BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



NGUYỄN THỊ HẢI YẾN


TỔNG QUAN VỀ ỨNG DỤNG SINH
HỌC PHÂN TỬ TRONG NHẬN DIỆN
THẢO DƯỢC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ





HÀ NỘI - 2013


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



NGUYỄN THỊ HẢI YẾN

TỔNG QUAN VỀ ỨNG DỤNG SINH
HỌC PHÂN TỬ TRONG NHẬN DIỆN
THẢO DƯỢC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
TS. Phùng Thanh Hương
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa sinh




HÀ NỘI – 2013


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được sự
giúp đỡ và hướng dẫn quý báu của các thầy cô, gia đình và bạn bè. Với lòng
kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin được gửi lời cảm ơn tới:
- Ban giám hiệu, các thầy, cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình
dạy dỗ và tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa học này.
- Các thầy, cô trong bộ môn Hóa sinh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
hoàn thành khóa luận.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Tiến sĩ Phùng Thanh Hương –
người thầy kính mến đã hết lòng giúp đỡ, dạy bảo, động viên và tạo mọi điều
kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình đã luôn bên cạnh động viên
và ủng hộ tôi trong suốt khóa học.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong thời
gian qua.
Tôi xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày 7 tháng 5 năm 2013
Tác giả
Nguyễn Thị Hải Yến



MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH
ĐẶT VẤN ĐỀ….………………………………………………………………… 1
Chương 1. Tổng quan về hiện trạng nghiên cứu và thực hành
nhận diện thảo dược…………………………………………………………… … 3
1.1. Sự cần thiết của việc nhận diện thảo dược……………………………… ……3
1.2. Các phương pháp thường được sử dụng trong nhận diện thảo dược…… …….4
1.2.1. Phương pháp hình thái…………………………………………………… 4
1.2.2. Phương pháp vi học………………………………………………… ……5
1.2.3. Phương pháp phân tích hóa học…………………………………………….6
Chương 2. Các kĩ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong
nhận diện thảo dược……………………………… ……………………………… 9
2.1. Các marker dựa trên phản ứng khuếch đại chuỗi (PCR)……………….….……9
2.1.1. Kĩ thuật PCR sử dụng các mồi ngẫu nhiên (RP-PCR)……… ……… ….10
2.1.2. Kĩ thuật sự đa hình chiều dài của các đoạn ADN
có thể khuếch đại trực tiếp (DALP)… ………………………………… 13
2.1.3. Kĩ thuật sự đa hình chiều dài các đoạn được khuếch đại (AFLP)…… …14
2.1.4. Kĩ thuật sự đa hình các trình tự khuếch đại được phân cắt (CAPS)………18

2.1.5. Kĩ thuật phân tích các trình tự lặp đơn giản (SSR)…………………… …20
2.1.6. Kĩ thuật sự đa hình trình tự giữa các vùng lặp (ISSR)…………………….22
2.1.7. Kĩ thuật khuếch đại trực tiếp vùng ADN tiểu vệ tinh (DAMD)………… 25
2.1.8. Kĩ thuật khuếch đại vùng đặc trưng (SCAR)………………………… …27
2.1.9. Kĩ thuật sự đa hình hình dạng sợi đơn (SSCP)………………………… 31
2.1.10. Kĩ thuật khuếch đại hệ thống đột biến bền vững (ARMS)
và multiplex-ARMS (MARMS)………………………………………………….33


2.2. Các marker thu được bằng phương pháp giải trình tự ADN………………… 38
2.2.1 Vùng phiên mã nội (ITS)………………………………………….………40
2.2.2. Vùng trnH – psbA…………………………………………………………42
2.2.3. Maturase K (matK)………………………………… ……………………43
2.2.4. Tiểu đơn vị lớn của ribulose-biphosphat carboxylase (vùng rbcL)……….44
2.2.5. Các trình tự ADN khác dùng trong nhận diện thảo dược…………………45
2.3. Phương pháp ADN microarray………………………………… ……… … 47
2.3.1. Kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò là các oligonucleotid………… …47
2.3.2. Kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò là gen…………… …………… …49
Chương 3. Bàn luận………………………………………………………… ……51
3.1. Đánh giá về các phương pháp nhận diện thảo dược sử dụng
công cụ sinh học phân tử………………………………………………… ….51
3.2. Đánh giá thực tế việc nhận diện thảo dược ở Việt Nam……………………….56
KẾT LUẬN………………………………………………………………… ……59
ĐỀ XUẤT…………………………………………… ………………………… 59







DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH
B
ả
ng

Tên

Trang

1 Trình tự mồi SCAR dùng cho phản ứng khuếch đại PCR 29

2 So sánh một số kĩ thuật khác nhau sử dụng công cụ sinh học
phân tử để nhận diện thảo dược
55

Hình



1 Nguyên tắc của kĩ thuật sự đa hình các đoạn ADN được khuếch
đại ngẫu nhiên – RAPD
11

2 Nghiên cứu RAPD với các loài S. angustifolia, S. acutifolia,
S. sophera, S. tora
12

3 Nguyên tắc của kĩ thuật AFLP 16

4 Nguyên tắc của kĩ thuật CAPS 18


5 Nghiên cứu CAPS trên các sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1,
ITS5 và được cắt bằng enzym giới hạn EaeI
19

6 Nguyên tắc của kĩ thuật phân tích các trình tự lặp lại đơn giản
SSR
21

7 Nguyên tắc của kĩ thuật ISSR – PCR 23

8

D
ấ
u vân tay ISSR c
ủ
a
R. palmatum, R. officinale

và
R.
tanguticum sử dụng mồi UBC-811
24

9 Trình tự của tiểu vệ tinh Pge2 26

10 Nguyên tắc của kĩ thuật SCAR (sử dụng mồi SCAR đặc hiệu 27




từ marker RAPD)
11 Trình tự của đoạn ADN đặc trưng cho loài Panax
notoginseng
28

12 Nguyên tắc của kĩ thuật SSCP 32

13

Sơ đ
ồ

vùng ITS và v
ị

trí các m
ồ
i đư
ợ
c s
ử

d
ụ
ng

34

14 Sản phẩm thu được sau phản ứng khuếch đại đặc trưng allel

của năm loài thuộc chi Citrus
35

15 Mồi đặc hiệu được thiết kế dựa vào sự khác nhau về trình tự
gen matK giữa năm loài thuộc chi Panax
36

16 Mồi đặc hiệu được thiết kế dựa vào sự khác nhau về trình tự
gen 18S rADN giữa năm loài thuộc chi Panax
37

17 Đơn vị lặp lại 18S – 26S của ADN ribosom 41

18 Nguyên tắc của kĩ thuật microarray với mẫu dò là
oligonucleotid hoặc gen để nhận diện thảo dược
48





DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt
A Adenine
ADN 2’- deoxyribonucleic acid Axít 2’- deoxyribonucleic
AFLP Amplified fragment length
polyphorphism
Kĩ thuật sự đa hình chiều dài
các đoạn được khuếch đại
AP-PCR Arbitrarily primed- Polymerase

chain reaction
Kĩ thuật PCR với mồi tùy
chọn
ARMS Amplification refractory mutation
system
Kĩ thuật khuếch đại hệ thống
đột biến bền vững
AS-PCR Allele specific - Polymerase chain
reaction
Kĩ thuật khuếch đại đặc trưng
cho allel
ATP-P
33
Adenosine triphosphate -
phosphorus
33


BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò
C Cytosine
CAPS Cleaved amplified polymorphism
sequence
Kĩ thuật sự đa hình các trình
tự khuếch đại được phân cắt
CTAB Cetyltrimethylammonium bromide
DAF DNA amplification fingerprinting Kĩ thuật vân tay khuếch đại
ADN
DALP Direct amplification of length
polymorphisms
Kĩ thuật sự đa hình chiều dài

của các đoạn ADN có thể


khuếch đại trực tiếp
DAMD Directed amplification of
minisatellite - region DNA
Kĩ thuật khuếch đại trực tiếp
vùng ADN tiểu vệ tinh
G Guanine
IR Infrared Vùng hồng ngoại
ISSR Inter-simple sequence repeat
polymorphism
Kĩ thuật sự đa hình trình tự
giữa các vùng lặp
ITS Internal trancribed spacer Vùng phiên mã nội
MARMS

Multiplex amplification refractory
mutation system

matK Maturase K
PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại chuỗi
rADN DNA ribosome ADN ribosom
RAPD Random amplified polymorphic
DNA
Kĩ thuật sự đa hình các đoạn
ADN được khuếch đại ngẫu
nhiên
rbcL Ribulose-bisphosphat carboxylase
RFLP Restriction fragment length

polymorphism
Kĩ thuật sự đa hình chiều dài
các đoạn giới hạn
RP-PCR Random primed - Polymerase chain
reaction
Kĩ thuật PCR dùng mồi ngẫu
nhiên
SCAR Sequence characterized amplified Kĩ thuật khuếch đại vùng đặc





regions trưng
SNP Single-nucleotide polymorphism Sự đa hình đơn nucleotid
SSCP Single strand conformation
polymorphism
Sự đa hình hình dạng sợi đơn
SSR Simple sequence repeats Các trình tự lặp đơn giản
T Thymine
UV Ultraviolet Vùng tử ngoại
WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ thời cổ đại, con người đã biết sử dụng thảo dược để chữa bệnh. Trong vài
thập kỉ gần đây, mặc dù thuốc có nguồn gốc hóa dược được ưa chuộng do có nhiều
ưu điểm, thuốc có nguồn gốc từ thảo dược vẫn có những đóng góp quan trọng trong
lĩnh vực chăm sóc sức khỏe con người. Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới
(WHO), có đến 80% dân số thế giới sử dụng thảo dược để chăm sóc sức khỏe, đặc

biệt là ở các nước đang phát triển [44]. Xu hướng sử dụng các thuốc này hiện nay
ngày càng phát triển. Thị phần thảo dược của toàn thế giới đạt khoảng 60 tỉ đôla
mỗi năm và con số này không ngừng tăng lên với tỉ lệ tăng 6,4% / năm [53]. Tuy
nhiên, bên cạnh sự tăng lên về nhu cầu sử dụng thảo dược, một vấn đề nghiêm trọng
xuất hiện trên thị trường dược phẩm là sự nhầm lẫn, giả mạo các vị thuốc một cách
vô tình hoặc do cố ý. Việc sử dụng các thảo dược giả mạo có thể dẫn đến làm mất
tác dụng điều trị và gây những hậu quả không mong muốn nghiêm trọng, thậm chí
là tử vong. Do đó, việc nhận diện chính xác cây thuốc, vị thuốc là một bước quan
trọng để đảm bảo hiệu quả điều trị. Các thảo dược giả mạo có thể là các loài họ
hàng gần của cây thuốc hoặc các loài từ các họ khác. Do đó, việc nhận diện thảo
dược liên quan đến việc xác định chính xác loài dùng làm thuốc và phân biệt nó với
các loài có thể gây nhầm lẫn hoặc giả mạo đồng thời phát hiện nếu có sự có mặt của
loài giả mạo.
Hiện nay, có nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để nhận diện thảo
dược. Phương pháp nhận diện dựa vào hình thái tuy đơn giản nhưng lại phụ thuộc
rất nhiều vào kinh nghiệm của người nhận diện và không thể nhận diện được thảo
dược ở dạng đã sơ chế. Phương pháp vi học có thể khắc phục được nhược điểm của
phương pháp hình thái nhưng việc nhận diện lại không thể thực hiện được khi thảo
dược ở dạng dịch chiết và khi phải tiến hành với số lượng lớn các mẫu. Các phương
pháp dựa vào thành phần hóa học là một công cụ mạnh trong nhận diện thảo dược
và hoàn toàn có thể thực hiện khi thảo dược ở dạng dịch chiết. Tuy nhiên, nhược
điểm chung của các phương pháp hóa học là phụ thuộc vào thành phần hóa học của
cây mà thành phần này lại thay đổi rất nhiều tùy theo môi trường, điều kiện thu hái
2

và bảo quản. Phương pháp nhận diện thảo dược nhờ sử dụng công cụ sinh học phân
tử ra đời đã khắc phục được nhược điểm của các phương pháp phân tích hóa học.
Phân tử ADN tương đối bền vững và ít bị ảnh hưởng bởi môi trường do đó phương
pháp này đem lại một công cụ tiên tiến, chính xác và hiệu quả trong nhận diện thảo
dược.

Tại Việt Nam, việc ứng dụng công cụ sinh học phân tử trong nhận diện thảo
dược vẫn còn mới mẻ và có rất ít nghiên cứu sử dụng công cụ sinh học phân tử
trong nhận diện các thảo dược lưu hành trong nước. Do đó, đề tài này được thực
hiện với mục đích:
- Tìm hiểu nguyên tắc của các kĩ thuật sinh học phân tử được sử dụng để nhận
diện thảo dược.
- Bước đầu đánh giá ưu nhược điểm và khả năng áp dụng của từng kĩ thuật
sinh học phân tử trong nhận diện thảo dược.



3

Chương 1. Tổng quan về hiện trạng nghiên cứu và thực hành nhận diện thảo
dược
1.1. Sự cần thiết của việc nhận diện thảo dược
Nhận diện thảo dược là khái niệm liên quan đến việc xác định chính xác loài
dùng làm thuốc và phân biệt nó với các loài có thể gây nhầm lẫn hoặc giả mạo đồng
thời phát hiện nếu có sự có mặt của loài giả mạo. Việc nhận diện thảo dược là một
yêu cầu cấp thiết khi mà tình trạng giả mạo vẫn đang là một vấn đề nghiêm trọng
tồn tại trên thị trường dược phẩm thế giới. Sự giả mạo có thể là do vô tình khi dùng
nhầm lẫn các các thảo dược có tên hoặc kiểu hình tương tự nhau hoặc do người kinh
doanh cố tình giả mạo nhằm thu được lợi nhuận cao hơn. Tuy nhiên, dù là nguyên
nhân nào thì đều có thể dẫn đến hậu quả làm mất tác dụng điều trị và gây những tác
dụng không mong muốn nghiêm trọng, thậm chí là dẫn đến tử vong. Tại Mỹ, Trung
tâm chăm sóc sức khỏe California đã báo cáo về một trường hợp bị nhiễm độc do
dùng Clematis chinensis bị lẫn với Podophyllum emodi. Trong Podiphyllum emodi
có chứa podophyllotoxin là một hoạt chất có độc tính. Hậu quả trên bệnh nhân này
là bệnh lý trên thần kinh ngoại biên theo bệnh nhân đến suốt đời [41]. Ở Bỉ, trong
suốt giai đoạn 1990 - 1992, sự nhầm lẫn giữa một thảo dược có độc tính là

Aristolochia fangchi dùng thay thế cho Stephania tetrandra đã làm cho hơn 100 phụ
nữ bị suy thận [13]. Năm 2004, ở Hồng Kông có một báo cáo về độc tính do dùng
thảo dược mà nguyên nhân là do sự nhầm lẫn một thảo dược được kê trong đơn.
Bệnh nhân đã được kê Aristolochia mollissima thay vì Solanum lytatum. Trên thực
tế, hai loại thuốc này có nguồn gốc và tác dụng dược lý khác nhau, điểm chung duy
nhất là cùng có tên thông dụng là “Baimaoteng”. Sự nhầm lẫn này đã dẫn đến hậu
quả làm suy giảm chức năng thận và ung thư đường tiết niệu trên bệnh nhân [81].
Bên cạnh đó, năm 2004, ở Mỹ và các nước châu Âu như Hà Lan, Pháp, Tây Ban
Nha, các báo cáo về tình trạng ngộ độc ở trẻ em sau khi dùng một loại trà có nguồn
gốc từ Illicium verum không ngừng được tăng lên. Những trẻ bị ngộ độc thấy xuất
hiện tình trạng co giật, buồn nôn, bồn chồn, nhãn cầu chuyển động nhanh. Nguyên
4

nhân được xác định là do Illicium anisatum đã được dùng thay thế cho Illicium
verum khi sản xuất loại trà này [63]. Do những tác dụng không mong muốn nêu trên
nên việc nhận diện chính xác thảo dược đã và đang là một yêu cầu cấp thiết. Có
nhiều phương pháp đã được sử dụng trong nhận diện thảo dược từ đơn giản đến
phức tạp, từ các phương pháp truyền thống đến các phương pháp hiện đại. Phương
pháp nhận diện dựa vào hình thái là phương pháp đầu tiên được sử dụng, tiếp đó là
phương pháp vi học, phương pháp phân tích hóa học và phương pháp dựa vào công
cụ sinh học phân tử.
1.2. Các phương pháp thường được sử dụng trong nhận diện thảo dược
1.2.1. Phương pháp hình thái
Phương pháp hình thái là phương pháp dựa vào các đặc điểm hình thái tổng
quát để nhận diện cây thuốc và các bộ phận của nó. Phương pháp truyền thống yêu
cầu sử dụng hầu hết các giác quan (quan sát, sờ nắn, nếm, ngửi) để nhận biết một
dược liệu [81]. Đây là phương pháp đầu tiên được áp dụng trong nhận diện thảo
dược và cho đến nay vẫn đang được áp dụng rộng rãi trên toàn thế giới.
Đối với một cây thuốc, các đặc điểm dùng để định danh bao gồm các đặc
điểm như: cây gỗ hay cây thảo, kích thước, hình dạng lá (ví dụ như mép lá có răng

cưa hay gợn sóng, lá chia thùy hay không chia thùy), đặc điểm cụm hoa (như dạng
chùm, bông, tán), đặc điểm hình thái học thực vật (như dạng bầu trên, bầu dưới hay
bầu giữa, hình dạng và số lượng nhị, số lượng lá noãn trong mỗi bầu và số lượng
hạt trong mỗi lá noãn) và đặc điểm của rễ bao gồm cấu trúc rễ và dạng rễ (như rễ
chùm, thân rễ hay thân hành) [63].
Đối với một dược liệu từ thực vật, những căn cứ quan trọng để nhận diện là
dựa vào hình thái, kích thước, màu sắc và đặc điểm về mùi vị [81]. Ví dụ như để
nhận diện được rễ của loài Ligusticum chuanxiong, Dược điển Trung Quốc 10 đã sử
dụng các đặc điểm hình thái, màu sắc, mùi vị để mô tả như sau: rễ có các mấu
không đều, đường kính 2 – 7 cm, bên ngoài có màu vàng nâu, thô ráp và khô lại, với
5

nhiều vòng giống nhau và lớn dần, có các vết lõm, mùi thơm, vị đắng, cay, để lại
cảm giác tê nóng sau đó thì hơi ngọt [69]. Bên cạnh cách thức mô tả như trong
Dược điển, còn có nhiều cách mô tả trong đời thường như thân rễ Polygonati như
đầu gà trống, rễ Codonopsis pilosulae như đầu sư tử, thân rễ Coptidis như cựa gà…
Đây là những cách mô tả rất sinh động giúp dễ dàng nhận diện được vị dược liệu
quan tâm [81].
Phương pháp nhận diện thảo dược dựa vào hình thái là phương pháp đơn
giản nhất, nhanh và dễ thực hiện. Tuy nhiên, nó phụ thuộc rất nhiều vào kinh
nghiệm của người nhận diện và khó phân biệt các cây thuốc có quan hệ họ hàng gần
như các cây cùng một chi hay họ có hình thái bên ngoài tương tự nhau [81]. Bên
cạnh đó, việc nhận biết thảo dược ở dạng bột bằng phương pháp hình thái là không
thể thực hiện được. Phương pháp vi học ra đời có thể giúp khắc phục được nhược
điểm này.
1.2.2. Phương pháp vi học
Phương pháp vi học liên quan đến việc sử dụng kính hiển vi để nghiên cứu
cấu trúc đặc điểm bên trong cây thuốc và đặc điểm tế bào. Khi thảo dược ở dạng
chế biến hoặc dạng khô, đặc điểm hình thái bị thay đổi. Phương pháp vi học thích
hợp cho việc nhận diện thảo dược trong quá trình chế biến như dạng nguyên liệu đã

bị cắt chẻ hoặc ở dạng bột. Nó cũng rất có ích trong việc nhận diện các loài có kiểu
hình tương tự nhau [81].
Một ví dụ sử dụng phương pháp vi học để nhận diện thảo dược là trường hợp
ở loài Illicium verum. Quả của Illicium verum có tác dụng trừ hàn, kích thích tiêu
hóa, giảm khó tiêu. Ở Mỹ và các nước phương Tây, loại thuốc này được sử dụng
dành cho trẻ em ở dạng trà gói để chữa đau bụng. Tuy nhiên, một số lượng lớn trẻ
sơ sinh sau khi sử dụng loại trà này xuất hiện triệu chứng thần kinh kích thích do
Illicium anisatum đã được dùng thay thế cho Illicium verum. Illicium anisatum chứa
các sesquiterpenes có độc tính như anisatin, neoanisatin, và 2-oxyneoanisatin sẽ gây
6

ngộ độc cho người sử dụng. Hai loài này có thể phân biệt với nhau qua hình dạng,
màu sắc, vị, mùi, số lượng nang. Tuy nhiên, rất khó để phân biệt chúng khi ở dạng
bột. Phương pháp vi học đã được sử dụng để phân biệt hai loài này. Dưới ánh sáng
huỳnh quang, hai loài bộc lộ sự khác nhau về đặc điểm tế bào ở vỏ quả ngoài nang.
Nang của Illicium verum có các tế bào hình đa giác với lớp màng ngoài có vằn, kích
thước thay đổi chiều dài từ 250 – 300 µm và chiều rộng 100 µm, có màu nâu xanh
dưới kính hiển vi huỳnh quang tại vùng UV bước sóng 330 – 380 µm. Trái lại, nang
của Illicium anisatum có thành mỏng hơn. Tế bào lớp ngoài của nang có chiều dài
từ 15 – 20 µm, có hình trứng hoặc hình thuôn và khác nhau đáng kể về kích thước,
chúng có màu xanh vàng nhẹ dưới kính hiển vi huỳnh quang tại vùng UV bước
sóng 330 – 380 µm. Sự khác nhau này là đặc điểm rất quan trọng để nhận biết được
hai loài Illicium verum và Illicium anisatum [63].
Phương pháp vi học là phương pháp rất thông dụng để nhận diện thảo dược.
Nó có mặt trong Dược điển của nhiều nước như Dược điển Anh, Dược điển thảo
dược Mỹ, Dược điển Nhật Bản, Dược điển thảo dược Hàn Quốc… Phương pháp
này đơn giản, dễ thực hiện, khắc phục được nhược điểm của phương pháp hình thái
là có thể xác định thảo dược đã được chế biến hoặc ở dạng bột. Tuy nhiên, nó cũng
có nhược điểm là không thể xác định chính xác các loài của một hỗn hợp có quá
nhiều thành phần, đồng thời nó không thể giúp phân biệt loài khi ở dạng dịch chiết

[81]. Phương pháp phân tích hóa học có thể giúp giải quyết được các khó khăn này.
1.2.3. Phương pháp phân tích hóa học
Phương pháp phân tích hóa học là phương pháp căn cứ vào đặc điểm về
thành phần hóa học của một dược liệu để xác định dược liệu đó. Các phương pháp
phân tích hóa học thường được sử dụng là phương pháp sắc ký, phương pháp điện
di và phương pháp quang phổ [81].
Phương pháp sắc ký được sử dụng để thu được dấu vân tay sắc ký của một
thảo dược. Dấu vân tay sắc ký là sắc ký đồ của các hoạt chất và các thành phần hóa
7

học đặc trưng có trong dịch chiết của cây đó. Dựa vào dữ liệu của dấu vân tay sắc
ký thu được có thể xác định được cây thuốc ngay cả khi lượng mẫu là khác nhau
hoặc có thể xác định sự tương đồng hoặc khác biệt giữa các mẫu khác nhau. Tuy
nhiên, dịch chiết của một cây thuốc chứa hàng trăm hoạt chất khác nhau. Một số
hoạt chất lại tồn tại với tỉ lệ khác nhau trong các mẫu của cùng một loại thảo dược.
Do vậy, điều quan trọng là cần phải chọn phương pháp sắc ký tin cậy để thể hiện
thành phần hoạt chất và các thành phần hóa học đặc trưng trong cây thuốc [52].
Phương pháp điện di mao quản cũng được sử dụng trong nghiên cứu thảo
dược do có khả năng tách tốt [31]. Dấu vân tay đặc trưng của Flos carthami [16] và
Gingo biloba [71] đã được xây dựng để nhận diện hai loài này ở dạng thảo dược
thô đồng thời giúp phân biệt với loài giả mạo, thay thế.
Ngoài ra phương pháp sắc ký và điện di, phương pháp quang phổ cũng được
sử dụng trong nhận diện thảo dược. Nguyên tắc chung của các kĩ thuật là sử dụng
phương pháp thăm dò nghiên cứu quang phổ điển hình của toàn bộ các chất hóa học
được chiết xuất từ mẫu quan tâm. Các phương pháp thường dùng là phổ khối, phổ
cộng hưởng từ hạt nhân proton và phổ hồng ngoại (IR) [63].
Các kĩ thuật dựa trên phân tích thành phần hóa học của cây là những công cụ
rất hữu ích trong nhận diện thực vật. Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của các kĩ
thuật này là phụ thuộc vào thành phần hóa học của cây, nhưng thành phần hóa học
của cây chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi môi trường sống, vào giai đoạn sinh trưởng và

phát triển. Đồng thời, nó còn phụ thuộc vào quá trình thu hái và điều kiện bảo quản
mẫu. Trong điều kiện bảo quản không tốt, mẫu có thể bị phân hủy làm biến đổi các
thành phần hóa học trong đó, dẫn đến việc nhận diện là không thể [26].
Với sự phát triển của sinh học phân tử và di truyền học thực vật trong những
năm gần đây, công cụ di truyền được xem như là một phương pháp đáng tin cậy
trong nhận diện nguyên liệu có nguồn gốc thực vật ở cấp độ ADN. Phương pháp
này tỏ ra chính xác, thuận tiện, đặc hiệu và ổn định. Hơn nữa, một lượng nhỏ mẫu là
8

đủ cho nghiên cứu ADN. Trái ngược với các dấu vân tay hóa học chịu ảnh hưởng
nhiều bởi giai đoạn sinh trưởng, phát triển, điều kiện môi trường, điều kiện thu hái,
làm khô và bảo quản, ADN là một đại phân tử tương đối bền vững, ít chịu ảnh
hưởng của các yếu tố bên ngoài, có thể thu được từ mẫu tươi, mẫu đã làm khô, thậm
chí là cả ở mẫu đã qua chế biến. Bên cạnh đó, các ADN không đặc trưng cho mô
nên có thể thăm dò ở bất kì giai đoạn sinh trưởng nào của cây [26]. Do đó, công cụ
sinh học phân tử rất hữu ích và thích hợp cho nhận diện thảo dược.

9

Chương 2. Các kĩ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong nhận diện thảo dược
Trong sinh học phân tử, việc nhận diện thảo dược được thực hiện dựa vào
các marker di truyền (hay các marker ADN). Marker ADN có thể được hiểu là đoạn
ADN đặc trưng thể hiện sự khác biệt ở cấp độ bộ gen. Các marker này có thể thu
được nhờ sử dụng các phương pháp như phương pháp PCR, phương pháp giải trình
tự ADN và phương pháp ADN microarray [78].
2.1. Các marker dựa trên phản ứng khuếch đại chuỗi (PCR)
Phản ứng khuếch đại chuỗi (Polymerase chain reaction-PCR) là một kĩ thuật
cơ bản của sinh học phân tử. Đây là một phản ứng khuếch đại ADN ở bên ngoài cơ
thể sống. Trước đây, để giải quyết những trở ngại về số lượng vật chất di truyền cần
có, các kĩ thuật tạo dòng in vitro thường được sử dụng để tạo số lượng lớn vật chất

di truyền. Tuy nhiên, kĩ thuật này đòi hỏi thao tác rất phức tạp và tốn rất nhiều thời
gian. Kĩ thuật PCR ra đời đã khắc phục những khuyết điểm của phương pháp hiện
có. Áp dụng kĩ thuật PCR cho phép làm tăng nhanh lượng vật chất di truyền trong
thời gian ngắn [2].
Về nguyên tắc, phản ứng PCR là một phản ứng chuỗi, trong đó một phân tử
ADN được sử dụng để từ đó tạo ra hai bản sao, sau đó là bốn, tám…Sự nhân đôi
liên tục được thực hiện nhờ enzym ADN polymerase [33]. Tất cả các ADN
polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch ADN mới đều cần sự hiện diện của
những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với
một đầu của mạch khuôn và ADN polymerase sẽ kéo dài mồi để hình thành mạch
mới [2].
Trên cơ sở kĩ thuật PCR, bằng việc sử dụng các mồi khác nhau sẽ thu được
các marker ADN khác nhau. Các mồi sử dụng có thể là mồi ngẫu nhiên, không yêu
cầu thông tin trước về bộ gen hoặc các mồi đặc hiệu khuếch đại một vùng nhất định
trên bộ gen mà thông tin về bộ gen cần được biết trước [26]. Sau bước khuếch đại
10

nhờ PCR sử dụng các mồi đặc trưng cho từng kĩ thuật, các sản phẩm thu được sẽ
được điện di trên gel để thu được sản phẩm khuếch đại và đánh giá kích thước [78].
2.1.1. Kĩ thuật PCR sử dụng các mồi ngẫu nhiên (RP-PCR)
Kĩ thuật PCR dùng mồi ngẫu nhiên (Random-primed PCR – RP-PCR) là kĩ
thuật mà trong đó phản ứng khuếch đại được xảy ra trong điều kiện nhiệt độ gắn
mồi thấp, sử dụng một hoặc hai mồi ngẫu nhiên trong mỗi phản ứng PCR để tạo ra
các đoạn ADN đặc trưng. Các mồi này sẽ gắn vào các vị trí ngẫu nhiên trên ADN
khuôn để khuếch đại. Sự đa hình được đánh giá bằng sự có mặt hoặc không có mặt
của một băng điện di nhất định [78].
Trong kĩ thuật RP-PCR bao gồm: kĩ thuật PCR với mồi tùy chọn (Arbitrarily
primed-PCR – AP-PCR), kĩ thuật sự đa hình các đoạn ADN được khuếch đại ngẫu
nhiên (random amplified polymorphic DNA – RAPD) và kĩ thuật vân tay khuếch
đại ADN (DNA amplification fingerprinting – DAF). Với các kĩ thuật khác nhau thì

mồi được sử dụng có chiều dài khác nhau. Kĩ thuật DAF có tính nghiêm ngặt thấp
nhất do sử dụng mồi có chiều dài 5 – 8 nucleotid, tiếp đó là RAPD sử dụng mồi có
chiều dài 10 nucleotid, AP-PCR sử dụng mồi có chiều dài khoảng 20 nucleotid [78].
Kĩ thuật DAF do sử dụng các mồi ngắn nên mô hình các băng thu được là rất phức
tạp [57]. Khi chiều dài của mồi tăng lên, số lượng vị trí gắn trên bộ gen mục tiêu
giảm đi do giảm cơ hội tìm thấy các vị trí mục tiêu tương đồng hoặc gần tương
đồng trên bộ gen [29].
Trong ba kĩ thuật trên, kĩ thuật RAPD được ứng dụng rộng rãi nhất do sự sẵn
có của mồi RAPD trên thị trường [55]. Mồi RAPD có chiều dài 10 nucleotid thường
chứa hàm lượng GC từ 50% đến 80% vì trong quá trình lai ADN, nếu hàm lượng
GC nhỏ hơn 50 % thì sẽ không chịu được nhiệt độ của quá trình tổng hợp chuỗi
[19].
11


Hình 1. Nguyên tắc của kĩ thuật sự đa hình các đoạn ADN được khuếch đại
ngẫu nhiên – RAPD [8]
Một trong các ứng dụng kĩ thuật RAPD trong nhận diện thảo dược là trường
hợp của Senna angustifolia. Mục đích của nghiên cứu là nhận diện Senna
angustifolia và phân biệt nó với các loài thân thuộc là S. acutifolia, S.tora và
S.sophera. Trong nghiên cứu này, 32 mồi RAPD được sử dụng để khuếch đại ADN
chiết từ các mẫu, sau đó sản phẩm được điện di trên gel agarose và hiện màu bằng
ethidium bromid dưới ánh sáng UV. Trong 32 mồi được sử dụng có sáu mồi thu
được các băng đặc trưng cho loài. Dựa trên điện di đồ thu được thì thấy bốn loài
khác nhau và cho thấy sự đa hình cao (Hình 2). Do đó, kĩ thuật này thích hợp để
phân biệt các loài Senna có kiểu hình giống nhau được bán trên thị trường [37].
12


Hình 2. Nghiên cứu RAPD với các loài S. angustifolia, S. acutifolia, S. sophera,

S. tora [37]
Mồi OPC-3 (hàng: 1–8), mồi OPC-4 (hàng: 9–16). S. angustifolia (hàng: 1, 2, 9,
10), S. acutifolia (hàng: 3, 4, 11, 12), S. sophera (hàng: 5, 6, 13, 14), S. tora (hàng:
7, 8, 15, 16). Thang ADN 100 bp và 1 kb .
Qua nghiên cứu này, kĩ thuật RAPD bộc lộ ưu điểm là nhanh, dễ thực hiện.
Bên cạnh đó, lượng mẫu yêu cầu là rất nhỏ, tính bằng đơn vị nanogram (lượng
ADN cần là 30ng/µl), trong thử nghiệm không sử dụng bất kì chất phóng xạ nào
nên rất an toàn. Ngoài ra, kĩ thuật RAPD còn không yêu cầu bất kì thông tin nào của
bộ gen cần nghiên cứu.
Bên cạnh những ưu điểm trên, RAPD cũng cho thấy nhược điểm là độ lặp lại
(reproducibility) thấp. Phản ứng RAPD-PCR chịu ảnh hưởng rất nhiều về điều kiện
phản ứng, độ sạch của mẫu. Trong nghiên cứu với Senna angustifolia và các loài
thân thuộc, để khắc phục nhược điểm này, các tác giả chỉ xem xét các băng rõ ràng
và tin cậy. Cùng với đó, quá trình chuẩn hóa quy trình chiết ADN từ mẫu và lựa
13

chọn các thông số kĩ thuật thích hợp cho phản ứng cũng được thực hiện. Các ADN
thu trong nghiên cứu được làm sạch khỏi các chất chuyển hóa thứ cấp bằng phương
pháp CTAB cải tiến của Khan và cộng sự [37]. Áp dụng phương pháp chiết tách
này cho thấy ADN thu được có độ tinh sạch và chất lượng cao, tỉ lệ hấp thụ
A260/A280 là 1,8 – 2,0 [39]. Tiếp đó là quá trình chuẩn hóa điều kiện của phản
ứng. Phản ứng PCR được thực hiện với nồng độ MgCl
2
khác nhau 0,5mM, 1mM,
1,5mM đồng thời giữ nguyên các thông số khác. Nồng độ MgCl
2
1,5mM được xác
định là tối ưu nhất đã được sử dụng trong phản ứng khuếch đại. Ban đầu phản ứng
khuếch đại được thử với nồng độ enzym là 0,9 đơn vị Taq polymerase nhưng quá
trình thực hiện không cho kết quả tốt. Do đó, lượng enzym này được giảm xuống

0,5 đơn vị cho mỗi 25µl dung dịch phản ứng. Trong các thử nghiệm PCR, nhiệt độ
gắn mồi là 36
0
C được xác định. Quá trình biến tính ADN là một quá trình nghiêm
ngặt trong PCR. Trong hầu hết các phản ứng khuếch đại, thời gian ủ để thực hiện
quá trình biến tính ADN là một phút ở nhiệt độ 94
0
C. Cùng với đó, với mỗi mẫu
quá trình được làm ba lần để đảm bảo độ tin cậy của thử nghiệm [37].
Mặc dù tồn tại nhược điểm nêu trên, nhưng do có ưu điểm là nhanh và đơn
giản, kĩ thuật RAPD vẫn được ứng dụng rộng rãi để phân biệt các loài dùng làm
thuốc với loài giả mạo thuộc các chi như Echinacea, Typhonium, Dendrobium và
các sản phẩm từ nó, rễ của Astragalus, loài Dendrobium officinale, Tinospora
cordifolia, Piper nigrum, Mimosae tenuiflorae, Rahmannia glutinosa [37],
Glycirrhiza glabra [38], Cuscuta reflexa và Cuscuta chinensis [35], Ruta
graveolens [36] và Picrorhiza kurrooa và loài giả mạo [29].
2.1.2. Kĩ thuật sự đa hình chiều dài của các đoạn ADN có thể khuếch đại trực
tiếp (DALP)
Kĩ thuật sự đa hình chiều dài của các đoạn ADN có thể khuếch đại trực tiếp
(Direct amplification of length polymorphisms – DALP) được sử dụng để thu được
dấu vân tay ADN của bộ gen và cho phép giải trình tự trực tiếp sản phẩm thu được
nếu cần. Hai mồi được sử dụng, trong đó một mồi xuôi bao gồm phần trung tâm là
14

mồi giải trình tự phổ biến M13 (universal M13 sequencing primer) và các trình tự
ngẫu nhiên. Một mồi ngược chỉ bao gồm mồi M13. Cặp mồi này giúp tạo ra mô
hình nhiều băng rất phức tạp. Các sản phẩm PCR được thăm dò trên gel
polyacrylamid biến tính. Do sự thiết kế đặc biệt của mồi, mỗi băng của các mô hình
khác nhau có thể được giải trình tự trực tiếp với mồi giải trình tự chung khi cần thiết
[58].

Một ví dụ sử dụng kĩ thuật DALP để nhận diện cây thuốc là ở loài Panax
ginseng. Sâm là một loại dược liệu quý nên sự giả mạo thường xuyên xảy ra. Rất
nhiều nghiên cứu với nhiều kĩ thuật khác nhau đã được khai thác nhằm phân biệt
các loài Panax. Ngoài RAPD, kĩ thuật DALP cũng đã được khai thác trong nhận
diện Panax ginseng và Panax quinquefolius. Trong nghiên cứu sử dụng DALP,
phản ứng khuếch đại được thực hiện với mồi xuôi là (5’-GTT TTC CCA GTC ACG
ACG C-3’) và mồi ngược là (5’-AAC AGC TAT GAC CAT GA-3’). Một trong hai
mồi được đánh dấu bằng ATP-P
33
. Kết quả thu được cho thấy một đoạn đặc hiệu
636 bp chỉ xuất hiện ở mẫu Panax ginseng nhưng không xuất hiện tại mẫu Panax
quinquefolius [25].
Như vậy sử dụng DALP có thể giúp phân biệt được hai loài sâm với nhau.
Cũng như các kĩ thuật RP-PCR, kĩ thuật này có ưu điểm là không yêu cầu bất kì
thông tin nào về bộ gen cần nghiên cứu. Hơn thế nữa, do sử dụng mồi dài hơn cũng
như mức độ chính xác yêu cầu cao hơn, kĩ thuật này cho thấy độ tin cậy cao hơn so
với các kĩ thuật RP-PCR.
2.1.3. Kĩ thuật sự đa hình chiều dài các đoạn được khuếch đại (AFLP)
Kĩ thuật sự đa hình chiều dài các đoạn được khuếch đại (Amplified fragment
length polyphorphism – AFLP) là kĩ thuật liên quan đến sự khuếch đại toàn bộ các
đoạn ADN giới hạn từ ADN bộ gen sau khi đã được cắt nhờ các enzym giới hạn
[60].
AFLP là sự kết hợp giữa kĩ thuật sự đa hình chiều dài các đoạn giới hạn
(Restriction fragment length polymorphism – RFLP) và kĩ thuật PCR. RFLP là một
15

kĩ thuật dựa trên kĩ thuật lai phân tử. Trong RFLP, đoạn ADN được cắt bằng enzym
giới hạn sau đó điện di trên gel agarose. Các băng ADN đa hình được chuyển lên
màng lai và lai với mẫu dò được đánh dấu hóa học. Sự đa dạng được đánh giá bằng
sự có mặt hoặc vắng mặt của các băng [26].

Trong kĩ thuật AFLP, ADN bộ gen sẽ được cắt nhờ các enzym giới hạn tại
nhiều vị trí giới hạn khác nhau ở nhiều locus để tạo ra các đoạn giới hạn có đầu
dính, các enzym cắt được sử dụng là sự kết hợp giữa một enzym cắt hiếm (rare
cutter) (EcoRI hoặc PstI) với một enzym cắt thường (frequent cutter) (MseI hoặc
TaqI). ADN cần phải tinh sạch khỏi các chất ức chế ảnh hưởng đến enzym giới hạn.
Sau đó, các đoạn giới hạn sẽ được gắn với các adaptor ở cuối đoạn tạo ra trình tự đã
biết cho phản ứng khuếch đại PCR tiếp theo. Sau khi thực hiện bước gắn adaptor,
phản ứng khuếch đại ban đầu được thực hiện sử dụng mồi có bổ sung thêm một
nucleotid chọn lọc. Kế đó, phản ứng khuếch đại chọn lọc được thực hiện với mồi bổ
sung thêm 3 nucleotid chọn lọc, một trong hai mồi được đánh dấu huỳnh quang
hoặc phóng xạ. Quá trình khuếch đại được thực hiện trong điều kiện nghiêm ngặt.
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid biến tính với
thiết bị tự ghi phóng xạ, hiện màu bằng AgNO
3
hoặc dùng máy giải trình tự tự động
[60].