ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



NGUYỄN THỊ THU THỦY


TÊN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN

ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG CÁC CHẤT
β
-AGONIST
(CLENBUTEROL VÀ SALBUTAMOL) TRONG THỨC ĂN
GIA SÚC VÀ DƯ LƯỢNG TRONG THỊT GIA SÚC BẰNG
KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ.

Chuyên ngành: HÓA HỮU CƠ

Mã số chuyên ngành: 62 44 27 01


Phản biện 1: GS.TSKH. Nguyễn Công Hào
Phản biện 2: GS.TS. Nguyễn Kim Phi Phụng
Phản biện 3: PGS.TS. Trương Thế Kỷ
Phản biện độc lập 1: PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn
Phản biện độc lập 2: TS. Nguyễn Văn Thị
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. GS.TS. Chu Phạm Ngọc Sơn
2. TS. Trầ
n Kim Tính


Tp. Hồ Chí Minh - 2011
i

MỤC LỤC
Trang
• Mục lục i
• Danh mục chữ viết tắt và ký hiệu iv
• Danh mục các bảng, hình và đồ thị vii
• Danh mục các phụ lục xv
MỞ ĐẦU 1
- Lý do chọn đề tài 1
- Mục đích nghiên cứu 2
- Đối tượng nghiên cứu 2
- Phạm vi nghiên cứu và ý nghĩa khoa học, ý nghĩa thực tiễn 3
CHƯƠNG 1. T
ỔNG QUAN 4

1.1. Tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài ở nước ngoài và trong nước 4
1.1.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 4
1.1.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước 7
1.2. Lý thuyết về chất kích thích tăng trưởng họ β–agonists 10
1.2.1.Giới thiệu chung về nhóm chất kích thích tăng trưởng thuộc họ
β–agonists………………………………………………………… 10
1.2.2. Clenbuterol 14
1.2.3. Salbutamol 15
1.2.4.Tình hình sử dụng chất kích thích tăng trưởng trên thế giới và
ở
Việt Nam 17
1.2.5. Những dấu hiệu giúp người tiêu dùng nhận biết thịt gia súc, gia
cầm có chứa chất kích thích tăng trưởng
19
1.3. Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ và một số quy định của Châu
Âu về phương pháp phân tích mẫu bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ 20
1.3.1. Giới thiệu phương pháp phân tích sắc ký lỏng ghép khối phổ 21
1.3.2. Quy trình định tính và định lượng β-agonists (sal và clen) 30
1.3.3. Kỹ thuật chiế
t pha rắn (Solid Phase Extraction - SPE) 30
1.3.4. Một số quy định của Châu Âu về phương pháp phân tích mẫu
bằng LC-MS/MS (theo quyết định 20002/657/EC) 32
1.3.5. Độ không đảm bảo đo của phương pháp 33
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM 36
2.1.Thiết bị và hóa chất 36
2.2.Xây dựng phương pháp xác định clenbuterol và salbutamol bằng sắc ký
lỏng ghép khối phổ, tối ưu hóa các thông số kỹ thuật của hệ thống LC-
MS/MS 38
2.2.1. Khảo sát quá trình quét phổ các ion chất chuẩn và nội chuẩn (sử
dụng chế độ Full scan) 38


ii

2.2.2. Khảo sát năng lượng phân mảnh của các tiền ion (chọn chế độ
SRM: Selected Reaction Monitoring)
39
2.2.3. Khảo sát nhiệt độ ống mao quản 40
2.2.4. Khảo sát chương trình dung môi 40
2.2.5. Khảo sát khoảng tuyến tính của clen và sal trong xây dựng đường
chuẩn 42
2.3. Khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu. 43
2.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của đệm pH trên khả năng giữ lại clen, sal và
nội chuẩn đồng vị
trên cột SCX 43
2.3.2. Khảo sát độ lặp lại của tín hiệu đo của chuẩn clen và sal 43
2.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu trong quá trình phân tích 44
2.3.4. Xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu 45
2.3.5. Xác định hiệu suất thu hồi 45
2.4. Khảo sát giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp
(Limit of Detection - LOD and Limit of Quantification -LOQ)
46
2.5. Xác định độ không đảm bảo đo 47
2.6. Thực nghiệm nuôi gà lấy mẫu – Kiểm tra dư lượng của clenbuterol và
salbutamol trong mẫu thử nghiệm

53
2.6.1. Phương tiện thí nghiệm 53
2.6.2. Phương pháp thí nghiệm 55
2.7. Thực nghiệm nuôi heo lấy mẫu – Kiểm tra dư lượng của clenbuterol và
salbutamol trong mẫu thử nghiệm 55

2.7.1. Phương tiện thí nghiệm 55
2.7.2. Phương pháp thí nghiệm 56
2.8. Điều tra tình hình sử dụng clenbutrol và salbutamol trong thức ă
n chăn
nuôi và trong thịt heo, thịt gà ở Thành phố Cần Thơ, tỉnh Hậu Giang,
Tỉnh Vĩnh Long 57
2.8.1. Thu mẫu thức ăn chăn nuôi 57
2.8.2. Thu mẫu thịt heo và thịt gà 57
2.8.3. Phân tích mẫu 57
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 58
3.1. Kết quả tối ưu hóa các thông số kỹ thuật của hệ thống LC-MS/MS 58
3.1.1. Kết quả khảo sát quá trình quét phổ các ion chuẩ
n và nội chuẩn
(sử dụng chế độ Full scan) 58
3.1.2. Kết quả khảo sát năng lượng phân mảnh của các tiền ion (chọn
chế độ SRM: Selected Reaction Monitoring) 60
3.1.3. Kết quả khảo sát nhiệt độ ống mao quản. 63
3.1.4. Kết quả khảo sát chương trình dung môi 64
3.1.5. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của clen và sal trong xây
dựng đường chuẩn 66
iii

3.2.
K
ết quả khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu 70
3.2.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của đệm pH trên khả năng giữ lại
clen, sal và nội chuẩn đồng vị trên cột SCX. . 70
3.2.2. Kết quả khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu. . 71
3.2.3. Kết quả khảo sát độ lặp lại của tín hiệu đo của chuẩn clen và sal 72
3.2.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng c

ủa nền mẫu trong quá trình phân
tích - xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu. 74
3.2.5. Kết quả xác định hiệu suất thu hồi của clen, sal . 79
3.3. Kết quả khảo sát giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương
pháp
(Limit of Detection - LOD and Limit of Quantification -LOQ) 86
3.4. Độ dao động của tỷ lệ cường độ các mảnh ion .

87
3.5. Tóm tắt qui trình phân tích clen, sal bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép
khối phổ ba tứ cực (LC-MS/MS) . . 90
3.6.
K
ết quả tính độ không đảm bảo đo của phương pháp 94
3.7. Giới thiệu phương pháp xác định clen và sal bằng sắc ký lỏng ghép khối
phổ một tứ cực (LC/MS) . . 95
3.8. Kết quả thử nghiệm trên gà. . 101
3.8.1. Kết quả theo dõi khả năng tiêu tốn thức ăn cho gà trong suốt kỳ
thí nghiệm . 101
3.8.2. Kết quả theo dõi khả năng tăng trọng của gà trong suốt kỳ thí
nghiệm
102
3.8.3. Kết quả phân tích dư lượng của thịt gà sau khi nuôi thử nghiệm . 104
3.9. Kết quả thử nghiệm trên heo 107
3.9.1. Kết quả theo dõi tiêu tốn thức ăn, sự tăng trọng của heo, hệ số
chuyển hóa thức ăn. . . 107
3.9.2. Kết quả phân tích dư lượng của thịt heo sau khi nuôi thử nghiệm. 108
3.10. Kết quả điều tra tình hình sử dụng clenbuterol và salbutamol trong thức
ă
n chăn nuôi, thịt heo, thịt gà ở thành phố Cần Thơ, tỉnh Vĩnh Long và

tỉnh Hậu giang 111
3.10.1.Kết quả điều tra thức ăn chăn nuôi năm từ năm 2007- 2009 111
3.10.2.Kết quả điều tra thịt heo và thịt gà từ năm 2007- 2009 113
3.10.3. Kết quả điều tra thịt heo, thịt gà và TACN năm 2010- 2011 116
CHƯƠNG 4.
K
ẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 117
- Kết luận 117
- Đề nghị 119
Danh mục các công trình nghiên cứu của tác giả 120
TÀI LIỆU THAM KHẢO 121
PHỤ LỤC


iv

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ CÁC KÝ HIỆU
TRONG LUẬN ÁN

Các chữ viết tắt

APCI
Atmospheric Pressure Chemical Ionization ((Ion hóa
hóa học ở áp suất khí quyển)

ANOVA
Analysis of Variance
Clen
clenbuterol
Clen-d

9

clenbuterol -d
9

CI

Chemical ionization (ion hóa hóa học)
DC
Direct current ( dòng điện 1 chiều)
ESI

Electrospray Ionization (ion hóa tia điện)
HPLC
High Performance Liquid Chromatography
(sắc ký lỏng hiệu năng cao)

HSCHTA
Hệ số chuyển hóa thức ăn
LC/MS
Liquid Chromatography Mass Spectrometry
(sắc ký lỏng ghép khối phổ)

LC/MS/MS
Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry
(Sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ)

LOD
Limit of Detection (giới hạn phát hiện)
LOQ

Limit of Quantification (giới hạn định lượng)
MRL
Maximum Residue Limit

MRPL
Minimum Required Performance Limit (Giới hạn tối
thiểu bắt buộc)

ppb
Part per billion (một phần tỉ)

ppm
Part per million (một phần triệu)

RSD%
Độ lệch chuẩn mẫu tương đối theo phần trăm

SPE
Solid Phase Extraction (Chiết pha rắn)

SPE-SCX
Solid Phase Extraction Strong Cation Exchange
(Chiết pha rắn bằng cột trao đổi cation)

v

kph
Không phát hiện

RF

Radio frequency (tần số radio hay sóng cao tầng)
Sal
salbutamol
Sal-d
3
salbutamol-d
3

TACN
Thức ăn chăn nuôi
TTTA
Tiêu tốn thức ăn



Các ký hiệu

Nghiệm thức A
Nghiệm thức đối chứng
Nghiệm thức B
Thức ăn có hàm lượng clen 200ppb + sal 200ppb

Nghiệm thức C
Thức ăn có hàm lượng clen 300ppb + sal 300ppb

Nghiệm thức D
Thức ăn có hàm lượng clen 500ppb + sal 500ppb

1TA, 2TA, 3TA
Gà trống nghiệm thức A (gà ăn thức ăn không chứa

chất kích thích)

1TB, 2TB, 3TB
Gà trống nghiệm thức B (gà ăn thức ăn chứa
clen 200ppb + sal 200ppb)

1TC, 2TC, 3TC
Gà trống nghiệm thức C (gà ăn thức ăn chứa
clen 300ppb + sal 300ppb)

1TD, 2TD, 3TD
Gà trống nghiệm thức D (gà ăn thức ăn chứa
clen 500ppb + sal 500ppb)

1MA, 2MA, 3MA
Gà mái nghiệm thức A (gà ăn thức ăn không chứa
chất kích thích)

1MB, 2MB, 3MB
Gà mái nghiệm thức B (gà ăn thức ăn chứa
clen 200ppb + sal 200ppb)

1MC, 2MC, 3MC
Gà mái nghiệm thức C (gà ăn thức ăn chứa
clen 300ppb + sal 300ppb)

1MD, 2MD, 3MD
Gà mái nghiệm thức D (gà ăn thức ăn chứa
clen 500ppb + sal 500ppb)


1MBK, 2MBK, 3MBK
Mẫu thận gà mái nghiệm thức B

1TBK, 2TBK, 3TBK
Mẫu thận gà trống nghiệm thức B

vi

1MBL, 2MBL, 3MBL
Mẫu gan gà mái nghiệm thức B

1TBL , 2TBL, 3TBL
Mẫu gan gà trống nghiệm thức B

1MCM, 2MCM,
3MCM
Mẫu thịt gà mái nghiệm thức C

1TCM, 2TCM, 3TCM
Mẫu thịt gà trống nghiệm thức C

3MCK
Mẫu thận gà mái nghiệm thức C

3TCK
Mẫu thận gà trống nghiệm thức C

3MCL Mẫu gan gà mái nghiệm thức C
3TCL
Mẫu gan gà trống nghiệm thức C


1MDM, 2MDM,
3MDM
Mẫu thịt gà mái nghiệm thức D

1TDM, 2TDM, 3TDM
Mẫu thịt gà trống nghiệm thức D

3MDK
Mẫu thận gà mái nghiệm thức D

3TDK
Mẫu thận gà trống nghiệm thức D

3MDL
Mẫu gan gà mái nghiệm thức D

3TDL
Mẫu gan gà trống nghiệm thức D

PM1, PL1, PK1 Lần lượt là mẫu thịt, gan và thận heo đối chứng
PM2, PL2, PK 2
Lần lượt là mẫu thịt, gan và thận của heo (2) ăn thức
ăn chứa chứa 500ppb clen

PM3, PL3, PK3
Lần lượt là mẫu thịt, gan và thận của heo (3) ăn thức
ăn chứa chứa 500ppb clen

PM4, PL4, PK4

Lần lượt là mẫu thịt, gan và thận của heo (4) ăn thức
ăn chứa chứa 500ppb sal

PM5, PL5, PK5
Lần lượt là mẫu thịt, gan và thận của heo (5) ăn thức
ăn chứa chứa 500ppb sal








vii

DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

STT Số thứ tự Danh mục các bảng Tran
g

1 Bảng 1.1
Nhóm chất
β
2
-agonist
11
2 Bảng 1.2
Quy định của Châu Âu về hiệu suất thu hồi chỉ thị
2002/657/EC

32
3 Bảng 1.3
Qui định về của Châu Âu về tỉ lệ ion xác định so với
ion định lượng
32
4 Bảng 1.4
Qui định số điểm nhận danh khi kết hợp các kỹ thuật
phân tích
33
5 Bảng 2.1 Bảng tóm tắt cách pha dung dịch chuẩn 42
6 Bảng 2.2
Hiệu suất thu hồi và độ lặp lại của phương pháp
(salbutamol) dùng tính độ không đảm bảo đo.
47
7 Bảng 2.3
Hiệu suất thu hồi và độ lặp lại của phương pháp
(clenbuterol) dùng tính độ không đảm bảo đo
50
8 Bảng 2.4
Công thức phối hợp khẩu phần cơ sở và thành phần
hóa học
54
9 Bảng 3.1 Các trị số m/z của clen, sal 58
10 Bảng 3.2
Kết quả khảo sát năng lượng phân mảnh của tiền ion
clenbuterol
60
11 Bảng 3.3
Kết quả khảo sát năng lượng phân mảnh của tiền ion
clen-d

9

61
12 Bảng 3.4
Kết quả khảo sát năng lượng phân mảnh của tiền ion
sal
62
13 Bảng 3.5
Kết quả khảo sát năng lượng phân mảnh của tiền ion
sal-d
3

62
14 Bảng 3.6
Tóm tắt kết quả tối ưu hóa năng lượng (E) phân mảnh
tiền ion clen, clen-d
9
, sal, sal-d
3
.
63
15 Bảng 3.7 Kết quả khảo sát nhiệt độ ống mao quản 64
16 Bảng 3.8
Bảng kết quả thời gian lưu của sal, clen theo một số
chương trình đẳng dòng
65
17 Bảng 3.9
Kết quả thống kê thời gian lưu của sal, clen khi khối
phổ thực hiện theo chương trình gradient dung môi
66

18 Bảng 3.10 Khoảng tuyến tính của clen 67
19 Bảng 3.11 Khoảng tuyến tính của sal 68

viii

20 Bảng 3.12 Kết quả phân tích hồi qui về tương quan giữa nồng độ
clen và diện tích pic sắc ký
69
21 Bảng 3.13
Kết quả phân tích hồi qui về tương quan giữa nồng độ
sal và diện tích pic sắc ký
70
22 Bảng 3.14
Ảnh hưởng pH của đệm trên khả năng giữ clen, sal
trên cột SCX
71
23 Bảng 3.15
Độ lặp lại của tín hiệu đo với chuẩn clen 0,495ng/mL
trong nền mẫu thịt
72
24 Bảng 3.16
Độ lặp lại của tín hiệu đo với chuẩn clen 0,495ng/mL
trong nền mẫu TACN
73
25 Bảng 3.17
Độ lặp lại của tín hiệu đo với chuẩn sal 0,776ng/mL
trong nền mẫu thịt
73
26 Bảng 3.18
Độ lặp lại của tín hiệu đo với chuẩn sal 0,776ng/mL

trong nền mẫu TACN
74
27 Bảng 3.19
Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu trong quá trình phân
tích
75
28 Bảng 3.20 Khoảng tuyến tính của clen trên nền thịt 77
29 Bảng 3.21 Khoảng tuyến tính của clen trên nền TACN 77
30 Bảng 3.22 Khoảng tuyến tính của sal trên nền thịt 78
31 Bảng 3.23 Khoảng tuyến tính của sal trên nền TACN 78
32 Bảng 3.24 Hiệu suất thu hồi của clen trên nền thịt 80
33 Bảng 3.25 Hiệu suất thu hồi của sal trên nền thịt 81
34 Bảng 3.26 Hiệu suất thu hồi của clen trên nền TACN 82
35 Bảng 3.27 Hiệu suất thu hồi của sal trên nền TACN 83
36 Bảng 3.28 Hiệu suất thu hồi của clen trên nền gan 84
37 Bảng 3.29 Hiệu suất thu hồi của sal trên nền gan 85
38
Bảng 3.30
(a
1
)
Trị số LOD
tb
và LOQ
tb
của clen trên nền thịt heo 86
39
Bảng 3.30
(a
2

)
Trị số LOD
tb
và LOQ
tb
của sal trên nền thịt heo 86
40
Bảng 3.30
(b
1
)
Trị số LOD
tb
và LOQ
tb
của clen trên nền TACN 86
41
Bảng 3.30
(b
2
)
Trị số LOD
tb
và LOQ
tb
của sal trên nền TACN 87
42 Bảng 3.31
Tỉ lệ ion chính và phụ của clen và sal trên dung dịch
chuẩn
88

43 Bảng 3.32 Tỉ lệ ion chính và phụ của clen và sal trên nền thịt 88
ix

44 Bảng 3.33 Tỉ lệ ion chính và phụ của clen và sal trên nền TACN 89
45 Bảng 3.34 Tỉ lệ ion chính và phụ của clen và sal trên nền gan 89
46 Bảng 3.35 Tỉ lệ ion chính và phụ của clen và sal trên nền thận 90
47 Bảng 3.36
Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của clen và
sal (LC-MS/MS)
93
48 Bảng 3.37
Ion định lượng và ion xác nhận, tỉ lệ cường độ ion của
clen và sal
93
49 Bảng 3.38
Kiểm tra độ phù hợp của hệ thống sắc ký LC/MS của
sal và clen

97
50 Bảng 3.39 Khoảng tuyến tính của sal ( LC/MS) 98
51 Bảng 3.40 Khoảng tuyến tính của clen ( LC/MS) 98
52 Bảng 3.41
Hiệu suất thu hồi và giá trị RSD% của sal trên mẫu
thịt heo và TACN ( LC/MS)
99
53 Bảng 3.42
Hiệu suất thu hồi và giá trị RSD% của clen trên mẫu
thịt heo và TACN (LC-MS)
99
54 Bảng 3.43 Kết quả xác định LOD

Clen
của nền thịt heo và TACN 100
55 Bảng 3.44 Kết quả xác định LOD
sal
của nền thịt heo và TACN 100
56 Bảng 3.45
So sánh LOD và hiệu suất thu hồi khi phân tích clen
và sal bằng LC-MS/MS và LC-MS
100
57 Bảng 3.46
Số liệu ghi nhận lượng thức ăn đã cung cấp cho mỗi
gà trong thí nghiệm
101
58 Bảng 3.47
Bảng tổng kết sự tăng trọng của gà trong thời gian thí
nghiệm
103
59 Bảng 3.48
Ảnh hưởng các mức độ bổ sung clen + sal lên trung
bình tăng trọng và tiêu tốn thức ăn trung bình của gà
thí nghiệm
104
60 Bảng 3.49
Kết quả phân tích hàm lượng clen + sal (nghiệm thức
A, B) sau thời gian nuôi gà, lấy mẫu
105
61 Bảng 3.50
Kết quả phân tích hàm lượng clen +sal (nghiệm thức
C, D) sau thời gian nuôi gà, lấy mẫu
106

62 Bảng 3.51
Bảng tổng kết dư lượng clen, sal trong thịt gà, gan gà
thận gà sau thí nghiệm.
107
63 Bảng 3.52
Ảnh hưởng các mức độ bổ sung clen + sal lên tăng
trọng trung bình và Hệ số chuyển hóa thức ăn của
heo thí nghiệm
107
64 Bảng 3.53
Hàm lượng clenbuterol sau 18 tuần nuôi heo, lấy mẫu,
phân tích
109
x

65 Bảng 3.54
Hàm lượng salbutamol sau 18 tuần nuôi heo, lấy mẫu,
phân tích
110
66 Bảng 3.55
So sánh ảnh hưởng của clen và sal lên thịt và nội tạng
heo
111
67 Bảng 3.56
Kết quả điều tra hàm lượng clen và sal trong TACN
từ năm 2007 đến 2009
112
68
Bảng
3.57.a

Kết quả điều tra hàm lượng clen và sal trong thịt heo,
thịt gà năm 2007
114
69
Bảng
3.57.b
Kết quả điều tra hàm lượng clen và sal trong thịt heo,
thịt gà năm 2008
114
70
Bảng
3.57.c
Kết quả điều tra hàm lượng clen và sal trong thịt heo,
thịt gà năm 2009
115
71 Bảng 3.58
Kết quả điều tra hàm lượng clen và sal trong TACN,
thịt heo, thịt gà năm 2010-1011
116






















xi

DANH MỤC CÁC HÌNH
STT
Danh sách
hình
Danh mục các hình Trang
1 Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của nhóm chất β
1
-agonist 11
2 Hình 1.2
Cấu trúc hóa học nhóm chất β
2
-agonist có tác dụng
keo dài
12
3 Hình 1.3
Cấu trúc hóa học nhóm chất β
2
-agonist có tác dụng

ngắn
13
4 Hình 1.4
Cấu trúc hóa học nhóm chất β
2
-agonist chưa được
phân loại
13
5 Hình 1.5
Mô tả tổng quát các bộ phận của máy sắc ký lỏng hiệu
năng cao
22
6 Hình 1.6 Sơ đồ hệ thống ion hóa theo kỹ thuật APCI 24
7 Hình 1.7 Sơ đồ hệ thống ion hóa theo kỹ thuật ESI 25
8 Hình 1.8 Bộ phân tích khối một tứ cực 26
9 Hình 1.9 Bộ phân tích khối ba tứ cực 28
10 Hình 1.10
Sơ đồ đầu dò khối phổ ba tứ cực (LC-MS/MS) TSQ
Quantum Access của hãng Thermo Fisher với cấu
hình 90
0

28
11 Hình 1.11 Chế độ vận hành khối phổ ba tứ cực 29
12 Hình 3.1.a Cơ chế phân mảnh của clenbuterol 58
13 Hình 3.1.b Cơ chế phân mảnh của clenbuterol-d
9
59
14 Hình 3.2.a Cơ chế phân mảnh của salbutamol 59
15 Hình 3.2.b Cơ chế phân mảnh của salbutamol-d

3
59
16 Hình 3.3
Đường chuẩn clenbuterol theo các nồng độ ở bảng
3.10
67
17 Hình 3.4
Đường chuẩn salbutamol theo các nồng độ ở bảng
3.11
68
18 Hình 3.5
Sắc đồ dung dịch chuẩn clen (0,991 ppb) và dung
dịch chuẩn clen (0,991 ppb) thêm vào mẫu thịt sau
khi đã xử lý mẫu
76
19 Hình 3.6
Sắc đồ dung dịch chuẩn sal (1,552 ppb) và dung dịch
chuẩn sal (1,552 ppb) thêm vào mẫu thịt sau khi đã xử
lý mẫu
76
20 Hình 3.7 Biểu đồ thể hiện đường chuẩn clen trên nền thịt 77
21 Hình 3.8 Biểu đồ thể hiện đường chuẩn clen trên nền TACN 78
22 Hình 3.9 Biểu đồ thể hiện đường chuẩn sal trên nền thịt 78
xii

23 Hình 3.10 Biểu đồ thể hiện đường chuẩn sal trên nền TACN 79
24 Hình 3.11 Sơ đồ tóm tắt quy trình phân tích clen và sal 91
25 Hình 3.12 Đường chuẩn sal (trong LC-MS) 98
26 Hình 3.13 Đường chuẩn clen ( trong LC-MS) 98
27 Hình 3.14

Ảnh hưởng các mức độ bổ sung chất kích thích lên
tăng trọng, tiêu tốn thức ăn (TTTA) và hệ số chuyển
hóa thức ăn (HSCHTA) của gà thí nghiệm
104
28 Hình 3.15
Biểu đồ biểu diễn dư lượng clen trên thịt gà thử
nghiệm
107
29 Hình 3.16 Biểu đồ biểu diễn dư lượng sal trên thịt gà thử nghiệm 107
30 Hình 3.17
Biểu đồ thể hiện tỉ lệ nhiễm clen và sal trong các mẫu
TACN điều tra
113
31 Hình 3.18
Biểu đồ so sánh mức độ nhiễm clen, sal trong các
mẫu thịt từ năm 2007- 2009
115

























xiii

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ
STT
Danh
sách đồ
thị
Danh mục các đồ thị Trang
1 Đồ thị 3.1
Tối ưu hóa năng lượng (E) phân mảnh tiền ion clen
thành ion con (m/z= 132,10 và m/z = 203,01)
61
2 Đồ thị 3.2
Tối ưu hóa năng lượng (E) phân mảnh tiền ion
clen-d
9
thành ion con (m/z =204,01)
61
3 Đồ thị 3.3

Tối ưu hóa năng lượng (E) phân mảnh tiền ion sal
thành ion con (m/z=148,10 và m/z=166,01)
62
4 Đồ thị 3.4
Tối ưu hóa năng lượng (E) phân mảnh sal-d
3
thành
ion con (m/z =151,15)
63
5 Đồ thị 3.5
Tối ưu hóa nhiệt độ ống mao quản của hệ thống khối
phổ cho các ion của clen và sal
63
6 Đồ thị 3.6
Biểu đồ biến đổi cường độ ion theo pH của dịch
chiết K
2
HPO
4
0,1M
70























xiv

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC
STT PHỤ LỤC Danh mục các phụ lục Trang
1 Phụ lục 1.a
Dấu hiệu cảm quan giúp người tiêu dùng
nhận biết thịt gia súc, gia cầm có chứa clen
1
2 Phụ lục 1.b
Quyết định số 54/QĐ –BNN ngày 20/06/2002
về việc cấm sản xuất, nhập khẩu lưu thông và
sử dụng một số loại kháng sinh hóa chất trong
sản xuất và kinh doanh thức ăn chăn nuôi
.

2
3 Phụ lục 2.1 Máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 3

4 Phụ lục 2.2 Một số hình ảnh trong thí nghiệm nuôi gà 4
5 Phụ lục 2.3 Một số hình ảnh trong thí nghiệm nuôi heo 4
6
Phụ lục 3.1
Quá trình quét phổ các ion chất chuẩn và nội
chuẩn từ thực nghiệm
5-8
7 Phụ lục 3.2 Khảo sát nhiệt độ ống mao quản 9
8 Phụ lục 3.3 Khảo sát chương trình dung môi 10-16
9 Phụ lục 3.4 Khoảng tuyến tính clen –sal 17-19
10
Phụ lục 3.5
Ảnh hưởng của đệm pH trên khả năng giữ
clen, sal trên cột SCX
20-22
11 Phụ lục 3.6
Đ
ộ lặp lại tín hiệu đo của clen và sal 23-28
12 Phụ lục 3.7 Sắc ký đồ của hiệu suất thu hồi của clen và sal 29-36
13 Phụ lục 3.8 Sắc ký đồ các giá trị LOD 37-42
14 Phụ lục 3.9 Độ không đảm bảo đo của phương pháp 43- 44
15
Phụ lục 3.10
Tóm tắt kết quả xác định dư lượng gà thử
nghiệm
45-51
16
Phụ lục 3.11
Sắc ký đồ của clen và sal trong mẫu thịt, gan,
thận gà thử nghiệm

52-66
17 Phụ lục 3.12 Kết quả xác định dư lượng heo thử nghiệm. 67-70
18
Phụ lục 3.13
Sắc ký đồ của clen và sal trên mẫu thịt gan và
thận heo thử nghiệm
71-73
19 Phụ lục 3.14 Kết quả điều tra các mẫu thức ăn chăn nuôi 74-85
20
Phụ lục 3.15
Kết quả điều tra mẫu thịt heo, thịt gà ở các địa
phương từ 2007- 2009
86



Trang 1
MỞ ĐẦU
Lý do chọn đề tài
Trong lĩnh vực dược phẩm, β-agonist là nhóm chất được sử dụng nhiều trong
điều trị bệnh hen suyễn, điều trị bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính, hai chất điển hình là
salbutamol và clenbuterol
[14]
. Những chất này được xếp chung với nhóm thuốc điều
trị bệnh hen suyễn phổ biến hiện nay. Salbutamol được dùng cho người với tên biệt
dược là Albuterol, Salbutamol…Clenbuterol được dùng với tên biệt dược là
Broncodil, Clenburol, Ventolax, Protovent (Theo tài liệu trên trang web


Trong chăn nuôi, các hoạt chất này đã có lúc được đưa vào trong thức ăn gia

súc nhằm làm giảm lớp mỡ dưới da, làm tăng cơ, tăng trọng đối với thú vật nuôi.
Theo nhiều nghiên cứu, các loại biệt dược này gây hại cho gia súc và cả cho người
nếu ăn phải thịt thú vật nuôi bằng loại thức ăn có trộn các loại biệt dược trên, vì các
hóa chất thuộc nhóm β-agonist thường là những chất kích thích mạnh, làm suy
nhược chức năng gan
[14]
.
Tại Châu Âu và Châu Mỹ, những loại hóa chất trên bị cấm sử dụng. Ở Việt
Nam, các loại biệt dược thuộc nhóm β-agonist trong đó có clenbuterol và
salbutamol được xếp vào danh mục 18 hóa chất bị cấm của Bộ Nông Nghiệp và
Phát Triển Nông Thôn (Quyết định số 54 ngày 20 tháng 06 năm 2002 của Bộ NN &
PTNT)
[11]
. Tuy nhiên, các chất này vẫn còn bị một bộ phận người dân lén sử dụng
trong chăn nuôi và việc kiểm tra sự hiện diện của chúng trong thức ăn gia súc, gia
cầm vào những năm 2005-2008 phần lớn chỉ dừng lại ở mức độ định tính và định
lượng bằng phương pháp ELISA với độ chính xác chưa cao. Việc định lượng chính
xác dư lượng của các β-agonist trong thức ăn chăn nuôi là vấn
đề cần được quan
tâm trong công tác kiểm tra chất lượng sản phẩm. Đồng thời, việc xác định tồn dư
β-agonist trong thịt một số gia súc là rất cần thiết về mặt quản lý để đánh giá tình
hình mức độ sử dụng các chất này trong thức ăn chăn nuôi và đưa ra những cảnh
báo về vệ sinh an toàn thực phẩm nếu có.
Trang 2
Việc sử dụng chất kích thích tăng trưởng trong chăn nuôi thực sự ảnh hưởng
nghiêm trọng đến sức khỏe người tiêu dùng. Qua dây chuyền thực phẩm, chúng có
thể tích lũy dần trong cơ thể con người, đến một liều lượng nhất định sẽ gây ngộ
độc cho người tiêu dùng. Xuất phát từ tình hình thực tế, trên cơ sở khoa học của các
công trình nghiên cứu về salbutamol (sal) và clenbuterol (clen) được công bố trong
và ngoài nướ

c, đồng thời nhờ sự hỗ trợ về thiết bị của Trung tâm Đào tạo và Phát
triển Sắc ký TP Hồ Chí Minh, Phòng Thí nghiệm Chuyên sâu của trường Đại Học
Cần Thơ, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Đánh giá hàm lượng các chất
β
- agonists
(clenbuterol và salbutamol) trong thức ăn gia súc và dư lượng trong thịt gia súc
bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ”
Nghiên cứu này sẽ góp phần vào việc bảo đảm vệ sinh an toàn thực phẩm và
bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.
Mục đích nghiên cứu
Đề tài này được thực hiện với mong muốn :
• Xây dựng được phương pháp phân tích dư lượng clen và sal trong thức ăn chăn
nuôi, thịt gia súc, gia cầm bằ
ng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ đạt độ nhạy cao,
đáp ứng được nhu cầu phân tích của các đơn vị kiểm nghiệm trong nước.
• Theo dõi mức độ tồn lưu của clenbuterol và salbutamol trong thịt gà, thịt heo
khi nuôi gà, heo với thức ăn có chứa clen và sal.
• Điều tra sơ bộ tình hình sử dụng hợp chất β-agonist, cụ thể là sal và clen, trong
thức ăn gia súc và thịt gia súc ở một s
ố tỉnh đồng bằng sông Cửu Long (Cần Thơ,
Vĩnh Long, Hậu Giang) với mong muốn góp phần với các cơ quan chức năng đảm
bảo vệ sinh an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng trong nước.
Đối tượng nghiên cứu
a. Các mẫu thức ăn gia súc: lấy mẫu từ các cơ sở bán thức ăn gia súc, gia cầm
gồm một số loại như sau: Newhope (NH), Master (MT), Higro (HG), Cataco
(CTC), Con cò (
CC), Cargill (CG), S80 (TAS80), Sowtech (Biên Hòa) (ST),
ADB Complex (Hậu Giang) (ADBC), ODBAS (Biên Hòa) (ODBAS), Tăng tốc
Trang 3
11C30 (TTC30) , Thức ăn Thiên niên biến (TATNB), Trư đại đại 671 (TĐĐ), Cám

thường (CT)(mẫu được lấy từ tháng 7 năm 2007 đến tháng 12 năm 2009).
b. Mẫu thịt gia súc (heo), gia cầm (gà) dùng thử nghiệm bằng cách nuôi trực
tiếp sau đó lấy mẫu để kiểm tra khả năng tồn lưu của sal và clen
c. Mẫu thịt, thận, gan dùng cho điều tra: được lấy từ các tỉnh Vĩ
nh Long, Hậu
Giang, Thành phố Cần Thơ
Phạm vi nghiên cứu và ý nghĩa khoa học, ý nghĩa thực tiễn
• Xây dựng phương pháp chuẩn bị mẫu để đạt tỉ lệ thu hồi cao và tránh được
hiệu ứng khử ion ở đầu dò khối phổ vận hành theo chế độ ESI, đảm bảo tính chính
xác của phương pháp phân tích định lượng
• Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ c
ực để nhận danh
và định lượng dư lượng của β-agonist trong thức ăn gia súc và thịt gia súc, gia cầm.
• Qua phân tích nhiều mẫu thức ăn gia súc và thịt gia súc, gia cầm, sơ bộ
đánh giá tình hình sử dụng các β- agonist hiện nay. Các kết quả này có thể góp phần
làm cơ sở đánh giá mức độ sử dụng bất hợp pháp β-agonist trong nước.












Trang 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài ở nước ngoài và trong nước.
1.1.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
Năm 1999, nghiên cứu của tác giả Peter R.Cheeke cho thấy:
• Để đạt được danh hiệu vô địch trong các cuộc thi hội chợ, người ta đã cho
các con vật sử dụng “doping” với clenbuterol để tăng khối cơ.
• Người tiêu thụ gan động vật sử dụng thức ăn chứa clenbuterol có biểu hiện
run rẩy, tim đập nhanh, đau đầu, chóng mặt và buồn nôn.
• D
ư lượng của clenbuterol tồn tại trong võng mạc mắt và trong tóc lâu tới
vài tháng.
Năm 2001, tác giả Woodward K.N
[77]
thuộc viện nghiên cứu về thuốc thú y ở
Anh đã nghiên cứu quá trình chuyển hóa và độc tính của clenbuterol trên một số
loài động vật (chuột, khỉ, trâu, bò, ngựa).
Các tác giả Warriss P. D và cộng sự (1990 và 1991)
[73],[74]
, Fawcett J. P và
cộng sự (2004)
[40]
đã nghiên cứu ảnh hưởng của salbutamol lên thịt heo, một số
chuyển hóa về mặt sinh học của gia súc khi sử dụng hợp chất này.
Do tính độc hại của các hợp chất thuộc nhóm β-agonist, từ nhiều năm, các nhà
nghiên cứu trên thế giới đã không ngừng phát triển các các phương pháp, quy trình
để xác định clenbuterol, salbutamol nói riêng và các hợp chất thuộc nhóm β-agonist
nói chung. Nhiều phương pháp khác nhau được nghiên cứu: phương pháp ELISA,
sắc ký khí (GC), sắc ký lỏ
ng (LC), sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS), sắc ký lỏng
ghép khối phổ (LC-MS). Các trị số thường được dùng cho việc đánh giá độ chính
xác của các phương pháp phân tích chủ yếu là giới hạn phát hiện (LOD) hoặc giới

hạn định lượng (LOQ), hiệu suất thu hồi, các trị số này trên nguyên tắc cần đáp ứng
các quy định và tiêu chuẩn đã có của Châu Âu và của Codex.
Theo các tài liệu đã công bố, từ năm 1990 đến 1999, nhiều tác gi
ả đã nghiên
cứu phương pháp phân tích clenbuterol, salbutamol bằng LC-MS, LC-MS/MS với
các giá trị LOD cho clenbuterol trong nhiều nền mẫu khác nhau (thịt, gan, thận,
thức ăn gia súc, mẫu máu ) thường đạt từ 0,02 đến 0,5 ppb
[33]; [34],[41],[50],[54],[72],[75];
Trang 5
với phương pháp phân tích β-agonist trên các nền mẫu sinh học bằng sắc ký khí
(GC-MS), các nghiên cứu được công bố cho giá trị LOD < 0,5 ppb hoặc không
công bố giá trị LOD
[55]
. Riêng trong năm 1999, Guy và cộng sự
[43]
thuộc trung tâm
nghiên cứu Nestlé - Switzerland

đã thông báo phương pháp phân tích clenbuterol
trong thịt gia súc bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực (với qui
trình chiết mẫu bằng HClO
4
) với LOD đạt 0,01 ppb, hiệu suất thu hồi đạt 63-70%.
Từ năm 2001 đến năm 2004, nhiều tác giả đã sử dụng sắc ký khí hoặc sắc ký
lỏng ghép khối phổ một tứ cực để phân tích clenbuterol, salbutamol trong các nền
mẫu sinh học, giới hạn phát hiện cho các nghiên cứu này từ 0,8-2,5 ppb (cho
clenbuterol), 3,5ppb (cho salbutamol), hiệu suất thu hồi lớn hơn 90%
[66],[69]
.


- Năm 2005 Kootstra P.R. và cộng sự
[51]
thuộc Viện Nghiên cứu sức khỏe và
môi trường ở Hà Lan đã sử dụng kỹ thuật tách chiết bằng cột SPE với cột nhồi là
loại polymer in dấu phân tử (MIPs: Molecularly Imprinted Polymers) và kết hợp với
phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (bẩy ion) để phân tích các chất thuộc nhóm
β-agonist trong thịt bò. Giới hạn phát hiện đạt được 0,1 ppb.


- Năm 2006 Liu Pengyan và cộng sự
[64]
thuộc khoa Hóa, Trường Đại Học
Hebei (Bắc Kinh – Trung Quốc) công bố kết quả nghiên cứu xác định hàm lượng
clenbuterol trong thịt heo bằng GC-MS (chiết mẫu bằng HClO
4
) với hiệu suất thu
hồi 73,4% , giới hạn phát hiện LOD = 0,4ppb.


- Năm 2007 Limin He và cộng sự
[44]
thuộc trường Đại học Nông Nghiệp phía
Nam Trung Quốc đã nghiên cứu xác định ractopamine và clenbuterol trong thức ăn
chăn nuôi bằng sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS), hiệu suất thu hồi đo ở nồng độ
10, 100, 5000ppb là 64,4%, giá trị của LOD
Ractopamine
đạt 4ppb và LOD
Clenbuterol
đạt
2ppb. Cũng trong năm 2007, Lee H. B. và cộng sự cũng công bố kết quả nghiên

cứu khi phân tích các β-agonists trong nước thải bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ
với giá trị hiệu suất thu hồi khoảng 85% ở các nồng độ từ 0, 05 đến 0,5ppb.
[56]

- Năm 2008 Michel A.M và cộng sự
[61]
, khoa nông nghiệp trường Đại học
Autonomus – Mexico đã thông báo kết quả phân tích dư lượng của clenbuterol
trong thức ăn chăn nuôi và trong thịt bò bằng phương pháp ELISA và GC/ MS (giới
Trang 6
hạn phát hiện là 0,2ppb). Ngoài ra, cũng trong năm 2008, nhiều nghiên cứu về
phương pháp phân tích clenbuterol, salbutamol và các β-agonits khác trên thịt heo
hoặc các nền mẫu sinh học khác như nước tiểu, máu, bằng kỹ thuật sắc ký lỏng
ghép khối phổ hay kỹ thuật sắc ký khí ghép khối phổ cho các giá trị LOD từ 0,1 đến
9 ppb
[18],[38]
- Năm 2009 Jensuino. B và cộng sự
[47]
đã thông báo nghiên cứu về tính bền
của clenbuterol trong mẫu nước tiểu trong 12 tuần và mẫu gan trong 20 tuần nếu
được bảo quản ở nhiệt độ 4 , -20 và -60
o
C, phân tích mẫu bằng GC-MS.
Cũng trong năm 2009, Zhai. C và cộng sự
[81]
thông báo kết quả phân tích dư
lượng của β-agonist trong thịt heo, bằng kỹ thuật LC-MS/MS ba tứ cực với
LOD
clen
= 0,02 ppb, LOD

sal
= 0,05 ppb, hiệu suất thu hồi từ 78- 101%. Xu J. và cộng
sự
[78]
cũng thông báo kết quả nghiên cứu phương pháp phân tích dư lượng β-agonist
trong thực phẩm có nguồn gốc từ động vật bằng LC-MS/MS với

LOQ cho
clenbuterol, salbutamol là 0,1 ppb .

- Năm 2010, Pleadin J., và cộng sự
[65]
công bố phương pháp xác định dư
lượng của clenbuterol trong thịt heo bằng ELISA và kỹ thuật LC/MS/MS với LOD
dưới 0,1 ppb sau khi cho heo uống clenbuterol với nồng độ 20 μg/kg trọng lượng
heo, trong 1 ngày.
Cũng trong năm 2010, Xu Z ,và cộng sự
[79]
thuộc Khoa Hóa và kỹ thuật hóa,
trường đại học Sun Yat-sen (Trung quốc) đã công bố phương pháp phân tích
ractopamine, isoxpurine, clenbuterol trong thịt, gan, thận heo bằng cách kết hợp kỹ
thuật chiết mẫu bằng SPE với cột nhồi là loại polymer in dấu phân tử MIP
(Molecularly imprinted polymers) và kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp (HPLC), với LOD
từ 0,1-0,21 ppb, hiệu suất thu hồi từ 83,7- 92,3 %.

Đầu năm 2011, Liu B., và cộng sự
[58]
thuộc khoa Hóa trường đại học Baodinh,
Trung quốc đã thông báo phương pháp xác định clenbuterol trong thịt heo bằng quy
trình chiết pha rắn (có sự hỗ trợ trong quá trình chiết bằng sóng siêu âm) và kỹ thuật

HPLC-UV, giới hạn phát hiện LOD
clen
= 0,07ppb, hiệu suất thu hồi từ 87,9-103,6%

Trang 7
Nhìn chung, β-agonists không được phép sử dụng làm chất tăng trọng trong
thức ăn chăn nuôi ở nhiều nước trên thế giới
, hàm lượng tối đa cho phép (MRLs)
hiện nay chỉ có quy định cho clenbuterol với MRL là 0,1 ppb trong thịt, 0,5ppb
trong gan theo Châu Âu
[30]
hoặc 0,2ppb trong thịt và 0,6 ppb trong gan theo Codex
Alimentarius
[25]
. Riêng đối với Việt nam β-agonist tuyệt đối bị cấm sử dụng trong
TACN và do đó không được có trong thịt gia súc, gia cầm. Trên cơ sở các dữ liệu
đã có này, các trị số LOD
Clen
trong các phương pháp phân tích clenbuterol trong thịt
đã nêu là còn khá lớn, trừ trị số trong báo cáo của Guy năm 1999
(LOD
clen
= 0,01ppb) và của Zhai năm 2009 ( LOD
clen
= 0,02 ppb) đạt yêu cầu theo
qui định của Châu Âu và Codex đã nêu trên
[25],[43],[81]

1.1.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước
- Năm 2005, một số thông tin trong nước cho biết hiện tượng bất thường được

ghi nhận như gà đẻ hai trứng trong một ngày hoặc gà bị chết bất thường do sự hiện
diện của clenbuterol trong thức ăn chăn nuôi (TACN) (TACN được phân tích bằng
phương pháp Elisa ở Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí Nghiệm TP Hồ Chí Minh)
- Năm 2006, trong hội thảo về hormon tăng trưởng do Viện Khoa H
ọc Kỹ
Thuật Nông nghiệp miền Nam và Hiệp hội thức ăn chăn nuôi tổ chức, Cục Chăn
nuôi (Bộ NN&PTNT) đã công bố kết quả kiểm tra (từ 20/6 - 3/11/2006) theo đó cơ
quan chức năng đã phát hiện 47/428 mẫu dương tính với clenbuterol (theo

- Việc phân tích clenbuterol, salbutamol tại nhiều phòng thí nghiệm ở Việt
Nam vào năm 2006 chủ yếu được thực hiện với phương pháp ELISA (dựa vào phản
ứng kháng nguyên - kháng thể)
[6]
. Tuy nhiên, phương pháp này chủ yếu có tính sàng
lọc và có thể cho kết quả dương tính giả. Theo quyết định 2002/657/ EC của châu
Âu, một phương pháp sàng lọc, dù đã được chứng minh có thể áp dụng được cho
đối tượng kiểm nghiệm, vẫn phải được xác minh lại bằng một phương pháp có tính
khẳng định hơn nếu có nghi ngờ về kết quả. Nhìn chung
phương pháp sàng lọc
ELISA có độ tin cậy không thật cao.
Trang 8
- Năm 2007, Phạm Xuân Viết và cộng sự
[16]
, Trường Đại Học Dược Hà Nội đã
nghiên cứu phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ một tứ
cực

để định lượng salbutamol trong huyết tương, hiệu suất chiết salbutamol ở các
nồng độ 10, 75, 200ppb khoảng 80%.
- Năm 2008, Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí nghiệm TPHCM đã nghiên

cứu và xây dựng qui trình phân tích clenbuterol bằng sắc ký khí ghép khối phổ
(GC/MS) đạt hiệu suất thu hồi từ 65- 88%; giá trị LOD đối với TACN là 0,16 ppb
(clen), 0,11 ppb (sal); giá trị LOD đối với thịt là 0,05 ppb (clen), 0,07 ppb (sal)
[báo cáo nghiệm thu đề tài cấp thành phố năm 2008- chủ nhiệm đề tài là thạc sỹ
Chu Vân Hải]. Theo Codex Alimentarius vớ
i các chất giới hạn cho phép nhỏ hơn
0,1 ppm (MRL ≤ 0,1 ppm) thì giá trị LOD của phương pháp phân tích phải nhỏ hơn
hoặc bằng một phần năm của MRL ( LOD ≤1/5 MRL)
[48]
. Vì vậy, nếu áp dụng tiêu
chuẩn Châu Âu (MRL
clen
cho thịt 0,1ppb) hay theo tiêu chuẩn Codex Alimentarius
(MRL
clen
cho thịt 0,2ppb), thì trị số LOD đã đạt được trong nghiên cứu nêu trên còn
hơi lớn.
- Năm 2009, Bùi Quốc Anh (công ty Inotech – Thành phố Hồ chí Minh) nghiên
cứu đề tài bộ kit phát hiện nhanh chất clenbuterol trong thịt gia súc gia cầm trong
thời gian 2 giờ. Tuy nhiên, đây chỉ là phương pháp định tính dựa trên sự biến đổi
màu của thuốc thử. Để biết hàm lượng của clenbuterol cần phải dùng các kỹ thuật
phân tích khác (Bài viết “Bộ kit phát hiện thịt nhiễm Clenbuterol” c
ủa tác giả Thái
Ngọc trên báo Đất Việt)

- Năm 2010, Nguyễn Thị Chân và cộng sự
[2]
thuộc Trung tâm Phân tích Thí
nghiệm TPHCM, đã nghiên cứu đề tài “ Xác định clenbuterol trong thịt heo bằng
phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ triplequad (LC-MS/MS) ” giới hạn phát

hiện LOD = 0,03ppb. Nhóm nghiên cứu không sử dụng nội chuẩn đồng vị và do đó
không tận dụng được ưu thế của loại nội chuẩn nầy. Giá trị LOD
Clen
trong nghiên
cứu này phù họp với MRL 0,2 ppb theo tiêu chuẩn Codex
[25]
, nhưng không phù
hợp với MRL 0, 1 ppb theo Châu Âu.


Trang 9
- Về các nghiên cứu của chúng tôi:
+ Năm 2007, trong lúc nhiều phòng thí nghiệm vẫn còn dùng phương pháp
ELISA để kiểm tra clenbuterol thì nhóm tác giả Nguyễn thị Thu Thủy, Lâm văn
Xự, Phạm thị Ánh, Trần Kim Tính, Chu Phạm Ngọc Sơn, đã nghiên cứu thành công
phương pháp phân tích clenbuterol trong thức ăn chăn nuôi và sản phẩm thịt bằng
sắc ký lỏng ghép khối phổ một tứ cực (LC/MS) ( báo cáo tại hội nghị Hóa học
Châu Á lần thứ 12, tháng 8 n
ăm 2007 tại Kuala Lumpur, Malaysia - International
```Symposium on Food Analysis, Chemistry and Technology, 12th Asian Chemical
Congress, August 23-25, 2007, Kuala Lumpur, Malaysia và trong Tạp chí Khoa học
và Công nghệ, năm 2008). Tuy kỹ thuật LC/MS một tứ cực không đạt độ nhạy và
độ chọn lọc bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực LC-MS/MS, nhưng giá trị
LOD cũng khá thấp (LOD
Clen (thịt)
: 0,038 ppb và LOD
Clen (TACN)
: 0,497 ppb). Giá trị
LOD
Clen

này (≤1/5 MRL) phù hợp đối với trị số MRL 0,2 ppb theo tiêu chuẩn của
Codex, không phù hợp đối với MRL 0,1 ppb theo tiêu chuẩn Châu Âu.
+ Cuối năm 2007, nhóm tác giả Nguyễn thị Thu Thủy, Lâm văn Xự, Phạm
thị Ánh, Trần Kim Tính, Chu Phạm Ngọc Sơn, Kefei Wang, tiếp tục nghiên cứu
phương pháp phân tích clenbuterol trong thức ăn chăn nuôi và sản phẩm thịt bằng
sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực (LC-MS/MS) với LOD = 0,01 ppb cho thịt
heo, điểm m
ới là có sử dụng thêm nội chuẩn đồng vị Clenbuterol-d
9
để loại trừ ảnh
hưởng nền mẫu khi tách chiết và sự khử ion nếu có khi định lượng với đầu dò khối
phổ theo chế độ ESI (+) (Báo cáo tại hội nghị về khối phổ 56
th
ASMS Conference
on Mass Spectrometry and Allied Topics, 1-5 tháng 6 năm 2008 ở Denver,
Colorado, Mỹ). Trị số LOD
Clen
công bố 0,01 ppb phù họp với cả tiêu chuẩn về
MRL của Châu Âu và Codex.
Chính phương pháp nầy được áp dụng trong điều tra
mức độ tồn dư clenbuterol và salbutamol trong thịt heo, thịt gà trên thị trường hoặc
do chúng tôi tự nuôi với thức ăn có chứa clenbuterol và salbutamol.
+ Năm 2009, nhóm tác giả Nguyễn thị Thu Thủy, Nguyễn Nhựt Xuân Dung,
Phạm thị Ánh, Chu Phạm Ngọc Sơn nghiên cứu ảnh hưởng của clenbuterol,
salbutamol trên sự tăng trọng gà, heo và đánh giá độ tồn lưu của chúng trên gà heo
Trang 10
bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực (LC/MS/MS) (bài báo được
đăng vào số 1, 2 / Tập XVI của Tạp chí phân tích Hóa Lý và Sinh học Việt Nam
năm 2011)
+ Vào tháng 4 năm 2011, nhóm tác giả Nguyễn thị Thu Thủy, Lâm văn Xự,

Phạm thị Ánh, Chu Phạm Ngọc Sơn, Trần kim Tính đã báo cáo về phân tích
salbutamol trong thịt và thức ăn chăn nuôi bằng LC-MS/MS ở Hội Nghị Quốc Tế
Analytica 2011 tổ chức tại Thành phố Hồ Chí Minh.

1.2. Lý thuyết về chất kích thích tăng trưởng họ β-agonists
1.2.1. Giới thi
ệu chung về nhóm chất kích thích tăng trưởng thuộc họ
β–agonists
[3], [24]
β-agonists là loại hợp chất cường giao cảm, kích thích tăng trưởng gồm những
hợp chất tổng hợp có dẫn xuất từ thiên nhiên như là Adrenaline và Noradrenaline do
tủy của tuyến thượng thận tiết ra. Chúng là một nhóm thuốc gồm nhiều hóa chất
khác nhau



Nhóm chất thuộc họ
β
–agonists được chia thành nhiều loại tùy theo tác dụng của
các hợp chất