ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

♣♦♣


HOÀNG VĂN QUỐC CHƯƠNG








NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ
SẢN XUẤT INSULIN TÁI TỔ HP





LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2010

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

♣♦♣


HOÀNG VĂN QUỐC CHƯƠNG







NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ
SẢN XUẤT INSULIN TÁI TỔ HP



Chuyên ngành: Vi sinh học
Mã số: 1.05.12



LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC




NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. TRẦN LINH THƯỚC






Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2010
-i-
Luận án Tiến só Lời cảm ơn
LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, em xin chân thành gởi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Phó giáo
sư, Tiến só Trần Linh Thước. Thầy đã tận tụy hướng dẫn, giúp đỡ em trong quá
trình học tập, tạo điều kiện tốt nhất cho em để hoàn thành luận án. Không có sự
hỗ trợ của Thầy, em không thể hoàn thành được luận án này. Xin trân trọng cảm
ơn Thầy!
Em xin cảm ơn PGS.TS. Phạm Thành Hổ, đã thường xuyên quan tâm,
động viên và cung cấp những thông tin q báu cho em trong quá trình học tập và
thực hiện luận án.



Xin gởi lời cảm ơn đến PGS.TS. Phan Văn Chi, Phó viện trưởng Viện khoa
học Công nghệ Việt Nam, đã giúp đỡ chúng tôi phân tích trình tự mini-proinsulin.


Xin cảm ơn TS. Peer Nobert Jorgensen, công ty Norvonordisk, Đan Mạch,
đã cung cấp cho chúng tôi các kháng thể sử dụng trong quá trình nghiên cứu.


Em xin gởi lời cảm ơn đến tất cả q Thầy Cô trong Khoa sinh học, Trường
Đại học khoa học tự nhiên thành phố Hồ Chí minh, đã cung cấp cho em những
kiến thức bổ ích trong suốt quá trình học tập ở Trường.


Xin cảm ơn tất cả các bạn, các em trong phòng thí nghiệm công nghệ sinh
học phân tử (Lab A) ĐH KHTN tp HCM. Cảm ơn các bạn Hoàng, Trang, Thảo,
Trí… cảm ơn các em Nam, Nhung, Nghóa, Đạt, Đức, Trâm, Ngân… đặc biệt cảm
ơn Hoa, đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian thực hiện luận án. Không có sự
giúp đỡ của các bạn, các em, tôi không thể hoàn thành được luận án này.


Cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp đã động viên, hỗ trợ tôi trong quá trình thực
hiện luận án.


Và trên hết, xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân đã động viên, giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình học tập.


Đặc biệt cảm ơn Vợ và các con đã mang lại cho tôi niềm hạnh phúc, sự yên
tâm trong quá trình thực hiện luận án.


Tp Hồ Chí Minh, Tháng 01 năm 2010

-ii-

Luận án Tiến só Mục lục

MỤC LỤC

Trang
LỜI CẢM ƠN i
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi
DANH MỤC HÌNH viii
DANH MỤC BẢNG xi
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 5
1.1. Insulin và vai trò đối với cơ thể 5
1.2. Bệnh tiểu đường 8
1.3. Các phương pháp sản xuất insulin 10
1.3.1. Sản xuất insulin từ tụy tạng động vật 10
1.3.2. Sản xuất insulin người bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA 12
1.4. Sản xuất protein tái tổ hợp trong tế bào E. coli 18
1.4.1. Đặc điểm của E. coli trong sản xuất protein tái tổ hợp 18
1.4.2. Các chủng E. coli thường dùng trong sản xuất protein tái tổ hợp 20
1.5. Các hệ thống vector biểu hiện trong E. coli 24
1.5.1. Hệ thống pGEX biểu hiện protein dung hợp với GST 24
1.5.2. Hệ thống pET biểu hiện protein dung hợp với 6xHis 25
1.5.3. Hệ thống biểu hiện dung hợp với MBP - Hệ thống pMAL 27
1.5.4. Hệ thống IMPACT biểu hiện protein dung hợp với CBP 27
1.6. Phương pháp lên men vi sinh vật 28

1.6.1. Các phương pháp lên men sản xuất protein tái tổ hợp 28
1.6.2. Đặc điểm lên men mẻ 29
1.6.3. Đặc điểm lên men liên tục 32
1.6.4. Đặc điểm lên men mẻ-bổ sung 32
1.6.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến lên men mẻ-bổ sung chủng E. coli để sản xuất
protein tái tổ hợp
34
1.7. Các bước xử lý sau lên men để thu nhận mini-proinsulin và insulin có
hoạt tính
39
1.7.1. Thu nhận và làm tan thể vùi chứa mini-proinsulin 39
1.7.2. Tái gấp cuộn mini-proinsulin tái tổ hợp 40
1.7.3. Cắt loại đoạn peptide C để thu nhận insulin có hoạt tính 43
1.7.4. Các bước xử lý để thu nhận protein mục tiêu từ protein dung hợp 44
-iii-

Luận án Tiến só Mục lục

1.7.5. Các phương pháp tinh chế trung gian và tinh chế hoàn tất trong sản xuất
insulin từ mini-proinsulin
45
1.8. Qui trình sản xuất insulin tái tổ hợp theo mô hình mini-proinsulin 47
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 49
2.1. Dụng cụ và thiết bò 49
2.1.1. Thiết bò chính dùng trong sinh học phân tử 49
2.1.2. Thiết bò dùng trong thao tác nuôi cấy vi sinh 49
2.1.3. Thiết bò dùng cho tinh chế protein 49
2.1.4. Thiết bò dùng xác đònh hàm lượng đường huyết 50
2.2. Hóa chất và môi trường 50
2.2.1. Hóa chất 50

2.2.2. Môi trường nuôi cấy vi sinh 55
2.3. Nguyên vật liệu 55
2.3.1. Chủng vi sinh vật 55
2.3.2. Plasmid 56
2.3.3. Mồi dùng cho tổng hợp gen, tạo dòng và giải trình tự 56
2.3.4. Thang phân tử lượng dùng trong điện di 57
2.3.5. Các kháng thể sử dụng cho Western Blot và ELISA 57
2.4. Phương pháp 58
2.4.1. Thiết kế, tổng hợp gen mpi mã hóa 6xHis-MPI trong E. coli bằng phương
pháp PCR tái tổ hợp
58
2.4.2. Tạo dòng gen mpi trong plasmid pBlue (pBIns) 61
2.4.3. Tái tạo dòng gen mpi vào vector biểu hiện pET-43.1a 62
2.4.4. Cảm ứng biểu hiện và xác nhận sự biểu hiện của 6xHis-MPI 63
2.4.5. Hoạt hóa chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins 66
2.4.6. Khảo sát các điều kiện cảm ứng tối ưu sự biểu hiện 6xHis-MPI của chủng
E. coli BL21(DE3)/pET43Ins
66
2.4.7. Khảo sát thay thế trypton bằng pepton trong môi trường LB nuôi cấy E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins
68
2.4.8. Khảo sát sự biểu hiện 6xHis-MPI của chủng E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins
được nuôi cấy trong môi trường LBp và LB
68
2.4.9. Khảo sát điều kiện nuôi cấy E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins mật độ cao bằng
phương pháp mẻ-bổ sung ở qui mô phòng thí nghiệm
69
2.4.10. Khảo sát điều kiện lên men E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins bằng nuôi cấy
mẻ-bổ sung ở qui mô pilot 30L
70

2.4.11. Phương pháp thu sinh khối và đồng nhất tế bào 71
2.4.12. Thu nhận và làm tan thể vùi chứa 6xHis-MPI 72
2.4.13. Thu nhận và tinh chế sơ bộ 6xHis-MPI bằng sắc ký cột Ni-NTA 72
2.4.14. Phương pháp cắt loại bỏ 6xHis bằng CNBr để thu nhận MPI 72
-iv-

Luận án Tiến só Mục lục

2.4.15. Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng lên sự tái gấp cuộn của MPI 73
2.4.16. Tủa mini-proinsulin và insulin bằng ion kẽm kim loại 75
2.4.17. Phương pháp xử lý MPI bằng trypsin/carboxypeptidase B để thu nhận
insulin có hoạt tính
75
2.4.18. Kiểm tra cấu hình của MPI và insulin bằng phương pháp ELISA 76
2.4.19. Phân tích MPI và insulin bằng sắc ký RP-HPLC 77
2.4.20. Giải trình tự amino acid của MPI bằng khối phổ 77
2.4.21. Phương pháp đònh lượng protein 77
2.4.22. Phương pháp xác đònh tính hoạt tính của insulin tái tổ hợp 79
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 80
3.1. Tạo dòng tế bào E. coli có khả năng biểu hiện mini-proinsulin dung
hợp với 6xHis (6xHis-MPI)
80
3.1.1. Tổng hợp gen mpi mã hóa mini-proinsulin biểu hiện trong E. coli 80
3.1.2. Tạo dòng gen mpi vào plasmid pBlue 81
3.1.3. Tạo dòng tế bào E. coli BL21(DE3)/pET43Ins biểu hiện MPI ở dạng dung
hợp 6xHis-MPI
83
3.1.4. Kiểm tra trình tự amino acid của 6xHis-MPI 87
3.2. Lên men E. coli BL21(DE3)/pET43Ins tổng hợp 6xHis-MPI tái tổ hợp
ở qui mô phòng thí nghiệm và qui mô pilot

89
3.2.1. Hoạt hóa, nhân giống và kiểm tra khả năng biểu hiện 6xHis-MPI của
chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins
89
3.2.2. Khảo sát các điều kiện biểu hiện tối ưu 6xHis-MPI của E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins
91
3.2.3. Xác đònh điều kiện nuôi cấy mật độ cao chủng E. coli BL21(DE3)/
pET43Ins ở qui mô phòng thí nghiệm
95
3.2.4. Nuôi cấy E. coli BL21(DE3)/pET43Ins theo phương thức mẻ- bổ sung ở qui
mô 30 L để tổng hợp 6xHis-MPI
101
3.3. Thu nhận MPI có cấu hình tự nhiên 104
3.3.1. Thu nhận thể vùi chứa 6xHis-MPI 104
3.3.2. Thu nhận 6xHis-MPI từ thể vùi 105
3.3.3. Thu nhận MPI từ 6xHis-MPI 107
3.4. Thu nhận insulin từ MPI 111
3.4.1. Tái gấp cuộn MPI 111
3.4.2. Cắt loại peptide C bằng trypsin 116
3.5. Kiểm tra hoạt tính của insulin tái tổ hợp trên chuột 118
3.6. Sơ đồ qui trình công nghệ sản xuất insulin ở qui mô pilot 119
KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 122
-v-

Luận án Tiến só Mục lục

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN
ÁN
124

TÀI LIỆU THAM KHẢO 125
PHỤ LỤC 132




















-vi-

Luận án Tiến só Danh mục chữ viết tắt
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

6xHis: 6 Histidine
aH-LB
p

: Môi trường H-LB
p
có bổ sung khoáng
APS:
Ammonium persulfate
Arg: Arginine (amino acid)
ATP: Adenosine triphosphate
BTĐ: Bệnh tiểu đường
CDNB: 1-chloro-2-dinitrobenzene
CNBr: Cyanogen bromide
DCW: Hàm lượng tế bào khô
DOC: Hàm lượng ôxi hòa tan
DTT: Dithiothreitol
EDTA: Ethylenediamine tetraacetic acid
ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay
FDA: Cục quản lý dược phẩm Mỹ
FPLC: Fast performance liquid chromatography
GST: Glutathione S- Transferase
H-LB
p
: Môi trường LB
p
nồng độ cao
HRP: Horseradish Peroxidase
IDA: Iminodiacetic acid
IPTG: Isopropyl-β-D-thiogalactoside
kDa: KiloDalton
LB: Luria bertani, môi trường nuôi cấy E. coli
LB
p

: Môi trường LB thay thế trypton bằng pepton
-vii-

Luận án Tiến só Danh mục chữ viết tắt
Lys: Lysine (amino acid)
MBP: Maltose binding protein
MCS: Multicloning site
MPI: Mini-proinsulin
Ni-NTA: Nikel- nitrilotriacetic acid
OPD: o-Phenylenediamine
PBS-T: Phosphate Buffered Saline Tween
PDI: Protein disulfide isomerase
RP-HPLC: Sắc ký lỏng cao áp ngược pha
SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
SEC: Size exclusive chromatography , sắc ký lọc gel
TEMED: (N, N, N’, N’-tetramethylethylenediamine)
TFA: Trifluoroacetic acid
WHO: Tổ chức Y tế Thế giới

















-viii-
Luận án Tiến só Danh mục Hình
DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc của insulin 5
Hình 1.2. Các bước tạo insulin in vivo ở người 7
Hình 1.3. Cơ chế điều hòa hàm lượng đường trong máu 8
Hình 1.4. Cấu trúc không gian của insulin heo (bên trái), của người (bên phải). 10
Hình 1.5. Biến đổi insulin heo thành insulin người 11
Hình 1.6. Hình thái tế bào E. coli. 19
Hình 1.7. Cơ chế biểu hiện gen bởi hệ thống vector pET trong tế bào E. coli
(DE3)pLysS
21
Hình 1.8. Sơ đồ hệ thống vector biểu hiện pGEX 2TK. 24
Hình 1.9. Cấu trúc vector biểu hiện pET 43-1a(+) 26
Hình 1.10. Tương tác giữa protein dung hợp chứa 6xHis và giá thể gắn Nikel 26
Hình 1.11. Sơ đồ biểu hiện và thu nhận các protein có gắn thẻ MBP 27
Hình 1.12. Sơ đồ biểu hiện và tinh chế sử dụng hệ thống gắn thẻ Chitin. 28
Hình 1.13. Mô hình biểu diễn sự động học của nồng độ tế bào và của cơ chất
trong quá trình nuôi cấy theo thời gian của các phương pháp lên men.
29
Hình 1.14. Động học tăng trưởng của vi sinh vật trong lên men mẻ 30
Hình 1.15. Động học tăng trưởng tế bào trong nuôi cấy mẻ- bổ sung với tốc độ bổ
sung chất dinh dưỡng khác nhau
36
Hình 1.16. Cấu trúc của proinsulin. Sau khi cắt đoạn peptide C sẽ được insulin có

hoạt tính
44
Hình 1.17. Sơ đồ Tinh chế protein dung hợp với thể 6xHis trên hệ thống cột sắc ký
ái lực Ni-NTA
46
Hình 1.18. Cấu trúc của insulin dạng dimer (A) và hexamer (B) 47
Hình 1.19. Sơ đồ khái quát qui trình sản xuất insulin tái tổ hợp theo mô hình mini-
proinsulin bằng hệ thống vector pET trong E. coli.
48

Hình 2.1. Sơ đồ cấu trúc hệ thống biểu hiện gen mpi. 58
Hình 2.2. Sơ đồ trình tự amino acid của 6xHis-MPI. 59
Hình 2.3. Sơ đồ minh họa sự tổng hợp gen mpi bằng phương pháp PCR hai bước.

60

Hình 3.1. Kết quả phân tích gen mpi tổng hợp bằng PCR tái tổ hợp trên gel
agarose.
80
Hình 3.2. Kết quả chọn lọc dòng vi khuẩn E. coli DH5
α
mang pBIns bằng phương
pháp cắt giới hạn
81
-ix-
Luận án Tiến só Danh mục Hình
Hình 3.3. Kết quả giải trình tự gen mpi từ plasmid pBIns và so sánh mức độ tương
đồng với trình tự thiết kế
82
Hình 3.4. Sơ đồ tái tạo dòng gen mpi từ plasmid pBIns vào plasmid pET-43.1a tạo

plasmid tái tổ hợp pET43Ins biểu hiện 6xHis-MPI
84
Hình 3.5. Kết quả sàng lọc dòng E. coli DH5
α
mang plasmid pET43Ins bằng
phương pháp cắt giới hạn.
85
Hình 3.6. Kết quả kiểm tra mức độ đồng khung của gen mpi trên plasmid
pET43Ins
85
Hình 3.7. Kiểm tra sự biểu hiện của 6xHis-MPI bởi E. coli BL21(DE3)/pET43Ins.

87
Hình 3.8. Nhận diện các peptide được tạo thành từ sự thủy phân MPI 88
Hình 3.9. Sắc ký đồ MS/MS đoạn peptide chứa trình tự FFYTPTR của MPI 89
Hình 3.10. Động học tăng trưởng của chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins trong
môi trường LB
90
Hình 3.11. Kết quả kiểm tra sự biểu hiện 6xHis-MPI của chủng E. coli
BL21(DE3)/ pET43Ins.
91
Hình 3.12. Kết quả khảo sát nhiệt độ cảm ứng biểu hiện tối ưu. 92
Hình 3.13. Kết quả khảo sát nồng độ IPTG cảm ứng tối ưu. 93
Hình 3.14. Kết quả khảo sát thời lượng cảm ứng tối ưu 94
Hình 3.15. Động học tăng trưởng của chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins và sự
biến động pH theo thời gian khi nuôi cấy trên môi trường LBp và môi
trường LB
96
Hình 3.16. So sánh mức độ biểu hiện 6xHis-MPI khi nuôi cấy E. coli BL21
(DE3)/pET43Ins trên môi trường LBp với môi trường LB.

97
Hình 3.17. Động học tăng trưởng của chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins khi
nuôi cấy mẻ- bổ sung mật độ tế bào cao trên hai môi trường H-LBp và
aH-LBp.
99
Hình 3.18. So sánh mức độ biểu hiện 6xHis-MPI khi nuôi cấy E. coli BL21
(DE3)/pET43Ins theo phương thức mẻ- bổ sung mật độ tế bào cao trên
môi trường H-LBp với môi trường aH-LBp
100
Hình 3.19. Động học tăng trưởng của E. coli BL21(DE3)/pET43Ins trong quá
trình nuôi cấy theo phương thức mẻ- bổ sung ở qui mô 30 L.
103
Hình 3.20. Kết quả biểu hiện 6xHis-MPI ở qui mô lên men 30 lít. 104
Hình 3.21. Kiểm tra độ tinh sạch của 6xHis-MPI sau khi tinh chế qua cột Ni-NTA.

106
Hình 3.22. Kết quả kiểm tra phản ứng phân cắt 6xHis-MPI bằng CNBr 108
Hình 3.23. Kết quả tinh chế MPI từ dòch phân cắt 6xHis-MPI bằng CNBr. 110
Hình 3.24. Kết quả ELISA xác nhận cấu hình tái gấp cuộn của MPI. 111
Hình 3.25. Kết quả ELISA khảo sát pH dung dòch tái gấp cuộn. 113
-x-
Luận án Tiến só Danh mục Hình
Hình 3.26. Kết quả phân tích dung dòch MPI tái gấp cuộn bằng RP-HPLC 115
Hình 3.27. Kết quả kiểm tra sự cắt loại petide C bằng điện di SDS-PAGE. 117
Hình 3.28. Kết quả phân tích dòch cắt loại đoạn peptide C bằng trypsin theo
phương pháp RP-HPLC.
118
Hình 3.29. Sự biến động hàm lượng đường trong máu chuột sau khi xử lý bằng
insulin tái tổ hợp
119

Hình 3.30. Sơ đồ qui trình công nghệ sản xuất insulin ở qui mô pilot (80 L) 121

Hình 5.1. Kết quả phân tích và nhận dạng MPI 134
Hình 5.2. Hệ thống lên men mini-jar 5L. 135
Hình 5.3. Hệ thống lên men pilot. 136
Hình 5.4. Máy phá tế bào Microfluidizer M-110EH-30 136
Hình 5.5. Hệ thống FPLC dùng để tinh chế protein 137
Hình 5.6. Hệ thống sắc ký ngược pha RP-HPLC. 137
Hình 5.7. Hệ thống lọc tiếp tuyến protein 138
Hình 5.8. Máy ly tâm cao tốc thu sinh khối tế bào qui mô pilot 138
Hình 5.9. Máy đo đường huyết Accu-check Active. 139











-xi-
Luận án Tiến só Danh mục Bảng


DANH MỤC BẢNG


Bảng 1.1. So sánh các hệ thống tế bào chủ trong sản xuất protein tái tổ hợp 20

Bảng 1.2. Nồng độ gây ức chế của một số thành phần trong môi trường nuôi cấy

36

Bảng 2.1. Thành phần các môi trường tiêu chuẩn sử dụng trong nghiên cứu 55
Bảng 2.2. Thành phần môi trường thiết kế sử dụng cho các thí nghiệm nghiên cứu

55
Bảng 2.3. Mồi dùng để tổng hợp gen mpi, thiết kế các plasmid, giải trình tự gen
mã hóa MPI và chạy PCR khuẩn lạc
56
Bảng 2.4. Các dung dòch albumin có nồng độ khác nhau để xây dựng đường chuẩn
protein
78

Bảng 3.1. Kết quả động học tăng trưởng và tạo sinh khối của chủng E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins khi nuôi cấy mẻ-bổ sung mật độ cao trong môi
trường aH-LBp ở qui mô 30 lít
102
Bảng 3.2. Kết quả thu hoạch sinh khối tế bào sau lên men 104
Bảng 3.3. Kết quả thu nhận thể vùi chứa 6xHis-MPI từ sinh khối tế bào 105
Bảng 3.4. Kết quả thu nhận và tinh chế sơ bộ 6xHis-MPI từ thể vùi bằng cột Ni-
NTA
105
Bảng 3.5. Kết quả thu nhận MPI khi xử lý 6xHis-MPI bằng CNBr 107
Bảng 3.6. Kết quả tinh chế thu nhận MPI từ dòch xử lý bằng CNBr 109
Bảng 3.7. Kết quả ELISA kiểm tra cấu hình tái gấp cuộn MPI theo OD
492nm
111
Bảng 3.8. Kết quả ghi nhận giá trò OD

492nm
của phản ứng ELISA khảo sát pH của
dung dòch tái gấp cuộn
113
Bảng 3.9. Kết quả tái gấp cuộn MPI tạo cấu hình MPI tự nhiên 114
Bảng 3.10. Kết quả phân tích MPI tái gấp cuộn bằng RP- HPLC 115
Bảng 3.11. Kết quả đánh giá hoạt tính insulin tái tổ hợp trên chuột 119

Bảng 5.1. Bảng ký hiệu theo ký tự của amino acid 139
Bảng 5.2. Bảng mã codon ưa dùng trong E. coli 140
Bảng 5.3. Kết quả theo dõi hàm lượng đường trong máu chuột sau khi tiêm insulin

141
-1-
Luận án Tiến só Đặt vấn đề


ĐẶT VẤN ĐỀ
“Thế kỷ 21 là thế kỷ của các bệnh Nội tiết và các Rối loạn chuyển hóa
mà điển hình là bệnh đái tháo đường (Bệnh tiểu đường)”. Nhận xét này của
nhóm chuyên gia về dự báo tình hình bệnh tật của Tổ chức Y tế thế giới đã đang
trở thành hiện thực với những con số cụ thể. Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO,
2008) [
77], hiện nay trên toàn thế giới có khoảng 180 triệu người mắc bệnh tiểu
đường và ước tính con số này sẽ tăng gấp đôi vào năm 2030, chiếm khoảng 5%
dân số thế giới. Đáng lo ngại hơn là các biến chứng của bệnh, cứ 10 giây có một
người tử vong do nguyên nhân đái tháo đường, cứ 30 giây lại có một người đái
tháo đường bò cắt cụt chi và cứ mỗi ngày có 5000 người mất khả năng nhìn do
biến chứng mắt của bệnh. Mỗi năm có hơn 3,2 triệu người chết vì các bệnh liên
quan tới đái tháo đường tương đương với số người tử vong vì bệnh HIV/AIDS [

1].
Bệnh tiểu đường (BTĐ) đang trở thành gánh nặng cho mỗi nền kinh tế xã
hội, mặc dù mỗi năm hàng nghìn tỷ đôla Mỹ được chi phí cho điều trò bệnh,
nhưng chưa bao giờ và sẽ không bao giờ những chi phí khổng lồ về kinh tế có
thể lấp đầy được những tổn thất, nhất là những mất mát về tinh thần do bệnh tật
gây ra. Thực tế đáng lo ngại hơn là tình trạng bệnh xuất hiện ngày càng nhiều từ
lớp trẻ [
1].
Ở Việt Nam, tỷ lệ người mắc BTĐ ngày càng cao và ở các thành phố lớn
tỷ lệ này đã tăng gấp đôi từ 2% lên 4% trong 10 năm giai đoạn 1990-2000. Số
người mắc BTĐ hiện nay khoảng 4,5 triệu người, chiếm 5,7% dân số, trở thành
nước có tốc độ phát triển BTĐ nhanh nhất thế giới [
1].
Nguyên nhân của BTĐ là do thiếu insulin hoặc do cơ thể người bệnh
kháng insulin. Insulin là một polypeptide hormone được sinh ra nhờ các tế bào β
của tuyến tụy động vật, có vai trò điều hoà lượng đường trong máu. Phương
-2-
Luận án Tiến só Đặt vấn đề


pháp điều trò BTĐ phổ biến hiện nay là tiêm insulin đònh kỳ cho người bệnh. Do
số lượng người mắc BTĐ ngày càng cao nên nhu cầu sử dụng insulin càng lớn. Ở
châu Âu, lượng insulin đã tăng lên 3 lần trong vòng 12 năm từ 1995-2007. Theo
ước tính, nhu cầu insulin trên thế giới tăng từ khoảng 5.000kg trong năm 2007
lên khoảng 16.000kg vào năm 2010, với thò trường dự tính khoảng 11,8 tỷ Mỹ
kim [
41].
Năm 1978, lần đầu tiên các nhà khoa học của công ty công nghệ sinh học
Genetech đã dòng hóa thành công gen mã hóa cho insulin người vào vector biểu
hiện trong E. coli và đã cho phép công ty Eli Lilly sử dụng kỹ thuật này để sản

xuất insulin người tái tổ hợp với tên thương mại là Humulin. Năm 1982, Humulin
đã được FDA (Food & Drug Administration – Cơ quan Quản lý thuốc và thực
phẩm Hoa Kỳ) cho phép lưu hành. Hiện nay có nhiều công ty dược phẩm trên
thế giới sản xuất insulin tái tổ hợp như: Eli Lilly, Novo disk, Sanofi Aventis … với
nhiều loại sản phẩm insulin khác nhau. Công nghệ sản xuất insulin hiện nay
thường được tiếp cận theo hai phương pháp: phương pháp một chuỗi polypeptide
và phương pháp hai chuỗi polypeptide. Công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp
bằng phương pháp một chuỗi polypeptide bao gồm ba bước cơ bản. Đầu tiên là
bước tạo dòng chủng chủ (thường là E. coli) có khả năng mang gen ngoại tổng
hợp các chất tiền thân của insulin (proinsulin). Đây là khâu then chốt quyết đònh
sự thành công của công nghệ do cần phải biến đổi các codon thích hợp để tăng
cường hiệu quả biểu hiện. Tiếp theo là bước lên men, cảm ứng biểu hiện, thu
nhận proinsulin và xử lý để thu nhận insulin. Protein được biểu hiện dưới dạng
thể vùi nằm trong tế bào chất, do vậy cần phải biến tính để làm tan, sau đó tiến
hành tái gấp cuộn để có proinsulin có cấu hình tự nhiên. Proinsulin tái gấp cuộn
được xử lý bằng protease cắt loại đoạn nối nội phân tử (đoạn peptide C) để thu
insulin có hoạt tính. Đối với phương pháp sản xuất theo 2 mạch polypeptide,
-3-
Luận án Tiến só Đặt vấn đề


trước hết phải tạo dòng các chủng chủ riêng rẽ mang các gen mã hóa cho 2
chuỗi polypeptide khác nhau (chuỗi A, chuỗi B). Sau đó tinh chế thu nhận các
chuỗi polypeptide A và B và thực hiện phản ứng tạo cầu nối disulfide để thu
nhận insulin có hoạt tính.
Ở Việt Nam, nhu cầu sử dụng insulin rất cao, tuy nhiên toàn bộ nguồn
insulin sử dụng cho bệnh nhân mắc BTĐ đều phải nhập ngoại nên vừa gây tốn
kém ngoại tệ vừa không chủ động được nguồn thuốc để đáp ứng chữa trò kòp thời
cho bệnh nhân. Để đảm bảo cho điều trò toàn bộ bệnh nhân mắc BTĐ hàng ngày
với liều dùng 0,5-1,0 U/kg trọng lượng cơ thể trong một ngày [

78], thì Việt Nam
cần phải nhập ngoại khoảng từ 120-240 triệu U/ năm, tương đương 420-840 kg
insulin/ năm (100U =3,5 mg). Năm 2001, giấy phép độc quyền sản xuất insulin
tái tổ hợp chính thức hết hiệu lực, mở ra cơ hội lớn cho các nước đang phát triển
trong đó có Việt Nam, có thể tiếp cận được công nghệ hiện đại để phát triển qui
trình sản xuất insulin người tái tổ hợp trong nước, mang lại triển vọng góp phần
giải quyết khó khăn trên.
Mặc dù bản quyền sản xuất insulin bằng công nghệ DNA tái tổ hợp đã
hết hạn tuy nhiên các công ty dược phẩm vẫn tiếp tục giữ những bí quyết công
nghệ có tính thế mạnh của công ty nên rất khó tiếp cận để có được qui trình
công nghệ đầy đủ nhằm sản xuất insulin. Do vậy, cần phải nghiên cứu xây dựng
qui trình công nghệ riêng dựa trên những thông tin đã công bố và trình độ công
nghệ sẵn có để tiến đến việc sản xuất insulin trong nước đáp ứng được yêu cầu
đặt ra.
Năm 2007, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học quốc gia Thành
phố Hồ Chí Minh được giao nhiệm vụ thực hiện đề tài cấp nhà nước “Nghiên
cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp điều trò bệnh đái tháo đường”, mã số
-4-
Luận án Tiến só Đặt vấn đề


KC.04.09/06-10. Nội dung nghiên cứu của luận án là thực hiện một phần trong
nội dung của đề tài cấp nhà nước này.
Về mặt khoa học, mục tiêu của luận án nhằm bước đầu nghiên cứu qui
trình tổng hợp insulin người tái tổ hợp theo phương pháp một chuỗi polypeptide
trong E. coli bao gồm tạo dòng E. coli tái tổ hợp biểu hiện mini-proinsulin, lên
men, tái gấp cuộn mini-proinsulin và xử lý để tạo insulin có hoạt tính. Ý nghóa
thực tiễn của đề tài là ứng dụng công nghệ gen, công nghệ lên men và công
nghệ protein để tạo ra chế phẩm insulin có hoạt tính dùng làm thuốc trò bệnh
tiểu đường.

Luận án tập trung nghiên cứu cụ thể các vấn đề sau:
- Tạo chủng E. coli tái tổ hợp có mang vector biểu hiện mini-proinsulin tái
tổ hợp của người.
- Xây dựng qui trình lên men nuôi cấy chủng E. coli tái tổ hợp biểu hiện
mini-proinsulin.
- Thiết lập qui trình thu nhận và tinh sạch mini-proinsulin từ tế bào chủng
E. coli.
- Xây dựng qui trình tái gấp cuộn mini-proinsulin và xử lý thu nhận insulin
có hoạt tính.
- Thử nghiệm hoạt tính insulin tái tổ hợp trên chuột.







-5-
Luận án Tiến só Tổng quan


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Insulin và vai trò đối với cơ thể
Bệnh tiểu đường được mô tả lần đầu tiên và được ghi lại trên bia mộ của
Thebes (Ai cập) từ khoảng năm 3000-1500 trước công nguyên. Năm 1893
Hédon đã chứng minh vai trò quan trọng của tuyến tụy trong BTĐ. Năm 1901,
Opie chứng minh được mối liên hệ trực tiếp giữa BTĐ và sự hư hỏng tiểu phần
Langerhans trên tụy tạng, củng cố giả thuyết cho rằng có sự tiết nội tiết bởi tiểu
phần Langerhans của tụy tạng có chức năng ngăn ngừa BTĐ. Từ đó nhiều nhà

khoa học đã cố gắng phân lập những hợp chất từ tụy tạng có khả năng trò được
BTĐ. Năm 1922, Macleod chính thức công bố sự khám phá ra insulin. Năm
1955, Fredick Sanger xác đònh trình tự amino acid của insulin. Năm 1979, insulin
được sản xuất bằng phương pháp tái tổ hợp và được thương mại hóa vào năm
1982, trở thành protein tái tổ hợp đầu tiên được sản xuất bằng phương pháp này
và được sử dụng cho mục đích trò liệu [
35],[54].


Hình 1.1. Cấu trúc của insulin
-6-
Luận án Tiến só Tổng quan


Insulin là một hormone dạng polypeptide gồm hai chuỗi polypeptide nối
cộng hóa trò với nhau bằng 3 cầu nối disulfide: chuỗi A có 21 amino acid và
chuỗi B có 30 amino acid. Ba cầu nối disulfide (S-S) nối hai chuỗi A và B là A7-
B7, A20-B19 và A6-A11 (
Hình 1.1). Insulin có công thức phân tử chung là
C
257
H
383
N
65
O
77
S
6
, phân tử lượng 5,8 kDa. Điểm đẳng điện pI là 5,5 [14],[22],

[
74].
Ở động vật, ban đầu insulin được tạo ra từ tế bào β của tụy tạng ở dạng
preproinsulin chứa tổng cộng 109 amino acid, trong đó đoạn peptide tín hiệu
gồm 23 amino acid còn lại là proinsulin gồm 86 amino acid được cấu tạo theo
thứ tự từ đầu N như sau: chuỗi B 30 amino acid, chuỗi C 35 amino acid và chuỗi
A 21 amino acid (
Hình 1.2). Đoạn peptide tín hiệu gồm 23 amino acid có vai trò
trong sự vận chuyển proinsulin qua màng lưới nội chất đi vào khoang bên trong.
Đoạn peptide này sau đó bò cắt rời bởi một peptidase đặc trưng và tạo nên
proinsulin. Proinsulin tồn tại trong lưới nội chất và sau đó liên kết với các thể
Golgi tạo thành các thể tiết. Quá trình hình thành insulin diễn ra trong các thể
này nhờ sự thủy phân bởi protease để loại bỏ đoạn peptide C tạo phân tử insulin
có hoạt tính. Insulin được tích lũy trong tế bào β của tụy tạng dưới dạng
hexamer, gồm sáu phân tử insulin được ổn đònh nhờ gắn với 2 nguyên tử kẽm.
Thể tiết sẽ tiết insulin vào máu khi nồng độ glucose trong máu cao [
27].
Hầu hết insulin ở các loài có trình tự amino acid tương tự nhau nhưng
không hoàn toàn giống nhau. Insulin của chuột và của thỏ khác nhau một số
amino acid. Insulin của heo khác insulin của người chỉ một amino acid ở đầu C
của chuỗi B. Insulin của bò khác của người ba amino acid trong khi đó của cừu
thì khác bốn amino acid. Sự khác biệt trong cấu trúc của insulin người và insulin
của bò là ở các vò trí A8, A10, và B30 (insulin người ở các vò trí này là Thr, Ile
và Thr) [
21].
-7-
Luận án Tiến só Tổng quan




Hình 1.2. Các bước tạo insulin in vivo ở người.

Insulin có vai trò trung tâm trong cơ chế điều hòa sự biến dưỡng
carbohydrate, protein và lipid. Mức độ tiết của insulin từ các tế bào β được quyết
đònh bởi nồng độ glucose trong máu. Nồng độ glucose trong máu cao sẽ cảm ứng
sự tiết insulin nhằm thúc đẩy sự hấp thụ glucose trong máu bởi các mô cơ quan
khác nhau, đặc biệt là gan và cơ. Điều này giúp làm giảm lượng glucose trong
máu đến mức bình thường, sau đó sự tiết insulin bò giảm (
Hình 1.3).
-8-
Luận án Tiến só Tổng quan



Hình 1.3. Cơ chế điều hòa hàm lượng đường trong máu.

Insulin có ảnh hưởng lớn đối với hoạt động của nhiều cơ quan trong cơ
thể như tăng cường sự hấp thụ glucose trong máu và chuyển thành glucogen bởi
tế bào gan, làm giảm hàm lượng glucose trong máu. Tăng cường hấp thu amino
acid từ máu và chuyển thành protein. Chuyển glucose thành glucogen ở cơ vân.
Tăng cường sự tổng hợp mỡ bởi tế bào mỡ. Các ảnh hưởng này có thể giúp cơ
thể tích lũy được các chất dinh dưỡng hòa tan được hấp thụ từ ruột non thành
dạng dự trữ giàu năng lượng như glycogen, protein, mỡ đồng thời làm giảm hàm
lượng glucose trong máu [
3].
1.2. Bệnh tiểu đường
Bệnh tiểu đường là tình trạng lâm sàng diễn ra khi tuyến tụy không sản
xuất đủ insulin hoặc cơ thể sử dụng không hiệu quả insulin đã được tiết ra. Hậu
quả là hàm lượng đường huyết cao và gây nên các rối loạn liên quan trong trao
đổi chất, dẫn đến sự hư hỏng nghiêm trọng của nhiều cơ quan trong cơ thể đặc

-9-
Luận án Tiến só Tổng quan


biệt là thần kinh và tim mạch [76]. Bệnh tiểu đường được Tổ chức Y tế Thế giới
(WHO) [
2] phân loại như sau:
- Bệnh tiểu đường type I (BTĐ phụ thuộc insulin): Do cơ thể không thể
sản xuất đủ insulin, phần lớn xảy ra ở trẻ em và người trẻ tuổi và thường có yếu
tố tự miễn, chiếm từ 5-10% tổng số bệnh nhân mắc BTĐ. Ở Việt nam, tỷ lệ này
chiếm khoảng 7%.
- Bệnh tiểu đường type II (BTĐ không phụ thuộc insulin): Do cơ thể
kháng insulin đi kèm với sự thiếu hụt insulin tương đối, thường gặp ở lứa tuổi
trên 40, gần đây xuất hiện ở lứa tuổi 30, thậm chí cả ở lứa tuổi thanh thiếu niên,
chiếm xấp xỉ 90%-95% trong các trường hợp BTĐ. Ở Việt nam, tỷ lệ này chiếm
khoảng 91,2%.
- Bệnh tiểu đường thai nghén: là trường hợp rối loạn dung nạp glucose
được chẩn đoán lần đầu tiên khi có thai. Mặc dù trong đa số các trường hợp khả
năng dung nạp glucose có cải thiện sau thời gian mang thai, nhưng vẫn có sự gia
tăng đáng kể nguy cơ phát triển thành BTĐ type II về sau này.
- Các thể BTĐ khác: nhóm này bao gồm tất cả các nguyên nhân khác
hiếm gặp hơn, có thể gây BTĐ bao gồm tiểu đường là triệu chứng do bệnh lý
của hệ thống nội tiết, các bệnh về tụy, các hình thái di truyền của BTĐ hoặc tiểu
đường do thuốc và hóa chất.
Hiện nay trên thế giới có khoảng 180 triệu người mắc BTĐ, số người mắc
BTĐ ngày càng tăng cao và theo dự đoán thì năm 2030 có ít nhất là 366 triệu
người bò mắc BTĐ [
70]. Ở một số nước, tiểu đường được xem như là một căn
bệnh xã hội. Tỷ lệ mắc BTĐ loại II: ở Israel: 6,7%, ở Mỹ: 6,6%, ở Saudi Arabia:
6,6%, ở Nam Italia: 6,5% [

71],[77].
-10-
Luận án Tiến só Tổng quan


Ở Việt Nam, bệnh tiểu đường phát triển rất nhanh. Năm 1990 tỷ lệ mắc
bệnh tiểu đường chỉ ở mức từ 0,96%( Huế) cho đến 2,52%( thành phố Hồ Chí
Minh), nhưng chỉ sau 10 năm, năm 2001 tỷ lệ này ở các thành phố lớn đã là
4,1%, năm 2002 tăng lên 4,4%, với mức tính ở cả cộng đồng là 2,7% dân số; nếu
tính ở nhóm người có yếu tố nguy cơ mắc bệnh cao thì tỷ lệ bệnh đã tăng trên
10%. Theo thống kê năm 2008, tỷ lệ mắc bệnh tiểu đường trong cả nước là trên
5% (khoảng 4,5 triệu người), tại các thành phố lớn và khu công nghiệp có tỷ lệ
từ 7,0 đến 10% [
1].
1.3. Các phương pháp sản xuất insulin
1.3.1. Sản xuất insulin từ tụy tạng động vật
Trước đây người ta thường sử dụng insulin chiết tách từ tụy tạng động vật
như heo, cừu, bò để điều trò BTĐ. Tuy nhiên insulin heo thường được ưa dùng
hơn của bò do có trình tự amino acid gần với insulin của người, chỉ khác một
amino acid là alanine ở đầu C của chuỗi B trong khi insulin người là threonine
và ít gây các phản ứng miễn dòch (
Hình 1.4).






Hình 1.4. Cấu trúc không gian của insulin heo (bên trái), của người (bên phải).


Chế phẩm insulin tinh sạch đầu tiên dùng cho trò liệu vào những năm
1920 được chiết từ tụy tạng của heo hoặc bò bằng kỹ thuật tủa protein nhờ acid-
-11-
Luận án Tiến só Tổng quan


alcohol, do vậy độ tinh sạch của chế phẩm không cao. Năm 1926, các nhà khoa
học đã kết tinh thành công tinh thể insulin từ các dòch chiết insulin thô. Năm
1934, người ta phát hiện rằng kẽm kim loại có khả năng tăng cường sự kết tinh
của insulin từ các dòch chiết thô này. Từ đó có thể sản xuất insulin thương mại
dạng tinh thể và được coi là insulin truyền thống dù độ tinh sạch chưa cao [
35].
Qua nhiều thập niên, các nhà khoa học đã phát triển nhiều phương pháp
khác nhau để sản xuất insulin với số lượng lớn đáp ứng nhu cầu sử dụng ngày
càng cao của con người. Một trong những phương pháp được sử dụng trong một
thời gian dài là phương pháp biến đổi enzyme của insulin heo bằng cách thủy
phân bởi trypsin ở vò trí amino acid 22- 23 và ở vò trí 29-30 của chuỗi B, loại bỏ
một đoạn peptide có 8 đơn phân ra khỏi chuỗi này (
Hình 1.5). Sau đó tổng hợp
đoạn peptide gồm 8 amino acid tương đồng với đoạn cuối của insulin người, thực
hiện kết gắn đoạn này vào vò trí đã xử lý bằng trypsin trước đó (
Hình 1.5) [27].
GLy
Ile
Val
Glu
Gln Cys Cys Thr Ser Ile Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr CysCys AsnSer Leu
His
Gln
Asn

Val
Phe
Leu Cys Gly Ser Glu Ala Leu Tyr Leu Val CysHis GlyLeu Val Glu
Arg
Gly
Phe
PheTyrThrProLysAla
Gly
Phe
PheTyrThrProLysThr
(a)
(
b
)
Trypsin

Hình 1.5. Biến đổi insulin heo thành insulin người.
(a) Xử lý insulin heo bằng trypsin sẽ cắt bỏ đoạn gồm 8 amino acid đầu
C. (b) Tổng hợp đoạn peptide 8 amino acid cuối cùng của insulin người
và gắn vào (a).
-12-
Luận án Tiến só Tổng quan


Kỹ thuật này giúp tạo ra được chế phẩm insulin người và được sử dụng
rộng rãi trong nhiều năm. Tuy nhiên phương pháp này cũng chưa đáp ứng được
nhu cầu insulin do số người mắc BTĐ ngày một tăng cao. Do vậy, người ta đã
phát triển phương pháp sản xuất insulin người bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA và
đã được chấp nhận sử dụng từ năm 1982.
1.3.2.

Sản xuất insulin người bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA
Insulin người tái tổ hợp được sản xuất theo hai phương án: (1) Biểu hiện
hai chuỗi A, B độc lập sau đó thực hiện phản ứng tạo cầu nối disulfide hình
thành phân tử insulin (phương án hai chuỗi); (2) Sản xuất proinsulin tái tổ hợp
sau đó dùng enzyme đặc hiệu (trypsin/carboxypeptidase) cắt bỏ đoạn peptide C
tạo insulin có hoạt tính (phương án một chuỗi). Gần đây, thay cho proinsulin
trong phương án một chuỗi, người ta biểu hiện mini-proinsulin (có đoạn C ngắn
hơn so với trường hợp proinsulin) để sản xuất insulin.
1.3.2.1. Sản xuất insulin tái tổ hợp bằng phương án hai chuỗi
Chế phẩm insulin tái tổ hợp của người đầu tiên được thu nhận bằng cách
gắn hai đoạn cDNA mã hóa cho chuỗi A và chuỗi B vào plasmid, dòng hóa vào
các tế bào E. coli khác nhau (chủng K12) và biểu hiện hai chuỗi A, B tái tổ hợp
riêng rẽ. Hai chuỗi peptide A, B sau đó được tinh sạch tạo các cầu nối disulfide
để hình thành insulin có hoạt tính. Năm 1999, Michael Schmidt và cộng sự công
bố một nghiên cứu về “Sản xuất insulin người bằng E.coli tái tổ hợp với cảm
ứng nhiệt” theo phương án hai chuỗi. Hai chuỗi A, B được tổng hợp riêng rẽ trên
hai hệ thống biểu hiện sử dụng promotor của phage lamda (λ-P
L
), cảm ứng biểu
hiện bằng nhiệt độ. Tiến hành tinh chế hai chuỗi này khỏi các thể vùi, sau đó
cho thực hiện đúng cầu nối disulfide nhờ các dẫn xuất của S-sulfonate để hình
thành insulin có hoạt tính với hiệu suất biểu hiện của chuỗi A, B đạt tương ứng