacyl và syringyl. Cây một lá
mầm có hàm lượng p-hydroxylphenyl cao hơn ở cây hai lá mầm (Lewis và Yamonoto,
1990; Howard et al., 2003).

Hình 4. Các đơn vị cơ bản của lignin (Boerjan et al., 2003)
2.2. Tổng quan về cellulase
2.2.1. Giới thiệu về cellulase
Cellulase là định nghĩa chung để chỉ tất cả những enzyme có hoạt tính thủy phân
cellulose thành các đơn vị monomeric. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng hệ enzyme có
khả năng thủy phân cellulose thì cũng có hoạt tính tương tự như đối với hemicellulose
(Howard et al., 2003; Lynd et al., 2002). Cellulase phân cắt các liên kết β-1,4-
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 9 Viện NC và PT Công nghệ Sinh học
glucosidases của mạng lưới cellulose theo cơ chế thủy phân acid (cho và nhận proton).
Hệ thống enzyme cellulase được chấp nhận rộng rãi hiện nay là sự đồng hoạt động của
các loại enzyme sau: endoglucanase (EC 3.2.1.4), exoglucanase hoặc cellobiohydrolase
(EC 3.2.1.91), β-glucosidase (EC 3.2.1.21), oxidative cellulose và cellulose
phosphorylase (, 06/08/2013).
Các loại enzyme trong hệ enzyme cellulase thay phiên nhau phân hủy cellulose để
tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose. Mỗi một loại enzyme chỉ tham gia thủy phân
một phần phân tử cellulose.


Hình 5. Cơ chế quá trình thủy phân cellulose
(*Nguồn: ngày 06/08/2013)
Endoglucanases thủy phân các liên kết β-glucosidases của mạng lưới cellulose một
cách ngẫu nhiên để sản xuất chuỗi mới. Exoglucanases phân cắt những phân tử
cellulose được tổng hợp từ enzyme endoglucanases tại các vị trí đầu chuỗi giải phóng ra
những phân tử glucose hoặc cellobiose. β- glucosidases thủy phân các phân tử
cellodextrins và cellobiose thành glucose (Lynd et al., 2002; Howard et al., 2003;
Miyamoto, 1997). Oxidative cellulose cắt phân tử cellulose bằng những phản ứng tạo ra
các gốc tự do.
Cellulose phosphorylase phân cắt các phân tử cellulose thành các monomer bằng
cách sử dụng phosphate thay vì sử dụng nước (, 06/08/2013).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 10 Viện NC và PT Công nghệ Sinh học
2.2.2. Giới thiệu các nhóm vi sinph vật phân giải cellulose
Trong tự nhiên, có rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose gồm
các nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn. Chúng ta có thể tìm thấy chúng trong đất, phân ủ. Tuỳ
theo tính chất của chúng, có thể xếp vào 2 nhóm như sau:
a. Vi sinh vật phân giải cellulose trong đều kiện hiếu khí
Ở đất thoáng khí, nấm là thành phần quan trọng trong các vi sinh vật phân giải
cellulose, nhất là ở đất ẩm. Với xấp xỉ 700 loài nấm Zygomycete, nhưng chỉ một vài
loài thuộc giống Mucor cho thấy có hoạt tính thủy giải cellulose. Trái lại, lớp nấm nang,
nấm đảm và nấm bất toàn, mỗi ngành có hơn 15.000 loài, thủy giải mạnh cellulose.
Nhiều giống nấm thu hút nhiều sự nghiên cứu cho hoạt tính thủy giải cellulose và gỗ
như: Chaetomium và Helotium (lớp nấm nang); Coriolus, Phanerochaete, Poria,
Schizophyllum và Serpula (nấm đảm); Aspergillus, Cladosporium, Fusarium,
Geotrichum, Myrothecium, Paecilomyces, Penicillium và Trichoderma (nấm bất toàn)
(Lynd et al., 2002; Miyamoto, 1997; Boer et al., 2005). Trong đó, Trichoderma reese
được đánh giá là một trong những loài nấm có khả năng phân giải cellulose mạnh nhất
và được sử dụng rộng rãi trong sản xuất enzyme cellulose thương phẩm (Bon và
Ferrara, 2007; Rajesh et al., 2008; Haq et al., 2005).







Hình 6. Trichoderma
(*Nguồn: ngày4/08/2013)
Một số vi khuẩn hiếu khí như Cellulomonas, Cellovibrio và Cytophaga có khả
năng phân thủy cellulose cao (Lynd et al., 2002). Xạ khuẩn không giữ vai trò quan trọng
trong quá trình phân giải cellulose, tuy nhiên một số loài trong các chi Streptomyces,
Actinomucor cũng có khả năng này (Sukumaran et al., 2005).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 11 Viện NC và PT Công nghệ Sinh học






Hình 7. Streptomyces
(*Nguồn: , ngày 04/08/2013)
b. Vi sinh vật phân giải cellulose trong đều kiện yếm khí
Ở điều kiện yếm khí, vai trò của nấm và xạ khuẩn không quan trọng, còn vi khuẩn
chiếm ưu thế trong điều kiện này. Các loại nấm phân giải mạnh cellulose là các giống:
Neocallimastix, Piromyces, Caecomyces, Orpimomyces và Anaeromyces (Lee, 1997).
Các vi khuẩn phân giải cellulose trong điều kiện yếm khí phần lớn thuộc chi
Clostridium, Ruminococcus, Caldicellulosiruptor, Butyrivibrio, Acetivibrio và
Fibrobacter. Các vi khuẩn này thường có khả năng hình thành nội bào tử và chịu được
nhiệt độ cao (McCarter và Whithers, 1994; Wilson, 2008). Hệ thống enzyme phân giải

celllulose của vi khuẩn sống kị khí thuộc loại phức tạp (cellulosomes). Cellulsomes hình
thành tạo những vị trí nhô lên trên thành tế bào vi khuẩn và chúng là những phức hệ
enzyme rất bền vững (Schwarz, 2001).





Hình 8. Clostridium
(*Nguồn: ngày 04/08/2013)
Thông thường, chỉ một vài loài trong những giống trên có hoạt tính thủy giải
cellulose. Các vi khuẩn này khác nhau trong việc sử dụng oxy, nhiệt độ nuôi cấy, nồng
độ muối và cellulose trong môi trường tự nhiên. Việc phân loại các vi khuẩn kỵ khí sử
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 12 Viện NC và PT Công nghệ Sinh học
dụng cellulose là hết sức phức tạp bởi vì gần đây nhiều chủng vi khuẩn không có khả
năng thủy giải cellulose nhưng lại có hệ thống gen cellulosome không được biểu hiện
do sự sai hỏng của trình tự promoter như loài Clostridium acetobutylicum (Schwarz,
2001).
2.3. Ứng dụng enzyme cellulase trên thị trƣờng
Cellulase đã được phát hiện và sử dụng nhiều thập niên qua. Cellulase được ứng
dụng trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi, thực phẩm, dệt, chất tẩy rửa và
trong công nghiệp sản xuất giấy (Xia và Cen, 1999). Với sự cạn kiệt của nguồn nhiên
liệu hóa thạch và gia tăng nhu cầu tìm nguồn nhiên liệu thay thế, cellulase ngày càng
thu hút được sự chú ý của các nhà nghiên cứu nhằm chuyển hóa phần chất thải chứa
cellulose khổng lồ này thành năng lượng có thể sử dụng được.
Công nghệ dệt
Cellulase được dùng để làm mềm vải và tạo vẻ bạc màu cho những loại quần áo
vải bông thay vì sử dụng đá bọt theo phương pháp truyền thống (Belghith, 2001).
Chúng hoạt động trên các sợi cellulose để làm giảm độ đậm màu do thuốc nhuộm chàm

trên vải. Cellulase còn được sử dụng để phân hủy phần vải dư để tạo sản phẩm hoàn
chỉnh, đồng thời làm mềm vải và tạo vùng nhiều màu cho vải (Olson, 1990; Cortez et
al., 2001; Videbaek, 2000).
Công nghiệp nhuộm
Cellulase là một trong ba nhóm enzyme được ứng dụng nhiều nhất trong công
nghiệp dệt. Chúng giúp cho vải bông mềm và sáng màu hơn thay thế cho đá bột được
dùng truyền thống, giúp vết cắt hoàn hảo hơn, giúp điều chỉnh độ đậm nhạt cho vải sợi
(Belghith, 2001).
Công nghiệp tẩy rửa
Cellulase, đặc biệt là EGIII và CBHI thường được dùng làm sạch vải sợi (Clarkson
et al., 2000). Những cellulase thu nhận từ những chủng nấm mốc: Trichoderma reesei,
Trichoderma viride, Trichoderma harzianum, Humicola insolens,… hoạt động trong
môi trường kiềm nhẹ thường được ứng dụng trong công nghiệp tẩy rửa (Kottwitz và
Schambil, 2005). Chúng thường được dùng kết hợp với bột giặt và chất tẩy (Uhlig,
1998).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 13 Viện NC và PT Công nghệ Sinh học
Công nghiệp thực phẩm và thức ăn gia súc
Cellulase được dùng trong dịch chiết làm trong nước ép trái cây, dùng trong dịch
chiết dầu oliu (Galante et al., 1998). Glucanase được thêm vào để cải thiện dịch mạch
nha trong sản xuất bia rượu (Barbesgaard et al., 1984). Cellulase cũng được dùng trong
dịch chiết carotenoid cho sản xuất chất màu thực phẩm (Pajunen, 1986). Sự điều chế
phối hợp hoạt động cellulase, hemicellulase và pectinase cải thiện chất lượng dinh
dưỡng thức ăn cỏ cho vật nuôi (Cinar, 2005).
Công nghiệp sản xuất giấy
Cellulase và hemicellulase đã được sử dụng chuyển đổi bột gỗ thô thành bột gỗ
mịn, loại màu bột gỗ tái sử dụng và cải thiện hệ thống thoát nước trong các nhà máy bột
gỗ (Akhtar, 1994; Prasad et al., 1992). Chúng cũng được dùng sản xuất bột giấy mềm
làm nguyên liệu cho sản xuất khăn giấy và giấy vệ sinh (Hsu và Lakhani, 2002).
Sản xuất nhiên liệu sinh học

Có lẽ ứng dụng quan trọng nhất của cellulase hiện nay được dùng để sản xuất
nhiên liệu sinh học từ sinh khối thực vật. Cellulase có thể chuyển đổi sinh khối thực vật
thành đường glucose và các đường khác mà chúng có khả năng được vi sinh vật sử dụng
như là nguồn cơ chất sản xuất ethanol và protein đơn bào. Hiện nay, sản xuất ethanol từ
sinh khối thực vật trải qua quá trính gồm nhiều bước: tiền xử lý loại bỏ lignin, thủy giải
cellulose thành các loại đường có khả năng lên men bằng cellulase ở nhiệt độ 50
o
C và
cuối cùng dùng vi sinh vật để sản xuất ethanol (Rani et al., 1997).
2.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
Enzyme cellulase đóng vai trò rất quan trọng trong công nghiệp, nông nghiệp, thực
phẩm như: thủy phân các nguyên liệu rơm rạ, mạt cưa, vỏ trấu,… để sản xuất glucose,
giải quyết ô nhiễm môi trường, sản xuất nhiên liệu sinh học. Hiện nay việc sử dụng vi
sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase để sản xuất phân hữu cơ từ các phụ phẩm
nông và công nghiệp đang phát triển mạnh. Đã có nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước
về vi sinh vật sản sinh cellulase.
2.4.1. Trong nƣớc
Ở Việt Nam, có thể kể đến một số nghiên cứu điển hình như: Trịnh Đình Khá et al.
(2007) đã tiến hành tuyển chọn và nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 14 Viện NC và PT Công nghệ Sinh học
khả năng sinh tổng hợp cellulose của chủng Penicilium sp. DTQ-HK1. Kết quả cho thấy
sau 120 giờ lên men chìm ở pH 5,5, nhiệt độ 30
o
C, nuôi lắc 200 vòng/phút trong môi
trường CPY sẽ thu được cellulse có hoạt tính mạnh nhất. Nguyễn Hữu Quân (2009) đã
tuyển chọn được chủng nấm mốc Aspergillus oryzae sinh tổng hợp endo-β-1,4-
glucanase và xác định tính chất lý hóa của enzyme này. Đề tài cho thấy endo-β-1,4-
glucanase hoạt động tốt nhất ở pH 5,5 và nhiệt độ 55°C, bền ở 30-45°C và có hoạt tính
cao trong pH 6,0. Các dung môi hữu cơ ít ảnh tới endo-β-1,4-glucanase trừ n-butanol.

Các chất tẩy rửa (Tween 20, Tween 80, Triton X-100 và SDS), các ion kim loại và
EDTA (nồng độ 4-12 mM hầu như đều làm giảm hoạt tính endo-β-1,4-glucanase. Lê
Hương Thuỷ et al. (2010) đã tiến hành sàng lọc chủng vi sinh vật sinh cellulase sử dụng
trong thủy phân bã thải agar. Kết quả đã sàng lọc được hai chủng B505 (Bacillus subtilis
B-505) và Li (Bacillus lichenformis Li) có hoạt tính phân giải cellulose cao từ 17 chủng
vi sinh vât ban đầu. Đồng thời enzyme cellulase ngoại bào của 2 chủng này còn có khả
năng thủy phân bã agar rất tốt và mạnh hơn 18% so với chế phẩm cellulase thương mại.
Đến 2011, họ đã nghiên cứu nghiên cứu tối ưu hoá các điều kiện sinh cellulase ngoại
bào trên môi trường lên men công nghiệp đối với 2 giống trên.
2.4.2. Ngoài nƣớc
Một số nghiên cứu điển hình về cellulase trên thế giới có thể kể đến bao gồm:
Bravery (1968) khảo sát khả năng thủy phân cellulose của vi khuẩn với các nguồn
carbon khác nhau như DL-asparagine và dịch trích nấm men trên môi trường cellulose-
agar. Eriksson và Hollmark (1969) nghiên cứu về động học của enzyme cellulase trên
cơ chất carboxymethyl cellulose (CMC). Baig et al. (2005) đã tận dụng những phụ
phẩm của cây chuối sau khi thu hoạch (lá, thân), tiến hành thủy phân nguồn phụ phẩn
này thành đường khử bằng cách sử dụng enzyme cellulase từ nấm Trichoderma
lignorum. Bakare et al. (2005) đã phân lập và định tính enzyme cellulase từ một chủng
hoang dại và hai chủng đã được gây đột biến của Pseudomonas fluorescens. Động lực
học enzyme của ba loại enzyme trên ở pH 6,5-7,0, 35
o
C lần lượt là 3,6; 3,1 và 5,3
mg/mL. Othman et al. (2011) đã tiến hành thủy phân vỏ trái ca cao thành ethanol nhiên
liệu. Kết quả thu được cao nhất khi thủy phân vỏ trái ca cao bằng acid HCl ở 75
o
C trong
4 giờ. Lượng đường sinh ra sau quá trình thủy phân được lên men bằng nấm men
Saccharomyces cerevisiae ở 30
o
C. Lượng ethanol thu được là 17,3% sau thời gian lên

men là 26 giờ.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 15 Viện NC và PT Công nghệ Sinh học
CHƢƠNG III. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phƣơng tiện thí nghiệm
3.1.1. Địa điểm và thời gian thực hiện
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm CNSH Thực Phẩm và phòng Thí nghiệm Sinh Hóa
Viện NC và PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
- Thời gian thực hiện: từ tháng 07/2013 đến tháng 12/2013.
3.1.2. Nguyên vật liệu
- Trái ca cao được thu từ vườn trồng ca cao ở xã Mỹ Ái, huyện Phong Điền, TP.
Cần Thơ.
- Chủng nấm men Sacharomyces cerevisiae 2.1 (Phòng thí nghiệm CNSH Thực
phẩm, Viện NC và PT Công nghệ Sinh học)
3.1.3. Hóa chất và môi trƣờng: Carboxymethyl cellulose, (NH
4
)
2
SO
4
, K
2
HPO
4
,
MgSO
4
.7H
2
O, NaCl, dung dịch glucose, DNS, BSA, acid dichromate,…

Môi trường CMC
Bảng 2. Thành phần môi trƣờng CMC
Tên hóa chất
Hàm lƣợng (g/L)
Đơn vị
(NH
4
)
2
SO
4

1
gram
K
2
HPO
4

1
gram
MgSO
4
.7H
2
O
0,5
gram
NaCl
0,001

gram
CMC
10
gram
Agar
20
gram
Nước
1000
ml
(Nguồn: Ulrich et al., 2008)
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 16 Viện NC và PT Công nghệ Sinh học
Môi trường Delafield
Bảng 3. Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn (M1)
Tên hóa chất
Hàm lƣợng (g/L)
Đơn vị
Vỏ trái ca cao
10
Gram
(NH
4
)
2
SO
4

1
Gram

K
2
HPO
4

1
Gram
MgSO4.H
2
O
0,5
Gram
NaCl
0,001
Gram
Agar
15
Gram
Nước cất vừa đủ
1000
Ml
(Nguồn: Ryckeboer et al., 2003)
3.1.4. Thiết bị, dụng cụ
- Dụng cụ: Đĩa petri, ống đong, que cấy, pippet, các loại ống nghiệm, giá để ống
nghiệm, đèn cồn, bình tam giác.
- Thiết Bị:
 Nồi khử trùng nhiệt ướt (Pbi- international, Đức).
 Tủ cấy vô trùng (Microflow, Pháp).
 pH kế (Schott, Đức)
 Tủ ủ vi sinh vật (Inculell 111, Đức).

 Máy đo OD (Hitachi, Nhật).
 Máy vortex (HEIPOLPH, Đức)
 Tủ lạnh (Sanyo, Nhật) và một số thiết bị khác của phòng thí nghiệm.
3.2. Phƣơng pháp thí nghiệm
3.2.1. Phân tích hàm lƣợng cellulose trong vỏ trái ca cao
Nguyên tắc: Phương pháp định lượng cellulose dựa vào tính chất bền nhiệt của
cellulose đối với tác dụng của acid mạnh và base mạnh. Các chất khác thường đi kèm
theo cellulose là hemicellulose, lignin, tinh bột,… ít bền hơn đối với tác dụng của acid
và kiềm nên bị oxy hóa, phân giải và tan vào dung dịch khi xử lý nguyên liệu (AOAC,
1995).
Các bước tiến hành: