BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI













PHAN THỊ HƯƠNG




TẠO CÂY LÚA CHUYỂN GEN MANG MIRNA NHÂN TẠO
ỨC CHẾ ðẶC HIỆU GEN MỤC TIÊU MPG1
CỦA NẤM ðẠO ÔN MAGNAPORTHE GRISEA




LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI - 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI













PHAN THỊ HƯƠNG



TẠO CÂY LÚA CHUYỂN GEN MANG MIRNA NHÂN TẠO
ỨC CHẾ ðẶC HIỆU GEN MỤC TIÊU MPG1
CỦA NẤM ðẠO ÔN MAGNAPORTHE GRISEA




CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ: 60.42.02.01


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :
PGS. TS. NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO





HÀ NỘI - 2013
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
ii

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là
trung thực và chưa từng ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào.
Tôi xin cam ñoan mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã
ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn ñã ñược ghi rõ nguồn gốc.


Tác giả



Phan Thị Hương



Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
iii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn Thị
Phương Thảo, Trưởng khoa Công nghệ sinh học - Trường ðại học Nông
nghiệp Hà Nội, người ñã tận tình dạy bảo, hướng dẫn, tạo ñiều kiện cho tôi
ñược học tập, làm việc và thực hiện luận văn tại bộ môn Công nghệ sinh học
thực vật.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và cán bộ công tác tại bộ môn
Công nghệ sinh học thực vật - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã giúp
ñỡ, ñộng viên và tạo mọi ñiều kiện cho tôi thực hiện ñề tài tại phòng thí
nghiệm.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy PGS. TS. Nguyễn Văn Viên,
TS. Hà Viết Cường ñã tận tình giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập và
nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh ñạo Trung tâm Khảo nghiệm
Khuyến nông Khuyến ngư ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận
văn này.
Với tất cả lòng biết ơn, tôi xin cảm ơn gia ñình bố mẹ và các anh chị,
những người ñã tin tưởng, ñộng viên, khích lệ và là nguồn ñộng lực giúp tôi
học tập và làm việc.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn bạn bè ñã quan tâm, chia sẻ, giúp ñỡ tôi
trong suốt quá trình học tập và trong cuộc sống.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng 9 năm 2013
Tác giả


Phan Thị Hương
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
iv

MỤC LỤC


Lời cam ñoan ii
Lời cảm ơn iii
Mục lục iv
Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt vii
Danh mục các bảng viii
Danh mục các hình ix
MỞ ðẦU 1
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5
1.1 Khái quát về cây lúa 5
1.2 Biến ñổi khí hậu và bệnh ñạo ôn trên lúa. 6
1.2.1 Biến ñổi khí hậu 6
1.2.2 Bệnh ñạo ôn trên lúa 7
1.3 Phân tích di truyền gen kháng bệnh ñạo ôn của cây lúa 9
1.4 Phân tích genome nấm ñạo ôn và công nghệ RNAi trong phòng
chống bệnh ñạo ôn trên lúa 13
1.4.1 Phân loại nấm ñạo ôn 13
1.4.2 Phân tích genome của nấm ñạo ôn 14
1.4.3 Công nghệ RNAi và ứng dụng trong phòng chống bệnh ñạo ôn. 15
1.5 Ứng dụng cây trồng biến ñổi gen và thực trạng nghiên cứu
chuyển gen vào lúa 22
1.5.1 Ứng dụng cây trồng biến ñổi gen 22
1.5.2 Nghiên cứu chuyển gen vào cây lúa trên thế giới 23
1.5.3 Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào cây lúa ở Việt Nam 26

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
v

2.1 Vật liệu nghiên cứu 29
2.1.1 Vật liệu thực vật 29
2.1.2 Chủng vi khuẩn A.tumefaciens 29
2.1.3 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 30
2.2 ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 30
2.2.1 ðịa ñiểm nghiên cứu 30
2.2.2 Thời gian nghiên cứu 30
2.3 Phương pháp nghiên cứu 30
2.3.1 Khảo sát khả năng tái sinh của một số giống lúa Indica và
Japonica Việt Nam 30
2.3.2 Xác ñịnh ảnh hưởng của kháng sinh ñến sự sinh trưởng của mô sẹo. 33
2.3.3 Chuyển vector mang pre-amiR-P1 nhân tạo ức chế gen MPG1 ở
nấm ñạo ôn (M.grisea) vào lúa bằng vi khuẩn A.tumefaciens. 34
2.3.4 Phân tích cây chuyển gen bằng PCR 36
2.3.5 ðánh giá sinh trưởng, phát triển của 22 dòng lúa chuyển gen
trồng trong chậu vại ở nhà lưới 38
2.4 Phương pháp xử lý số liệu 38
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39
3.1 Khảo sát khả năng tái sinh của một số giống lúa Indica và
Japonica trồng tại Việt Nam 39
3.1.1 Khảo sát khả năng cảm ứng tạo mô sẹo của một số giống lúa 40
3.1.2 Khảo sát khả năng tái sinh cây từ mô sẹo của một số giống lúa 44
3.2 Xác ñịnh ảnh hưởng của kháng sinh ñến sự sinh trưởng của mô sẹo. 49
3.3 Chuyển vector pPS1-pre-amiR-P1 vào lúa bằng vi khuẩn
A.tumefaciens 50
3.4 Phân tích cây chuyển gen bằng PCR 58

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
vi

3.4.1 Kiểm tra sự có mặt của promoter 2x35S trong 22 dòng lúa J02
chuyển gen 58
3.3.2 PCR kiểm tra sự có mặt của gen chuyển pre-amiR-P1 trong 22
dòng lúa J02 chuyển gen 59
3.5 Sinh trưởng, phát triển của 22 dòng lúa chuyển gen trong chậu vại 59
KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 61
Kết luận 61
ðề nghị 61
TÀI LIỆU THAM KHẢO 63
PHỤ LỤC 69
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
vii

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

STT Kí hiệu, chữ viết tắt Từ viết tắt
1 amiRNA Artificial microRNA - microRNA nhân tạo
2 B5 Môi trường Gamborg (1963)
3 BA 6-Benzyl Amino purine
4 BðKH Biến ñổi khí hậu
5 Bp Base pair- Cặp bazơ
6 CIRAD French Agricultural Research Centre for
International Development – Trung tâm nghiên
cứu phát triển nông nghiệp Pháp
7 Cs Cộng sự
8 GMO Genetically Modified Organism - sinh vật biến
ñổi gen

9 Kb Kilo base
10 miRNA microRNA
11 MS Môi trường Murashige và Skoog (1962)
12 N6 Môi trường Chu và cộng sự (1975)
13 Nts Nucleotides
14 α-NAA α-Napthalene acetic acid
15 PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi
trùng hợp
16 QTL Quantitative trait loci - Di truyền tính trạng số
lượng
17 RISC RNA Inducing Silencing Complex - Phức hợp
làm câm cảm ứng bởi RNA
18 RNAi RNA interfering - RNA tương tác
19 sRNA Small RNA – RNA kích thước nhỏ
20 siRNA Small interfering RNA - RNA can thiệp kích
thước nhỏ
21 shRNA Short hairpin RNA - RNA kẹp tóc
22 T-DNA Transfer DNA
23 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
viii

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT Tên bảng Trang

2.1 Danh sách giống lúa sử dụng trong nghiên cứu 29
2.2 Một số ñặc ñiểm của trình tự miRNA ñã thiết kế 30
2.3 Công thức môi trường khảo sát khả năng tạo mô sẹo 32
2.4 Các công thức môi trường khảo sát khả năng tái sinh cây 33

2.5 Các công thức thời gian lây nhiễm dịch khuẩn với mô sẹo 35
2.6 Một số ñặc ñiểm cặp mồi nhân gen pre-amiR-P1 37
3.1 Tỷ lệ hình thành mô sẹo của một số giống lúa (%) 40
3.2 Ảnh hưởng của môi trường ñến khả năng tái sinh của mô sẹo sau
6 tuần nuôi cấy 45
3.3 Ảnh hưởng của kháng sinh chọn lọc kanamycin ñến sinh trưởng
của mô sẹo sau 3 tuần nuôi cấy 49
3.4 Kết quả chuyển gen vào mô sẹo 3 tuần tuổi (3W) và 6 tuần tuổi
(6W) của giống J02 51
3.5 Kết quả chuyển gen vào mô sẹo 3 tuần tuổi của giống HC 52
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
ix

DANH MỤC CÁC HÌNH

STT Tên hình Trang

1.1 Triệu chứng bệnh ñạo ôn trên lá 8
3.1 Tỷ lệ hình thành mô sẹo của một số giống lúa 41
3.2 Hình thái mô sẹo sơ cấp 3 tuần tuổi của 7 giống 43
3.3 Hình thái mô sẹo thứ cấp 6 tuần tuổi của giống J02 và HC 43
3.4 Ảnh hưởng của môi trường ñến khả năng tái sinh của mô sẹo 47
3.5 Cây tái sinh giống BC15 trên môi trường RM1 47
3.6 Hình ảnh tái sinh của giống lúa J02 và HC các giai ñoạn 48
3.7 Hình ảnh lây nhiễm dịch khuẩn với mô sẹo giống J02 (bên trái)
và HC (bên phải) 55
3.8 Hình ảnh mô sẹo trong giai ñoạn ñồng nuôi cấy 55
3.9 Một số hình ảnh mô sẹo trong giai ñoạn chọn lọc 56
3.10 Cây chuyển gen tái sinh của giống J02 56
3.11 Cây tái sinh bị bạch tạng của giống HC 56

3.12 Quy trình chuyển gen vào mô sẹo 3 tuần tuổi của giống J02 bằng
vi khuẩn Agrobacterium 57
3.13 Kết quả kiểm tra sự có mặt của promoter 2x35S trong 22 dòng
lúa J02 chuyển gen 58
3.14 Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen chuyển pre-amiR-P1 trong 22
dòng lúa chuyển gen 59
3.15 Hình ảnh một số dòng lúa chuyển gen trồng trong chậu vại 60
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
1

MỞ ðẦU

1. ðặt vấn ñề
Lúa gạo là nguồn lương thực quan trọng nuôi sống hơn một nửa dân số
thế giới. Năm 2011, tổ chức FAO ước tính sản lượng lúa thế giới ñạt 700 triệu
tấn, năng suất trung bình ñạt 4.30 tấn/ha; tổng sản lượng lúa gạo của Việt
Nam năm 2011 là 41,5 triệu tấn (
NewsDetail 4060.htm). Tuy nhiên, nhiều bệnh hại thường xuyên xuất hiện,
gây tổn thất lớn về sản lượng lúa như: bệnh ñạo ôn (do nấm M. grisea), khô
vằn (do nấm Rhizoctonia solani), bạc lá (do vi khuẩn Xanthomonas oryzae).
Trong ñó, bệnh ñạo ôn lúa do nấm M. grisea gây ra gây thiệt hại lớn về sản
lượng lúa gạo toàn cầu và là bệnh có ý nghĩa quan trọng nhất ñối với nghề
trồng lúa trên toàn thế giới (Valent and Chumley, 1991). Mỗi năm bệnh ñạo
ôn làm thế giới mất một lượng lúa ñủ ñể nuôi sống hơn 60 triệu người
(Scardaci S.C., 2003).
Trong chiến lược phòng chống bệnh ñạo ôn, việc tìm ra các gene kháng
nhằm tạo ra các giống lúa kháng bệnh ñạo ôn vẫn ñược coi là phương pháp có
hiệu quả và bền vững. Khoảng 85 gen và 350 QTL ñiều khiển tính kháng
bệnh ñạo ôn ñã ñược phát hiện, nhưng nhiều gen ñược tìm thấy trên cùng loci
(Ramkumar và cs, 2010), tạo cơ sở cho việc chọn tạo giống mang gene kháng

bệnh. Ở Việt Nam, việc ñánh giá ña dạng nguồn gen kháng và tạo ra các
giống lúa mang gen kháng bệnh ñạo ôn nhận ñược sự quan tâm của nhiều nhà
khoa học (Nguyễn Mạnh Cường và cs, 2004; Lê Cẩm Loan và cs, 2006;
Nguyễn Hoàng Lộc và cs, 2008; Lã Tuấn Nghĩa và cs, 2009; Phan Hữu Tôn,
2004). Tuy nhiên, chủng nấm ñạo ôn rất ña dạng và dễ phát sinh chủng mới,
trong khi ñó, mỗi gen kháng chỉ có khả năng chống ñược một số chủng nhất
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
2

ñịnh, bởi vậy các nhà khoa học luôn phải nỗ lực tìm ra gen kháng mới ñể
chống lại các chủng mới phát sinh.
ðể có thể kiểm soát ñược tác nhân gây bệnh, việc hiểu rõ về bản thân
tác nhân ñó và cơ chế gây bệnh là vô cùng cần thiết. Với thành công của
nhóm nghiên cứu do Dean ñứng ñầu, năm 2005 bộ genome của nấm ñã ñược
giải trình tự và công bố khá ñầy ñủ trên cơ sở dữ liệu ñã làm sáng tỏ phần nào
bản chất di truyền của nấm M. grisea và nguyên nhân dẫn tới sự ña dạng
trong quần thể nấm ở ngoài ñồng ruộng. Theo ñó M. grisea có hơn 11000
gene trong ñó có 8 gene ñược cho là có liên quan tới tính gây bệnh của nấm
(Dean và cs, 2005). Các gene này tham gia vào một trong các quá trình nhận
biết bề mặt kí chủ, này mầm của bào tử, hình thành vòi áp, xâm nhập vào
trong tế bào chủ, hình thành bào tử,…
Công nghệ RNAi nói chung hay miRNA nói riêng là công cụ ñể ñiều
hoà ức chế các gen ñơn hoặc các nhóm gen khác nhau trên cơ sở các trình tự
ñặc hiệu. Về mặt lý thuyết, RNAi có thể sử dụng ñể “làm câm” sự sản xuất
bất kỳ protein nào. Một số nghiên cứu ứng dụng công nghệ RNAi thương mại
trên thực vật như tạo giống chống bệnh virus, vi khuẩn, nấm và côn trùng
ñược báo cáo. Hiện tượng câm gen ở ở nấm M. grisea gây bệnh ñạo ôn ñã
ñược mô tả bởi Kadotani và cs (2003) khi nó ñược chuyển cấu trúc RNAi.
Việc chuyển trực tiếp cấu trúc RNAi vào tế bào nấm gây ra hiện tượng “câm
gen” rất có ý nghĩa trong các nghiên cứu thực hiện trong phòng thí nghiệm

tuy nhiên ñường hướng này khó khăn cho việc áp dụng RNAi trong chiến
lược phòng chống bệnh ở cây trồng. Trước vấn ñề này, một số tác giả ñã tiến
hành chuyển các cấu trúc RNAi ñặc hiệu cho các gen gây bệnh của nấm vào
cây ñể tạo nên cây chuyển gen có tính kháng ñối với nấm gây bệnh. Trong
trường hợp này, RNAi ở bên ngoài thành tế bào của nấm cũng có thể ñược tế
bào nấm hấp thu và gây ra ức chế sự biểu hiện của gen mục tiêu ở nấm gây
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
3

bệnh, kết quả này ñã ñược kiểm chứng bằng các thí nghiệm in vitro (Van de
Craen và cs, 2006) cũng như in vivo (Robert và cs, 2008). Việc tạo cây lúa
chuyển gen kháng bệnh ñạo ôn cũng ñã ñược tiếp cận theo hướng này bởi
Valent và cs (2006), Van De Craen và cs (2010) và cho kết quả bước ñầu rất
khả quan. Những kết quả trên cho thấy có thể ứng dụng công nghệ RNAi ñể
tạo ra giống lúa chống bệnh ñạo ôn bằng cách ức chế trực tiếp các gen quan
trọng liên quan tới khả năng gây bệnh của nấm. Việc bất hoạt các gen bảo thủ
giữa các chủng nấm sẽ giúp tạo ra ñược một giống lúa có khả năng kháng lại
với ña số các chủng nấm khác nhau.
Gen MPG1 (có mã số trên genbank: L20685.2) mã hóa cho một protein
nhỏ thuộc họ hydrophobins ñược tiết ra ngoài màng tế bào của bào tử, có liên
quan tới tính gây bệnh ñược biểu hiện trong suốt quá trình hình thành vòi áp,
quá trình phát triển triệu chứng bệnh và hình thành bào tử. Protein MPG1 rất
cần thiết cho việc hình thành và phát triển cấu trúc lây nhiễm, tham gia tương
tác với các thành phần kị nước trên bề mặt lá lúa và hoạt ñộng như một thụ
thể ñể kích thích sự hình thành vòi áp (Talbot và cộng sự, 1996). Như vậy,
MPG1 ñóng vai trò quan trọng trong sự hình thành và phát triển bệnh ñạo ôn
ở lúa. Việc ức chế sự biểu hiện của MPG1 có thể khiến nấm ñạo ôn không
gây ñược bệnh. Nghiên cứu “Tạo cây lúa chuyển gen mang miRNA nhân
tạo ức chế ñặc hiệu gen MPG1 ở nấm ñạo ôn Magnaporthe grisea” phục
vụ chiến lược phát triển chọn tạo giống lúa có khả năng kháng ñược nhiều

chủng nấm ñạo ôn ở Việt Nam.
2. Mục ñích nghiên cứu
Tạo thành công cây lúa chuyển gen mang miRNA nhân tạo ñược thiết
kế ức chế ñặc hiệu gen MPG1 ở nấm ñạo ôn thông qua vi khuẩn A.
tumefaciens.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
4

3. Yêu cầu
- Xác ñịnh môi trường cảm ứng mô sẹo thích hợp cho một số giống lúa
phục vụ chuyển gen.
- Xác ñịnh ñược môi trường tái sinh mô sẹo thích hợp cho một số giống
lúa phục vụ chuyển gen.
- Chọn ñược giống lúa có khả năng tái sinh tốt phục vụ cho chuyển gen.
- Chuyển cấu trúc miRNA nhân tạo vào lúa thông qua vi khuẩn A.
tumefaciens và tái sinh cây lúa chuyển gen.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của ñề tài
4.1. Ý nghĩa khoa học
Việc tạo ñược cây lúa chuyển gen mang cấu trúc miRNA nhân tạo có
khả năng ức chế ñặc hiệu gen MPG1 có liên quan tới tính gây bệnh ñược biểu
hiện trong suốt quá trình hình thành vòi áp, quá trình phát triển triệu chứng
bệnh và hình thành bào tử sẽ là tiền ñề ñể nghiên cứu làm sáng tỏ cơ chế gây
bệnh của nấm ñạo ôn ở mức phân tử, ñồng thời là cơ sở ñể ñề xuất các
phương pháp mới trong phòng chống bệnh ñạo ôn hại lúa.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Cung cấp cách tiếp cận mới trong tạo giống chống chịu bệnh ñạo ôn có
hiệu quả cao bằng cách sử dụng công nghệ RNAi ñể tác ñộng trực tiếp ñến
các gen tham gia quá trình xâm nhiễm và phát triển bệnh. Các qui trình
chuyển gen tạo ñược có thể áp dụng cho các giống lúa khác nhau nhằm tạo
các dòng lúa mới mang ñặc tính mong muốn.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
5

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Khái quát về cây lúa
Cây lúa Oryza spp. là một trong năm loại cây lương thực chính của thế
giới. Hiện nay, trên thế giới có hai loài lúa trồng dùng làm lương thực là loài
O. sativa và O. glaberrima có nguồn gốc ở vùng nhiệt ñới và cận nhiệt ñới,
phân bố ở khu vực ñông nam châu Á và châu Phi. Trong ñó, loài O. sativa
ñược trồng phổ biến tại tất cả các châu lục và chiếm phần lớn diện tích ñất
trồng lúa trên thế giới, riêng loài O. glaberrima chỉ ñược trồng hạn chế ở một
số vùng của châu Phi (Nguyễn Hữu Tề và cs, 1997).
Về nguồn gốc thực vật học, cây lúa thuộc họ Hòa thảo Gramineae, chi
Oryza. Lúa trồng hiện nay có nguồn gốc từ lúa dại O. fatua. Loài lúa dại này
thường gặp ở Ấn ðộ, Việt Nam, Thái Lan, Trung Quốc,…Có 22 loài trong
chi Oryza với 24 hoặc 48 NST (Nguyễn Văn Hoan, 2006). Theo kết luận của
Chang (1976) thì O. sativa xuất hiện ñầu tiên tại Hymalaya, Miến ðiện, Lào,
Việt Nam và Trung Quốc.
Cây lúa trồng hiện nay ñã trải qua một lịch sử tiến hóa rất lâu dài và
khá phức tạp, với nhiều thay ñổi rất lớn về ñặc ñiểm hình thái, nông học, sinh
lý và sinh thái ñể thích nghi với ñiều kiện khác nhau của môi trường thay ñổi
theo không gian và thời gian. Sự tiến hoá này bị ảnh hưởng rất lớn bởi 2 tiến
trình chọn lọc: chọn lọc tự nhiên và chọn lọc nhân tạo. Cho ñến nay, hệ thống
phân loại thực vật học của loài lúa trồng O. sativa L. gồm 3 loài phụ (gồm
Indica, Japonica và Javanica), 8 nhóm biến chủng và 284 biến chủng. Tuy
nhiên, theo ñịnh luật về dãy biến dị tương ñồng của Vavilov thì cây lúa vẫn
tiếp tục tiến hóa và nhiều biến chủng mới vẫn tiếp tục xuất hiện, các nhà khoa
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

6

học vẫn ñang tiếp tục nghiên cứu, tập hợp và bổ sung thêm cho hệ thống phân
loại này (Nguyễn Văn Hoan, 2006).
1.2. Biến ñổi khí hậu và bệnh ñạo ôn trên lúa.
1.2.1. Biến ñổi khí hậu
Theo nghiên cứu của ngân hàng thế giới, nước ta với bờ biển dài và hai
vùng ñồng bằng lớn, khi mực nước biển dâng cao từ (0,2 - 0,6)m, sẽ có từ
(100.000 - 200.000) ha ñất bị ngập và làm thu hẹp diện tích sản xuất nông
nghiệp. Nếu nước biển dâng lên 1m sẽ làm ngập khoảng từ 0,3 ñến 0,5 triệu
ha tại ðồng bằng sông Hồng và những năm lũ lớn khoảng trên 90% diện tích
của ðồng bằng sông Cửu Long bị ngập từ 4-5 tháng, vào mùa khô khoảng
trên 70% diện tích bị xâm nhập mặn với nồng ñộ lớn hơn 4g/l. Ước tính Việt
Nam sẽ mất ñi khoảng 2 triệu ha ñất trồng lúa trong tổng số hơn 4 triệu ha
hiện nay, ñe dọa nghiêm trọng ñến an ninh lương thực quốc gia và ảnh hưởng
ñến hàng chục triệu người dân.
Biến ñổi khí hậu (BðKH) làm thay ñổi ñiều kiện sinh sống của các loài
sinh vật, dẫn ñến tình trạng biến mất của một số loài và ngược lại xuất hiện
nguy cơ gia tăng các loại “thiên ñịch”. Trong thời gian 2 năm trở lại ñây, dịch
rầy nâu, vàng lùn, lùn xoắn lá diễn biễn ngày càng phức tạp ñặc biệt là bệnh
ñạo ôn gây hại nặng ở vụ Xuân – miền Bắc Việt Nam.
Báo cáo kết quả thực hiện ngành nông nghiệp năm 2012 cho thấy diện
tích gieo cấy lúa cả năm ước ñạt 7.753,2 nghìn ha; trong ñó, 294.130 ha bị
nhiễm bệnh ñạo ôn lá, tăng 21% với năm 2011, diện tích nhiễm nặng 11,4
ngàn ha, tăng 118% với năm 2011, diện tích mất trắng 8 ha. Bệnh tăng mạnh
tại các tỉnh phía Bắc, có 54,7 nghìn ha bị nhiễm bệnh, trong ñó có 4.238 ha bị
nhiễm bệnh nặng. Diện tích nhiễm bệnh ñạo ôn cổ bông 72.282 ha, tăng 40%
so với năm 2011, trong ñó diện tích nhiễm nặng 1.699 ha. Bệnh gây hại chủ
yếu trên lúa tại các ñịa phương bị nhiễm ñạo ôn lá nặng.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

7

BðKH ñang gây ra nhiều thách thức ñối với nền nông nghiệp toàn cầu
nói chung và nông nghiệp nước ta nói riêng. Các hiện tượng thời tiết, sự phát
sinh phát triển của sâu bệnh ñã và ñang gây trở ngại lớn cho sản xuất nông
nghiệp nói chung và nghề trồng lúa nói riêng. Thực tiễn ñó ñặt ra nhu cầu lớn
về các giống cây trồng mới có khả năng chống chịu ñiều kiện bất thuận và
kháng sâu bệnh trong tương lai.
1.2.2. Bệnh ñạo ôn trên lúa
Bệnh ñạo ôn là bệnh quan trọng nhất trên lúa trên thế giới và ở Việt
Nam. Bệnh ñạo ôn ñược phát hiện ñầu tiên ở Italia năm 1560, sau ñó là ở
Trung Quốc năm 1637, Nhật Bản năm 1760, Mỹ năm 1906 và Ấn ðộ năm
1913, v.v Ở nước ta, Vincens (người Pháp) ñã phát hiện nguồn bệnh ở Nam
Bộ vào năm 1921. Năm 1951, Roger (người Pháp) cũng ñã xác ñịnh sự xuất
hiện và gây hại của bệnh ở vùng Bắc Bộ (Vũ Triệu Mân và cs, 2007). Bệnh
ñạo ôn ñã ñược tìm thấy ở ít nhất 85 quốc gia và chưa có nơi nào báo cáo là
ñã từng tiêu diệt ñược hoàn toàn mầm bệnh. Thiệt hại về năng suất do bệnh
ñạo ôn gây ra có thể lên tới 75% hoặc cao hơn nữa nếu gặp những ñiều kiện
thuận lợi cho bệnh phát triển.
Triệu chứng:
Nấm có thể xâm nhiễm gây bệnh tất cả các bộ phận trên mặt ñất gồm
lá, ñốt thân, cổ bông, cổ gié (Hình 1.1). Các nghiên cứu gần ñây cho thấy mức
ñộ mẫn cảm của lá tỷ lệ thuận với mức ñộ mẫn cảm trên cổ bông. Tính mẫn
cảm của cây ñối với nấm phụ thuộc nhiều yếu tố môi trường cũng như các
yếu tố liên quan ñến phát triển của cây. Tính mẫn cảm thường giảm theo tuổi
cây và tuổi lá; tính mẫn cảm tăng mạnh khi bón thừa ñạm. Trái lại bón Si làm
giảm tính mẫn cảm. Ngoài ra, ñặc ñiểm vết bệnh thay ñổi ñáng kể theo mức
ñộ mẫn cảm:
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
8


Vết bệnh ñiển hình có hình elip hoặc thoi xuất hiện 5-7 ngày sau lây
bệnh. Biểu hiện của vết bệnh thay ñổi phụ thuộc theo giống: từ màu lục nhạt,
vết bệnh phát triển (mẫn cảm) tới màu lục ñậm với viền vết bênh màu nâu
(tính kháng tập nhiễm cục bộ).

Hình 1.1. Triệu chứng bệnh ñạo ôn trên lá
Tác nhân gây bệnh:
Nấm gây bệnh có tên giai ñoạn vô tính là P. oryzae (syn. Pyricularia
oryzae). Giai ñoạn hữu tính của nấm ñã ñược ñặt tên là Magnaporthe grisea
và gần ñây dựa vào các nghiên cứu phân tử, ñược ñặt tên là M. oryzae.
Nấm thuộc lớp nấm túi (Ascomycetes), tuy nhiên ngoài tự nhiên nấm
chỉ sinh sản vô tính tạo cành bào tử phân sinh và bào tử phân sinh không màu,
2 vách ngăn, hình quả lê (hoặc nụ sen).
Xâm nhiễm gây bệnh:
Nấm ñạo ôn là nấm bán sinh dưỡng (hemibiotroph) với pha sinh dưỡng
biotroph ở giai ñoạn sớm của quá trình xâm nhiễm.
Giai ñoạn sớm của quá trình xâm nhiễm bao gồm pha tiền xâm nhập
(prepeneration): bào tử nấm tiếp xúc trên bề mặt lá, ñỉnh bào tử nứt vỡ và tiết
ra một giọt chất nhầy gắn kết chặt bào tử và bề mặt lá. Lớp chất nhày này
chứa các hợp chất cacrbonhydrate và glycoprotein.
Tiếp theo, bào tử nấm nảy mầm tạo ống mầm, hình thành một tế bào ở
ñỉnh ống mầm và phát triển thành vòi áp (appressorium). Vòi áp của nấm là
một cấu trúc dạng vòm, có vách dày, mầu ñậm do bị melanin hóa. Sự melanin
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
9

hóa làm vách vòi áp trở nên chắc chắn hơn. Bên trong vòi áp, nấm tích lũy
nhiều glycerol và do vậy áp lực trương của vòi áp nấm ñạo ôn rất lớn, có thể
tới 80 at.

Tiếp theo quá trình tiền xâm nhập là xâm nhập của bào tử: Từ vòi áp sẽ
hình thành một sợi nấm nhỏ gọi là ñế xâm nhập (infection peg) ñể xâm nhập
trực tiếp qua tầng cutin và vào bên trong tế bào biểu bì. Bên trong tế bào biểu
bì, ñỉnh ñế xâm nhập sẽ phình to tạo thành vòi hút (haustorium). Nấm sẽ tiết
các enzyme và effector qua màng vòi hút vào tế bào chất của tế bào ký chủ và
hấp thụ dinh dưỡng. Trong quá trình dinh dưỡng, vách tế bào ký chủ dần dần
sụp ñổ và nấm tiếp tục phát triển sang tế bào bên cạnh (thông qua sợi liên
bào) và lại tiếp tục hình thành vòi hút ở tế bào mới bị xâm nhập.
Nhiều yếu tố dẫn truyền tín hiệu tham gia vào quá trình nhận biết và
hình thành vòi áp của nấm P. oryzae. Sự hình thành vòi áp chỉ xuất hiện trên
bề mặt cứng (như bề mặt lá). Hai yếu tố chính tham gia vào quá trình dẫn
truyền tín hiệu ñể hình thành vòi áp là chất lượng và bản chất hóa học của sự
gắn kết.
Bề mặt bào tử nấm có chứa một lớp protein gọi là hydrophobin (MPG1
protein) với phía ưa nước hướng vào tế bào nấm và phía ghét nước hướng về
bề mặt của lá. Lớp hydrophobin giúp bào tử nhận biết ñược bề mặt ghét nước
của lá và có vai trò quan trọng trong hình thành vòi áp.
Một số gen của nấm (MagA, MagB) cảm ứng hình thành cAMP (cyclic
adenosine monophosphate), một phân tử dẫn truyền tín hiệu kích thích hình
thành vòi áp.
1.3. Phân tích di truyền gen kháng bệnh ñạo ôn của cây lúa
Các nghiên cứu di truyền tính kháng bệnh ñạo ôn lúa cũng xuất hiện
rất sớm, ñặc biệt tại Nhật Bản từ năm 1917. Mặc dù nghiên cứu dài hạn như
vậy, nhưng giống kháng bệnh ñạo ôn bền vững rất hiếm. ðến ñầu thập niên
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
10

1960 Goto thiết lập hệ thống giống chuẩn nòi ñối với nấm gây bệnh ñạo ôn
trên lúa ở Nhật (Ou, 1985). Một bộ giống lúa chuẩn quốc tế kháng bệnh ñạo
ôn ñược phát triển bởi IRRI và Nhật Bản. Những giống chuẩn kháng này

mang một gen ñơn và phủ trên 24 kiểu gen khác. ðiều ñó sẽ tạo thuận lợi cho
việc ñiều tra ngân hàng gen, phát triển hệ thống chuẩn kháng, và làm rõ sự
khác biệt của các isolate (Yoshimichi Fukuta, 2006).
Thuyết gen ñối gen của Flor năm 1971 ñã mở ra hướng tiếp cận ñể
phòng bệnh thông qua việc sử dụng các gen bảo vệ vật chủ rất hiệu quả và
kinh tế. Người ta cũng sử dụng các gen mã hóa PR protein như chitinase và ß-
1, 3 glucanase trong phòng chống bệnh ñạo ôn (Hiroshi và cs, 2010).
Tuy nhiên, một trong những ñặc ñiểm cơ bản của nấm bệnh ñạo ôn là
tồn tại rất nhiều chủng khác nhau. Mỗi vùng sinh thái, tồn tại một số chủng
nhất ñịnh và có mức ñộ gây hại khác nhau. Tương ứng với các chủng, có
những gen chống khác nhau. Trên thế giới ñã phát hiện có 256 chủng nấm
ñạo ôn (Veeraraghavan, 1975). Với nỗ lực nghiên cứu không ngừng của các
nhà khoa học trên toàn thế giới, khoảng 85 gen và 350 QTL ñiều khiển tính
kháng bệnh ñạo ôn, nhưng nhiều gen ñược tìm thấy trên cùng loci, trong ñó
gen pi-21 là gen lặn (Fukuoka và Okun, 2000; Liu và cs, 2003; Gowda và cs,
2006; Jeung và cs, 2007; Lin và cs, 2007; Ballini và cs, 2008; Ramkumar và
cs, 2010; Costanzo và Jia, 2010). Người ta ñã dòng hoá ñược 7 gen Pib, Pita,
Pi36, Pi9, Pi2, Pid2, Piz-t (Liu và cs, 2007) tạo cơ cở cho việc chọn tạo giống
mang gen kháng bệnh. Gần ñây, Ramkumar và cs (2011) công bố một chỉ thị
gen kháng bệnh ñạo ôn mới Pi54 MAS rất hữu ích cho chọn tạo giống lúa
kháng bệnh ñạo ôn.
Wu và cs (1996), Nakamura và cs (1997) nghiên cứu 2 gen Pi-ta2 và
Pi-ta cho thấy chúng liên kết rất chặt, hoặc có thể xem ñó là hai alen khác
nhau ñịnh vị trên cùng một locus, hai gen này ñã ñược thiết lập bản ñồ di
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
11

truyền, ñịnh vị ở tâm ñộng của nhiễm thể số 12. Bên cạnh ñó, Wu và cs
(1996) ñã thiết lập bản ñồ di truyền và bản ñồ vật lý bằng cách sử dụng vector
BAC, quét rất kỹ khu vực gen Pi-ta, với 3 marker phân tử liên kết chặt trong

khoảng 0,5 cM. Tương tự như vậy, Nakamura và cs (1997) ñã thiết lập một
"contig map", với qui mô quét 300 kb, và marker liên kết với gen Pi-ta2 trong
khoảng 0,3 cM. Tuy nhiên, vùng tâm ñộng là nơi thể hiện rất thấp khả năng
tái tổ hợp và thể hiện tần suất cao của chuỗi mã lập lại. ðiều này ñặt ra cho
chúng ta những khó khăn trong việc tiếp cận với gen mục tiêu bằng kỹ thuật
"chromosome walking". Gần ñây, Rybka và cs (1997) ñã xác ñịnh gen Pi-ta2
liên kết với hai marker kế cận với khoảng cách di truyền khoảng 0,3 cM. Gen
Pi-ta ñược ñịnh vị trên bản ñồ ở vị trí chồng lấp với Pi-ta2 bằng phương pháp
phân tích kiểu gen theo giản ñồ (graphical genotype) của một dòng ñẳng gen.
Hai gen này có quan hệ với nhau về chức năng, tương tác allelic, hoặc ít nhất
chúng liên kết với nhau rất chặt, và chúng có thể có cùng một nguồn gen tổ
tiên (Rybka và cs, 1997). Jean (thuộc tổ chức CiRAD, Pháp) là một chuyên
gia rất nổi tiếng về bệnh ñạo ôn trên cây lúa ñã chứng minh ñược có sự kết
hợp giữa di truyền quần thể và di truyền phân tử ñể nghiên cứu giống lúa
chống chịu bệnh này (Bùi Chí Bửu - Viện KHKTNN Miền Nam).
Morel ñã bắt ñầu từ nghiên cứu gen Pi-1, Pi-2 ñể xem xét sự tiến hóa
của tác nhân gây bệnh (pathogen) làm phá vỡ tính kháng bệnh ñạo ôn trên cây
lúa ở khu vực ðông Nam Á. Sự tiến hóa di truyền quần thể của M. grisea
ñược nghiên cứu trên gen Pi-33 và dòng hóa của nó, gen Pi-33 + Pi-1 + Pi-2
cho thấy một phối hợp tốt cho tính kháng bền vững, trong ñó gen Pi-33 biểu
hiện phổ kháng bệnh ñạo ôn rất rộng. Sự tương tác của 30 gen thuộc hệ thống
tự vệ của cây lúa cũng ñược ghi nhận (Bùi Chí Bửu - Viện KHKTNN Miền
Nam).
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
12

Ở Việt Nam, Viện Lúa ðồng Bằng Sông Cửu Long ñã thành công khi
thực hiện khai thác lúa hoang, Tẻ Tép, Sóc Nâu làm nguồn cung cấp gen
kháng và dòng hoá gen Pi2, ñịnh vị giữa 2 RFLP marker là RG64 (phân cắt
bằng XbaI) và LPO111-112 (phân cắt bằng Bgl11) trên nhiễm sắc thể số 6 và

tìm kiếm gen mới kháng dòng nấm có ñộc tính mạnh nhất trong bộ sưu tập là
OMP1 (Nguyễn thị Lang, Bùi chí Bửu, 2002).
Trong khuôn khổ dự án JICA giữa Chính phủ Nhật Bản-Việt Nam và
ðại học Nông nghiệp Hà Nội, Phan Hữu Tôn và cs ñã khảo sát một tập ñoàn
gồm 24 dòng giống lúa chứa các gen kháng bệnh ñạo ôn khác nhau. ðể sử
dụng nguồn gen này trong công tác chọn tạo giống kháng bệnh ñạo ôn ở Việt
Nam, ông ñã tiến hành thu thập, phân lập chủng, rồi lây nhiễm nhân tạo ñể
xác ñịnh gen nào chống ñược các chủng của Việt Nam, ñồng thời khảo sát ñặc
ñiểm nông sinh học của các dòng giống. Bằng phương pháp lây nhiễm nhân
tạo sử dụng 4 chủng nấm bệnh ñạo ôn ñã phân lập, nhóm nghiên cứu phát
hiện 8 dòng giống chứa các gen Pi- k
s
, Pi-k, Pi-z, Piz-5, Pi 1, Pi 3 và Pi 5(t)
biểu hiện khả năng kháng mạnh với cả 4 chủng nấm phân lập và xác ñịnh các
gen Pi-1, Pi-5(t), Pi-3, Pi-4(t) kháng tốt với các chủng nấm ñạo ôn ở miền
Bắc (Phan Hữu Tôn, 2004; Bùi Chí Bửu - Viện KHKTNN Miền Nam).
Sử dụng kỹ thuật AFLP, Nguyễn Thị Ninh Thuận (2006) ñã nghiên cứu
mức ñộ ña dạng và tính gây bệnh của 114 isolates nấm thu thập tại nhiều tỉnh
thuộc miền Bắc Việt Nam. Kết quả nghiên cứu cho thấy quần thể nấm M.
grisea tại ñồng bằng sông Hồng có tính ña dạng cao gồm 7 nhóm VNG1,
VNG2, , VNG7. Quần thể nấm phân lập trên các giống lúa tẻ khác với quần
thể nấm phân lập trên các giống lúa nếp. Quần thể nấm trên lúa tẻ gồm 4
nhóm VNG1, VNG2, VNG3 và VNG4, còn trên lúa nếp gồm 3 nhóm VNG 5,
VNG6 và VNG7. Các nhóm VNG1, VNG3, VNG 4 chiếm ưu thế với VNG1
chiếm tới hơn 50%. Nhiều giống chỉ thị mang nhiều gen kháng có thể chống
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
13

ñược quần thể nấm M. grisea của miền Bắc (ví dụ giống Morobenekan mang
các gen kháng Pi-7(t), Pi-10(t), Pi-12(t), Pi-44(t), Pi-157), tuy nhiên nghiên

cứu chưa chỉ ra ñược gen nào ñiều khiển tính kháng. Dựa trên phản ứng của
ñại diện các nhóm ñối với các giống chỉ thị có số lượng gen kháng ít, nhóm ñề
xuất sử dụng các gen Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-ta
2
, Pi-k ñể tạo giống kháng nấm
ñạo ôn ở miền Bắc.
Nhiều gen kháng bệnh ñạo ôn ñược xác ñịnh ở trên lúa. Tuy nhiên, chủng
nấm ñạo ôn rất ña dạng và dễ phát sinh chủng mới, trong khi ñó, mỗi gen kháng
chỉ có khả năng chống ñược một số chủng nhất ñịnh, bởi vậy các nhà khoa học
luôn phải nỗ lực tìm ra gen kháng mới ñể chống lại các chủng mới phát sinh.
Ứng dụng công nghệ RNAi ñể tạo ra giống lúa chống bệnh ñạo ôn bằng
cách ức chế trực tiếp các gen quan trọng liên quan tới khả năng gây bệnh của
nấm ñã và ñang trở thành một hướng mới trong chiến lược tạo ra ñược một
giống lúa có khả năng kháng lại với ña số các chủng nấm khác nhau.
1.4. Phân tích genome nấm ñạo ôn và công nghệ RNAi trong phòng
chống bệnh ñạo ôn trên lúa
1.4.1. Phân loại nấm ñạo ôn
Nấm M. grisea thuộc:
Giới (regnum):
Fungi
Ngành (phylum): Ascomycota
Lớp (class): Sordariomycetes
Bộ (ordo): Magnaporthales
Họ (familia): Magnaporthaceae
Chi (genus): Magnaporthe
Loài (species): M. grisea, P. oryzae, M. oryzae
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
14

Dựa trên những phân tích phân tử ñối với phức hợp các tác nhân gây ra

triệu chứng của bệnh ñạo ôn ñược thu thập trên lúa và các cây kí chủ khác
thuộc họ Grassaceae thì nấm ñạo ôn bao gồm một phức hợp các loài lẫn lộn
chứa ít nhất hai loài sinh học có sự khác biệt về di truyền rõ ràng và không
giao phối với nhau. Những thành viên ñược phân lập từ chi Digitaria ñược
gọi là M. grisea, những thành viên còn lại ñược phân lập từ lúa và một số cây
trồng khác thì ñược gọi là M. oryzae (Couch và Kohn, 2002).
1.4.2. Phân tích genome của nấm ñạo ôn
Năm 2005, nhóm do Dean ñứng ñầu công bố trình tự genome của M.
grisea khá ñầy ñủ. Genome của M. grisea có kích thước 40,3Mb với 7 nhiễm
sắc thể, có 11.109 gen, phân bố theo tỉ lệ 1/3,5 kb, bao gồm 45% số gen có
mã di truyền ñược xác ñịnh, trong ñó khoảng 8 gen ñược cho là liên quan ñến
quá trình xâm nhập và lây nhiễm sang lúa. Chức năng gen gây bệnh hoặc liên
quan ñến quá trình phát triển bệnh của nấm M. grisea, hoặc các gen liên quan
ñến tương tác giữa cây lúa và nấm M. grisea cũng ñược làm sáng tỏ trong các
công trình nghiên cứu trên toàn thế giới. Hơn 1000 ESTs ñã ñược giải trình tự
từ một số thư viện cDNA ñại diện cho các giai ñoạn sinh trưởng, phát triển
khác nhau của nấm và xâm nhiễm thực vật (Xu J-R và cs, 2002). Một số gen
chức năng như: gen Pth11 mã hóa cho một GPCR (G-protein-coupled
receptor, receptor ) tiếp nhận thông tin môi trường và hoạt hóa chất truyền tin
thứ cấp và ñiều hòa sự biểu hiện của gen) cần thiết cho sự hình thành vòi áp
(appressorium) và sự phát triển của bệnh (Talbot và cs, 1993); gen PMK1
kích hoạt protein kinase ñiều hòa quá trình hình thành giác bám
(appressorium) và sinh trưởng xâm nhiễm ở thực vật của nấm (Xu J-R và cs,
1996; Xu J-R và cs, 2000); gen MST12 cần thiết cho sự xâm nhập của vòi áp
và ñiều khiển sự xâm nhiễm ở thực vật (Xu J-R và cs, 1998; Park G. và cs,
2002; Park G. và cs, 2004). Và một số gen khác cũng liên quan ñến sinh
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
15

trưởng, xâm nhiễm, hình thành vòi áp, hình thành bào tử của nấm ñược báo

cáo như adenyl cylase (MAC1), tiểu phần xúc tác của protein kinase A
(CPKA) và tiểu phần MagB của G protein α trong nấm M. grisea (Liu S. và
Dean, 1997), gen MMT1 (Jeon J. và cs, 2004), MCK1 (Jeon và cs, 2008), gen
MgATG1 (Liu H X. và cs, 2007), PLS1 (Clergeot và cs, 2001), gen CUT2
(Skamnioti và Sarah J., 2007) ñã ñược chứng minh là làm giảm triệu chứng
bệnh trong các nghiên cứu chức năng bằng cách làm gián ñoạn hoặc mất gen.
Theo nghiên cứu mới ñây của Chen và cs năm 2010, các GTPases nhỏ
Rac/Rop ở thực vật có chức năng như là các phân tử dẫn truyền tín hiệu liên
quan ñến các phản ứng phòng thủ. Họ ñã nghiên cứu mô hình biểu hiện của
gen Rac/ Rop bằng RT-PCR và cũng ñịnh vị gen ñó bằng gen chỉ thị GFP ñể
hiểu ñược chức năng cụ thể của mỗi phân tử trong 7 thành viên của họ Rac/
Rop ở lúa. Các phân tích lây nhiễm nhân tạo chỉ ra rằng OsRac1 ñiều hòa tích
cực phản ứng kháng bệnh ñạo ôn. OsRac1 cũng ñiều hòa tích cực cho phản
ứng kháng vi khuẩn gây bệnh trên lúa. Các thông tin về trình tự và chức năng
của gen này góp phần quan trọng trong chiến lược tạo cây lúa chuyển gen
kháng ñạo ôn bằng công nghệ RNAi ñể ức chế gen mục tiêu ở phạm vi rộng.
1.4.3. Công nghệ RNAi và ứng dụng trong phòng chống bệnh ñạo ôn.
Hiện tượng RNA can thiệp (RNA interference-RNAi) mà trước ñây ñã
từng ñược gọi là hiện tượng ñồng ức chế (co-suppression), câm gen hậu phiên
mã (post transcriptional gen silencing -PTGS), chế ngự (quelling) là một quá
trình xảy ra trong các tế bào sống ñể ñiều khiển sự hoạt ñộng của các gen.
Trải qua hơn 20 năm phát hiện, phát triển, RNAi ñã và ñang trở thành chủ ñề
nóng bỏng trong các nghiên cứu ở mức ñộ cơ bản cho ñến ứng dụng. Ngày
nay, RNAi vẫn là công cụ hàng ñầu trong các nghiên cứu về genomic, chức
năng gen, ñiều hòa biểu hiện gen và rất nhiều ứng dụng trong y học cũng như
trong nông nghiệp.