TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
PHẠM THUỲ DƯƠNG
GÓP PHẦN NGHIÊN cứu TANIN TRONG CHÈ DÂY
Ampelopsis cantoniensis Planch. Vitaceae
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 1999 - 2004)
- Người hướng dẫn
- Nơi thực hiện
-Thời gian thực hiện
GS.TS. PHẠM THANH KỲ
BỘ MÔN DƯỢC LIỆU
Hà Nội, tháng 5 - 2004
LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn :
GS.TS. Phạm Thanh Kỳ
Người thầy đã tận tình chỉ bảo hướng dẫn em trong suốt quá trình làm khoá
luận.
Em xin chân thành cảm ơn :
TS. Cao Văn Thu - Bộ môn Vi sinh
TS. Nguyễn Thái An - Bộ môn Dược cổ truyền
TS. Trần Vân Hiền - Phòng Đông Y thực nghiệm
TS. Đỗ Ngọc Thanh - Phòng thí nghệm trung tâm
Cùng tất cả các thầy cô giáo, các cô kỹ thuật viên Bộ môn Dược liệu, Bộ môn
Vi sinh và các phòng ban đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn
thành khoá luận này.
Nhân dịp này em xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè và người thân đã luôn bên
cạnh động viên, khích lệ em trong quá trình học tập cũng như làm khoá luận.
Hà N ội, tháng 5 năm 2004
Sinh viên
Phạm Thuỳ Dương
MỤC LỤC
Trang

Đặt vấn đ ê 1
Phần 1: Tổng quan 2
1.1. Tổng quan về cây chè dây (Ampelopsis cantoniensis Planch.)

2
1.1.1. Đặc điểm thực vật và sự phân bố
2
1.1.2. Thành phần hoá học 3
1.1.3. Tác dụng sinh học 5
1.1.4. Công dụng 7
1.2. Tổng quan về tanin 8
1.2.1. Khái niệm về tanin 8
1.2.2. Cấu trúc hoá học của tanin 8
1.2.3. Tác dụng và công dụng 12
Phần 2: Thực nghiệm và kết quả 14
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm 14
2.1.1. Nguyên liệu 14
2.1.2. Phương tiện nghiên cứu 14
2.1.3. Phương pháp nghiên cứu
.

15
2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét 17
2.2.1. Định tính tanin trong lá chè dây bằng các phản ứng hóa học

.
17
2.2.2. Chiết xuất ta n in
18
2.2.3. Phân lập tanin 28

2.2.4. Sơ bộ nhận dạng chất phân lập được 30
2.2.3. Thử một số tác dụng sinh học 31
Phán 3: Kết luận và đề xuất 38
3.1. Kết luận 38
3.2. Đề xuất 38
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
A.s
Ánh sáng
DL Dược liệu
IR Infra red spectrometry
MeOH
Methanol
MS
Mass spectrometry
NXB Nhà xuất bản
SKLM
Sắc ký lớp mỏng
T.T
Thuốc thử
uv Ultra violet spectrometry
ĐẬT VẤN ĐỂ
Thuốc phòng bệnh và chữa bệnh hầu hết được điều chế từ hai nguồn:
dược liệu và hoá dược. Không chỉ các nước Á đông mà các nước phương Tây
cũng tiêu thụ một lượng rất lớn dược liệu. Người ta thống kê thấy rằng ở các
nước có nền công nghiệp phát triển thì 1/4 số thuốc thống kê trong các đơn
đều có chứa hoạt chất từ thảo mộc. Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt
đới có thảm thực vật rất phong phú và đa dạng, do đó cũng có nguồn dược liệu
rất quý và dồi dào. Điều đó càng khẳng định vị thế quan trọng của dược liệu
trong ngành y tế Việt Nam. Chè dây là dược liệu đã được nghiên cứu về thực
vật, xác định tên khoa học, về thành phần hóa học, độc tính và một số tác

dụng sinh học. Chế phẩm AMPELỌP sản xuất từ chè dây chữa viêm loét dạ
dày- hành tá tràng đã được Bộ y tế cấp giấy phép lưu hành trên thị trường. Qua
các kết quả nghiên cứu trên chúng tôi nhận thấy ngoài thành phần flavonoid
thì tanin cũng chiếm một hàm lượng không nhỏ. Để góp phần nâng cao giá trị
sử dụng của cây chè dây chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Góp phần
nghiên cứu tanin trong chè dây” với các nội dung chính sau:
Về hóa học:
- Định tính tanin trong lá chè dây.
- Xây dựng phương pháp chiết xuất tanin trong lá chè dây.
- Phân lập một số chất chính.
Về tác dụng sinh học:
- Thử tác dụng kháng khuẩn và tác dụng chống oxy hoá của tanin chiết được từ
chè dây.
1
PHẦN I
TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỂ CÂY CHÈ DÂY (AMPELOPSIS CANTONIENSIS
PLANCH.)
1.1.1. Đặc điểm thực vật và sự phân bố
1.1.1.1. Đặc điểm thực vật và sư phân bố của họ Nho.
Theo Vũ Văn Chuyên [7]: các cây trong họ Nho có các đặc điểm chung
như: Cây có dạng leo hoặc dạng bụi leo nhờ tua cuốn. Tua cuốn có nguồn gốc
từ thân, mọc đối diện với lá. Lá mọc so le có lá kèm, có hình dạng khác nhau.
Lá đơn nguyên, khía thuỳ hoặc kép chân vịt. hoa nhỏ tập trung thành cụm hoa
xim, ngù hay chùm. Hoa lưỡng tính hay có khi giảm thành hoa đơn tính.Hoa
mẫu 4-5. Số nhị bằng số cánh hoa. Giữa bộ nhị và bộ nhụy có đĩa mật phát
triển thành vòng khuyên hay khía thùy hoặc chỉ là những tuyến riêng rẽ. Nhụy
gồm hai lá noãn dính lại với nhau thành bầu trên có hai ô, trong mỗi ô có hai
noãn, một vòi nhụy. Núm nhụy hình đĩa hoặc hình đầu. Quả mọng, hạt phôi
nhỏ và có nội nhũ. Thụ phấn nhờ gió.

Trên thế giới họ Nho có tất cả 10 chi với trên 700 loài, được phân bố ở
vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, một số ít ở vùng ôn đới. Ở Việt Nam có 7 chi
với nhiều loài khác nhau.
1.1.1.2. Đặc điểm thực vật và sự phán bô của chi Ampelopsis.
Chi Ampelopsis là một trong những chi điển hình của họ Nho với các
đặc điểm chung là: dạng dây leo, lá kép đơn hay có chia thuỳ. Hoa nhỏ tập
trung thành cụm hoa xim ngù hoặc tán mọc đối diện với lá. Quả thường hai ô,
hai lá noãn. Hạt có hố nhỏ, hẹp và dài [6,7].
ở Việt Nam có 4 loài: A.brevipedunculata(Maxim.) Trautv.
A.cantoniensis(Hook. et Am.) Planch.
2
A.heterophylla Sieb. et Zucc.
A.japonica(Thunb.) Makino.
Các loài trên có ở nam Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật bản, Indonexia,
Lào, Ấn độ. Ở Việt Nam có ở các tỉnh miền núi phía bắc, Ninh Bình và Tây
Nguyên [6].
1.1.1.3. Đặc điểm thực vật và sự phân bổ của cây chè dây.
Cây dạng dây leo dài, xanh tốt. Mọc hoang và được trồng trong các vườn
bờ rào nhà dân. Cành có lông nhỏ hình trụ mềm, có tua cuốn mọc đối diện với
lá. Lá kép lông chim lẻ có 3 -11 lá chét. Các lá chét hình trứng, phiến lá nhẩn,
mặt dưới ráp, nhạt, răng cưa đôi khi giảm thành mũi nhọn, lá chét cuối thường
to, dài gấp đôi các lá chét khác. Khi sao và ủ đến khô mặt dưới lá có những
chấm trắng nhỏ nổi lên. Cụm hoa xim hai ngả có cuống dài. Hoa nhỏ cuống
rất ngắn. Nụ hoa hình trứng tròn có những lông nhỏ. Đài hình đầu, cánh hoa 5,
chỉ nhị hình chỉ, nhụy hình trụ, bầu hai ô có hai noãn. Quả mọng màu nâu
đen, hơi cay. Hoa nở vào tháng 6, quả chín vào tháng 9.
Sách “Cây cỏ Việt Nam” ghi: trên thế giới cây có ở Lào, Trung Quốc,
Indonexia, Ấn Độ. Ở Việt Nam cây có ở: Cao Bằng, Lào Cai, Lạng Sơn, Hải
Phòng, Quảng Ninh, Hoà Bình, Hà Tây, Ninh Bình [10]
1.1.2. Thành phần hoá học:

1.1.2.1. Những nghiên cứu vê thành phần hoá học có trong chi Ampelopsis.
Nghiên cứu về chi Ampelopsis trên thế giới chủ yếu tập trung vào loài
A.brevipedunculata Trautv Ở Việt Nam, A.cantoniensis Planch, là cây đầu
tiên trong chi này được công bố về thành phần hóa học.
Căn cứ vào các tài liệu thu thập được, chúng tôi tóm tắt thành phần hoá
học một số loài trong chi Ampelopsis ở bảng 1
3
Bảng 1. Thành phần hoá học có trong một số loài thuộc chi Ampelopsis
Tên cây
Bộ
phân
Thành phần hoá học
Tài
liệu
Ampelopsis
brevipedunculata
var. hancei
Rễ
ampelopsin D, E, H và cis-ampelopsin E
(-)- epicatechin, pallidol, myabenol c,
acid oleanolic C30H48O3, acid betulinic
^30^48^3
[25]
Lá
ampelopsin A, ampelopsin B, ampelopsin
c
Ampelopsis
cantoniensis
Lá
-flavonoid: trong đó nhiều nhất là

myricetin và dihydromyricetin
- tanin
- flavon(4,73%), protein(9,25%), nguyên
tố vi lượng:K,Ca,Fe, Zn, và các vitamin
E,B1, B2
[12]
[17]
A.meliaefolia
Lá - myricetin(7,4%)
- dihydromyricetin(l,7%)
[17]
A.japonica
tanin và polyphenol
[24]
l.ỉ.2.2. Những nghiên cứu về thành phần hoá học của loài A. cantoniensis
Planch
Nghiên cứu về A.cantoniensis trên thế giới hầu như không có. Ở Việt
Nam nhóm nghiên cứu của Phạm Thanh Kỳ [12, 16, 17], đã công bố: Lá chè
dây mọc ở Cao Bằng và Sa Pa có Havonoid, tanin, đường, caroten và sterol.
Trong đó flavonoid và tanin có hàm lượng cao.
Hai ílavonoid đã phân lập được là myricetin và dihydro myricetin
4
ỔH Ồ
Myricetin
Dihydro Myricetin
1.1.3. Tác dụng sinh học
1.1.3.1.Những nghiên cứu về tác dụng sinh học của một số flavonoid trong
loài Ampelopsis
Cũng như một số flavonoid khác, myricetin trong một số loài
Ampelopsis có hoạt tính vitamin p [16]. Nghiên cứu ảnh hưởng của myricetin

trên hệ thống tạo gốc tự do và peroxy hóa trong microsom tế bào gan chuột,
Laughton M.J và cộng sự [16] nhận thấy những cây có nhiều flavonoid không
những có tác dụng chống oxy hoá mà còn làm giảm các chất tiền oxy hóa.
Bên cạnh tác dụng chống oxy hóa, tác dụng chống ung thư của một số
flavonoid cũng đang được quan tâm.
Camoirano A. và cộng sự [18] đã nghiên cứu tác dụng chống ung thư
của một số flavonoid thấy myricetin có khả năng ức chế sự đột biến gây nên bởi
hai tác nhân là 4- nitroquinolin-l-oxyd và khói thuốc lá trên các chủng
Salmonella typhimonium TA 100 và TA98. Acid tanic, myricetin ngăn cản sự
5
khởi đầu ung thư trên biểu bì và phổi chuột gây ra bởi tác nhân hydrocarbon
thơm.
Kostas Dimas và cộng sự [19] thử tác dụng gây độc tế bào đối với
dòng tế bào gây bệnh ung thư bạch cầu ở người của myricetin và hai dẫn chất
của myricetin là 3,7,4\5’-tetrametyl ether myricetin và 3’,5-diacetyl
myricetin, dùng vinblastin làm đối chứng. Kết quả cho thấy : dẫn chất 3\5-
diacetyl myricetin có tác dụng mạnh hơn dẫn chất còn lại và myricetin không
có tác dụng này.
1.1.3.2. Những nghiên cứu vê tác dụng sinh học của cây chè dây
(A.cantoniensis Planch.):
+ Theo kết quả nghiên cứu của nhóm Phạm Thanh Kỳ[12, 16, 17] có thể tóm
tắt như sau:
- Cao khô chè dây và các flavonoid khác không gây ngộ độc cấp tính
trong chuột thí nghiệm.
- Cao chè dây không ảnh hưởng đến các chỉ tiêu hoá sinh và huyết học
bao gồm: số lượng hồng cầu, bạch cầu, công thức bạch cầu, điện di protein
huyết thanh, ure máu, khi cho thỏ dùng thuốc trong thời gian dài 5 tuần.
- Myricetin không gây rối loạn nhiễm sắc thể, không ảnh hưởng tới sinh
sản và di truyền.
- Thử sơ bộ thấy cao khô chè dây, myricetin, dyhidromyricetin có hoạt

tính chống oxy hoá cao.
Cao khô chè dây và myricetin có khả năng thải độc theo cơ chế trung
hoà gốc tự do của tetraclorua carbon.
+ Phùng Gia Hợp đã dùng cao đặc chè dây điều trị vết bỏng nông [16]: bỏng
độ II và bỏng độ III ở 32 bệnh nhân thấy vết bỏng tạo được màng thuốc bám
chắc vào bề mặt vết thương. Khi màng thuốc bong thì vết bỏng lành sẹo, bề
mặt mềm và mịn.Thời gian khỏi trung bình của bỏng độ II là 9,2 ngày, bỏng
độ III là 18,5 ngày. Cao chè dây không dùng được cho bỏng sâu, bỏng nông
6
đã nhiễm khuẩn, bỏng đầu mặt, cổ, bàn tay, ngón tay, chân và vùng khớp.Việc
sử dụng cao chè dây bôi lên tổn thương không gây độc hại tại chỗ cũng như
toàn thân đối với bệnh nhân.
1.1.4. Công dụng:
• Theo kinh nghiệm dân gian:
-Loài A.japonica: người dân Việt Nam dùng rễ gọi là Bạch liễm(vị đắng
ngọt, hơi lạnh) có tác dụng thanh nhiệt giải độc, tiêu ung tán kết để chữa trĩ
rò, tràng nhạc, mụn nhọt sưng lở, bỏng lửa, nước [6].
-Loài A.heterophylla (Dâu dây): người dân Việt Nam dùng toàn cây (vị
ngọt, tính mát) có tác dụng thanh nhiệt, tiêu sưng để chữa phong thấp, đau
nhức xương và đắp mụn nhọt [6].
-Loài A. cantoniensis (Chè dây) được dùng lá chủ yếu có vị ngọt, tính mát
và có nhiều công dụng [6, 17]:
+Nhân dân vùng núi phía Bắc dùng pha nước uống hàng ngày thay
chè và để trị đau dạ dày.
+ Nhân dân vùng Lạng Sơn dùng đắp lá vào chỗ bị viêm tấycó mủ
(áp xe vú).
+ Có nơi nhân dân dùng lá tươi giã đắp vào các vết bỏng.
+ Người dân Sa Pa dùng nước sắc uống hoặc nước hãm dạng chè
uống hàng ngày với tác dụng thanh nhiệt, chữa mất ngủ, kích thích tiêu hoá,
đặc biệt chữa đau dạ dầy, viêm đại tràng, viêm đường ruột rất tốt.

• Theo những kết quả nghiên cứu về tác dụng điều trị loét dạ dày- hành tá
tràng của chè dây, chế phẩm AMPELOP sản xuất từ chè dây (A. cantoniensis
Planch.) đã ra đời.
- Những nghiên cứu trên lâm sàng của chế phẩm AMPELOP có một số
kết luận sau [13, 14]:
7
+ AMPELOP có tác dụng cắt cơn đau trung bình 8,9 ngày, sau 2 tuần có
90,09 % bệnh nhân hết đau.
+ AMPELOP làm liền sẹo ổ loét tá tràng 79,55%.
+ AMPELOP làm sạch HP 53,9 %.
+ AMPELOP có tác dụng làm giảm viêm dạ dày.
+ AMPELOP không độc và không có tác dụng không mong muốn.
- Để nâng cao tác dụng điều trị của thuốc AMPELOP, các nhà lâm sàng
dã nghiên cứu các phác đồ điều trị như: Dùng AMPELOP trong một tháng kết
hợp với AMOXICILLIN và METRONIDAZOL dùng trong một tuần đạt kết
quả rất tốt.
1.2. TỔNG QUAN VỀ TANIN
1.2.1. Khái niệm về tanin
Theo tài liệu [1]: Tanin là những hợp chất polyphenol có trong thực vật có vị
chát, có tính chất thuộc da, được phát hiện dương tính với “thí nghiệm thuộc
da” và được định lượng dựa vào mức độ hấp phụ trên bột da sống chuẩn.
Định nghĩa này không bao gồm những chất phenol đơn giản hay gặp cùng
với tanin như acid gallic, các chất catechin, acid chlorogenic mặc dù những
chất này ở những điều kiện nhất định có thể kết tủa với gelatin và một phần
nào bị giữ trên bột da sống. Chúng được gọi là Pseudotanin.
1.2.2. Cấu trúc hoá học của tanin [1, 20, 21]
Tanin có cấu trúc phức tạp, dựa vào cấu trúc hoá học người ta chia tanin
làm hai loại chính: tanin thuỷ phân (tanin pyrogallic) và tanin không thuỷ
phân được (tanin pyrocatechic).
1.2.2.1. Tanỉn thuỷ phân được (Hydrolyzable)

Khi thuỷ phân bằng acid hoặc bằng enzym tanase thì giải phóng ra phần
đường thường là glucose, đôi khi cũng gặp những loại đường đặc biệt. Phần
8
không phải là đường là các acid. Acid hay gặp là acid gallic. Các acid gallic
nối với nhau theo dây nối pepsid để tạo thành acid digallic, trigallic.
O H
C O O H
Acid gallic Q J J
Acid digallic
Ngoài acid gallic, còn có các acid khác như acid ellagic, acid luteolic
Acid luteolic Acid ellagic
Phần đường và phần không đường nối với nhau theo dây nối ester nên người
ta coi tanin loại này là những Pseudoglycosid.
1.2.2.2. Tanin ngưng tụ (Condensed tannin)
Tanin ngưng tụ được hình thành từ các đơn phân tử cơ bản là catechin và
epicatechin đó là hai chất đồng phân của nhau. Phân tử cơ bản thuộc loại
9
tlavan có carbon sô 4 là nhóm methylen (-CH,-) dễ ngưng tụ thành các
polyme.
OH
.OH
OH
OH
Epicatechin
Catechin
Sự ngưng tụ thường xảy ra ở dây nối carbon-carbon, ví dụ giữa C8 của
catechin và C4 của epicatechin tạo thành một dimer như sau:
epicatechin-(4ị3-8)-catechin
10
K. Freudenberg đã đưa ra giả thuyết nhất nguyên [9], ông đã thực nghiệm

tổng hợp các catechin từ procyanidol với sụ có mặt của men phenolaza thảo
mộc và đã tổng hợp được dicatechin.
OH
Catechin
Dicatechin
Năm 1953 Bate-Smith đã nêu ra giả thuyết nhị nguyên [9], ông cho rằng các
leucoanthocyan và catechin cùng tham gia cấu tạo thành tanin catechic.
Creasy đã ngưng tụ catechin với procyanidol tạo thành procyanidol dime sau:
m
w v / ^
CH
CH
Catechin
Procyanidol dime
Masquelier đã dựa vào trọng lượng phân tử của tanin catechic phân thành 4 loại [9]:
m QH
Procyanidol
11
-Monome chỉ gồm đơn phân tử flavan có trọng lượng phân tử 300,
không có hoạt tính thuộc da.
-Oligome có từ 2 đến 5 phân tử cơ bản ngưng tụ có trọng lượng phân tử
từ 500 đến 1500. Loại này có hoạt tính thuộc da.
-Loại tanịn thực sự có từ 6 đến 10 phân tử ngưng tụ có trọng lượng
phân tử từ 1500 đến 3000, có hoạt tính thuộc da mạnh nhất.
-Loại polyme có từ 11 phân tử ngưng tụ trở lên gọi là flobaphen hoặc
đỏ tanin, loại này có thuộc tính thuộc da kém hơn.
1.2.3. Tác dụng và công dụng [1]
Ở trong cây, tanin tham gia vào quá trình trao đổi chất, các quá tình oxy
hoá khử.
Là những chất polyphenol, tanin có tính kháng khuẩn nên có vai trò bảo

vệ cho cây.
Dung dịch tanin kết hợp với protein, tạo thành màng trên niêm mạc nên
ứng dụng làm thuốc săn da. Tanin còn có tác dụng kháng khuẩn nên dùng làm
thuốc súc miệng khi niêm mạc miệng, họng bị viêm loét, hoặc ổ loét do nằm
lâu. Tanin có thể dùng trong chữa viêm ruột, chữa tiêu chảy.
Tanin kết tủa với muối kim loại nặng và với alcaloid nên dùng chữa ngộ
độc đường tiêu hoá.
Tanin có tác dụng làm đông máu nên dùng đắp lên vết thương để cầm
máu, trĩ, rò hậu môn.
Có thể dùng tanin tinh chế pha trong dung dịch nước 1-2% hoặc thuốc
bột, thuốc mỡ 10-20%. Khi dùng trong (uống) nên dùng chế phẩm tanalbumin
hay tanalbin. Đây là dạng kết hợp tanin và albumin, điều chế bằng hoà tan 10
gam albumin vào 90 gam nước, thêm vừa đủ dung dịch tanin 6% để kết tủa
hết albumin, đun nhẹ 50° c để làm vón, lọc và rửa với một ít nước, sấy khô 40-
50°c rồi tán nhỏ.Tanalbin có màu vàng nhạt, không mùi, không vị, chứa 50%
12
tanin, không hoà tan trong nước và trong cồn, không bị dịch phân huỷ. Khi
vào đến ruột gặp môi trường kiềm tanin mới giải phóng, tránh được tanin tác
dụng trên niêm mạc miệng - thực quản- dạ dày gây khó chịu và rối loạn tiêu
hóa. Người lớn uống 2- lOg chia làm liều nhỏ lg.
Có thể chế dạng tanat gelatin dùng như tanalbin. Tanaform (=tanin +
formol) dùng bôi ngoài.
13
PHẦN 2
THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỤC NGHIỆM.
2.1.1. Nguyên liệu.
Lá chè dây thu hái ở Cao Bằng tháng 10 năm 2003, tên khoa học của mẫu
nghiên cứu đã được GS. Vũ Văn Chuyên xác định là Ampelopsis cantoniensis
Planch. Vitaceae.

2.1.2. Phương tiện nghiên cứu.
2.1.2.1. Hóa chất.
Hoá chất sử dụng đạt tiêu chuẩn phân tích: Aceton, Ethylacetat, Cloroform,
Ethanol, MeOH, Toluen, Acid formic, n Buthanol
2.1.2.2. Các chủng gốc vi sinh vật kiểm định và môi trường nuôi cấy:
*. Chủng vi sinh vật kiểm định :
- Escherichia coli ATCC 25922 viết tắt là E.c
- Proteus mirabilis BV108 viết tắt là Pro
- Pseudomonas aeruginosa VM 201 viết tắt là Pseu
- Shigella flexneri DT 112 viết tắt là Shi
- Salmonella typhi DT 220 viết tắt là Sal
- Bacillus cereus ATCC 9946 viết tắt là B.c
- Bacillus pumilus ATCC 10241 viết tắt là B.p
- Bacillus subtilis ATCC 10241 viết tắt là B.s
- Sarcina lutea ATCC 9341 viết tắt là S.L
- Staphyloccocus aureus ATCC 122 viết tắt là Sta
*. Môi trường nuôi cấy:
14
- Môi trường thạch thường: pepton 5,0g; cao thịt 3,0g; NaCl 5,0g;
thạch 18g; nước cất vừa đủ 1000 ml; pH: 6,8 - 7,2 tiệt trùng ở 118°c, thời gian
30 phút.
- Môi trường canh thang: Pepton 5,0 g; cao thịt 3,0g; NaCl 5,0g;
nước cất vừa đủ 1000 ml; pH: 6,8 - 7,2 tiệt trùng ở 118°c, thời gian 30 phút.
2.1.2.3. Súc vật thí nghiệm:
Chuột nhắt trắng chủng Swiss có trọng lượng 20± 2g do Viện Vệ sinh
dịch tễ Trung ương cung cấp đạt tiêu chuẩn thí nghiệm
2.1.3. Phương pháp nghiên cứu.
2.1.3.1. Nghiên cứu về hóa học:
- Định tính các nhóm chất hữu cơ theo phương pháp ghi trong “Bài giảng
Dược liệu”[l], và “Thực tập Dược liệu”[2].

- Định tính bằng SKLM theo phương pháp ghi trong “Thực tập Dược liệu”[2]
và “Bài giảng Dược liệu”[l]
- Sắc ký cột dùng silicagen (Merck) cỡ hạt 0,04 - 0,063mm và Sephadex
LH20.
- Phổ tử ngoại (UV) đo trên máy UV-VIS Spectrophotometer carry 1E-
varian(Australia) tại phòng thí nghiệm trung tâm- Trường Đại học Dược Hà
Nội.
- Phổ hồng ngoại (IR) đo trên máy 1650-Perkin Elmer (USA) tại phòng thí
nghiệm trung tâm- Trường Đại học Dược Hà Nội.
- Phổ khối (MS) đo trên máy 5989 -B- MS tại Viện hoá học, Trung tâm
KHTN và công nghệ quốc gia.
15
2.1.3.2. Nghiên cứu vê tác dụng sinh học:
2.1.3.2.1. Thử tác dụng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán [3]:
*. Nguyên tắc: Mẫu thử được đặt lên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy vi sinh vật
kiểm định. Hoạt chất từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát
triển của các vi sinh vật tạo thành vòng vô khuẩn, đo đường kính vòng vô khuẩn.
Hoạt lực kháng khuẩn của mẫu thử tỷ lệ với đường kính vòng vô khuẩn. Tác dụng
kháng khuẩn thử tại Bộ môn Vi sinh trường Đại học Dược Hà Nội.
2.1.3.2.2. Thử tác dụng chống oxy hoá của tanin:
Thử tác dụng chống oxy hoá bảo vệ tế bào não và gan chuột của tanin toàn
phần chiết từ lá chè dây (invitro) tại phòng Đông Y thực nghiệm Viện YHCT.
Đánh giá tác dụng chống peroxy hoá lipid màng tế bào được thực hiện qua
việc xác định hàm lượng MDA, một sản phẩm trung gian của quá trình này
dựa theo phương pháp đã được miêu tả bởi Jadwiga Robax (Ba Lan, 1987) và
Mitsno Tanaka (Nhật Bản, 1994) với một số thay đổi nhỏ [23].
Nguyên lý của phương pháp là MDA, một sản phẩm được tạo ra trong quá
trình peroxy hoá lipid, có thể phản ứng với acid thiobarbituric để tạo phức
Trimethin có màu hồng và có đỉnh hấp thụ cực đại ở 530 - 532 nm.
Malonyl dialdehyd Thiobarbituric acid Phức hợp Trimethin

Cường độ màu của dung dịch tỷ lệ thuận với nồng độ MDA. Hàm lượng MDA là
số nmol MDA trong lg tổ chức (não và gan chuột) và được tính theo đường cong
chuẩn sử dụng MDA tinh khiết nồng độ từ 2,00 nmol đến 15,2 nmol.
16
2.1.3.2. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu trong thực nghiệm được xử lý theo phương pháp thống kê ứng dụng
trong Y Dược [11]. Xác định giá trị trung bình , độ lệch chuẩn
2.2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT
2.2.1. Định tính tanin trong lá chè dây bằng các phản ứng hóa học
Chuẩn bị dung dịch thử: Cho 2g dược liệu vào bình nón 50 ml, thêm 20 ml
nước cất, đun sôi cách thuỷ 30 phút, lọc lấy dịch lọc để làm các phản ứng.
- Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch lọc,
thêm 2-3 giọt FeCl3 5%, dung dịch chuyển sang mầu xanh đen (Phản ứng
dương tính).
- Phản ứng với dung dịch gelatin 2%: Lấy 1 ml dịch lọc cho vào ống
nghiệm, thêm từ từ 1 ml dung dịch gelatin 2%, thêm 0,5 ml NaCl 10%, thấy
xuất hiện tủa bông trắng ( Phản ứng dương tính).
- Phản ứng với dung dịch chì acetat 10%: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch
lọc, thêm 2-3 giọt chì acetat 10% vào thấy xuất hiện tủa bông trắng (Phản ứng
dương tính).
- Phản ứng phân biệt tanin pyrogallic và tanin pyrocatechic:
+ Phản ứng với nước Brom bão hòa: Lấy 1 ml dịch lọc cho vào ống
nghiệm , thêm từ từ 2-3 giọt nước Brom, lắc đều, xuất hiện tủa (Phản ứng
dương tính với tanin pyrocatechic).
/
_
\ I n
Giá trị trung bình : (p) = X A-
Đô lêch chuẩn SD
+ Phản ứng Stiasny: Lấy 2ml dịch lọc thêm 5 ml dung dịch formol và 5

ml dung dịch acid clohydric đặc, đun sôi cách thuỷ 3 phút, thâý xuất hiện kết
tủa (Phản ứng dương tính với tanin pyrocatechic).
Kết quả định tính tanin được tóm tắt ở bảng 2.
Bảng 2. Kết quả định tính tanin trong lá chè dây
Phản ứng
Kết quả
Kết luận
Với FeCl3 5%
+ + +
Có tanin
Với gelatin 2%
+ + +
Có tanin
Với Pb(CH3COO)2
+ + +
Có tanin
Với nước Br2 bão hoà
+ + +
Có tanin pyrocatechin
Phản ứng Stiasny
+ + +
Có tanin pyrocatechin
Chú thích: +++: phản ứng rất rõ
Nhận xét:
Trong lá chè dây có tanin pyrocatechic (tanin ngưng tụ). Trong các khoá luận
trước mới chỉ nghiên cứu tanin ở mức độ phản ứng định tính và định lượng ,
để tiếp tục các công trình nghiên cứu trước , chúng tôi tiến hành xây dựng
phương pháp chiết xuất tanin.
2.2.2. Chiết xuất tanin
2.2.2.1. Xây dựng phương pháp chiết xuất tanin trong lá chè dây

Tanin catechic không bền vững, đặc biệt nhanh nhậy với tác động của ion
H+ và Oxy nên các phương pháp chiết xuất và phân lập gặp nhiều khó khăn, ở
đây chúng tôi tiến hành chiết xuất tanin theo hai phương pháp:
+ Phương pháp 1: Tanin trong dược liệu được chiết xuất bằng cồn 50%.
Cho lOOg dược liệu vào bình cầu 1000 ml, chiết hồi lưu bằng cồn 50% liên tục
trong 8 giờ. Lấy dịch chiết ra để lắng, gạn dịch trong, đem dịch trong cô cách
thuỷ còn 1/10 thể tích.
18
Tủa tanin bằng dung dịch amoni sulfat 15%, lọc lấy tủa . Hoà tan tủa
bằng aceton : nước [6:1], thu hồi dung môi, rửa bằng ether, thu được tanin
toàn phần. Làm như vậy 3 lần.
Quy trình chiết xuất theo phương pháp 1 được tóm tắt ở sơ đồ 1 và hàm
lượng tanin chiết được từ lá chè dây được trình bày ở bảng 3.
Bột dược liệu
_
_______ _____________
y
+ Ethanol 50%
Dịch chiết cồn
I Đểlấng,ga n Ỹ ' ũ ^ - 4 ;
ố ')
Dịch lọc
Cô cách thuỷ
Dịch chiết đậm đặc
(NH4)2S04 15%, lọc lấy tủa /-??/ #* ứ
Tủa
__________
______________J <
Aceton: H20(6:l), lọc f'7ty ùe^o
Dịch lọc

__________
V
ị Cô áp suất giảm
Cắn T
Sơ đồ 1. Sơ đổ chiết xuất tannin theo phương pháp 1
Aceton thu hồi
19
Bảng 3. Hàm lượng tanin chiết được từ lá chè dây.
Số lần
chiết
Khối lượng DL(g)
Khối lượng
tanin(g)
Tỷ lệ
(%)
1
100
3,51
3,51
2
100,13
4,12
4,11
3 100,05
3,70 3,69
Trung bình
3,77 %
- Để kiểm tra cắn T có phải là tanin hay không chúng tôi tiến hành các phản
ứng định tính sau:
Hoà tan 0,1 g cắn T trong 10 ml nước nóng làm dung dịch thử.

Kết quả định tính được ghi ở bảng 4.
Bảng 4. Kết quả định tính tanin trong cắn T
Phản ứng
Kết quả
Kết luận
Với FeCl3 5%
+++
Có tanin
Với gelatin 2%
+++
Có tanin
Với Pb(CH3COO)2
+++
Có tanin
Với nước Br2 bão hoà
+++
Có tanin pyrocatechic
Phản ứng Stiasny
+++
Có tanin pyrocatechic
Chú thích: +++: Phản ứng rất rõ.
20
- Định tính cắn T bằng SKLM:
Hoà tan 0,1 g cắn T trong 5 ml MeOH. Tiến hành SKLM trên bản Silicagen
GF 2 5 4 (Merck) tráng sẩn đã hoạt hoá, khai triển với các hệ dung môi:
Hệ I: Toluen : Ethylacetat: Acid formic [5:6: 1]
Hệ II: Ethylacetat: n Butanol: Acid formic [5:3:1]
Hệ 3: Cloroform : Acid acetic : Nước [10 : 9 : 1]
Hệ 4: n Butanol: Acid acetic : Nước [4:1:2]
Thuốc thử hiện màu là FeCl3 / MeOH (1:1).

Kết quả SKLM cho thấy các hệ dung môi trên đều không tách tốt. Do đó
chúng tồi tiếp tục khảo sát cắn T bằng SKLM hai chiều với hệ dung môi (1) và
(2). Kết quả được thể hiện trên sắc ký đồ (hình 1).
►
Chiều 2
Hình 1: sắc ký đồ SKLM hai chiều tủa T
21