BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP
VIỆT NAM
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP
VIỆT NAM
*

NGUYỄN THỊ NHƯ QUỲNH



NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM NPV TRÊN
TẾ BÀO SỐNG ĐỂ PHÒNG TRỪ SÂU KHOANG

Chuyên ngành:
Bảo vệ thực vật
Mã số: 60.62.01.12

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP


Người hướng dẫn khoa học
PGS.TS Lê Văn Trịnh

HÀ NỘI, 2014

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận
được sự hướng dẫn nhiệt tình, sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các anh chị
nơi tôi công tác cũng như Ban lãnh đạo của Viện Bảo vệ thực vật, Trung tâm
Đấu tranh Sinh học và Ban Đào tạo sau đại học .
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn
chân thành nhất t
ới PGS.TS. Lê Văn Trịnh – Giám đốc Trung tâm đấu tranh
Sinh học, Viện Bảo vệ thực vật, một người thầy đáng kính trong công việc
cũng như trong cuộc sống, đã trực tiếp hướng dẫn và định hướng chuyên
môn. Đồng thời tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình
công tác và hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này.
Để thực hiện được nghiên c
ứu này, tôi xin chân thành cảm ơn sự tài trợ
từ đề tài cấp Nhà nước: “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV-spl
(Nucleo Polyhedrosis Virus) từ tế bào gốc sâu khoang để phòng trừ sâu hại
cây trồng nông nghiệp”.
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh, các chị trong nhóm đề tài đã nhiệt
tình giúp đỡ để tôi hoàn thành tốt luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong hội đồng chấm luận văn
đã cho tôi những đóng góp quý báu để hoàn chỉnh luậ
n văn này.










Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii



LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn cao học này là công trình nghiên cứu của
riêng cá nhân tôi. Các tài liệu, số liệu được nêu trong luận văn là trung thực.
Các luận điểm và các kết quả nghiên cứu chưa từng được ai công bố trong bất
cứ công trình nào khác.
Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã
được chỉ rõ nguồn gốc.


Tác giả luận văn




NGUYỄN THỊ
NHƯ QUỲNH



















Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii




MỤC LỤC
Lời cảm ơn I

Lời cam đoan II
Mục lục III
Danh mục bảng VII
Danh mục hình IX
MỞ ĐẦU 1
1.Tính cấp thiết của đề tài 1
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2
3. Yêu cầu cần đạt 2

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3
5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3
5.1. Đối tượng nghiên cứu 3
5.2. Phạm vi nghiên cứu 3
CHƯƠNG I: CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1.Cơ sở khoa học của đề tài nghiên cứu 4
1.2. Kết quả nghiên cứu ở nước ngoài 5
1.2.1. Vài nét về sâu khoang (Spodoptera litura) hại cây trồng 5
1.2.2. Đặc điểm của vi rút NPV 6
1.2.3. Cơ chế gây bệnh của vi rút côn trùng 10
1.2.4. Tiềm năng sử dụng vi rút NPV trong phòng trừ sâu hại 12
1.2.5. Nghiên cứu phân lập, làm thuần thực liệu vi rút NPV sâu khoang - 13
1.2.6. Kỹ thuật lây nhiễm vi rút NPV trên tế bào nuôi nhân 14


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv

1.2.7. Kỹ thuật tạo dạng chế phẩm NPV sâu khoang 15

1.2.8. Kỹ thuật sử dụng chế phẩm NPV sâu khoang 18
1.3. Kết quả nghiên cứu ở trong nước 19
1.3.1. Nghiên cứu về NPV ở Việt Nam 19
1.3.2. Nghiên cứu phân lập, chọn lọc vi rút NPV có hoạt lực cao trong
phòng trừ sâu khoang 21

1.3.3. Nghiên cứu tạo dạng và sử dụng chế phẩm NPV để phòng trừ sâu
hại cây trồng 21

1.3.4. Nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV để phòng trừ sâu hại 23
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 27

2.1. Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu 27
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu 27
2.1.2. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 28
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 28
2.3. Nội dung nghiên cứu 28
2.3.1. Thu thập, phân lập và chọn lọc nguồn vi rút NPV sâu khoang có
hoạt lực cao trong gây chết sâu khoang 28

2.3.2. Nghiên cứu tạo dạng chế phẩm vi rút NPV từ nguồn vi rút được
sản xuất trên tế bào sâu khoang nhân nuôi 28

2.3.3. Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm NPV 29
2.4. Phương pháp nghiên cứu 29
2.4.1. Thu thập, phân lập và chọn lọc nguồn vi rút NPV sâu khoang có
hoạt lực cao trong gây chết sâu khoang 29

2.4.2. Nghiên cứu tạo dạng chế phẩm vi rút NPV từ nguồn vi rút được
sản xuất trên tế bào sâu khoang nhân nuôi 34

2.4.3. Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm NPV 35


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v

2.5. Phương pháp xử lý số liệu 36

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37
3.1. Nghiên cứu phân lập tạo thực liệu virút NPV sâu khoang 37

3.1.1. Thu thập, phân lập sâu khoang nhiễm bệnh ngoài tự nhiên 37
3.1.2. Phân lập và chọn lọc nguồn thực liệu vi rút NPV có hoạt lực cao - 38
3.1.2.1. Hiệu lực của các nguồn thực liệu vi rút NPV thu ngoài đồng 38
3.1.2.2. Hiệu lực của các nguồn vi rút NPV qua các lần tuyển chọn 39
3.2. Thăm dò tạo dạng bột thấm nước chế phẩm NPV sâu khoang 56
3.2.1. Phân lập thể vùi tinh của vi rút NPV sau lây nhiễm trên tế bào 56
3.2.2. Sản xuất thử nghiệm chế phẩm NPV dạng bột thấm nước 60
3.3. Hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm NPV sau tạo dạng 64
3.3.1. Hiệu lực gây chết sâu khoang trong phòng thí nghiệm 64
3.3.2. Hiệu lực phòng trừ sâu khoang ngoài đồng ruộng 67
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 71
1. Kết luận 71
2. Đề nghị 71
TÀI LIỆU THAM KHẢO 72
1. Tiếng Việt 72
2. Tiếng Anh 74
PHỤ LỤC 1: MỘT SỐ HÌNH ẢNH HOẠT ĐỘNG 78
PHỤ LỤC 2: XỬ LÝ SỐ LIỆU 79






Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi


DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

BVTV Bảo vệ thực vật

CS
CT
Cộng sự
Công thức
DMSO Dimethyl Sulfoxide
FBS Fetal Bovine Serum
GV Vi rút hạt (Granular virus)
KTCN Kỹ thuật công nghệ
NPV Vi rút nhân đa diện (Nucleo Polyhedrosis Virus)
NPV-Spl Vi rút NPV sâu khoang
NSP
NSN
Ngày sau phun
Ngày sau nhiễm
OB
Thể vùi (Oclusion Body)
PBS Phosphate Buffered Saline
PIB
Thể vùi (Polyhedra Inclusion Body)
SDS
TL
Sodium Dodecyl Sulphate
Thực liệu
WP Bột thấm nước (Wetable powder)
2WP Bột thấm nước hàm lượng 2 tỷ thể vùi/gam












Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii



DANH MỤC BẢNG
Bảng 3. 1. Tỷ lệ sâu khoang nhiễm NPV trên các cây trồng qua các kỳ điều
tra (Hà Nội, 2013) 37

Bảng 3. 2. Hoạt lực gây chết sâu khoang và khả năng sinh thể vùi của các
nguồn thực liệu vi rút đã thu thập 39

Bảng 3. 3. Hoạt lực gây chết sâu khoang và khả năng sinh thể vùi sau phân
lập lần 1 của các nguồn vi rút NPV đã thu được 40

Bảng 3. 4.Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành từ nguồn M1
sau phân lập lần 2 42

Bảng 3. 5.Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành từ nguồn M2
sau phân lập lần 2 43

Bảng 3. 6.Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành từ nguồn M3
sau phân lập lần 2 44

Bảng 3. 7.Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành từ nguồn M1

sau phân lập lần 3 45

Bảng 3. 8. Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành từ nguồn M2
sau phân lập lần 3 46

Bảng 3. 9. Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành từ nguồn M3
sau phân lập lần 3 47

Bảng 3. 10. Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành từ nguồn M1
sau phân lập lần 4 48

Bảng 3. 11. Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành từ nguồn M2
sau phân lập lần 4 49

Bảng 3.12. Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành từ nguồn M3
sau phân lập lần 4 50



Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii

Bảng 3. 13. Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành từ nguồn M1
sau phân lập lần 5 51

Bảng 3. 14. Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành từ nguồn M2
sau phân lập lần 5 52

Bảng 3. 15. Hoạt lực trừ sâu và hàm lượng thể vùi hình thành từ nguồn M3
sau phân lập lần 5 53


Bảng 3. 16. Các nguồn vi rút NPV sâu khoang tiềm năng đã được chọn lọc
sau 5 lần phân lập 54

Bảng 3. 17. Hiệu lực gây chết sâu khoang và khả năng sinh thể vùi của các
nguồn vi rút NPV sau tuyển chọn 55

Bảng 3. 18. Các chủng NPVSpl sử dụng trong phân tích phả hệ 59
Bảng 3. 19. Hàm lượng thể vùi của các sản phẩm sau tạo dạng 60
Bảng 3. 20. Hiệu lực gây chết sâu khoang của các dạng sản phẩm 60
Bảng 3. 21. Hiệu lực gây chết sâu khoang tuổi 1; 2 và 3 của chế phẩm trong
phòng thí nghiệm 65

Bảng 3. 22. Hiệu lực gây chết non sâu khoang tuổi 4 và 5 của chế phẩm
trong phòng thí nghiệm 66

Bảng 3. 23. Hiệu lực phòng trừ sâu khoang trên bắp cải của chế phẩm 68
Bảng 3. 24. Hiệu lực của chế phẩm ở các liều lượng phun khác nhau đối
với sâu khoang trên đậu tương (Từ Liêm, 2014) 69














Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ix





DANH MỤC HÌNH
Hình 1. 1. Nhộng (A) và Ngài vũ hóa khỏe (B) Nhộng (C) và Ngài vũ hóa
bị biến dạng do nhiễm NPV (D) 11

Hình 1. 2. Sâu khoang khỏe (A) và sâu khoang chết do nhiễm NPV (B) 12
Hình 2. 1. Các bước để phân lập vi rút NPV sâu hại 30
Hình 3. 1. Thể vùi NPV phân lập từ sâu khoang bị bệnh ngoài đồng 39
Hình 3. 2. Thể vùi tinh được lưu giữ 53
Hình 3. 3. Tế bào sâu khoang nhiễm NPV (A); Thể vùi tinh (B) 57
Hình 3. 4. Kết quả phân tích PCR các mẫu NPV sâu khoang 58
Hình 3. 5. Cây phả hệ xây dựng theo phương pháp Neighbor-joining. 59
Hình 3. 6. Sản phẩm dạng bột thấm nước đóng gói khối lượng 10gam/gói - 63






Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 1

MỞ ĐẦU
1.Tính cấp thiết của đề tài
Các nhà khoa học đã xác định vi rút lây nhiễm trên sâu khoang là loài

vi rút nhân đa diện (Nucleo Polyhedrosis Virus- NPV) thuộc họ Baculoviridae
và thuộc nhóm vi rút sinh thể vùi, mỗi thể vùi có chứa tới 200 thể vi rút
(virion) hình que có vỏ ngoài là protein bao bọc phân tử ADN (nhân) dạng
vòng xoắn kép. Thể vùi của NPV côn trùng có hình khối đa diện với kich
thước từ 0,15- 15µm. NPV-Spl rất chuyên tính và có hiệu quả gây chết cao
đối với sâu khoang, không lây nhiễm trên các loài không phải là ký chủ của
nó. (Grzywacz, et al. (1996) [23].
Theo kết quả nghiên cứu của Viện Bảo vệ thực vật (2001) [13], vi rút
NPV có vai trò quan trọng góp phần điều tiết số lượng quần thể sâu khoang
cũng như các loài côn trùng bộ Cánh phấn khác trên đồng ruộng. Kết quả theo
dõi đã xác định khi sâu khoang phát sinh ở mật độ cao, thì tỷ lệ sâu bị chết do
nhiễm NPV từ 0,2- 1,5% trên rau bắp cải, từ 0,9- 1,6% trên đậu tương và từ
0,3- 1,9% trên lạc.
Các chế phẩm sinh học s
ử dụng tác nhân vi rút NPV đều rất chuyên
tính và có hiệu quả cao trong phòng trừ sâu hại cây trồng nông, lâm nghiệp.
Tuy nhiên, các loại vi rút chỉ có thể tồn tại, phát triển được trong các tế bào
sống và trong điều kiện môi trường thích hợp. Vì vậy, việc sản xuất chế phẩm
vi rút đòi hỏi phải được thực hiện trên cơ thể sâu hoặc trên các mô, tế bào sâu
còn sống. Nhưng lâu nay, việc sản xuất NPV vẫn tiến hành theo phương pháp
thủ công với quy mô nhỏ hẹp. Bằng cách nuôi sâu sống số lượng lớn, sau đó
nhiễm vi rút NPV của loài sâu tương ứng, rồi nghiền lọc và đem ra sử dụng.
Theo cách này, sản xuất chế phẩm NPV để trừ sâu hại khó có thể thực hiện
với quy mô công nghiệp, vì để nuôi được số lượng lớn một loài sâu hại
phụcvụ sản xuất chế phẩm là một vấn đề khó kh
ăn và phải có đủ nhà xưởng,
trang thiết bị cần thiết.


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2


Để khắc phục những hạn chế nói trên, các nước như: Mỹ, Hà Lan,
Canada, Đức, Trung Quốc, Ấn Độ, v.v. đã ứng dụng công nghệ nuôi nhân tế
bào côn trùng để sản xuất các loại chế phẩm NPV với quy mô công nghiệp.
Tại Nga đã có chế phẩm NPV dạng bột thương phẩm với tên là VIRIN Ha,
VIRIN Dp để trừ sâu xanh hại thuốc lá, cà chua, sâu róm thông, v.v. Tại
Trung Quốc đã nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học đ
a chức năng V-Bt
để trừ sâu hại trên hàng vạn hecta bông, thuốc lá, cà chua, đậu đỗ, v.v. và
nhiều sản phẩm vi rút NPV được sản xuất trên cơ sở nuôi nhân tế bào côn
trùng đã được thương mại hóa như Keyun HaNPV dạng dịch lỏng để trừ sâu
xanh, Keyun PxGV dạng dịch lỏng trừ sâu tơ hại bắp cải, Keyun SeNPV dạng
bột thấm nước và dạng dịch thể trừ sâu keo da láng, Keyun Spl-NPV dạng bột
thấm n
ước trừ sâu khoang, v.v.
Để góp phần vào việc khai thác, phát triển và sử dụng các tác nhân
sinh học phục vụ phòng trừ sâu hại cây trồng, tôi tiến hành nghiên cứu đề
tài: “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV (Nucleo Polyhedrosis Virus)
trên tế bào sống để phòng trừ sâu khoang (Spodoptera litura)”
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
Nghiên cứu thăm dò sản xuất chế phẩm NPV theo công nghệ nuôi
nhân tế bào để phòng trừ sâu khoang hại cây trồng nông nghiệp.
3. Yêu cầu cần đạt
- Thu thập, phân lập và tuyển chọn được 1-2 nguồn thực liệu vi rút
NPV từ đồng ruộng có hoạt lực cao trong gây chết sâu khoang và có khả
năng sinh thể vùi lớn.
- Thử nghiệm sản xuất chế phẩm NPV dạng bột thấm nước trên cơ sở
lây nhiễm vi rút trên tế bào sâu khoang đã được nhân nuôi sẵn.
- Đánh giá được hiệu quả gây chết sâu khoang trong điều kiện trong
phòng thí nghiệm và ngoài đồng ruộng.



Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 3

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
+ Ý nghĩa khoa học
Kết quả thực hiện đề tài sẽ đóng góp tư liệu khoa học về tiềm năng sinh
thể vùi và hiệu quả gây chết của vi rút NPV sâu khoang trên đồng ruộng tại
các vùng sản xuất nông nghiệp ngoại thành Hà Nội.
Đồng thời, bước đầu cung cấp các dẫn liệu khoa học về khả năng lây
nhiễm vi rút NPV thu thậ
p ngoài đồng ruộng trên tế bào sâu khoang sau khi
được nhân nuôi trên môi trường nhân tạo.
+ Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả thu thập, phân lập và tuyển chọn nguồn vi rút NPV sâu khoang có
hoạt lực cao sẽ góp phần khai thác nguồn tài nguyên hữu ích trong tự nhiên.
Đồng thời, góp phần tạo thực liệu phục vụ sản xuất chế phẩm thử nghiệm sản
xuất chế phẩm trên cơ sở lây nhiễm NPV trên tế bào đã được nuôi nhân sẵ
n.
Kết quả đánh giá hiệu quả trừ sâu khoang của chế phẩm NPV có ý
nghĩa to lớn trong việc hướng tới xây dựng kỹ thuật sử dụng chế phẩm để
phòng trừ sâu khoang. Từ đó, hạn chế sử dụng thuốc trừ sâu hóa học độc hại,
phục vụ sản xuất nông sản an toàn, góp phần cải thiện và nâng cao chất lượng
nông sản , bảo tồn các loài sinh vậ
t có ích và bảo vệ môi trường đồng ruộng
5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
5.1. Đối tượng nghiên cứu
- NPV sâu khoang
5.2. Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu thu thập, chọn lọc chủng NPV có hoạt lực cao gây chết đối

với sâu khoang tại Mê Linh, Đông Anh, Từ Liêm.
Xác định kỹ thuật tạo dạng cũng như cách sử dụng có hiệu quả của chế
phẩm NPV-Spl để phòng trừ sâu khoang hại cây trồng.


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 4

CHƯƠNG I
CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Cơ sở khoa học của đề tài nghiên cứu
Tác nhân vi rút NPV đều rất chuyên tính và có hiệu quả cao trong
phòng trừ sâu hại cây trồng nông, lâm nghiệp. Trên đồng ruộng, vi rút NPV
thường phát sinh gây chết sâu hại với tỷ lệ khá cao, kết quả theo dõi liên tục
từ năm 1988 đến 1995 trên đay tại Đan Phượng (Hà Tây cũ) đã xác định tỷ lệ
sâu đo xanh chết cao nhất do NPV c
ủa các năm biến động từ 31,1% (năm
1995) đến 66,6% (năm 1992) (Nguyễn Văn Cảm và CS, 1996) [2]. Còn trên
sâu khoang hại trên cây đậu tương và lạc thường có tỷ lệ chết do vi rút NPV
đạt từ 1,2- 12,5%.
Theo Pourmirza (2000) [34],vi rút NPV sau khi xâm nhập vào cơ thể
côn trùng sẽ nhân lên ngay trong nhân hoặc trong nguyên sinh chất của tế bào,
phá hủy các mô và làm cho vật chủ chết. Những côn trùng còn sống sót vẫn tiếp
tục bị ảnh hưởng trong giai đoạn nhộng (nhộng bị thối, ngài v
ũ hóa bị biến
dạng), trong giai đoạn trưởng thành thì tuổi thọ giảm và khả năng đẻ trứng kém,
gây ảnh hưởng tới số lượng quần thể ở các thế hệ sau. Nguồn vi rút tồn đọng
trong tự nhiên tiếp tục chờ cơ hội nhờ quá trình canh tác, làm đất hoặc mưa gió
sẽ xâm nhiễm gây hại cho sâu hại ở các thế hệ tiếp theo.
Trên đồng ruộng, vi rút NPV thường phát sinh gây ch
ết sâu hại với tỷ lệ

khá cao và luôn tồn tại dưới dạng thể vùi, các thể vùi có thể tồn tại tới 30 năm
và chỉ bị tiêu diệt thể vùi khi gặp phải môi trường đất, nước có pH ≥ 9,0
hoặcbám dính trên thân cây, lá cây hay tàn dư cây trồng ở vị trí bị phơi dưới
ánh sáng trực xạ cũng như cực tím (Grzywacz, et al.1996) [23].
Hơn nữa, các loài vi rút gây chết trên côn trùng, sâu hại thường có đặc
điể
m chuyên cao với ký chủ của chúng. Do vậy, vi rút gây bệnh côn trùng
ngày càng được chú ý nghiên cứu và được coi là một trong những nhân tố có


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 5

triển vọng trong phát triển sản phẩm bảo vệ thực vật, phục vụ đấu tranh sinh
học phòng chống sâu hại cây trồng.
Như vậy, việc sử dụng chế phẩm vi rút NPV vừa có ý nghĩa như một
loại thuốc sinh học sử dụng trong phòng trừ sâu hại, vừa bổ sung nguồn vi rút
hữu ích vào đồng ruộng, góp phần bảo vệ, duy trì quần thể các sinh vật có ích,
đảm bả
o an toàn sức khoẻ người lao động, môi trường và chất lượng sản
phẩm khi thu hoạch.
1.2. Kết quả nghiên cứu ở nước ngoài
1.2.1. Vài nét về sâu khoang (Spodoptera litura) hại cây trồng
Là đối tượng sâu hại có tại hầu hết các vùng rau ăn lá trong cả nước,
nhất là rau thập tự và rau muống. Sâu khoang có thể sống và gây hại tới 290
loài cây thuộc 90 họ thực vật khác nhau. Sâu khoang là đối tượng sâu hại
quan trọng trên rau muống, rau thập tự, cà chua, đậ
u tương, lạc, v.v. Sau khi
trứng nở, sâu non tuổi nhỏ thường sống tập trung và gặm nhấm phần thịt lá ở
mặt dưới. Khi sâu lớn từ cuối sâu tuổi 2, chúng phân tán và ăn khuyết lá, thậm
chí ăn trụi toàn bộ lá cây, nụ, hoa và quả non.

Trứng đẻ thành ổ, to như hạt đậu xanh và có lớp lông màu nâu vàng
bao phủ bên ngoài. Bên trong chứa nhiều trứng và trứng có hình bán cầu,
đường kính từ 0,4- 0,5mm màu trắng vàng, sau chuyển màu vàng tro, đến khi
sắp n
ở trứng có màu tro tối.
Sâu non hình ống tròn, khi đẫy sức sâu dài từ 38- 51mm, màu nâu đen
hoặc nâu tối. Trên lưng có vạch lưng và vạch phụ lưng màu vàng nhạt. Sâu
non tuổi 1 và 2 thường sống tập trung gây hại ở mặt dưới lá, triệu chứng lá bị
hại rất dễ nhận biết.
Khi sâu lớn từ cuối tuổi 2 trở đi, chúng di chuyển và sống phân tán,
ban đêm bò lên cắn phá, ban ngày thì ẩn nấp dưới gốc cây, kẽ
lá hoặc nằm
dưới lớp tàn dư thực vật.


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 6

Nhộng sâu khoang màu nâu tươi hoặc nâu đậm và bóng, dài 18- 21mm.
Trưởng thành có thân dài từ 16- 21mm và sải cánh từ 37- 42mm. Ở 2 cánh
trước có màu nâu tối và 2 cánh sau màu trắng trong phản quang màu tím.
Trưởng thành ưa thích mùi vị chua ngọt và thường hoạt động vào thời gian từ
chiều tối đến nửa đêm.
Các nhà khoa học đã xác định thời gian vòng đời sâu khoang khá dài từ
20,0- 60,0 ngày tuỳ theo điều kiện nhiết độ không khí cao hay thấp. Nhìn
chung, sâu non sâu khoang phát dục trong thời gian dài, nên khả năng và mức
độ gây h
ại cây trồng của chúng khá lớn.
Sâu khoang là đối tượng có tiềm năng sinh sản cao, một trưởng thành
cái có thể đẻ từ 491,9 – 668,0 trứng và tỷ lệ trứng nở đạt từ 97,6- 98,9%.
Trên rau thập tự, rau muống, khoai sọ, v.v. sâu khoang phát sinh quanh

năm và có sự luân chuyển từ cây này sang cây khác. Đặc biệt sâu thường phát
sinh thành dịch nặng tại các ruộng rau gần mương nước, ao hồ, đầm. Tuy
nhiên, nếu gặp nhiệt độ không khí thấp, mưa xuân ẩ
m ướt hoặc có mưa lớn
vào cuối tháng 10 hàng năm thì sâu khoang bị chết nhiều do sự phát triển xâm
nhiễm của vi rút NPV (Nucleo Polyhedrosis Virus) và nấm có ích Beauveria.
Sau khi phá hại trên rau thập tự, đến mùa đông và xuân, sâu khoang di chuyển
sang khoai sọ, khoai lang, rau muống, đậu tương đông để tiếp tục phát triển
quần thể và gây hại trên cây trồng.
1.2.2. Đặc điểm của vi rút NPV
Lịch sử cổ đại ghi nhận những phát hiện về bệnh t
ằm dâu và ong khi
con người bắt đầu nhân nuôi, thuần dưỡng hai loài côn trùng có ích này.Năm
384-322 Trước Công nguyên Aristotle đã miêu tả bệnh của ong, nhưng người
Trung Quốc đã có những quan sát về bệnh tằm dâu từ 2700 năm Trước Công
nguyên.Đến năm 1856, Cornalia và Maestri [19] đã mô tả bệnh tằm nghệ -
bệnh vi rút. Các tác giả này đã phát hiện thấy các thể đa diện trong cơ thể tằm.


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 7

Bolle (1898) mô tả sự hoà tan thể đa diện trong ruột tằm và giải phóng các
hạt .Năm 1919, Akkva, Komarek và Breidl (1923)đã phát hiện dịch qua lọc có
bản chất vi rút và dịch lọc này có khả năng gây bệnh, tạo nên những thể đa
diện ở côn trùng).(dẫn theo Phạm Văn Lầm, 1995 [6])
Người đầu tiên nhìn thấy vi rút gây bệnh côn trùng là Bergold
[16]trong những công trình công bố 1943-1947 sau khi có kính hiển vi điện
tử.
Vi rút NPV thuộc họ Baculoviridea là một trong 7 thành viên thuộc
nhóm vi rút ký sinh côn trùng. Vi rút NPV ở thể hình gậy kích thước 330-80

nm. Baculovirus thuộc họ Baculoviridae chỉ có một chi. Chi này được chia
thành các nhóm phụ là vi rút đa diện nhân (NPV), vi rút hạt (GV) và Oryctes
giống vi rút (OV).
Vi rút NPV có dạng hình gậy, chứa ADN, nucleocapsid, có kích thước
35- 50 x 200 - 320 nm. Các hạt vi rút có một lớp bọc bên ngoài gọi là nhân
capsid. Hơn nữa NPV có một đặc tính là hình thành các protein tinh thể trong
nhân của tế bào côn trùng với kích thước 0,5 - 15 nm.
Vi rút NPV có cấu tạo gồm: vỏ ngoài, vỏ capsid, và lõi axit nucleic.
- Vỏ ngoài: là một lớp màng nhầy ngoài cùng có tính chất là protein và
g
ọi là protein ngoài. Protein ngoài mang trính kháng nguyên và có tác dụng
kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể vật chủ.
- Vỏ capsid: Vỏ capsid nằm kế tiếp bên trong lớp vỏ ngoài và được
ngăn cách với lớp vỏ ngoài bởi một lớp keo dính. Protein cấu tạo nên vỏ
Capsid được gọi là protein trong. Protein trong mang tính kháng nguyên làm
tăng khả năng gây bệnh của vi rút.
- Genom: Genom của vi rút NPV là một phân tử ADN gồm 2 mạch
xoắn kép (ADN ds). Khi nhiễm vào tế bào v
ật chủ vi rút tuồn lõi ADN vào tế
bào vật chủ, ADN của vi rút sử dụng năng lượng, nguyên liệu và riboxom của
tế bào vật chủ để tổng hợp nên protein và quá trình nhân lên của ADN. Mặt


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 8

khác khi tế bào bị nhiễm vi rút, ADN của vi rút sinh ra men azenaza ức chế
ADN của tế bào chủ và phân giải tạo thành các nucleotit tự do. Sau khi tổng
hợp đủ các thành phần như vỏ, ADN (lõi…), vi rút tiến hành lắp ráp để tạo
thành thể vi rút mới.
Quá trình nhân lên của vi rút NPV và sự hình thành thể đa diện được

tiến hành trong nhân tế bào, vỏ của thể đa diện được tổng hợp ở ngoài nhân
sau đó vận chuyển vào trong nhân để hình thành các thể đ
a diện. Số lượng vi
rút và thể đa diện ngày một tăng, kêt quả phá vỡ tế bào chủ, giải phóng vi rút
tự do và thể đa diện. Vi rút tự do lại tiếp tục xâm nhập vào tế bào lân cận, bắt
đầu chu trình phá vỡ tế bào tiếp theo. Các tế bào chủ bị phá vỡ, quá trình phát
bệnh biểu hiện ra bên ngoài.
Vi rút NPV tồn tại ở 2 dạng:
+ Dạng tự do (NPV hình thành thể vùi đa diện PIB) chứa mộ
t nhân
capsidtrong một vỏ bọc vi rút. Do đó NPV loại này được gọi là SNPVs (hoặc
SEVs)): Dễ bị bất hoạt hơn khi ngâm trong cồn 70 %, vi rút tự do bất hoạt trong
vòng 5 phút (nếu ở thể đa diện vi rút bị bất hoạt trong vòng 3 giờ). Trong cơ thể
dạng tự do có thể xâm nhập tế bào gây nhiễm ngay.
+ Dạng thể đa diện (NPV hình thành các thể vùi đa diện chứa nhiều
nhân capsid trong một vỏ vi rút gọi là MNPVs (hoặ
c MEVs) : Theo
Rammosca & Hink (1974) [36], thể đa diện còn được gọi là thể bao hàm, thể
đa diện chứa khoảng 3-5 % hạt vi rút thành thục còn lại là protein. Vỏ của thể
bao hàm là protein loại polyhedrin. Polyhedrin dễ bị thủy phân trong môi
trường kiềm. Do đó trong dịch ruột của sâu khoang pH là 9-10 các thể đa diện
bị phá vỡ giải phóng các hạt vi rút tự do. Vi rút xâm nhập vào tế bào máu đến
tế bào da, tế bào biểu mô khí quản, tế bào mỡ và các cơ quan khác trong cơ
th
ể sâu để gây bệnh. Cuối cùng làm sâu bị chết.
Trong môi trường tự nhiên vi rút NPV thường tồn tại ở 2 dạng :


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 9


- Dạng tự do dễ gây bệnh, nó xâm nhập vào đường miệng qua thức ăn,
qua các vết xây xước trên da sâu non của sâu hại.
- Thể đa diện (còn gọi là thể vùi) thường tồn tại trên tàn dư thực vật. Nhờ
quá trình canh tác, các thể vùi bám trên lá cây, khi sâu ăn thực vật thì thể vùi
đi theo đường miệng vào ruột. Các khối đa diện có đặc điểm dễ bị kiềm hoá,
dùng 1/10N NaOH có thể phá vỡ các vỏ
đa diện giải phóng các virion. Chính
vì vậy, trong ruột côn trùng, dịch ruột mang tính kiềm nên các polyhedra dễ bị
phân huỷ để lây nhiễm tiếp vào các nhân của các tế bào khác. Mỗi
nucleocapsid chỉ chứa một sợi đôi ADN dạng vòng. Trọng lượng phân tử của
thể đa diện từ 5 – 100 x 10
6
Da.
Tại ruột giữa, do tác động của pH cao giúp phá vỡ vỏ protein và giải
phóng ra các thể hoạt động (các virion). Một phần bị thải ra ngoài do tác dụng
của protein huỳnh quang đỏ trong dịch tiêu hóa của ruột, phần lớn xâm nhập
vào tế bào gây bệnh tại chỗ, sau đó theo máu đến các cơ quan nội tạng khác
nhau trong cơ thể lây nhiễm và gây bệnh.
Khi tiếp xúc với tế bào, trên lớp vỏ của vi rút có khả năng giúp cho vi
rút gắ
n với thực thể của tế bào để xâm nhập vào bên trong, quá trình tổng hợp
protein và ADN của vi rút được tiến hành trong nhân và có thể quan sát được
băng phương pháp vạch chất đồng vị. Protein loại polyhedrin được tổng hợp
ngoài nhân, sau đó vận chuyển vào trong nhân bao lấy các hạt vi rút thành
thục tạo thành thể đa diện.
Phân tích trên kính hiển vi điện tử thấy các thể vùi đa diện nhân là
những tinh thể lớn, nhiều cạnh, có d
ạng như hình que, hình vuông, kích thước
từ 1- 4μm. Các thể vùi này có cấu tạo bởi các thể protein. Các lát cắt cực
mỏng phóng đại trên 60.000 lần cho thấy các khối đa diện chứa nhiều virion

hình que. Các virion là thể nucleocapsid trong một lớp vỏ bao và nucleopsid
này có dạng hình que.


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 10

Thể đa diện có thể tồn tại ngoài tế bào vật chủ, tận dụng tính chất này
người ta đã sử dụng vi rút NPV để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, tiêu diệt
côn trùng có hại.
1.2.3. Cơ chế gây bệnh của vi rút côn trùng
Khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng, các vi rút nhân lên ngay trong nhân
hoặc trong chất nguyên sinh của tế bào, phá huỷ các mô và làm cho vật chủ
chết. Những côn trùng còn sống sót vẫn tiếp tục bị ảnh h
ưởng trong giai đoạn
nhộng (nhộng bị thối, ngài vũ hoá bị biến dạng), trong giai đoạn ngài (khả
năng đẻ trứng giảm) và ảnh hưởng tới các thế hệ sau. Nguồn vi rút tồn đọng
trong tự nhiên lại gây lây nhiễm cho các thế hệ mới. Trên cơ sở khoa học này,
vi rút gây bệnh côn trùng ngày càng được chú ý nghiên cứu và được coi là
một trong những nhân tố có triển vọng trong phương pháp sinh học để phòng
chố
ng sâu hại cây trồng trong tương lai.
A B
C D


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 11

Hình 1. 1. Nhộng (A) và Ngài vũ hóa khỏe (B) Nhộng (C) và Ngài vũ
hóa bị biến dạng do nhiễm NPV (D)
(Nguồn Nguyễn Thị Như Quỳnh, 2013)

Năm 1923, Tanaka và Kayađã miêu tả hơn 20 họ vi rút gây bệnh cho
côn trùng. Trong đó 2 họ được nghiên cứu nhiều là Baculoviridae và
Reoviridae. Đại diện của họ Baculoviridae là vi rút đa diện nhân (NPV-
Nucleo polyhedrosis virus) và đại diện của họ Reoviridae là vi rút đa diện tế
bào chất (CPV - Cytoplasmic polyhedrosis vi rut).(dẫn theo Ph
ạm Văn Lầm,
1995 [6])
Theo Hukuhara, et al. (2001) [25] thì CPV ký sinh trong 4 bộ côn trùng
hay gặp nhất là bộ cánh vảy (Lepidoptera) có 201 vật chủ, bộ hai cánh (Diptera)
có 39 vật chủ. Tuy nhiên chỉ có CPV của sâu thông Dendrolimus spectabilis là
được sản xuất và đăng ký là thuốc trừ sâu sinh học vi rút. Mặc dù thuốc CPV có
hiệu quả diệt sâu, nhưng người ta vẫn ít quan tâm để phát triển nó hơn
Baculovirus, vì lí do chủ yếu là CPV chỉ tấn công tế bào biểu mô ruột của sâu và
có xu hướng gây ra nhiễ
m trùng mãn tính. Hơn nữa trong điều kiện tự nhiên,
chúng gây bệnh dịch với tỷ lệ thấp và ít ảnh hưởng tới quần thể vật chủ như
Baculovirus. Tuy nhiên chúng có thể nhân nuôi qui mô lớn trong công nghiệp.
Theo các tác giả Granados và Federici (1986); Possee (1993), Tanada
và Kaya (1993),có hơn 600 loài sâu thuộc bộ Lepidoptera, Hymenoptera,
Coleoptera, Diptera, v.v. là vật chủ của Baculovirus. Do đó có rất nhiều
nghiên cứu và sản xuất thuốc trừ sâu vi rút tập trung vào nhóm vi rút này. Hầu
hết Baculovirus thuộc tính chuyên hoá cao, chỉ ký sinh trong mộ
t loài sâu,
thậm chí ký sinh một số mô nhất định nào đó của sâu (Groner, 1986).
Theo (Groner, 1990)Baculovirus của Autographa californica
(AcMNPV) và Baculovirus của Autographa falcifera có vật chủ của hơn 30
loài côn trùng thuộc bộ cánh vảy (Lepidoptera). Cho đến nay, những tác động

Họ
c

có
ch
ư
ng
ừ
ph
ồ
độ
n
th
ấ
N
g

dễ
pH
vi
r
m
à
ra
C
ơ
1
.2

A
c
viện Nông n
g

hại của
B
ư
a được p
h
Sau k
h
ừ
ng ăn.
C
ồ
ng, mọn
g
n
g chậm,
c
ấ
y đầu ch
ú
g
uyên Thà
n
Hình 1.
2
Nguy
ê
mẫn cảm
H
> 9 các
t

r
ion được
g
à
ng này là
ngoài và
t
ơ
chế này
g
2
.4. T
i
ềm
n
Các l
o
A

g
hiệp Việt Nam
B
aculoviru
s
h
át hiện tr
o
h
i NPV và
o

C
ơ thể sâu
g
nước. C
ơ
c
hết nhan
h
ú
c xuống
n
h, 2006)
[
2
. Sâu kho
a
(N
g
ê
n nhân g
â
và xâm n
h
t
hể vùi đa
g
iải phóng
cho phép
t
hâm nhập

g
iống như
c
n
ăn
g
sử d
ụ
o
ài Baculo
v
– Luận văn T
h
s
đối với
o
ng tự nhi
ê
o
cơ thể k
ý
biến đổi
ơ
thể có m
h
. Ngoài đ
ồ
dưới, dịc
[
9].

a
ng khỏe (
A
g
uồn Nguy
â
y chết sâ
u
h
ập vào cá
diện nhan
h
. Các viri
o
thâm nhậ
p
các tế bà
o
c
ơ chế nh
â
ụ
n
g
vi rút
N
v
irus chỉ
l


h
ạc sỹ Khoa h
ọ
thiên địc
h
ê
n.).(dẫn t
h
ý
chủ côn t
r
về màu s
ắ
àu vàng h
o
ồ
ng ruộng
h trắng c
h
A
) và sâu
k
ễn Thị Nh
ư
u
là do khi
c
t
ế bào đ
ó

h
chóng h
o
o
n hấp ph
ụ
p
vào để s
i
o
khác củ
a
â
n lên của
t
N
PV tron
g
l
ây nhiễm
B
ọ
c Nông nghiệ
p
h
và các o
n
h
eo Phạm
V

r
ùng bằng
ắ
c. Sau 1-
o
ặc trắng.
sâu chết
d
h
ảy ra n
g
k
hoang ch
ế
ư
Quỳnh,
2
các hạt v
i
ó
. Dưới tá
c
o
à tan tro
n
ụ
vào màn
g
i
nh sản, p

h
a
vật chủ
v
t
hực khuẩ
n
g
phòn
g
t
r
t
r
ên các l
o
B

p

n
g kí sin
h
V
ăn Lầm,
đường tiê
u
2 ngày c
ơ
Hạ bì dễ

b
d
o vi rút t
h
g
oài.(Phạ
m
ế
t do nhiễ
m
2
013)
i
rút bám
v
c
dụng củ
a
n
g môi tr
ư
g
vi mao.
C
h
á vỡ thàn
h
v
à gây bện
h

n
thể trong
r
ừ sâu hại
o
ài động
v
Pag
h
trưởng t
h
1995 [6])
u
hoá, sâu
ơ
thể sâu
c
b
ị nứt, ch
u
h
ường qua
n
m
Văn Ty,
m
NPV (B
v
ào các tế
a

dịch tiêu
ư
ờng kiềm
,
C
hức năn
g
h
tế bào, t
h
h
cho vật
tế bào.
v
ật chân k
h
e 12
h
ành
non
c
ăng
u
yển
n
sát
Vũ
)
bào
hoá

,
các
g
của
h
oát
chủ.
h
ớp,


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 13

chủ yếu là các loài côn trùng thuộc bộ Lepidoptera. Chúng thuộc họ
Baculoviridae, bao gồm 2 giống: vi rút nhân đa diện (Nucleo Polyhedrosis
Virus- NPV) và vi rut hạt (Granulosis Virus – GV). Theo Yeh, et al.
(2007)[40], hiện nay đã xác định được hơn 600 chủng vi rút thuộc 42 loài
Baculovirus. Trong số đó, có 28 loài NPV được xác định là có thể vùi
(Occlusion Body - OB) chứa lượng lớn các thể vi rút (virion). Các tác giả
cũng chỉ rõ hầu hết các loài NPV trên côn trùng đều có phạm vi ký chủ hẹp và
không lây nhiễm gây hại trên các loài không phải là ký chủ của nó.
Đặc biệt, các loài NPV hoàn toàn không lây nhiễm trên các loài động
vật có xương sống. Vì thế, chúng là những tác nhân sinh học rất hữu ích trong
phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng và là vector hiển thị các gen lạ. Theo Farrar
và Ridgway (1999) [20] thì NPV là nhóm vi rút lớn và có hiệu quả gây chết
cao đối với các loài côn trùng, mỗi loài vi rút thường rất chuyên tính với một
loài ký chủ hoặc một vài loài côn trùng họ hàng gần gũi với ký chủ chuyên
tính của chúng.
1.2.5. Nghiên cứu phân lập, làm thuần thực liệu vi rút NPV sâu khoang
Đã có nhiều tài liệu đã chỉ ra rằng để

có sản phẩm có hàm lượng vi rút
cao và có hiệu quả trong phòng trừ sâu hại thì phải có nguồn thực liệu vi rút
tiêu chuẩn đã được làm thuần và nghiên cứu đầy đủ về kỹ thuật lây nhiễm trên
tế bào nhân nuôi. Theo Grzywacz, et al. (1996) [23], để có nguồn thực liệu vi
rút NPV có hiệu quả, tốt nhất nên phân lập và nuôi nhân từ nguồn NPV trên
các cá thể sâu chết do nhiễm NPV được thu thập ngoài đồng ruộng. Vì chủng
NPV này phù hợp và có hiệu quả cao với nòi sinh thái c
ủa loài sâu hại cần
phát triển chế phẩm NPV để phòng trừ. Các tác giả này đã đưa ra qui trình kỹ
thuật rất chi tiết gồm 8 bước để phân lập và làm thuần nguồn thực liệu vi rút
NPV. Các tác giả này còn khuyến cáo, việc nhân sinh khối nguồn thực liệu vi
rút để phục vụ lây nhiễm tạo chế phẩm tốt nhất nên tiến hành trên nguồn tế


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 14

bào nuôi nhân, như thế sẽ đảm bảo độ thuần và chống lẫn tạp với các loại vi
sinh vật khác.
Lynn,et al. (2002) [29] và một số tác giả khác đã đưa ra qui trình chi
tiết gồm 8 công đoạn kế tiếp nhau. Bao gồm nhân sơ cấp và làm thuần thực
liệu vi rút NPV. Các tác giả cũng khuyến cáo việc làm thuần thực liệu vi rút
NPV để sản xuất chế phẩm và cho các mục đích nghiên cứu khác cần ph
ải
tiến hành 2- 3 lần trên sâu khỏe. Sau đó mới cho lây nhiễm trên tế bào loài sâu
hại đã được nuôi nhân.
Còn kỹ thuật duy trì, bảo quản thực liệu vi rút NPV cũng tiến hành
tương tự như cách làm đối với tế bào gốc, phải tuân theo qui trình 4 bước đã
chỉ dẫn. Cũng theo tác giả này, thì nguồn thực liệu vi rútcó thể bảo quản theo
3 cách khác nhau: 1/ Bảo quản ở nhiệt độ thấp: duy trì ổn định ở
nhiệt độ bảo

quản là 40C – 50
0
C và định kỳ hàng tháng phải tiến hành nhân nuôi phục hồi.
2/ Bảo quản trong nitơ lỏng: là phương pháp bảo quản lâu dài và rất ổn định,
nhưng trước khi bảo quản cần bổ sung vào môi trường bảo quản một số thành
phần trợ giúp như Glyceron và DMSO để hạn chế các thể virion bị chết. 3/
Bảo quản theo phương pháp lạnh đông trong nhiệt độ -80
0
C. Với cách làm đó,
có thể bảo quản thực liệu từ 1 tháng đến 1 năm khi duy trì ở nhiệt độ 4
0
C và
trong tối. Nếu bảo quản thực liệu ở nhiệt độ -70
0
C hoặc ni tơ lỏng thì có thể
duy trì được lâu dài, nhưng trước khi đưa vào bảo quản phải bổ sung thêm
dung dịch BSA từ 0,1 đến 1,0%. Sau đó, cho các tuyp chứa vi rút vào túi ni
lon hoặc hộp nhựa để trong thiết bị bảo quản.
1.2.6. Kỹ thuật lây nhiễm vi rút NPV trên tế bào nuôi nhân
Các kết quả nghiên cứu lây nhiễm vi rút NPV trên tế bào nhân nuôi để
tạo chế phẩm đã được diễn giải khá chi tiết trong nhiều tài liệu. Các tài liệu
này đ
ã chỉ rõ quá trình lây nhiễm sản xuất chế phẩm NPV được thực hiện qua
13 công đoạn kế tiếp nhau với các yêu cầu cụ thể cho mỗi công đoạn. Theo


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 15

kết quả nghiên cứu của Goodman,et al. (2001) [21], nồng độ tế bào khi lây
nhiễm là 0,95 x 10

5
, 2,05 x 10
5
và 5,13 x 10
5
tế bào/ml thì đạt tỷ lệ tế bào bị
nhiễm vi rút NPV tương ứng là 98,5; 99,5 và 100% sau 120 giờ. Sử dụng tỷ lệ
dịch thể khi lây nhiễm là 1:1 và 1:2 thì tỷ lệ tế bào bị nhiễm vi rút NVP tương
ứng là 72,5 và 93,7% trong 120 giờ.Kanokwan, et al. (2003) [27] xác định chỉ
số MOI thích hợp khi sản xuất NPV-Ha sâu xanh là 0,3. Điều đó cho thấy
việc lây nhiễm vi rút NPV trong môi trường có mật độ tế bào thấp sẽ mang lại
hiệu quả cao.
Jakubowska , et al. (2009) [26] xác định pH môi trường có tác động rất
lớn đến khả năng lây nhiễm và hình thành thể vùi của vi rút NPV trên tế bào.
Song yêu cầu về pH cũng rất khác nhau tùy theo tế bào của từng loài côn
trùng khác nhau. Theo kết quả nghiên cứu của tác giả thì hàm lượng thể vùi
thu được đạt hàm lượng cao nhất khi pH môi trường trong phạm vi từ 6,5- 7,0
đối với tế bào sâu xanh.
Theo Agathos, et al.(1994) [15], Maiorella, et al. (1988) [30]và nhiều
tác giả khác thì bình chứa dịch tế bào để lây nhiễm vi rút NPV chỉ nên chi
ếm
2/3 tổng dung tích bình chứa, pha loãng để đảm bảo mật độ tế bào từ 0,5- 1,0
x 10
6
tế bào/ml để qua 1 ngày đêm. Nếu kiểm tra thấy tế bào tiếp tục phân
chia trở lại thì mới tiến hành lây nhiễm vi rút NPV. Các tác giả còn đề xuất
một công thức tính toán liều lượng NPV lây nhiễm thích hợp để đạt hiệu quả
cao dựa vào chỉ số MOI (Mức độ lây nhiễm) của vi rút đối với tế bào. Lynn,
et al.(2002) [29]xác định chỉ số MOI thích hợp đối với NPV khi nhiễm trên tế
bào Sf- 9 là 0,1. Nhiễm vi rút NPV với dòng tế

bào sâu đo xanh (Trichoplusia
ni) thích hợp với chỉ số MOI = 0,4 (Potter, et al. 1976) [35].

1.2.7. Kỹ thuật tạo dạng chế phẩm NPV sâu khoang
Theo kết quả nghiên cứu của tác giả trên thế giới về đặc điểm tồn tại
của vi rút NPV, đã xác định thể vùi của vi rút NPV có thể tồn tại trong