1
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐOÀN
TP. HỒ CHÍ MINH TP. HỒ CHÍ MINH
CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM
SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ
 * 
BÁO CÁO NGHIỆM THU
BÁO CÁO NGHIỆM THU
TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG TỔNG HỢP FELODIPIN
TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG TỔNG HỢP FELODIPIN
Chủ nhiệm đề tài: TRẦN BỘI CHÂU
Cơ quan chủ trì: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ
TP. Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2011
PHẦN MỞ ĐẦU
1. Tên đề tài: Tối ưu hóa điều kiện phản ứng tổng hợp Felodipin
Chủ nhiệm đề tài/dự án: Trần Bội Châu
Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ
Thời gian thực hiện: 12/2009 -12/2010
Kinh phí được duyệt: 80.000.000
Kinh phí đã cấp: 62.250.000 theo TB số: 327/HĐ - SKHCN ngày 23/12/2009
2. Mục tiêu
Tối ưu hóa các điều kiện phản ứng trong qui mô phòng thí nghiệm để tổng hợp
felodipin đạt tiêu chuẩn dược dụng (BP-2009). Đề tài nhằm làm tiền đề cho sự
xây dựng qui trình sản xuất ở mức độ lớn hơn (pilot), từ đó có thể ứng dụng vào
sản xuất công nghiệp góp phần phát triển ngành công nghiệp Hóa dược nước
nhà. Cụ thể
- Chọn phương pháp với nguồn nguyên liệu để điều chế felodipin phù hợp
điều kiện trang thiết bị, hóa chất sẵn có.
- Tối ưu hóa các điều kiện phản ứng, tinh chế để thu được felodipin hiệu suất
cao, đạt tiêu chuẩn dược dụng

3. Nội dung
Hiện nay, tuy đã có nhiều công trình công bố qui trình điều chế felodipin (với
nguồn nguyên liệu đầu, hệ xúc tác, dung môi phản ứng…khác nhau), nhưng
phần lớn các công bố này khi áp dụng sản xuất vẫn còn nhiều bất cập, ví dụ
hiệu suất không cao, nguyên liệu không sẵn có, điều kiện tiến hành không thực
hiện được với trang thiết bị sẵn có trong nước.
Vì vậy, nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm
- Chọn một phương pháp điều chế felodipin phù hợp điều kiện trang thiết bị,
hóa chất sẵn có.
- Tối ưu hóa một số điều kiện phản ứng theo mô hình Box-Behnken với sự hỗ
2
trợ của phần mềm JMP 4.0 để thu felodipin có hiệu suất cao
- Kiểm nghiệm sản phẩm theo một số tiêu chuẩn về định tính và định lượng
trong BP 2009
4. Sản phẩm của đề tài:
- Quy trình điều chế Felodipin với các thông số tối ưu : thực hiện được ở quy
mô phòng thí nghiệm cho sản phẩm đạt tiêu chuẩn dược dụng
- Bài báo đăng trong tạp chí chuyên ngành (Tạp chí Dược học hoặc Tạp chí
Hóa học)
- Soạn bài thực hành sau đại học dùng cho công nghệ hóa học, hóa dược
3
CHƯƠNG I
TỔNG QUAN
4
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ FELODIPIN
1.1.1 Tên khoa học và tính chất của felodipin [6]
Tên IUPAC: 3-ethyl-5-methyl 4-(2,3-diclorophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-
dihydropyridin-3,5-dicarboxylat.
Công thức cấu tạo:

Công thức phân tử: C
18
H
19
Cl
2
NO
4
Tính chất:
Tinh thể màu trắng đến vàng nhạt, không tan trong nước (19,17mg/l ở 25
o
C),
tan hoàn toàn trong aceton, ancol, dicloromethan.
Nhiệt độ nóng chảy: 145
o
C.
Khối lượng phân tử: 384.26g/mol.
Bảo quản:ở nhiệt độ phòng dưới 30
o
C, tránh ẩm và tránh ánh sáng.
Dược động học
Hấp thu: sinh khả dụng của felodipin khoảng 15% và không phụ thuộc vào
liều điều trị.
Phân bố: felodipin liên kết mạnh với protein huyết tương khoảng 99%. Chủ
yếu gắn với albumin.
Chuyển hóa: felodipin phần lớn được chuyển hóa qua gan. Tất cả các chuyển
hóa được xác định không có hoạt tính.
5
Thải trừ: khoảng 70% liều dùng được bài tiết dưới dạng chuyển hóa trong
nước tiểu. Felodipin có độ thanh thải cao với độ thanh thải trung bình trong máu là

1200ml/phút. Thời gian bán thải trung bình ở pha cuối là 14 giờ. Không có sự tích
lũy đáng kể khi điều trị dài hạn.
Tác dụng dược lý
Felodipin là một chất ức chế kênh calcium chọn lọc trên mạch máu, làm
giảm áp lực máu động mạch do làm giảm sức cản mạch máu toàn thân. Do có tính
chọn lọc cao trên cơ trơn của tiểu động mạch nên khi sử dụng ở liều điều trị không
tác dụng trực tiếp lên tính co bóp và dẫn truyền của cơ tim.
Felodipin có tác dụng lợi tiểu, thải trừ natri nhẹ và không gây ứ dịch trong cơ
thể.
Felodipin có hiệu quả ở tất cả các mức độ tăng huyết áp.
Felodipin có tác dụng chống đau thắt ngực và chống thiếu máu cục bộ do cải
thiện sự cân bằng cung-cầu oxi cơ tim.
Felodipin có hiệu quả và dung nạp tốt trên người lớn không kể tuổi tác,
chủng tộc, và khi bệnh nhân có bệnh lý khác cùng lúc như suy tim sung huyết, hen,
các bệnh phổi tắt nghẽn khác,…
Tác dụng phụ: có thể gây đỏ bừng mặt, nhức đầu, đánh trống ngực, choáng
váng, mệt mỏi thoáng qua. Hạ huyết áp, phù, dị ứng da (ngứa, phát ban,…)
Một số chế phẩm chứa felodipin: viên nén 2,5mg; 5mg; 10mg.
1.1.2. Tiêu chuẩn felodipin dược dụng B.P 2009 [14]
Mô tả
Felodipin chứa không dưới 99,0% và không nhiều hơn 101,0% đương lượng
felodipin tính trên khối lượng sấy khô.
Tính chất
Tinh thể trắng đến vàng nhạt, thực tế không tan trong nước, tan hoàn toàn
trong aceton, methanol và dicloromethan.
6
Định tính
A: Hòa tan 50mg felodipin trong methanol và pha loãng tới vạch trong bình
định mức 100ml. Hút 3ml dung dịch vừa pha tiếp tục pha loãng trong methanol
đến vạch định mức 100ml. Kiểm tra ở bước sóng 220-400nm, dung dịch có 2 đỉnh

hấp thụ cực đại ở bước sóng 361nm và 238nm là 0,34-0,36.
B: Khảo sát bằng quang phổ hồng ngoại rồi so sánh với phổ hồng ngoại của
felodipin chuẩn.
C: khảo sát bằng sắc ký lớp mỏng tráng silicagel GF 254
- Dung dịch thử: hòa tan 10mg chất thử trong 10ml methanol.
- Dung dịch đối chiếu (a): hòa tan 10mg felodipin chuẩn trong 10ml
methanol.
- Dung dịch đối chiếu (b): hòa tan 5mg nifedipin chuẩn trong 5ml dung dịch
đối chiếu (a).
- Chấm mỗi dung dịch 5µl. Khai triển trên bản mỏng với đường đi của dung
môi là 15cm, hệ dung môi là ethyl acetat : cyclohexan (40:60). Làm khô bản
mỏng trong không khí và kiểm tra dưới ánh sáng 254nm. Vết chính trên sắc
ký thu được của dung dịch thử tương tự về vị trí, độ phát quang và kích
thước so với dung dịch đối chiếu (a). Kết quả sẽ không có giá trị nếu dung
dịch đối chiếu (b) cho 2 vết không rõ ràng.
D: hòa tan 150mg chất thử trong hỗn hợp 25ml 2-methyl-2-propanol và
25ml dung dịch acid percloric. Thêm 10ml ceri sulphat 0,1M để yên 15 phút. Thêm
3,5ml NaOH đậm đặc và trung hòa bằng NaOH loãng. Lắc với 25ml
dicloromethan. Làm bay hơi lớp dưới đến khô trong bồn chứa nitrogen (chất cặn bã
được dùng để thử các chất liên quan). Pha loãng 20mg chất cặn bã trong 50ml
methanol. Hút 2ml dung dịch vừa pha cho vào bình định mức 50ml pha loãng đến
vạch định mức. Kiểm tra ở khoảng phổ 220-400nm. Dung dịch có độ hấp thụ cực
đại ở bước sóng 273nm.

7
Thử
Dung dịch S: hòa 1g chất thử trong 20ml methanol.
Dung dịch S phải trong suốt.
Độ hấp thu dung dịch S ở bước sóng 440nm không lớn hơn 0,1.
Những tạp chất liên quan: khảo sát bằng sắc ký lỏng

Dung dịch thử: hòa 25mg chất thử trong 50ml pha động.
Dung dịch đối chiếu (a): hòa 1ml dung dịch thử trong 100ml pha động.
Dung dịch đối chiếu (b): hòa 1ml dung dịch đối chiếu (a) trong 10ml pha
động.
Dung dịch đối chiếu (c): hòa 50mg chất cặn bã thu được ở định tính D (tạp
chất A) và 25 mg felodipin chuẩn trong 50ml pha động. Hút 1ml pha loãng thành
100ml trong pha động.
Quy trình sắc ký được tiến hành như sau:
• Cột sắc ký bằng thép không gỉ dài 0,125-0,15m, đường kính trong 4mm
được nhồi với octadecylsilyl silicagel kích thước hạt 5µm.
• Pha động: hỗn hợp methanol: acetonitril : dung dịch đệm phosphat pH=3
(0,8g/l H
3
PO
4
và 8g/l NaH
2
PO
4
) theo tỷ lệ 20:40:40.
• Phát hiện ở bước sóng 254nm.
• Bơm 20µl dung dịch đối chiếu (c). Điều chỉnh độ nhạy của hệ thống sao cho
chiều cao của 2 peak không nhỏ hơn 20% tổng chiều cao của sắc ký đồ. Sự
phân giải giữa peak thứ nhất (tạp chất A) và peak felodipin nhỏ nhất là 2,5.
Hai peak khác có thể quan sát được tương ứng với tạp chất B và tạp chất C.
Các chất rửa giải theo thứ tự: tạp A, tạp B, felodipin và tạp C.
• Bơm 20µl dung dịch thử, 20µl dung dịch đối chiếu (a) và 20µl dung dịch
đối chiếu (b), tiếp tục sắc ký lần thứ 2, thời gian lưu của felodipin là 12
phút.
8

• Trên sắc ký đồ của dung dịch thử: tổng diện tích của tạp B và C không lớn
hơn diện tích của peak đặc trưng trong sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (a)
(1.0%). Đối với mỗi tạp chất có diện tích peak không lớn hơn diện tích peak
đặc trưng trong sắc ký đồ ở dung dịch đối chiếu (b) (0.1%). Tổng diện tích
các peak tạp chất không lớn hơn 3 lần diện tích của peak đặc trưng trên sắc
ký đồ của dung dịch đối chiếu (b) (0.3%). Bỏ qua peak có diện tích nhỏ hơn
0,2 lần peak đặc trưng trong sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (b) (0.02%)
Mất khối lượng do sấy khô: khối lượng không giảm quá 0.5% xác định trên
1.000g chế phẩm đã sấy khô ở 105
o
C trong 3 giờ.
Tro sulphate: không lớn hơn 0.1% trên 1.0g chế phẩm
Định lượng: hòa tan 0.160g trong 25ml 2-methyl-2-propanol và 25ml dung
dịch percloric acid. Thêm 0.05ml ferroin. Chuẩn độ với ceri sulphat 0.1M cho đến
khi mất màu hồng.
Tạp chất
A. ethyl methyl 4-(2,3-dichlorophenyl)-2,6-dimethylpyridin-3,5-dicarboxylat.
.
B. R = CH
3
: dimethyl 4-(2,3-diclorophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-dihydropyridin-3,5-
dicarboxylat
9
C. R = C
2
H
5
: diethyl 4-(2,3-diclorophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-dihydropyridin-3,5-
dicarboxylat.
1.1.3. Các phương pháp tổng hợp felodipin

Felodipin là dẫn chất thuộc dãy hợp chất có khung cơ bản 1,4-
dihydropyridin(1,4-DHPs). Các dẫn chất thuộc dãy này ngày nay được xác định là
những thuốc quan trọng, chủ yếu trong điều trị đau thắt ngực và tăng huyết áp. Một
vài đại diện thuộc nhóm này như nifedipin, felodipin, nicardipin và amlodipin…
được đưa ra thị trường dược phẩm toàn thế giới. Các dẫn chất này được tổng hợp
chủ yếu theo 2 phương pháp sau:
1.1.3.1 Phương pháp Hantzsch
Phương pháp này được công bố lần đầu tiên bởi Arthur Hantzsch in 1882 sơ
đồ 1 [8].
Phản ứng tổng hợp đầu tiên các dẫn chất 1,4-dihydropyridin thông qua phản
ứng ngưng tụ đóng vòng từ 3 thành phần ester của acetoacetic, aldehyd và NH
3
.
COOR
CH
3
O
CHO
+
NH
3
N
H
COOR'ROOC
H
3
C CH
3
2eq
Sơ đồ 1.1. Phản ứng Hantzsch tổng hợp dẫn chất 1,4-dihydropyridin

Nhược điểm:
Phản ứng Hantzsch thường cho hiệu suất thấp, do vậy nhiều sự thay đổi bổ
sung để nâng cao hiệu suất cho phản ứng trên đã được nghiên cứu.
Chỉ thích hợp sử dụng để điều chế các dẫn chất có tính đối xứng (như
nifedipin)
1.1.3.2 Phương pháp Knoevenagel (1898) [8]
Phương pháp này bao gồm 2 giai đoạn:
10
Giai đoạn 1: ngưng tụ methyl acetoacetat với diclorobenzaldehyd thu được
sản phẩm trung gian benzyliden (I)
Giai đoạn 2: ngưng tụ (I) với ethyl-3-aminocrotonat tạo felodipin

CO OMe
CH
3
O
CHO
CH
3
O
CO OR
EtOO C
H
3
C NH
2
+
+
(I)
(I)

N
H
CO OEtMeOOC
H
3
C CH
3
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
Sơ đồ 1.2. Tổng hợp felodipin theo phương pháp Knoevenagel
Cơ chế
Phản ứng ngưng tụ của methyl acetoacetat với diclorobenzaldehyd thu
benzyliden xảy ra theo cơ chế ghép ái nhân:

H
3
C C
O
C
H
H
COOCH
3
OH
-
-

C
H
COCH
3
COOCH
3
+
Cl
Cl
C
O H
Cl
Cl
CH
-
O CH
COOCH
3
COCH
3
+H
2
O
Cl
Cl
CH
OH
CH
COOCH
3

COCH
3
H
+
T
o
C
Cl
Cl
HC
+
CH
COOCH
3
COCH
3
-H
+
Cl
Cl
HC
C
COOCH
3
COCH
3
Phản ứng ngưng tụ của benzyliden và ethyl-3-aminocrotonat tạo felodipin xảy ra
theo cơ chế:
11


RO R
O
OR'
H
2
N R '
OR ''
O
R OR''
O
R ' O
N
R '
H
H
O
O R'
+
R OR''
O
R ' O
N
R '
H
O
O R'
-
-
R OR''
O

R ' O
N
R '
H
O
O R'
-
R OR ''
O
R ' O
N
R '
H
O
O R'
-
N H
4
+
N H
3
R OR''
O
R ' R '
O
O R'
N
H
H O
-H

2
O
R OR''
O
R ' R '
O
O R'
N
R OR''
O
R ' R '
O
O R'
N
H
N H
3
N H
4
+
N H
3
N H
4
+
Ưu điểm
- Phương pháp dễ thực hiện
- Nguồn nguyên liệu ban đầu sẵn có
- Trang thiết bị và điều kiện phản ứng đơn giản nên quá trình triển khai sản
xuất lớn sau này là khả thi.

- Theo các tài liệu, hiệu suất có thể thay đổi từ 25-86% tùy theo các phương
pháp và điều kiện tiến hành phản ứng.
1.1.4. Cơ sở lựa chọn phương pháp tổng hợp felodipin
• Từ các tài liệu thu thập được, nhận thấy các nghiên cứu đa phần sử dụng
phương pháp Knoevenagel, trong đó phản ứng tổng hợp felodipin được tiến
hành qua 2 giai đoạn có thể không hoặc có tách sản phẩm trung gian M.B.I
(của giai đoạn 1). Trong đó, nhận thấy các quy trình tổng hợp theo kiểu
insitu thường cho hiệu suất thấp và nhiều sản phẩm phụ hơn, độ tinh khiết
12
của sản phẩm không cao (US Pat 6,858,747B2; 5,977,369)
• Ngoài ra, do sản phẩm hình thành sau giai đoạn 1 là M.B.I dưới dạng hỗn
hợp đồng phân E và Z (chỉ dạng E mới thích hợp điều chế felodipin) và dạng
E dễ kết tinh ở nhiệt độ thấp (khoảng 15
o
C) trong khi dạng Z khó kết tinh
nên việc tiến hành tách sản phẩm dạng E để thực hiện tiếp giai đoạn 2 khá
dễ. (US Pat 5,977,369)
⇒ Vì vậy, việc tổng hợp felodipin thường được tiến hành qua 2 giai đoạn và có
tinh chế sản phẩm trung gian.
Phản ứng tổng hợp felodipin bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, trong đó loại
xúc tác có ý nghĩa đặc biệt quan trọng.
• Xúc tác cho giai đoạn 1: Phản ứng ngưng tụ DCB và MAA có thể được xúc
tác bởi acid (acid acetic), bazơ (pyridin, piperidin), hoặc hỗn hợp của axit và
bazơ. Tuy nhiên, khi sử dụng một xúc tác thuần túy thì M.B.I có thể được
hình thành ở nhiệt độ thấp hơn nhưng phản ứng lại dễ cho sản phẩm phụ gây
khó khăn cho giai đoạn tinh chế (US Pat 0204604)

Cl
O
OO

O
O O
Cl
⇒Vì vậy, phản ứng thường sử dụng hệ xúc tác kết hợp tối ưu cân bằng tính
acid và bazơ, do có thể thu hiệu suất M.B.I cao và hạn chế các sản phẩm
phụ. Xúc tác sử dụng còn ảnh hưởng nhiều đến tỉ lệ đồng phân E/Z . Có
nhiều hệ xúc tác đã được nghiên cứu như acid acetic và piperidin (US Pat
4,600,778), cloroacetic acid và N-methylbenzylamin, picolinic acid và
piperidin (US Pat 6,858,747B2)…
• Xúc tác cho giai đoạn 2: Phản ứng cộng vòng của DCB và EAC có thể được
xúc tác bởi bazơ, axit, hệ acid-bazơ hoặc cũng có thể không cần dùng xúc
13
tác. Trong đó:
- Với xúc tác axit (thường dùng HCl): thời gian phản ứng nhanh (dưới 1 giờ)
nhưng phản ứng lại có quy trình tổng hợp phức tạp, chế độ làm lạnh dài
(hơn 1 tuần), hiệu suất thu được không cao và nhiều tạp chất (US Pat
5,310,917), gây khó khăn cho việc tách chiết.
- Với phản ứng nhiệt cộng vòng: Phản ứng cộng vòng này không cần dùng
xúc tác nhưng thời gian phản ứng lâu (12 giờ) (US Pat 6,858,747B2) hoặc
24 giờ (US Pat 4,600,778) nhưng hiệu suất felodipin thu được không cao.
- Với xúc tác bazơ: Phản ứng có quy trình đơn giản, việc tinh chế sản phẩm
dễ dàng và hiệu suất thu được tương đối cao (khoảng 85%)
⇒ Vì vậy, việc tổng hợp felodipin sẽ được tiến hành qua 2 giai đoạn với xúc tác
giai đoạn một là hệ acid acetic-piperidin và xúc tác giai đoạn 2 là một bazơ như
pyridin
1.2 SƠ LƯỢC VỀ CÁC PHẦN MỀM MÁY TÍNH ĐƯỢC SỬ DỤNG
TRONG ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU
1.2.1 Phần mềm JMP 4.0
Việc sử dụng các phương pháp thống kê trong công nghiệp ngày càng gia
tăng. Trong đó, thiết kế thống kê các thử nghiệm là một phương pháp hữu hiệu giúp

cải thiện hiệu suất. Nghiên cứu thử bằng cách làm sai một vài yếu tố ảnh hưởng đến
hiệu suất thì rất tốn kém về thời gian và tiền của. Nhờ những nghiên cứu trong lĩnh
vực “bố trí thí nghiệm” đã cho thấy có tiềm lực mạnh và là một phương pháp
nghiên cứu nhanh, hiệu quả. JMP là một phần mềm của SAS Institue Inc. giúp thiết
kế các bố trí thí nghiệm với nhiều mô hình khác nhau nhằm mục đích có thể tìm ra
hoặc dự đoán được những điều kiện tối ưu để thực hiện phản ứng mà không phải
mất thời gian tiến hành nhiều phản ứng. Hơn nữa, JMP còn cho phép phân tích dữ
liệu với những thuật toán về xác suất thống kê, đưa ra những minh họa cụ thể bằng
hình ảnh (đồ thị, biểu đồ…), cung cấp nhiều công cụ để xử lý số liệu [1].
Mỗi loại mô hình thiết kế của JMP có những tính năng và mục đích khác
nhau, trong đó thiết kế theo phương pháp đáp ứng bề mặt (Respones Surface
14
Methodology) cho phép tối ưu hóa thông số đáp ứng khi đã xác định các khoảng giá
trị sẽ khảo sát cho từng yếu tố.
Thiết kế đáp ứng bề mặt rất hữu dụng cho mô hình mặt cong (phương trình
bậc 2) với các yếu tố liên tục. Nếu một đáp ứng tối thiểu hay tối đa tồn tại bên trong
miền yếu tố thì mô hình đáp ứng bề mặt có thể xác định được điểm tối thiểu hay tối
đa đó [1]. Với phương pháp đáp ứng bề mặt có thể lựa chọn mô hình Central
Composite Design hay mô hình Box-Benhken. Một trong các điểm khác biệt quan
trọng giữa 2 loại thiết kế này là thiết kế Box-Behnken không có điểm đỉnh trên hình
khối mà chỉ là dãy các yếu tố. Điều này đôi khi có lợi trong trường hợp cần tránh
các điểm mà cần cân nhắc các điều kiện kỹ thuật. Vào năm 1960, Box và Behnken
đã thiết kế mô hình thí nghiệm cho 3 yếu tố, trong đó mỗi yếu tố đều có 3 mức -1,
0, +1 ứng với mức thấp, mức trung bình, mức cao của một yếu tố thực. Với 3 yếu tố
khảo sát này, số thí nghiệm tối thiểu cần phải tiến hành là 15 thí nghiệm, trong đó
có 12 thí nghiệm được đặt giữa các cạnh của khối lập phương (12 cạnh) và 3 thí
nghiệm nằm ở tâm của khối lập phương. Với sự bố trí này thì khoảng cách từ các
điểm thí nghiệm tới tâm phương án đều bằng nhau, hay nói cách khác là các điểm
thí nghiệm nằm trên một hình cầu.
Hình 1.1: Bố trí thí nghiệm theo mô hình Box-Benhken

15
1.2.2. Phần mềm Matlab R2010b [4], [6]
Matlab (Matrix Laboratory) là một môi trường tính toán số và lập trình, được
thiết kế bởi công ty MathWorks, cho phép tính toán số với ma trận, vẽ đồ thị hàm số
hay biểu đồ thông tin, thực hiện thuật toán, tạo các giao diện người dùng và liên kết
với những chương trình máy tính viết trên nhiều ngôn ngữ lập trình khác .
Matlab, nguyên sơ được viết bởi ngôn ngữ Fortran. Đến năm 1983, Jack
Little đã viết lại Matlab bằng ngôn ngữ C và được xây dựng thêm các thư viện phục
vụ cho thiết kế hệ thống điều khiển, hệ thống hộp công cụ (tool box), mô phỏng…
Từ đó, Matlab trở thành mô hình ngôn ngữ lập trình trên cơ sở ma trận. Như vậy,
Matlab không chỉ là một phần mềm mà còn là một ngôn ngữ lập trình, cho phép
thực hiện các giải thuật, giao tiếp đồ họa dễ dàng. Theo đó, các mã nguồn được viết
bằng ngôn ngữ matlab có thể chạy được ngay trên máy tính mà không cần phải biên
dịch qua các tập tin thi hành.
Như vậy, trong đề tài nghiên cứu này sẽ sử dụng Matlab như là một công cụ
dùng để thiết lập chương trình xử lý hình ảnh giúp tính toán diện tích vết sắc ký đồ.
Theo đó vết sắc ký sẽ được tính toán diện tích với đơn vị đo lường là pixel ảnh.
Một số khái niệm về kiểu ảnh trong Matlab
Ảnh grayscale: Mỗi ảnh được biểu diễn bởi một ma trận hai chiều, trong đó
giá trị của mỗi phần tử cho biết độ sáng (hay mức xám) của điểm ảnh đó và có thể
trình bày theo 2 kiểu:
Kiểu double: mỗi phần tử có giá trị trong khoảng từ 0 – 1. Mức 0 tương ứng
với màu đen, mức 1 tương ứng với màu trắng.
Kiểu uint8: Mỗi phần tử được biểu diễn dưới dạng là một số nguyên nằm
trong khoảng từ 0 đến 255, với mức 0 biểu diễn cho mức cường độ đen nhất và 255
biểu diễn cho mức cường độ sáng nhất.
Ảnh nhị phân: Ảnh được biểu diễn bởi một ma trận hai chiều thuộc kiểu
logical. Mỗi điểm ảnh chỉ có thể nhận một trong hai giá trị là 0 (đen) hoặc 1 (trắng).
Ảnh màu RGB: Còn gọi là ảnh “truecolor” do tính trung thực của nó. Ảnh
này được biểu diễn bởi một ma trận ba chiều kích thước m x n x 3, với m x n là kích

thước ảnh theo pixels. Các số tại mỗi phần tử của ma trận biểu diễn cho ba màu
riêng rẽ gồm: đỏ (red), lục (green) và lam (blue).
16
CHƯƠNG II
THỰC NGHIỆM
17
CHƯƠNG II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.1. HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
2.1.1. Hóa chất
Bảng 2.1: Các hóa chất được sử dụng
Tên hóa chất Hàm lượng (%) Xuất xứ
2,3 – diclorobenzaldehyd 99,0 Acros Organics
Methyl acetoacetat Acros Organics
Ethyl-3-aminocrotonat 98,5 Acros Organics
Acid acetic 99,5 AR
Piperidin 98,0 Merck
Pyridin Trung Quốc
Isopropyl ancol 99,5 Trung Quốc
Ethanol 99,5 Trung Quốc
Bản sắc lý lớp mỏng tráng
sẵn Kieselgel 60F 254
Merck
n-hexan Trung Quốc
Aceton Trung Quốc
Ethyl acetat Trung Quốc
Xyclohexan Prolabo
2.1.2. Trang thiết bị
Cân phân tích Sartorius 224S
Bộ phản ứng 4 chỗ Eyela/Tokyo Rikakikai
Thiết bị làm lạnh sinh hàn Eyela PFR 1000

Máy cô quay Buchi
Micropipette thể tích 10-100µl
18
Pipet chính xác 1ml
Máy hút chân không, phễu Buchner
Buồng soi UV Vilber Lourmat
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Thiết lập chương trình xử lý hình ảnh tính toán diện tích vết sắc ký sử
dụng ngôn ngữ Matlab
Nguyên tắc:
Hình ảnh được cấu tạo từ rất nhiều các điểm nhỏ gọi là điểm ảnh hay pixel,
điểm ảnh được xem như là dấu hiệu hay cường độ sáng tại một tọa độ trong không
gian của đối tượng.
Trước tiên ảnh màu (RGB) sẽ được chuyển đổi thành ảnh xám (mỗi điểm
ảnh sẽ được loại bỏ các thông tin về màu và giữ lại những thông tin về độ sáng) và
mang giá trị trong khoảng 0 – 1. Những điểm ảnh có sự thay đổi nhanh hoặc đột
ngột về mức xám sẽ được xác định là những điểm biên giữa vật thể và môi trường.
Ảnh xám (grayscale) này được tiếp tục chuyển đổi thành ảnh nhị phân (trắng
đen) với hệ số mức chuyển đổi X thích hợp: các điểm ảnh mang giá trị lớn hơn hệ
số X sẽ nhận giá trị 1 và trở thành màu trắng và các điểm ảnh mang giá trị nhỏ hơn
hệ số X sẽ nhận giá trị 0 và trở thành màu đen.
Từ hình trắng đen, ta coi hình ảnh như là một ma trận với nhiều hàng và cột,
sử dụng hàm nghịch đảo để chuyển giá trị 0 thành 1 và 1 thành 0, theo đó tính tổng
ma trận thì sẽ thu được tổng giá trị các điểm ảnh màu đen chính là diện tích pixel
của vật thể khảo sát.
Một số hàm được sử dụng để thiết lập chương trình xử lý ảnh:
I = rgb2gray ( ) : chuyển hình màu thành hình xám.
Im2bw (I, level) : chuyển đổi hình xám sang hình trắng đen tùy thuộc vào hệ
số mức chuyển đổi lựa chọn.
Imread ( ) : đọc hình ảnh.

19
Imshow ( ) : trình xuất hình ảnh.
[r_X c_X] : xây dựng ma trận với hàng và cột.
Sum ( ) : tính tổng giá trị.
Num2str ( ) : chuyển dữ liệu dạng số sang dạng chuỗi.
Figure ( ): tạo một cửa sổ mới cho trình xuất.
2.2.2. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng M.B.I và felodipin có
trong hỗn hợp sau phản ứng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng [3] [6]
2.2.2.1. Khảo sát độ lặp lại
Khảo sát sự ổn định kết quả bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng đối với dung
dịch chuẩn và dung dịch thử bằng cách tiến hành sắc ký lớp mỏng cho cả mẫu
chuẩn và mẫu thử để so sánh diện tích của vết sắc ký. Đối với mỗi dung dịch chấm
3 vết lên bản mỏng, triển khai sắc ký ghi nhận hình ảnh ở bước sóng 254nm và tính
diện tích của vết sắc ký thu được.
a) M.B.I
Hệ dung môi triển khai là n-hexan – aceton (10:1)
Dung dịch chuẩn: cân chính xác 10mg mẫu chuẩn hòa tan trong 1ml
isopropyl ancol.
Dung dịch thử: dung dịch sau phản ứng hút lấy 10µl pha vừa đủ 200µl dung
dịch.
b) Felodipin
Hệ dung môi khai triển cyclohexan – ethyl acetat (6:4)
Dung dịch chuẩn: cân chính xác 10mg mẫu chuẩn hòa tan trong 1ml etanol
tuyệt đối.
Dung dịch thử: dung dịch sau phản ứng pha vừa đủ 10ml.
2.2.2.2. Khảo sát tính tuyến tính
a) M.B.I
Xây dựng đường hồi quy tuyến tính diện tích vết của mẫu chuẩn M.B.I theo
nồng độ từ 0.0133g/ml đến 0.004g/ml bằng cách cân 6 mẫu chuẩn có khối lượng
20

chính xác lần lượt là 0.0133g, 0.012g, 0.01g, 0.008g, 0.006g, 0.004g, sau đó dùng
micropipet hút chính xác 1ml isopropyl ancol cho lần lượt vào hòa tan các mẫu trên
rồi triển khai sắc ký lớp mỏng để xác định diện tích vết sắc ký thu được.
b) Felodipin
Xây dựng đường hồi quy tuyến tính diện tích vết của mẫu chuẩn M.B.I theo nồng
độ từ 0.0192g/ml đến 0.008g/ml bằng cách cân 6 mẫu chuẩn có khối lượng chính
xác lần lượt là 0.0192g, 0.018g, 0.016g, 0.014g, 0.012g, 0.01g, 0.008g, sau đó dùng
micropipet hút chính xác 1ml etanol tuyệt đối cho lần lượt vào hòa tan các mẫu trên
rồi triển khai sắc ký lớp mỏng để xác định diện tích vết sắc ký thu được.
2.2.2.3 Khảo sát độ đúng
Độ đúng là mức độ sát gần của giá trị tìm thấy so với giá trị thực. Độ đúng
được tiến hành bằng mẫu thử thêm chuẩn đối chiếu. Tiến hành sắc ký lớp mỏng cho
dung dịch thử và dung dịch thử thêm chuẩn đối chiếu:
- Với M.B.I :mẫu thử thêm 1mg và 2mg chuẩn đối chiếu.
- Với felodipin: mẫu thử thêm 0.5mg, 1mg và 2mg chuẩn đối chiếu.
Ghi nhận hình ảnh và tính diện tích của vết sắc ký thu được.
2.2.3 Xác định và giới hạn khoảng khảo sát của các yếu tố ảnh hưởng đến
phản ứng tổng hợp M.B.I từ 2,3-dichlorobenzaldehyd và methyl
acetoacetat
Có rất nhiều các tác nhân ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng của giai đoạn
này như: nhiệt độ, tỉ lệ mol các chất tham gia phản ứng, thời gian, tỉ lệ chất xúc tác
so với nguyên liệu ban đầu, hệ xúc tác…Do điều kiện phòng thí nghiệm chưa có
nhiều loại xúc tác khác nhau nên không khảo sát được nhiều hệ xúc tác mà sử dụng
hệ xúc tác cho giai đoạn này là piperidin và acid acetic.
2.2.3.1 Nhiệt độ phản ứng
Nhiệt độ phản ứng thấp cho hiệu suất thấp và thời gian phản ứng kéo dài
không hiệu quả về mặt kinh tế. Tuy nhiên nhiệt độ cao có thể tạo các sản phẩm phụ
và ảnh hưởng đến tỷ lệ đồng phân E và Z trong khi đó chỉ có dạng đồng phân E mới
21
thích hợp để điều chế felodipin đạt chuẩn dược dụng. Theo US Pat 6,858,747 B2

cho rằng phản ứng có thể tiến hành ở nhiệt độ khoảng từ 30-60
o
C. Vì thế, nghiên
cứu này sẽ tiến hành khảo sát ở nhiệt độ 30-70
o
C.
Tiến hành phản ứng: cân 0,175g (1mmol) 2,3-diclorobenzaldehyd và 0,116g
(1mmol) methyl acetoacetat cho vào bình cầu dung tích 25ml, thêm vào 1ml
isopropyl ancol, tỷ lệ xúc tác của hệ piperidin và acid acetic so với 2,3-
diclorobenzaldehyd là 1:10, thời gian thực hiện phản ứng là 4 giờ, các phản ứng này
được thực hiện ở những nhiệt độ khác nhau nằm trong khoảng 30-70
o
C.
2.2.3.2 Tỉ lệ mol các chất tham gia phản ứng
Tỉ lệ mol tác chất có ảnh hưởng rất lớn đến việc hình thành sản phẩm phụ và
tỉ lệ mol giữa 2,3-diclorobenzaldehyd và methyl acetoacetat có thể 0,5-2 (US Pat
5,977,369). Trong nghiên cứu này sẽ tiến hành khảo sát tỉ lệ mol giữa 2,3-
diclorobenzaldehyd và methyl acetoacetat từ 1:0,8-1:1,3.
Tiến hành phản ứng: cân 0,175g (1mmol) 2,3-diclorobenzaldehyd và lượng
methyl acetoacetat thay đổi theo tỉ lệ từ 0,8-1,3 so với 2,3-diclorobenzaldehyd rồi
cho vào bình cầu dung tích 25ml,và thêm vào 1ml isopropyl ancol, tỷ lệ xúc tác của
hệ piperidin và acid acetic so với 2,3-diclorobenzaldehyd là 1:10, nhiệt độ phản ứng
là 60
o
C, thời gian thực hiện phản ứng là 4 giờ.
2.2.3.3 Thời gian phản ứng
Thời gian phản ứng ngắn cho hiệu suất thấp nhưng thời gian phản ứng kéo
dài thì không hiệu quả về mặt kinh tế và cho nhiều sản phẩm phụ. Đối với giai đoạn
1 thì thời gian phản ứng có thể kéo dài từ 3-18 giờ (US Pat 5,977,369), nghiên cứu
thực hiện khảo sát thời gian từ 4-10 giờ.

Tiến hành phản ứng: cân 0,175g (1mmol) 2,3-diclorobenzaldehyd và 0,116g
(1mmol) methylacetoacetat cho vào bình cầu dung tích 25ml, thêm vào 1ml
isopropyl ancol, tỷ lệ xúc tác của hệ piperidin và acid acetic so với 2,3-
diclorobenzaldehyd là 1:10, ở nhiệt độ phản ứng là 60
o
C, các phản ứng này được
thực hiện ở những khoảng thời gian 4, 6, 8, và 10 giờ.
22
Tất cả các phản ứng trên đều được thực hiện trong bình phản ứng 4 chỗ có
gắn hệ thống sinh hàn và cài đặt tốc độ khuấy 185 vòng/phút. Để đánh giá phản
ứng, tất cả các hỗn hợp sau phản ứng được lấy ra 10µl bằng micropipet và pha thêm
isopropyl ancol sao cho thể tích dung dịch là 200µl, chấm sắc ký bằng ống mao
quản 5µl, tiến hành chạy sắc ký lớp mỏng. Kết quả hình ảnh của bảng sắc ký sẽ
được xử lý bằng phần mềm matlab để tính toán diện tích của vết M.B.I tạo thành.
Từ đường chuẩn vết M.B.I đã xây dựng có thể suy ra nồng độ hàm lượng M.B.I của
mẫu thử và tính toán sơ bộ hiệu suất của phản ứng.
Dựa trên thông số hiệu suất phản ứng và tỉ lệ tạp chất tạo thành ở các điều
kiện thăm dò, tiến hành giới hạn khoảng khảo sát của các yếu tố ảnh hưởng. Ở mỗi
yếu tố, mức giới hạn có thể giữ nguyên hoặc thay đổi so với điều kiện phản ứng
trong các tài liệu tham khảo sao cho hiệu suất sản phẩm tạo thành cao, tỉ lệ tạp chất
ít.
2.2.4 Xác định và giới hạn khoảng khảo sát của các yếu tố ảnh hưởng đến
phản ứng tổng hợp felodipin từ M.B.I và ethyl-3-aminocrotonat.
Có rất nhiều các tác nhân ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng của giai đoạn
này như: nhiệt độ, tỉ lệ mol các chất tham gia phản ứng, thời gian, tỉ lệ chất xúc tác
so với nguyên liệu ban đầu,…Xúc tác sử dụng trong phản ứng này là pyridin và
không khảo sát tỉ lệ mol xúc tác so với nguyên liệu ban đầu mà sử dụng xúc tác với
tỉ lệ 1:10 so với nguyên liệu ban đầu cho tất cả các phản ứng.
2.2.4.1 Nhiệt độ phản ứng
Nhiệt độ phản ứng thấp cho hiệu suất thấp, tuy nhiên nhiệt độ cao có thể tạo

nhiều sản phẩm phụ gây khó khăn cho quá trình tinh chế, vì vậy cần phải khảo sát
phản ứng ở khoảng nhiệt độ thích hợp sao cho hiệu suất phản ứng cao và sản phẩm
23
phụ ít. Theo US Pat 5,310,917 cho rằng phản ứng có thể tiến hành ở nhiệt độ
khoảng từ 50-140
o
C. Nghiên cứu này sẽ tiến hành khảo sát ở nhiệt độ 40-90
o
C.
Tiến hành phản ứng: cân 0,1365g (0.5mmol) M.B.I và 0,0646g (0.5mmol)
ethyl-3-aminocrotonat cho vào bình cầu dung tích 25ml, thêm vào 1ml etanol, tỷ lệ
xúc tác của pyridin so với M.B.I là 1:10, thời gian thực hiện phản ứng là 4 giờ, các
phản ứng này được thực hiện ở những nhiệt độ khác nhau nằm trong khoảng 40-
90
o
C trong bình phản ứng 4 chỗ có gắn hệ thống sinh hàn.
2.2.4.2 Tỉ lệ mol các chất tham gia phản ứng
Tỉ lệ mol tác chất có ảnh hưởng rất lớn trong giai đoạn này vì liên quan đến
việc hình thành sản phẩm phụ khi lượng ethyl-3-aminocrotonat tăng lên. Theo US.
Pat. 6,858,747 B2 thì tỉ lệ mol ethyl-3-aminocrotonat có thể từ 0.8 đến 2 so với tỉ lệ
mol M.B.I. Trong nghiên cứu này sẽ tiến hành khảo sát tỉ lệ mol giữa M.B.I và
ethyl-3-aminocrotonat từ 1:0,8-1:1,3.
Tiến hành phản ứng: cân 0,1365g (0.5mmol) M.B.I và lượng ethyl-3-
aminocrotonat thay đổi theo tỉ lệ từ 0,8-1,3 so với M.B.I rồi cho vào bình cầu dung
tích 25ml, thêm vào 1ml etanol, tỷ lệ xúc tác của pyridin so với M.B.I là 1:10, nhiệt
độ phản ứng là 80
o
C, thời gian thực hiện phản ứng là 4 giờ trong bình phản ứng 4
chỗ có gắn hệ thống sinh hàn.
2.2.4.3 Thời gian phản ứng

Thời gian phản ứng ngắn cho hiệu suất thấp nhưng thời gian phản ứng kéo
dài thì không hiệu quả về mặt kinh tế và cho nhiều sản phẩm phụ. Đối với giai đoạn
2 thì thời gian phản ứng có thể kéo dài từ 8-30 giờ (US Pat 6,858,747 B2), nghiên
cứu thực hiện khảo sát thời gian từ 4-10 giờ.
Tiến hành phản ứng: cân 0,1365g (0.5mmol) M.B.I và 0,0646g (0.5mmol)
ethyl-3-aminocrotonat cho vào bình cầu dung tích 25ml, thêm vào 1ml etanol, tỷ lệ
xúc tác của pyridin so với M.B.I là 1:10, ở nhiệt độ phản ứng là 80
o
C, các phản ứng
này được thực hiện ở những khoảng thời gian 4, 6, 8, và 10 giờ.
Tất cả các phản ứng trên đều được thực hiện trong bình phản ứng 4 chỗ cài
đặt tốc độ khuấy 185 vòng/phút. Để đánh giá phản ứng, tất cả các hỗn hợp sau phản
ứng được định mức bằng etanol tuyệt đối đến 10ml, sau đó tiến hành sắc ký lớp
24
mỏng. Kết quả hình ảnh của bản sắc ký sẽ được xử lý bằng phần mềm matlab để
tính toán diện tích của vết felodipin tạo thành. Từ đường chuẩn vết felodipin đã xây
dựng có thể suy ra nồng độ hàm lượng felodipin của mẫu thử và tính toán sơ bộ
hiệu suất của phản ứng.
Dựa trên thông số hiệu suất phản ứng và tỉ lệ tạp chất tạo thành ở các điều
kiện thăm dò, tiến hành giới hạn khoảng của các yếu tố ảnh hưởng: nhiệt độ, tỉ lệ
mol, thời gian phản ứng. Ở mỗi yếu tố, mức giới hạn có thể giữ nguyên hoặc thay
đổi so với điều kiện phản ứng trong các tài liệu tham khảo sao cho hiệu suất sản
phẩm tạo thành cao, tỉ lệ tạp chất ít và hiệu quả về kinh tế.
2.2.5 Bố trí thí nghiệm và xác định các thông số tối ưu bằng cách sử dụng
phần mềm JMP
Sau khi xác định sơ bộ hiệu suất phản ứng ở các điều kiện thăm dò và giới
hạn khoảng khảo sát của các yếu tố ảnh hưởng, để tìm ra được thông số phản ứng
mà hiệu suất sản phẩm tạo thành cao nhất cần tiến hành bố trí thí nghiệm theo
phương pháp đáp ứng bề mặt với các mức đã giới hạn, từ đó xây dựng được phương
trình bề mặt đáp ứng của các yếu tố ảnh hưởng lên hiệu suất phản ứng.

Bố trí thí nghiệm theo mô hình Box-Benhken được thiết lập trong phần mềm
JMP với tổng số thí nghiệm là 15. Theo đó, các yếu tố khảo sát sẽ được mã hóa
trong hệ tọa độ không thứ nguyên với tọa độ của mức cơ sở bằng 0, trùng với gốc
hệ trục tọa độ. Các yếu tố mã hóa sẽ nhận 2 giá trị -1 và +1 tương ứng với mức trên
và mức dưới của mức cơ sở (Bảng 2.2.).
Bảng 2.2. Mã hóa các yếu tố ảnh hưởng
Yếu tố
Các mức
Mức dưới -1 Mức cơ sở 0 Mức trên+1
X
1
Nhiệt độ phản ứng (°C)
T t
0
T
X
2
Tỉ lệ mol các chất phản ứng M m
0
M
X
3
Thời gian phản ứng (giờ) H h
0
H
25