BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2


PHẠM THỊ NGỌC MAI


NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG
DINH DƯỠNG TỚI KHẢ NĂNG TẠO MÀNG
BACTERIAL CELLULOSE CỦA VI KHUẨN
GLUCONACETOBACTER

Chuyên ngành: Sinh thái học
Mã số: 60 42 01 20

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung







HÀ NỘI, 2014


ii
LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình tìm hiểu, nghiên cứu và hoàn thành luận văn tốt ngiệp,
tôi đã nhận được những lời chỉ bảo, hướng dẫn tận tình của cô giáo: PGS.TS
Đinh Thị Kim Nhung. Tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ phòng Vi sinh trường
ĐHSP Hà Nội 2 . Bên cạnh đó, Ban giám hiệu, Phòng sau đại học, các Phòng,
Ban trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo các điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong
quá trình làm việc. Cùng với đó là sự hỗ trợ nhất định từ gia đình và bạn bè.
Tôi xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu đó!


Hà Nội, tháng 12 năm 2014
Học viên


Phạm Thị Ngọc Mai














iii
LỜI CAM ĐOAN


Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, dưới sự
hướng dẫn của PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung. Luận văn này không có sự
trùng lặp với các đề tài khác.


Hà Nội, tháng 12 năm 2014
Học viên




Phạm Thị Ngọc Mai
















iv


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
BC : Bacterial cellulose
GK : Glucokinase
PMG : Phosphoglucomutase
STT : Số thứ tự
CFU : Colony Forming Unit
MT : Môi trường
VSV : Vi sinh vật
Cs : Cộng sự
Nxb : Nhà xuất bản




















v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter
theo Frateur (1950)
Bảng 3.1. Một số dặc điểm về hình thái khuẩn lạc và tế bào của 18 mẫu vi
khuẩn acetic
Bảng 3.2. Khả năng sinh acid acetic của 18 mẫu vi khuẩn acetic
Bảng 3.3. Khảo sát khả năng tạo màng BC của các mẫu vi khuẩn acetic
Bảng 3.4. Khảo sát khả năng tạo màng BC của một số chủng vi khuẩn
Gluconacetobacter
Bảng 3.5.
Bảng 3.6.
Bảng 3.7.
Bảng 3.8.
Bảng 3.9.
Bảng 3.10.


Bảng 3.11.

Khả năng thấm hút nước của màng BC sau khi xử lý
Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng tạo màng BC
Ảnh hưởng của hàm lượng glucose đến khả năng tạo màng BC
Ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ đến khả năng tạo màng BC
Ảnh hưởng của hàm lượng pepton đến khả năng tạo màng BC
Ảnh hưởng của hàm lượng nitơ vô cơ đến khả năng tạo màng BC
Ảnh hưởng của hàm lượng (NH
4

)
2
SO
4
đến khả năng tạo màng BC
Bảng 3.12.

Ảnh hưởng của nồng độ KH
2
PO
4
đến khả năng tạo màng BC
Bảng 3.13.

Đặc tính của màng BC lên men sau 5 ngày ở 2 lô thí nghiệm
Bảng 3.14.

Các bước xử lý màng sau lên men







vi

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
1. Lý do chọn đề tài 1

2. Mục đích nghiên cứu 2
3. Nội dung nghiên cứu 2
4. Ý nghĩa của đề tài 2
5. Điểm mới của đề tài 2
NỘI DUNG 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. 4
1.1. Lược sử nghiên cứu vi khuẩn Gluconacetobacter 4
1.2. Tổng quan về vi khuẩn Gluconacetobacter 9
1.2.1. Đặc điểm hình thái, tế bào học 9
1.2.2. Đặc điểm nuôi cấy 10
1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 10
1.2.4. Đặc điểm về sinh trưởng 11
1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter 12
1.3.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon 12
1.3.2. Nhu cầu Nitơ của sinh vật 13
1.3.3. Nhu cầu nguồn photpho 14
1.4. Đặc điểm và cơ chế hình thành màng BC 17
1.4.1. Đặc điểm cấu trúc của cellulose 17
1.4.2. Đặc điểm cấu trúc của màng BC 18
1.5. Các đặc điểm của quá trình lên men 19
1.5.1. Ảnh hưởng của oxy 19
1.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ 21



vii
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
2.1. Đối tượng nghiên cứu và thiết bị hóa chất 23
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 23
2.1.2. Hóa chất 23

2.1.3. Dụng cụ và thiết bị 23
2.1.4. Môi trường nghiên cứu 24
2.1.4.1. Môi trường giữ giống (MT1) 24
2.1.4.2. Môi trường nhân giống (MT2)…………………………… 24
2.1.4.3. Môi trường lên men (MT3)……………………………… 24
2.2. Phương pháp nghiên cứu…………………………………………24
2.2.1. Phương pháp vi sinh vật 24
2.2.1.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc……………………………… 24
2.2.1.2. Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn gluconacetobacter
thuần khiết………………………………………………………………… 25
2.2.1.3. Phương pháp phân biệt tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter
bằng phương pháp nhuộm Gram…………………………… ………… …25
2.2.1.4. Phương pháp bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng…….26
2.2.1.5. Phương pháp hoạt hoá giống…………………………………26
2.2.1.6. Phương pháp lên men tạo màng……………… ……………27
2.2.2. Phương pháp xử lý và bảo quản màng BC………………….…27
2.2.3. Phương pháp ứng dụng làm bao bì bảo quản thực phẩm………… 28
2.2.4. Phương pháp toán học………………………………………… ……28
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN………… ….31
3.1. Phân lập vi khuẩn Acetic từ màng bia, dịch hoa quả, tuyển chọn các mẫu
vi khuẩn Gluconacetobacter 31
3.2. Nghiên cứu một số đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hóa vi khuẩn
Gluconacetobacter 40


viii
3.2.1. Quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter
trên kính hiển vi quang học………………………………… 40
3.2.2. Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa……………………………….40
3.2.3. Hoạt tính catalase…………………………………………………….41

3.2.4. Khả năng sinh acid acetic của vi khuẩn Gluconacetobacter
trên môi trường Blue bromphenol………………………………………….41
3.3. Quá trình lên men tạo màng ………………………………………… 42
3.4. Nghiên cứu ảnh hường của một số môi trường dinh dưỡng tới khả năng
tạo màng BC của vi khuẩn Gluconacetobacter 45
3.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ Glucose đến hình thành màng BC 45
3.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ (NH
4
)
2
SO
4
đến hình thành màng BC 50
3.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ KH
2
PO
4
đến hình thành màng BC 53
3.5. Xử lý màng sau lên men……………………………………………… 55
3.6. Ứng dụng màng trong bảo quản thực phẩm……………………………60
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………………67
1. Kết luận 67
2. Đề nghị 67
TÀI LIỆU THAM KHẢO 68


1

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài

Màng sinh học (Bacterial cellulose; BC) có cấu trúc và đặc tính rất
giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết với nhau
bằng liên kết β-1,4 glucorit) cellulose vi khuẩn khác với cellulose thực vật ở
chỗ không chứa các hợp chất cao phân tử như: ligin, hemicellulose và sáp nến
do vậy chúng có những đặc tính vượt trội với độ dẻo dai, bền chắc. Ngoài ra,
màng BC còn chứa nhiều dưỡng chất, acid hữu cơ đồng thời là một hàng rào
cản oxi và các sinh vật khác và ngăn cản tác động của tia UV…[2].
Nhờ những đặc tính độc đáo trên mà màng BC được coi là nguồn
polimer mới, là một giải pháp trên con đường tìm nguồn nguyên liệu mới hiện
nay. Nó đã và đang thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học ngay từ nửa
sau của thế kỷ XIX và hiện được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau
như: dùng làm màng phân tách cho quá trình xử lí nước, chất mang đặc biệt
cho các pin và năng lượng cho tế bào, dùng trong y học làm da tạm thời thay
thế da trong quá trình trị bỏng, làm mặt nạ dưỡng da cho con người. Đặc biệt
trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm, màng BC đã được ứng dụng để bảo
quản thực phẩm trong thời gian dài ở nhiệt độ phòng [5], [9].
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC còn ở mức độ
khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu. Do sự đa
dạng về các mặt ứng dụng như trên và với mong muốn được tìm hiểu thêm về
vi khuẩn Gluconacetobacter, quá trình tạo màng BC cũng như nhiều ứng
dụng hữu ích của nó, tôi quyết định chọn đề tài “ Nghiên cứu ảnh hưởng của
môi trường dinh dưỡng tới khả năng tạo màng Baterial cellulose của vi
khuẩn Gluconacetobacter ”




2

2. Mục tiêu

Tìm được thành phần môi trường dinh dưỡng thích hợp cho sự phát
triển của vi khuẩn có khả năng tạo màng BC.
3. Nội dung
3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng BC
từ bia, dịch hoa quả lên men giấm
3.2. Nghiên cứu đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Gluconacetobacter B
2

3.3. So sánh khả năng tạo màng BC được tạo ra từ vi khuẩn
Gluconacetobacter B
2
với vi khuẩn Gluconacetobacter BHN
2

3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới khả năng
tạo màng BC
3.5. Lên men tạo màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter B
2
trên môi
trường thay thế
3.6. Xử lý và bảo quản màng BC sau lên men
3.7. Ứng dụng màng BC trong bảo quản thực phẩm, thay thế túi nilon
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học
Môi trường dinh dưỡng có ý nghĩa rất quan trọng tới sự phát triển của
vi khuẩn Gluconacetobacter. Nguồn dinh dưỡng quyết định tới khả năng hình
thành màng BC.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Nghiên cứu tìm ra chủng vi khuẩn Gluconacetobacter có khả năng tạo
màng BC có chất lượng tốt với chi phí thấp, ứng dụng bảo quản thực phẩm

thay thế túi nilon.
5. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
5.1. Đối tượng nghiên cứu
Chủng vi khuẩn Gluconacetobacter được phân lập từ bia, dịch hoa quả
lên men giấm, vi khuẩn Gluconacetobacter BHN
2
trên phòng thí nghiệm vi


3

sinh. Thí nghiệm được thực hiện tại phòng Vi sinh - Khoa Sinh-KTNN,
Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2.
5.2. Phương pháp nghiên cứu
5.2.1. Phương pháp vi sinh
Vi khuẩn Gluconacetobacter là các vi khuẩn Gram âm, do đó có thể
phân biệt với vi khuẩn Gram dương nhờ phương pháp nhuộm Gram (nhuộm
kép).
Tiến hành: Lấy chủng vi khuẩn Gluconacetobacter trong các ống thạch
nghiêng, làm vết bôi lên lam kính, cố định vết bôi bằng cách hơ nhẹ trên ngọn
lửu đèn cồn, nhuộm tế bào bằng phương pháp nhuộm gram [12].
Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu của kính hiển vi quang học
Olympus với độ phóng đại 1000 lần.
5.2.2. Phương pháp hóa sinh
Phương pháp xác định hoạt tính catalase.
Phát hiện khả năng oxy hóa rượu etylic thành acid acetic.
5.2.3. Phương pháp toán học
6. Đóng góp của đề tài
Tìm ra môi trường lên men thích hợp tạo màng BC của chủng vi khuẩn
Gluconacetobacter B

2
: Glucose 4‰(w/v); pepton 0,4‰(w/v); (NH
4
)
2
SO
4
0,6‰(w/v); KH
2
PO
4
0,5‰(w/v)

và môi trường nước gạo thay thế cho quá
trình lên men.






4

NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vi khuẩn Gluconacetobacter
1.1.1. Vị trí phân loại
Đã có rất nhiều công trình phân loại vi khuẩn acetic như Rothenback
1898, Beijerinck 1898, Hoyer 1899, Hansen 1911, Heneberg 1926, Fraterur
1950 Thuật ngữ “Gluconacetobacter” được dùng đầu tiên cho cấp độ phân

loại giống phụ trong giống Acetobacter khi Yamada và Kondo (1984) nhận
thấy các thành phần ubiquinone chính trong thành phần màng tế bào vi khuẩn
sinh acetic khác nhau [27]. Các chủng có Q – 10 là thành phần uniquinone
chính được phân loại trong giống phụ Gluconacetobacter, trong khi Q- 9 là
thành phần uniquinone chính trong màng tế bào vi khuẩn Acetobacter. Sau đó
giống phụ Gluconacetobacter được đưa lên thành giống thứ tư trong họ
Acetobacteraceae dựa vào mối quan hệ phát sinh khi phân tích một phần trình
tự gen mã hóa 16S rARN. Do cách đặt tên Gluconacetobacter chưa đúng quy
cách nên Yamada (1998) đã sửa lại tên giống thành Gluconacetobacter nom.
corrig, theo khoản luật Rule 61 trong Bacteriological code. Ban đầu giống
Gluconacetobacter chưa được chấp nhận rộng rãi do được công bố dựa vào
một phần trình tự mà không phải toàn bộ gen 16S rARN. Tuy nhiên Frankel
et al (1999) đã xác nhận việc phân loại và đặt tên giống Gluconacetobacter và
đề nghị phân tích trình tự 16S rADN để chuyển các loài đã biết, định danh
nhầm giống Acetobacter vào đúng giống Gluconacetobacter. Cuối cùng
Yamada (1997) đã kết luận sự hiện diện của giống Gluconacetobacter dựa
vào các đặc điểm phát triển được trên môi trường thạch có nguồn cacbon duy
nhất là D- mantose, sở hữu Q – 10 là thành phần uniquinone chính và kết quả
phân tích toàn bộ trình tự gen mã hóa rARN. Các loài thuộc giống
Gluconacetobacter có đặc điểm hình thái học tế bào khác nhau nhưng không


5

rõ rệt lắm và được phân loại chủ yếu dựa trên mối quan hệ phát sinh loài trên
cơ sở phân tích vùng trình tự 16S rADN và mức độ tương đồng ADN [27].
Theo Bergey (2005) [21], G.intermedius được xếp vào chi
Gluconacetobacter thuộc họ vi khuẩn Acetobacteraceae. Họ này gồm 6 chi:
Acetobacter, Acidomonas, Asaia, Gluconobacter, Gluconacetobacter và
Kozakia.

Ngày nay, việc phân loại vi khuẩn acetic nói chung và vi khuẩn
Gluconacetobacter nói riêng còn tồn tại nhiều quan điểm khác nhau. Vì vậy,
đòi hỏi cần nhiều nghiên cứu hơn nữa về loại vi khuẩn này.
1.1.2. Đặc điểm hình thái, tế bào học
Gluconacetobacter có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước
khoảng 2μm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả
năng di động, không sinh bào tử. Các tế bào được bao bọc bởi chất nhày tạo
váng nhăn và dày. Váng có chứa hemicellulose nên khi gặp H
2
SO
4
và thuốc
nhuộm iôt sẽ bắt màu xanh (do phản ứng của hemicellulose), bắt màu hồng
khi nhuộm fucshin chúng có thể tích luỹ 3,5% acid acetic trong môi trường.
Khi nồng độ acid acetic quá cao vượt quá giới hạn cho phép nó sẽ ức chế hoạt
động của vi khuẩn, chúng có thể sống chung với nấm men trong một loại
nước giải khát dân gian làm bằng nước chè và đường loãng, pH thích hợp là
4,5 – 6; nhiệt độ thích hợp từ 25 - 30
0
C [18].
Vi khuẩn Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí
bắt buộc, hoá dị dưỡng. Tế bào của chúng thường tìm thấy trong giấm, dịch
rượu, nước ép hoa quả, trong đất.
Theo Nguyễn Lân Dũng [10] vi khuẩn Gluconacetobacter có bao nhầy
cấu tạo bởi cellulose. Thành phần cấu tạo chủ yếu của bao nhầy là các
polysacarit (chủ yếu là glucose), ngoài ra còn có các polypeptit, protein. Bao
nhầy có tác dụng bảo vệ, cung cấp dinh dưỡng, giúp vi khuẩn bám vào giá thể.


6


Theo Sokolniki và cs độ dai và chắc của màng cellulose do vi khuẩn
sinh ra có liên quan đến hình dạng của tế bào vi khuẩn [28]. Nếu độ dài (chiều
dài của tế bào) càng cao thì tính bền vững của màng cellulose do vi khuẩn đó
tổng hợp càng lớn. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu tác giả Nguyễn
Thúy Hương (2006) khi nghiên cứu về mối liên hệ giữa hình dáng kích thước
tế bào vi khuẩn và độ chịu lực của màng BC cũng cho rằng những vi khuẩn có
tế bào dài thì màng BC mà chúng tạo ra có khả năng giữ nước tốt hơn và có
độ dai chắc hơn, còn những dòng Gluconacetobacter có hình dạng tròn dài thì
màng BC có khả năng chịu lực thấp hơn [13].

1.1.3. Đặc điểm nuôi cấy
Trên môi trường thạch đĩa vi khuẩn Gluconacetobacter hình thành
khuẩn lạc nhẵn hoặc sù sì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu
trắng hoặc trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên dễ tách khỏi môi
trường. Vi khuẩn Gluconacetobacter khi nuôi cấy trong môi trường lỏng ở
điều kiện tĩnh chúng sẽ hình thành trên bề mặt môi trường một lớp màng, đó
là tập hợp các tế bào vi khuẩn liên kết với các phân tử cellulose, trong tế bào
xảy ra quá trình trao đổi chất nói chung còn ở màng cellulose xảy ra quá trình
trao đổi oxy và các chất dinh dưỡng [18].
Ngược lại, trong điều kiện nuôi lắc cellulose hình thành dạng hạt nhỏ
với kích thước không đều nhau và phân tán trong môi trường dinh dưỡng tạo
ra những đặc tính hình thái khác hẳn cellulose trong điều kiện nuôi cấy tĩnh.
1.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
+ Đặc điểm sinh lý
Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển ở nhiệt độ 25 - 30
0
C, pH :4,5 -
6. Nhiệt độ và pH tối ưu tuỳ thuộc vào giống. Nếu nhiệt độ vượt quá 37
0

C thì
tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay cả trong môi trường tối ưu.


7

Gluconacetobacter có khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ
sung thêm acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ.
Tuy nhiên vẫn còn những ý kiến khác nhau và nhiều tranh cãi về điều
kiện nhiệt độ, pH tối ưu cho chủng vi khuẩn Gluconacetobacter sinh trưởng
và tạo màng.
+ Đặc điểm sinh hoá
Năm 1950 Frateur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới căn cứ
vào các tiêu chuẩn: khả năng oxy hóa acid acetic thành CO
2
và H
2
O; hoạt tính
catalase; khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer [29] …Theo quan điểm
này Gluconacetobacter là chủng thuộc chi chi Acetobacter, họ
Pseudomonasdaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizomycetes. Đặc điểm phân
biệt với các chủng khác trong cùng một chi được trình bày ở bảng 1 dưới đây:
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter
theo Frateur (1950)
STT Đặc điểm Hiện tượng Kết quả
1 Oxy hoá ethanol thành acid acetic
Chuyển hoá môi trường chứa
Bromphenol Blue 0,04% từ màu
xanh lục sang màu vàng
+

2 Hoạt tính catalase Hiện tượng sủi bọt khí +
3
Sinh trưởng trên môi trường
Hoyer
Sinh khối không phát triển _
4
Chuyển hoá Glycerol thành
dihydroxyacetone
Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch
sau lên men
+
5 Chuyển hoá glucose thành acid
Vòng sáng xuất hiện xung quanh
khuẩn lạc trên môi trường chứa
CaCO
3
+
6 Kiểm tra khả năng sinh sắc tố nâu Không hình thành sắc tố nâu _
7
Kiểm tra khả năng tổng hợp
cellulose
Váng vi khuẩn xuất hiện màu
lam
+



8

1.1.5. Đặc điểm về sinh trưởng

Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển tốt trên môi trường nước bia, các
môi trường có chứa cao nấm men, glucose, rượu etylic hay mannitol,… trong
điều kiện hiếu khí bắt buộc, nhiệt độ 25 - 30
0
C, pH: 5,4 - 6,8.
Tính chất đặc trưng nhất của vi khuẩn Gluconacetobacter là khả năng oxy
hóa rượu etylic thành acid acetic ở pH > 4,6. Ngoài ra, chúng còn thực hiện quá
trình oxy hóa không hoàn toàn các hợp chất hữu cơ khác (các loại đường và dẫn
xuất của chúng) để tạo thành các hợp chất xeto hay các acid hữu cơ tương ứng.
Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter đối với nguồn
cacbon, nguồn nitơ và chất sinh trưởng rất đa dạng, chúng có thể đồng hóa
nhiều loại thức ăn cacbon khác nhau như: các loại đường (monosaccaride,
disaccaride, polysaccaride) rượu etylic, acid hữu cơ, nhưng không sử dụng
được tinh bột và lactose.


9

1.2. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter
1.2.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Để vi khuẩn sinh trưởng và phát triển tốt hơn cần cung cấp nguồn
cacbon phù hợp. Tuỳ nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp là vô
cơ hay hữu cơ. Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ cacbon phụ thuộc vào
hai yếu tố: thành phần hoá học và tính chất sinh lý của nguồn thức ăn, đặc
điểm sinh lý của từng loại vi sinh vật.
Người ta sử dụng đường làm thức ăn nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật
dị dưỡng, đường đơn ở nhiệt độ cao có thể bị chuyển hoá thành loại hợp chất
có màu tối khó hấp thụ. Trong môi trường kiềm sau khử trùng, đường còn dễ
bị chuyển hoá làm biến đổi pH môi trường. Để tránh hiện tượng này khi khử
trùng môi trường có chứa đường người ta thường chỉ hấp ở áp lực 0,5atm ở

110
0
trong 30 phút. Từ các loại đường đơn, tốt nhất nên sử dụng phương pháp
hấp gián đoạn (phương pháp Tyndal). Để nuôi cấy các loại vi sinh vật khác
người ta sử dụng các nồng độ đường không giống nhau, với vi khuẩn thường
dùng 0,2- 0,5% đường. Hầu hết vi khuẩn chỉ đồng hoá được các loại đường ở
dạng đồng phân D [8].
Các hợp chất hữu cơ chứa cả cacbon và nitơ (pepton, nước thịt, nước
chiết ngô, nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch, ) có thể vừa sử dụng
làm nguồn cacbon, vừa sử dụng làm nguồn nitơ đối với vi sinh vật.


10
1.2.2. Nhu cầu nitơ của sinh vật
Môi trường cơ bản cho các nghiên cứu về cellulose vi khuẩn là môi
trường do Hestrin và Schramm thiết lập, có chứa cao nấm men và pepton là
nguồn nitơ hữu cơ, (NH
4
)
2
SO
4
là nguồn nitơ vô cơ [30].
Nguồn nitơ vô cơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH
3
và NH
4
+
.
Tuy nhiên, khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường có sử dụng NH

4
+
thì sau
khi chúng đồng hóa NH
4
+
trong môi trường sẽ tích lũy anion vô cơ làm hạ
thấp rất nhiều trị số pH của môi trường, muối amoni của các acid hữu cơ ít
làm chua môi trường hơn do đó có lúc được sử dụng nhiều hơn.
Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ thích hợp với nhiều loại tảo, nấm sợi,
xạ khuẩn nhưng lại ít thích hợp với vi khuẩn, vì sau khi vi khuẩn sử dụng hết
NO
3
-
các ion kim loại còn lại sẽ kiềm hóa môi trường.
Vi sinh vật có khả năng đồng hóa tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu
cơ, các thức ăn này vừa là nguồn cacbon vừa là nguồn cung cấp nitơ cho vi
sinh vật. Vi sinh vật không có khả năng hấp thụ trực tiếp các protein cao phân
tử, chỉ có các polypeptid không chứa quá 5 gốc axit amin mới có thể di
chuyển trực tiếp qua màng tế bào chất của vi sinh vật.
1.2.3. Nhu cầu nguồn photpho
Photpho chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các nguyên tố khoáng của tế bào
vi sinh vật. Để đảm bảo nguồn dinh dưỡng photpho, người ta dùng các loại
photpho vô cơ như KH
2
PO
4
, K
2
HPO

4
, KNO
3
Bổ sung photphat các môi
trường dinh dưỡng còn có tác dụng tạo ra tính đệm của môi trường.
Ngoài ra còn nhiều nguyên tố vi lượng cũng có vai trò ảnh hưởng đến
sinh trưởng của chủng Gluconacetobacter và quá trình hình thành màng BC
như Mg, Fe, S, Ca, Mn, Na, Cl… Nếu thiếu một trong số các nguyên tố vi
lượng thì chủng vi khuẩn Gluconacetobacter sinh trưởng và phát triển không
bình thường.


11
1.2.4. Ảnh hưởng của oxi
Theo cơ chế của quá trình lên men để oxi hóa 1mol rượu cần 1mol O
2
.
Thực tế càng thoáng khí thì năng suất càng cao. Ở phương pháp lên men
chậm do bề mặt tiếp xúc giữa tế bào và không khí bị hạn chế bởi sự bao phủ
bề mặt dịch lên men của lớp váng giấm, độ dày của lớp dung dịch. Vì vậy quá
trình lên men kéo dài 3-5 tuần, nồng độ giấm thu được 3-7% acid acetic. Ở
phương pháp chìm thời gian chỉ còn 3-4 ngày, hệ số chuyển hóa đạt 98%,
nồng độ giấm đạt 7-14% acid acetic [3], [4].
1.2.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Vi khuẩn Gluconacetobacter thuộc vi khuẩn ưa ấm, nhiệt độ hoạt động
thích hợp là từ 25-30
0
C, nhiệt độ quá thấp làm chậm quá trình lên men, nhiệt
độ cao sẽ làm ức chế hoạt động của vi khuẩn, khi nhiệt độ tăng quá cao thì
quá trình sinh sản của vi khuẩn sẽ bị dừng lại làm giảm hiệu suất của quá

trình lên men [3], [6].
1.2.6. Ảnh hưởng của pH
pH được đo bằng nồng độ ion H
+
trong dung dịch, pH ảnh hưởng đến
tính thấm hút của màng tế bào, vì thế nó ảnh hưởng trực tiếp đến sự trao đổi
chất của vi khuẩn. Sự tổng hợp ATP, đặc biệt là hoạt tính của enzyme rất
nhạy cảm với sự thay đổi pH. Độ pH ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển
của vi khuẩn, ảnh hưởng lớn đến khả năng tổng hợp cellulose vì pH kích thích
quá trình trao đổi chất của tế bào, độ pH quá cao hay quá thấp cũng gây ức
chế cho vi khuẩn. Người ta dựa vào độ pH đã chia vi khuẩn ra thành các loại:
vi khuẩn acid, vi khuẩn trung tính, vi khuẩn bazơ. Đã có rất nhiều nghiên cứu
về ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của vi khuẩn Gluconacetobacter và
hầu hết đều chỉ ra rằng chủng vi khuẩn Gluconacetobacter sinh trưởng và
phát triển trong môi trường hơi có tính acid (pH: 4,5 - 6) [6].
1.2.7. Ảnh hưởng của nồng độ acid acetic và rượu etylic


12
Acid acetic có tác dụng ức chế hoạt động của vi khuẩn, khi nồng độ
acid 8% thì vi khuẩn hoạt động kém, khi nồng độ acid từ 12-14% thì hoàn
toàn đình chỉ hoạt động. Vì vậy, nồng độ acid acetic cần dùng hoạt hóa vào
khoảng 2-2,5% (Nodes, 1986) và 2% (Ebner, 1985). Hàm lượng rượu etylic
trong dung dịch lên men cũng giống như acid acetic là một chất sát khuẩn với
vi khuẩn Gluconacetobacter, nó được sử dụng như một cơ chất. Hàm lượng
rượu có thể thay đổi từ 2-10% thể tích, hàm lượng rượu cao hơn sẽ làm giảm
năng suất lên men. Khi không có rượu etylic trong môi trường vi khuẩn sẽ
chuyển hóa acid acetic thành CO
2
và H

2
O [8].
1.3. Đặc điểm và cơ chế hình thành màng BC
1.3.1. Đặc điểm cấu trúc của cellulose
Cellulose là một polisaccarit có phân tử lượng: 8.10
5
– 22,68.10
5
đvC.
Có công thức chung của tinh bột (C
6
H
10
O
5
)
n
trong đó n có thể nằm trong
khoảng 5000 – 14000, mỗi phân tử cellulose gồm những đường đa được cấu
tạo từ các liên kết glucose. Các phân tử glucose nối với nhau ở vị trí β-1,4
bằng cầu nối oxi, có thể được cấu tạo từ 200 đến 1000 phân tử glucose.
Cellulose có hình dạng sợi dài, nhiều sợi liên kết song song với nhau thành
chùm nhờ các liên kết hydro giữa các nhóm (- OH). Mạch cellulose xếp song
song tạo thành các sợi có đường kính 3,5 nm, mỗi phân tử cellulose chứa
khoảng 8000 gốc momosaccharide. Cellulose có tính chất của 1 tinh thể
Crystal và có tính khúc xạ kép vì do cấu tạo mà phân tử cellulose có tính định
hướng không gian 3 chiều sắp xếp song song với nhau [15].
Cellulose là chất rắn dạng sợi, có màu trắng, không mùi, không vị, tính
bền vững cơ học cao, chịu được nhiệt độ đến 200
o

C mà không bị phân hủy.
Tỷ trọng khô là 1,45; khi khô cellulose dai và khi tẩm nước nó mềm đi.
Cellulose không tan trong nước và các dung môi hữu cơ nhưng tan trong dung
môi như: HCl, HNO
3
…và một số dung dịch muối: ZnCl
2
, PbCl
2
…


13
Cellulose được cấu tạo bởi các mắt xích β-D glucose liên kết với nhau
bằng liên kết 1,4 glucid, liên kết này thường không bền.
Đun nóng cellulose trong dung dịch acid vô cơ đặc thu được glucose.
(C
6
H
10
O
5
)
n
+ nH
2
O -> nC
6
H
12

O
6

Đun nóng cellulose trong hỗn hợp acid nitric đặc và acid sunfuric đặc
thu được cellulose nitrat.
[C
6
H
7
O
2
(OH)
3
]
n
+ 3n HNO
3
(đặc) -> [C
6
H
7
O
2
(ONO
2
)
3
]
n
+ 3nH

2
O
1.3.2. Đặc điểm cấu trúc của màng BC
Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polymer-β-1,4 glucopyranose mạch
thẳng, nó có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật nhưng cấu
trúc và đặc tính của nó lại khác xa nhau.
Chuỗi polymer-β-1,4 glucopyranose mới hình thành liên kết với nhau
tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm; những sợi nhỏ kết tinh tạo
sợi lớn hơn - sợi vĩ mô, những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối
cùng tạo dải lớn.
Những dải lớn từ tế bào này khi đẩy ra ngoài sẽ liên kết với những dải
lớn của tế bào khác bằng liên kết hydro hoặc Van Der Waals tạo thành dạng
sệt (gel) hay một lớp màng mỏng. Kích thước của màng tăng lên khi quần thể
vi khuẩn sinh trưởng. Những điểm tạo màng BC mới có thể xuất hiện, chính
vì thế mà màng BC được mở rộng [7].



14
1.3.3. Một số tính chất của màng BC
Chung và Shu (1999) đã nghiên cứu tính chất của BC như độ cứng, độ
dính, độ dai và ảnh hưởng của dung dịch đường, muối…lên tính chất của
màng BC. Màng BC có độ cứng là 3,68 kg/cm
2
, độ cứng của màng BC giảm
khi chúng được nhúng vào dung dịch đường và độ cứng màng BC tăng lên
khi được nhúng bằng dung dịch muối [32].
Sản phẩm của cellulose vi khuẩn có một số tính chất sau:
- Độ bền hóa học, độ bền cơ học và sức căng cao.
- Khả năng giữ nước và độ ẩm cao, do đó có thể điều chỉnh độ xốp.

- Có thể theo dõi, kiểm soát lý tính của cellulose do cấu trúc của
cellulose vi khuẩn có khả năng biến đổi trong quá trình nuôi cấy.
- Kiểm soát được kích thước, cấu trúc và chất lượng của cellulose
(kiểm soát được cellulose kết tinh dị hình) trong quá trình nuôi cấy tạo
cellulose.
- Cellulose vi khuẩn là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp mà
không gắn lygnin, có thể dễ dàng phân hủy bởi một số nhóm vi sinh vật. Vì
vậy cellulose vi khuẩn được xem là nguồn vật liệu mới có nhiều ưu thế trong
tương lai.
Màng BC có cơ chế kết tinh khác hẳn cellulose của thực vật ở chỗ
chúng không có sự kết hợp hemicellulose, lignin hay những thành phần phụ
khác mà được cấu tạo từ các sợi microfibril tạo nên những bó sợi song song
cấu thành mạng lưới cellulose. Do đó màng BC có độ bền cơ học cao, độ tinh
khiết cao, khả năng thấm hút nước lớn… hơn hẳn cellulose của thực vật.






15
1.3.4. Cơ chế tổng hợp Bacterial cellulose







Hình 1.1. Con đường sinh tổng hợp cellulose ở Gluconacetobacter

Quá trình sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được
điều hoà một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều
loại enzyme, phức hợp xúc tác và các protein điều hoà.
Theo tác giả Alina Krystyna Vicz và cs cho rằng có 4 enzym tham gia
xúc tác tổng hợp cellulose ở vi khuẩn Gluconacetobacter gồm Glucokinase
(GK), Phosphoglucomutase (PGM), Glucose - 1 - và Hromatka (1949-1953)
cho rằng: tế bào vi khuẩn có khả năng sản sinh phosphate uridylyltransferase
(UDPG pyrophosphorylase hay UGP), Cellulose synthase (CS). Trong đó
UGP là enzyme có vai trò quan trọng nhất [33].
Hai giai đoạn chính sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn:
Giai đoạn polymer hóa:
Đầu tiên enzyme glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hóa
chuyển sang glucose thành glucose-6-phosphate. Enzyme
phosphoglucomutase tiếp tục chuyển hóa glucose-6- phosphate thành glucose-
1-phosphate thông qua phản ứng isome hóa. Glucose-1-phosphate nhờ
enzyme UDP-glucose pyrophosphorylase chuyển hóa thành UDP-glucose.
Cuối cùng, UDP-glucose được tổng hợp nên sẽ được hóa thành cellulose và
celluose được tiết ra môi trường ngoại bào nhờ một phức hợp protein màng là


16
cellulose synthase, enzyme này được hoạt hóa nhờ một nucleotide vòng là
cyclic-di-GMP.
Giai đoạn kết tinh
Các chuỗi glucal được nối với nhau nhờ liên kết -1,4-glucan. Trong đó
các chuỗi glucal kết hợp tạo thành chuỗi glucan nhờ lực liên kết yếu Van Der
Waals, lớp chuỗi glucan này chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn, sau đó
chúng kết hợp với nhau bằng liên kết hidro tạo thành các sợi cơ bản gồm 16
chuỗi glucal. Các sợi cơ bản tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các vi sợi,
sau đó các vi sợi lại tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các bó sợi.


Hình 1.2. Sự giải phóng cellulose ra môi trường ngoài
Ý nghĩa của quá trình sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn
Gluconacetobacter
Phần lớn tế bào trong môi trường tĩnh, Gluconacetobacter không di
động do chúng nằm bên trong lớp màng cellulose. Điều này làm cản trở
nghiên cứu về quá trình chuyển hóa, vận chuyển chất dinh dưỡng và oxy đến
tế bào.
Lớp màng cellulose do vi khuẩn Gluconacetobacter tạo ra bao xung
quanh môi trường hạn chế nguồn oxy từ bên ngoài vào môi trường, điều này


17
ngăn cản sự cung cấp oxy cho các vi khuẩn hiếu khí khác, tạo điều kiện thuận
lợi cho quá trình cạnh tranh sinh tồn của vi khuẩn Gluconacetobacter. Màng
cellulose có khả năng giữ nước nên giúp cho vi khuẩn phân hủy các chất dinh
dưỡng để sử dụng và giúp tế bào chống lại ảnh hưởng của tia UV (tia tử
ngoại). Nhờ tính dẻo dai và tính thấm nước của các lớp cellulose mà các tế
bào vi khuẩn kháng lại được những thay đổi không thuận lợi trong môi trường
sống như giảm ẩm độ, thay đổi pH, xuất hiện các chất độc hại.
Mạng lưới BC là giá thể chống đỡ cho vi khuẩn Gluconacetobacter
luôn ở bề mặt tiếp giáp giữa môi trường lỏng và không khí. Chính mạng lưới
này làm cho các tế bào có thể bám chặt trên bề mặt môi trường và làm tế bào
nhận chất dinh dưỡng một cách dễ dàng hơn so với khi tế bào ở trong môi
trường lỏng không có mạng lưới cellulose. Trong môi trường tự nhiên, đa số
vi khuẩn tổng hợp các polisaccarit ngoại bào để hình thành nên lớp vỏ bao
quanh tế bào và màng BC là một điển hình.
1.4. Tổng quan về nguyên liệu
1.4.1. Môi trường lên men nước gạo
Gạo là loại thực phẩm carbohydrate hỗn tạp, chứa tinh bột (80%), một

thành phần chủ yếu cung cấp nhiều năng lượng, protein (7,5%), nước (12%),
vitamin. Chất tinh bột chứa trong hạt gạo dưới hình thức carbohydrate (carb) gồm
đường glucose, fructuose, lactose và sucrose. Có chứa các vitamin B-1, vitamin B-
2, niacin, vitamin E, ít chất sắt và kẽm và nhiều chất khoáng Mg, P, K, Ca. Thành
phần dinh dưỡng có trong gạo thích hợp để vi sinh vật phát triển tốt.