BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



NGUYỄN NGỌC TÚ


NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI CÁC LOÀI
TRONG CHI GYMNEMA R.BR. THU Ở
VIỆT NAM SỬ DỤNG VÂN TAY HÓA
HỌC HPTLC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


HÀ NỘI – 2013


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


NGUYỄN NGỌC TÚ

NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI CÁC LOÀI
TRONG CHI GYMNEMA R.BR. THU Ở
VIỆT NAM SỬ DỤNG VÂN TAY HÓA

HỌC HPTLC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
ThS. Phạm Hà Thanh Tùng
Nơi thực hiện:
Bộ môn Thực vật – Trường Đại
học Dược Hà Nội


HÀ NỘI – 2013



Lời cảm ơn

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới ThS Phạm Hà Thanh
Tùng. Thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và dìu dắt em trong quá trình làm
Nghiên cứu khoa học và làm Khóa luận tốt nghiệp. Nhờ có sự dìu dắt của Thầy mà
em đã trưởng thành lên từng ngày, học được nhiều điều bổ ích và hoàn thành được
khóa luận tốt nghiệp này.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS. Trần Văn Ơn và TS. Hoàng
Quỳnh Hoa. Thầy cô đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình làm khóa luận và cho
em những lời khuyên bổ ích trong học tập và nghiên cứu.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các Thầy, Cô trong bộ môn Thực vật.
Các Thầy Cô đã tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành Khóa luận tốt nghiệp này
và Thầy Cô luôn là tấm gương sáng để em noi theo và học tập.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến chị Chu Thị Thoa và các chị kỹ thuật

viên trong Bộ môn Thực vật trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn giúp đỡ, tạo điều
kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt quá trình làm thực nghiệm tại Bộ môn.
Tôi cũng xin gửi tới các bạn cùng làm Nghiên cứu và Khóa luận tại Bộ môn
lời cảm ơn chân thành vì những giúp đỡ chân tình trong quá trình làm thực nghiệm.
Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ông bà, bố mẹ và xin gửi lời
cảm ơn tới em trai đã giúp đỡ và động viên tinh thần con trong suốt những năm
tháng học Đại học.
Hà Nội, tháng 5 năm 2013



Nguyễn Ngọc Tú





MỤC LỤC
Danh mục từ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

ĐẶT VẤN ĐỀ
1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
2
1.1. TỔNG QUAN VỀ CHI GYMNEMA R.BR.
2

1.1.1. Đặc điểm thực vật
2
1.1.2. Thành phần hóa học
3
1.1.3. Tác dụng sinh học
7
1.1.4. Một số kết quả nghiên cứu đã tiến hành ở Việt nam
7
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA HỌC
DƯỢC LIỆU
9
1.2.1. Phân tích hóa học bằng phương pháp dung môi phân đoạn
9
1.2.2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography)
9
1.2.3. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (High performance thin layer
chromatography)
16
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
18
2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ
18
2.1.1. Nguyên vật liệu
18
2.1.2. Thiết bị
19
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
20
2.2.1. Định tính bột dược liệu
2

2.2.2. Xây dựng quy trình phân tích HPTLC
20
2.2.3. Tiến hành phân tích hóa học một số mẫu trong chi Gymnema
R.Br.
20
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
20
2.3.1. Định tính sơ bộ các nhóm chất trong các loài nghiên cứu
20


2.3.2. Xây dựng quy trình phân tích định tính bằng phương pháp sắc
ký lớp mỏng
27
2.3.3. Tiến hành phân tích định tính các phân đoạn dịch chiết một số
loài trong chi Gymnema R.Br.
28
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
30
3.1. ĐỊNH TÍNH CÁC NHÓM CHẤT CHÍNH
30
3.2. QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
LỚP MỎNG
31
3.2.1. Sàng lọc phương pháp chiết xuất
31
3.2.2. Định tính các phân đoạn dịch chiết
32
3.2.3. Sàng lọc hệ dung môi pha động
33

3.3. PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH CÁC DỊCH CHIẾT TOÀN PHẦN
VÀ PHÂN ĐOẠN THEO QUY TRÌNH ĐỀ XuẤT
37
3.4. BÀN LUẬN
46
3.4.1. Về phương pháp nghiên cứu
46
3.4.2. Về định tính các nhóm chất chính
46
3.4.3. Về xây dựng quy trình định tính bằng HPTLC
47
3.4.4. Về phân tích định tính các mẫu theo quy trình đề xuất
48
KẾT LUẬN
52
ĐỀ XUẤT
52
TÀI LIỆU THAM KHẢO
56
PHỤ LỤC





DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

CHDCND
Cộng hòa dân chủ nhân dân
DAGA

Deacylgymnemic acid
HL
Hồi lưu
HPTLC
High performance thin layer chromatography (Sắc ký lớp
mỏng hiệu năng cao)
NK
Ngấm kiệt
NL
Ngâm lạnh
STZ
Streptozotocin
TLC
Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng)
UPGMA
Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical Averages
UV
Ultraviolet light (ánh sáng tử ngoại)
VIS
Visible spectrum (ánh sáng trắng)




DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1
Danh mục các loài thuộc chi Gymnema R.Br ở Việt
Nam theo Phạm Hoàng Hộ (2000)
2

Bảng 1.2
Một số tác dụng sinh học đã được công bố của các
loài trong chi Gymnema R.Br
7
Bảng 1.3
Bảng tóm tắt quy tắc Stahl
11
Bảng 1.4
Một số hệ dung môi dùng trong phân tích TLC
11
Bảng 2.1
Danh mục mẫu được phân tích và mã hiệu
18
Bảng 2.2
Tóm tắt các phản ứng định tính các nhóm chất trong
các loài nghiên cứu
22
Bảng 3.1
Kết quả các phản ứng định tính thành phần hóa học
một số loài trong chi Gymnema R.Br.
30
Bảng 3.2
Kết quả khối lượng cắn thu được khi chiết xuất bằng
các phương pháp khác nhau
31
Bảng 3.3
Tóm tắt kết quả định tính saponin và flavonoid trong
các phân đoạn dịch chiết
33
Bảng 3.4

Giá trị R
f
của các vạch đặc trưng chi Gymnema R.Br.
37
Bảng 3.5
Bảng hệ số tương đồng cặp đôi giữa các mẫu nghiên
cứu, sử dụng chỉ số Nei&Li
44




DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1
Cấu trúc của các acid gymnemic phân lập từ
Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult.
5
Hình 1.2
Cấu trúc của Gurmarin
6
Hình 1.3
Sơ đồ tách chiết phân đoạn sử dụng dung môi không
đồng tan
10
Hình 3.1
Sắc ký đồ dịch chiết NL, NK, HL với hệ dung môi
(S.2), hiện màu dưới đèn UV 366nm
32
Hình 3.2

Sắc ký đồ mẫu DM với hệ dung môi F.11 và S.2 hiện
màu dưới đèn UV 366nm
35
Hình 3.3
Quy trình phân tích định tính các phân đoạn dịch
chiết bằng HPTLC
36
Hình 3.4
Sắc ký đồ khai triển dịch chiết toàn phần và phân
đoạn ethylacetat với hệ dung môi S.2
38
Hình 3.5
Sắc ký đồ khai triển dịch chiết toàn phần và phân
đoạn ethylacetat với hệ dung môi F.11
39
Hình 3.6
Sự khác biệt giữa các mẫu của loài Gymnema
sylvestre (Retz.) R.Br. ex Schult.
42
Hình 3.7
Sự khác nhau giữa các mẫu của loài Gymnema
inodorum (Lour.) Decnc.
43
Hình 3.8
Sự khác nhau giữa các mẫu của loài Gymnema
latifolium Wallich ex Wight.
43
Hình 3.9
Cây phân loại dựa trên phân tích UPGMA hệ số
tương đồng giữa sắc ký đồ của các mẫu

45


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong nền y học cổ truyền Ấn Độ Ayurveda, Dây thìa canh (Gymnema
sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult.) đã được sử dụng từ hơn 2.000 năm nay để điều
trị Đái tháo đường [41], [43]. Dựa trên kinh nghiệm này, hàng loạt các nghiên cứu
đã được tiến hành để chứng minh tác dụng sinh học của cây và xác định hoạt chất
chính trong cây, đó là acid gymnemic [36], [38] . Một hướng nghiên cứu mới đang
được các nhà khoa học quan tâm áp dụng là tìm kiếm và sàng lọc tác dụng điều trị
đái tháo đường tương tự Dây thìa canh từ các loài khác trong cùng chi Gymnema
R.Br. Phương pháp này dựa trên nguyên lý là các loài cùng một bậc taxon thực vật
thường có các thành phần hóa học tương tự nhau do đó có xu hướng có tác dụng
sinh học giống nhau [3]. Một số nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh được tác
dụng hạ đường huyết tương tự trên các loài Gymnema montanum Hook.f. [15],
Gymnema inodorum (Lour.) Decnc [34], [33], Gymnema yunnanense Tsiang [44]…
Cho đến nay, các nghiên cứu trong nước được tập trung thực hiện trên 2 loài là
Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br. ex Schult. [7] và Gymnema latifolium Wallich ex
Wight. [3], [11]. Trong các nghiên cứu này, tác dụng hạ đường huyết đã bước đầu
được chứng minh trên các mẫu thu hái ở trong nước. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu
nào được thực hiện một các hệ thống về sự tương đồng trong thành phần hóa học
của các loài trong chi Gymnema R.Br
Xuất phát từ thực tế này, đề tài “Nghiên cứu phân loại các loài trong chi
Gymnema R.Br. thu ở Việt Nam sử dụng vân tay hóa học HPTLC” được thực hiện
với các mục tiêu sau:
- Xây dựng quy trình định tính các thành phần hóa học một số loài thuộc
chi Gymnema R.Br. bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng.
- Xác định sự tương đồng về thành phần hóa học của một số loài trong chi

Gymnema R.Br. và xây dựng cây phân loại thực vật chi dựa trên phân
tích định tính thành phần hóa học.
2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.TỔNG QUAN VỀ CHI GYMNEMA R.BR
1.1.1.Đặc điểm thực vật
1.1.1.1.Vị trí phân loại
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan công bố năm 2009, Chi Gymnema
R.Br thuộc Họ Thiên lý (Asclepiadaceae) có vị trí phân loại như sau [39]:
+ Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
+ Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
+ Phân lớp Bạc hà (Lamiidae)
+ Bộ Long đởm (Gentianales)
+ Họ Trúc đào (Apocynacea)
+ Phân họ Thiên lý (Asclepiadaceae)
+ Chi Gymnema
Theo Phạm Hoàng Hộ (2000), ở Việt Nam có 07 loài thuộc Chi Gymnema
R.Br được thể hiện trong Bảng 1.1. [8].
Bảng 1.1. Danh mục các loài thuộc chi Gymnema ở Việt Nam theo Pham
Hoàng Hộ (2000) [8]
STT
Tên khoa học
Tên thường dùng
1
Gymnema acuminatum (Roxb.) Wall.
Lõa ty nhọn
2
Gymnema albiflorum Cost.
Lõa ty hoa trắng

3
Gymnema inodora (Lour.) Decne.
Lõa ty không mùi
4
Gymnema latifolia Wall. ex Wight.
Lõa ty lá rộng, Dây thìa canh lá
to
5
Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex
Schult.
Dây thìa canh, dây muôi, Lõa
ty rừng
6
Gymnema reticulatum (Moon) Alston
Cost.
Dây thìa canh gân mạng
7
Gymnema tingens (Roxb.) Spreng.
Rau mỏ, Lõa ty nhuộm

3

Tuy nhiên, theo tài liệu được công bố mới nhất về họ Thiên lý ở Việt Nam
của Trần Thế Bách (2007), có 5 loài thuộc chi Gymnema R.Br phân bố ở Việt Nam.
Đó là: Gymnema inodorum (Lour.) Decne, Gymnema latifolium Wall. ex Wight,
Gymnema yunnanense Tsiang, Gymnema reticulatum (Moon) Alst. và Gymnema
sylvestre (Retz) R. Br. ex Schult. [2].
1.1.1.2.Đặc điểm thực vật và phân bố:
Đặc điểm thực vật của chi Gymnema R.Br: Cây leo, không có rễ phụ trên
thân. Lá mọc đối, không nạc. Cụm hoa xim, dạng tán đến chùm. Hoa nhỏ. Thùy đài

nhỏ, hình trứng, đầu tù, gốc đài có tuyến, ít khi không có tuyến. Tràng hình bánh
xe; thùy tràng không gập trong nụ, vặn, phủ nhau phải. Tràng phụ đơn, vảy tràng
phụ dính ở tràng, thường có các hàng lông xếp dọc theo tràng. Chỉ nhị dính nhau;
bao phấn 2 ô, có phần phụ ở đỉnh, hạt phấn dính thành khối phấn và có sáp bao bên
ngoài vách khối phấn, khối phấn không có mỏm ở đỉnh; cơ quan truyền phấn có gót
đính và 2 chuôi; khối phấn hướng lên; chỉ có một khối phấn trong mỗi ô phấn. Đầu
nhụy phình lên hình trứng, đỉnh bầu không thót lại thành dạng vòi nhụy. Cột nhị -
nhụy hình ống nhọn đầu [4], [2], [8].
Phân bố ở Ấn Độ, Nam Trung Quốc, Việt Nam, Indonesia. Ở Việt Nam, các
loài thuộc chi Gymnema R.Br phân bố ở nhiều vùng miền trên cả nước, từ Hải
Dương, Hưng Yên, Hải Phòng, Bắc Giang, Ninh Bình đến Thanh Hóa, Tây
Nguyên, Tây Ninh [4].
1.1.2.Thành phần hóa học
Cho đến nay, các nghiên cứu sâu về thành phần hóa học được tập trung vào
loài Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br. ex Schult. với các nhóm chất triterpene
saponin thuộc 2 nhóm oleane và dammarane. Saponin khung Oleane có các acid
gymnemic và gymnemasaponins, trong khi đó saponin khung dammarane là các
gymnemasides. Trong lá còn xác định có resine, albumin, chlorophyll,
carbonhydrates, acid tartric, acid formic, acid butyric, anthraquinon, alkaloid
inositole, acid hữu cơ (5.5%), parabin, calci oxalate (7.3%), lignin (4.8%), cellulose
(22%) [36], [35].
4

Lá Gymnema latifolium Wall. ex Wight bằng các phản ứng định tính thường
quy được xác định là có chứa các nhóm chất sau: saponin, tanin, flavonoid, acid
amin, đường khử và coumarin [7].
Thành phần tác dụng chính được xác định là acid gymnemic, là tên chung
của các acid hữu cơ thuộc nhóm saponin triterpenoid [23], [20], [36] . Các acid
gymmenic là các dẫn chất thế acyl (Tiglolyl, Methyltutylroyl,…) của
deacylgymnemic acid (DAGA). DAGA tương ứng là dẫn xuất thế 3-O-

betaglucoronide của gymemagenin [27]. Cấu trúc của Gymnemagenin và 17 loại
acid gymnemic được minh họa trong Hình 1.1 [36], [38].
Thành phần thứ hai được quan tâm nghiên cứu liên quan đến cơ chế hạ
đường huyết là Gurmarin (Hình 1.2), một polypeptid có khả năng làm mất cảm giác
ngọt mà không ảnh hưởng tới các vị giác khác, được phân lập từ lá Gymnema
sylvestre (Retz.) R.Br. ex Schult [25], [32].
5


Hình 1.1a. Cấu trúc của các acid gymnemic phân lập từ Gymnema sylvestre
(Retz.) R. Br. ex Schult.
6



Hình 1.2. Cấu trúc của Gurmarin


Hình 1.1b.Cấu trúc của các acid gymnemic phân lập từ Gymnema sylvestre
(Retz.) R. Br. ex Schult. [37]
7

1.1.3.Tác dụng sinh học
Cho đến nay, các nghiên cứu về hóa học và tác dụng sinh chủ yếu được thực
hiện trên loài Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br. ex Schult và đã được công bố. Bên
cạnh đó, một số nghiên cứu cũng được tiến hành trên các loài khác như Gymnema
inodorum (Lour.) Decne, Gymnema latifolium Wall. ex Wight và Gymnema
yunnanense Tsiang (Bảng 1.2)
Bảng 1.2. Một số tác dụng sinh học đã được công bố của các loài trong chi
Gymnema R.Br.

Loài
Tác dụng sinh học
Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br. ex
Schult
Hạ đường huyết [16], [30], [26], [31].
Làm mất cảm giác ngọt [17].
Hạ lipid máu và chống béo phì [41], [32],
[21], [25].
Kháng khuẩn [29].
Gymnema inodorum (Lour.) Decne
Ức chế hấp thu glucose [33], [34].
Gymnema latifolium Wall. ex Wight
Hạ đường huyết [7].
Gymnema yunnanense Tsiang
Hạ đường huyết [44],

1.1.4. Một số kết quả nghiên cứu đã tiến hành ở Việt Nam
Năm 2007, Đỗ Anh Vũ công bố một số kết quả nghiên cứu sau [14]:
₋ Khẳng định tên khoa học của cây Dây thìa canh là Gymnema sylvestre (Retz.)
R. Br. ex Schult., Họ Thiên lý (Asclepidiaceae).
₋ Khẳng định cây Dây thìa canh ở Việt nam cũng có những tác dụng hạ đường
huyết tương tự như những nghiên cứu trước đó đã được thực hiện trên thế
giới.
Năm 2008, Trương Thị Tâm đã công bố các kết quả nghiên cứu sau [12]:
₋ Xác định trong lá Dây thìa canh có saponin, flavonoid, đường khử, acid hữu
cơ và acid amin.
8

₋ Dịch chiết toàn phần, dịch chiết nước và phân đoạn dịch chiết ethylacetat có
tác dụng trên cả mô hình chuột bình thường và mô hình chuột gây tăng

đường huyết bằng STZ. Các phân đoạn dịch chiết n-hexan, chloroform
không có tác dụng trên cả 2 mô hình thí nghiệm. Phân đoạn n-buthanol chỉ
có tác dụng hạ glucose huyết trên mô hình chuột gây tăng đường huyết bằng
STZ.
Năm 2009, Lương Thúy An công bố các kết quả nghiên cứu sau [1]:
₋ Flavonoid tập trung chủ yếu trong phân đoạn ethylacetat và n-buthanol.
Saponin triterpenoid có trong 3 phân đoạn: chloroform, ethylacetat và n-
buthanol, trong đó tập trung chủ yếu trong phân đoạn ethylacetat và n-
buthanol.
₋ Phân lập được 1 flavonoid tinh khiết kí hiệu là A
1
từ phân đoạn ethylacetat
dự kiến là Kaempferol.
Năm 2010, Nguyễn Hương Giang đã công bố các kết quả nghiên cứu sau [6]:
₋ Xây dựng và mô tả được quy trình chiết xuất dạng cao thuốc tinh chế từ dịch
chiết Dây thìa canh (GS4) tối ưu với các điều kiện: kích thước của dược
liệu, phương pháp chiết xuất, nồng độ cồn và pH trong phản ứng acid hóa.
₋ Lựa chọn được 2 hệ dung môi định tính GS4 bằng sắc ký lớp mỏng:
 Hệ 1: Chloroform : Methanol : Acid formic (10 : 1.1 : 0,02) cho 10
vết với thuốc thử hiện màu là H
2
SO
4
10%.
 Hệ 2: Chloroform : Aceton : Acid formic (3.3 : 1 : 0,02) cho 9 vết với
thuốc thử hiện màu là H
2
SO
4
10%.

₋ Đã phân lập được 2 chất tinh khiết từ GS4 kí hiệu là GS4A1 và GS5F2. Dự
kiến GS4A1 là Myrtillogenic acid và GS5F2 là Glochioeriosides A.
Năm 2013, Phạm Hà Thanh Tùng đã công bố kết quả nghiên cứu [13]:
- Mô tả đặc điểm hình thái và cấu tạo giải phẫu của 26 mẫu trong chi
Gymnema R.Br. được thu thập từ các địa phương khác nhau trong cả nước;
Xác định được hệ số tương đồng có giá trị 0,44 – 0,88 sử dụng chỉ thị
RAPD.
9

- Xác định sự có mặt của acid gymnemic trong dịch chiết methanol của 08
mẫu của 05 loài và gymnemagenin trong tất cả dịch chiết thủy phân.
- Định lượng phân đoạn giàu saponin triterpenoid (GX4) trong 08 mẫu trong
đó mẫu của 2 loài cho tỷ lệ cao nhất là Gymnema latifolium Wallich ex
Wight thu ở Thái Nguyên (2,25%) và Gymnema yunnanense Tsiang thu ở
Kon Tum (2,57%). Thành phần phân đoạn GX4 có tính tương đồng cao khi
khai triển trên hệ dung môi chloroform

: methanol (25:15) và so sánh.
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA HỌC DƯỢC
LIỆU
1.2.1.Phân tích hóa học bằng phương pháp dung môi phân đoạn:
Phương pháp dựa trên độ phân cực và độ tan khác nhau của các chất trong
các dung môi khác nhau. Sơ đồ tách chiết phân đoạn sử dụng dung môi không đồng
tan thường gặp được thể hiện ở Hình 1.3 [22].
1.2.2.Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)
1.2.2.1. Định nghĩa
Sắc ký lớp mỏng (TLC) là phương pháp phân tích trong đó dung dịch chất
phân tích di chuyển trên một lớp mỏng chất hấp phụ mịn, vô cơ hay hữu cơ, theo
một chiều nhất định. Trong quá trình di chuyển, mỗi thành phần chuyển dịch với tốc
độ khác nhau, tùy theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại ở những vị trí khác

nhau [22], [10], [5].
a. Chất hấp phụ:
Hiện tượng hấp phụ là sự tích tụ một chất ở thể khí hoặc trong dung dịch trên
bề mặt một chất rắn. Các chất hấp phụ được dùng trong sắc ký lớp mỏng hầu hết là
các oxid không tan, các oxid hydrat hóa và các muối. Các chất hấp phụ thường dùng
là silica, alumina, octadecasilica, cellulose, dextran gel, polyamid, hoặc các resin
trao đổi ion khác. Silicagel là chất hấp phụ thường gặp nhất. Khả năng hấp phụ của
silicagel là do các nhóm silanol có nhóm hydroxyl. Khi bảo quản trong điều kiện
thường, silicagel dễ dàng hấp phụ nước trong không khí, làm giảm khả năng hấp
phụ của nó. Do vậy, silicagel thường được sấy ở 100-120
o
C để loại nước hấp phụ
10

mà không làm mất đi nhóm hydroxyl của đơn vị silanol. Khả năng hấp phụ của
silicagel cao nhất khi được hoạt hóa ở 105
o
C trong 2 giờ [10].


Hình 1.3. Sơ đồ tách chiết phân đoạn sử dụng dung môi không đồng tan [22]
b. Dung môi:
Tốc độ di chuyển của một chất trên bề mặt chất hấp phụ, phụ thuộc vào
dung môi. Tiêu chuẩn quan trọng nhất để lựa chọn một dung môi chính là độ phân
cực của dung môi và pH của dung môi. Chọn lựa dung môi cho sắc ký, cách tốt nhất
Dược liệu
Dịch chiết
methanol
Phân đoạn
n-hexan

Lớp nước
Phân đoạn
EtOAc
Lớp nước
Phân đoạn
n-butanol
Phân đoạn
nước
Chiết với n-butanol bão
hòa nước
Bay hơi hết MeOH, lắc với đồng
lượng ethylacetat
Cô đặc, hòa tan vào
methanol 90%
Lắc với n-hexan
Chiết bằng
methanol
11

là bằng thực nghiệm. Để định hướng cho thực nghiệm này, có thể áp dụng quy tắc
tam giác của Stahl (1960s’) (Bảng 1.3).
Bảng 1.3. Bảng tóm tắt quy tắc Stahl [10]
Mẫu thử
Chất hấp phụ
Hệ dung môi khai triển
Phân cực kém
(phytosterol, coumarin,
terpenoid, carotenoid, )
Phân cực mạnh
(silicagel, nhôm oxid)

Phân cực kém
(hexan, toluen, benzen )
Phân cực mạnh
(glycosid, polyphenol )
Phân cực kém
(silicagel RP )
Phân cực mạnh
(AcCN, methanol, nước )

Mặt khác, pH của dung môi cũng đóng vai trò quan trọng. Khi sắc ký các
polyphenol có tính acid, nếu cho thêm acid (acid formic, acid acetic băng) vào dung
môi sẽ làm giảm tương tác giữa polyphenol và silanol, mẫu sẽ di chuyển nhanh hơn
và vết gọn hơn. Ngược lại, khi sắc ký các alcaloid base có tính kiềm, người ta
thường thêm một ít kiềm (amoniac, triethylamin, diethylamin, dimethyl,
fornamid ) vào dung môi khai triển. Các chất này được gọi là chất điều chỉnh [22],
[10], .
Bảng 1.4. Một số hệ dung môi dùng trong phân tích TLC [22]
Hệ dung môi
Chất hấp phụ
Ứng dụng
Hexan:ethyl acetat
Silica gel
Tách chất ít phân cực hoặc phân
cực trung bình
Petroleum ether :
Chloroform
Silica gel
Tách chất ít phân cực, ví dụ như
các dẫn xuất acid cinamic,
coumarins

Chloroform:aceton
Silica gel
Tách chất phân cực trung bình
Benzen:aceton
Silica gel
Tách hợp chất thơm
Chloroform:methanol
Silica gel
Tách chất phân cực, ví dụ như
glycoside và polyphenol
Butanol:acid acetic:nước
Silica gel
Tách glycosid và đường
12

Methanol:acetonitril:nước
C
18
/C
8

TLC pha đảo
Đối với các acid hoặc base, thêm
lượng nhỏ acid hoặc base có thể
cải thiện sắc kí
Methanol:ethanol:nước
Polyamide
Phổ biến cho polyamide
Methanol:ethanol:nước
Cellulose

Tách chất phân cực nhiều như
đường hoặc glycosid.

1.2.2.2. Ý nghĩa - Ứng dụng
Sắc ký lớp mỏng là một phương pháp đơn giản, kinh tế và nhanh gọn có thể
được dùng cho phân tích định tính và định lượng cũng như là tinh chế hợp chất từ
thiên nhiên. Thực tế, phương pháp này rất hữu ích trong nhận dạng một hợp chất đã
biết và phát hiện sự có mặt của nhiều loại hợp chất khác trong cây cỏ, ví dụ như
phenols, steroids, alkaloids, flavonoid, và coumarin. TLC còn đóng vai trò như một
công cụ bổ trợ tối ưu hóa điều kiện của sắc ký cột, bao gồm lựa chọn pha động và
pha rắn, xác định chất phân lập từ sắc ký cột, cũng như là xác nhận sự tinh khiết của
phân đoạn phân lập được [22].
1.2.2.3. Phương pháp tiến hành
a. Chuẩn bị bản mỏng:
Bản mỏng nên được rửa sạch trước khi tiến hành khai triển do lớp hấp phụ
silicagel có thể dễ dàng bị nhiễn bẩn bởi thời gian và điều kiện bảo quản kém. Bản
mỏng được nhúng vào một bể mở. Dịch rửa có thể là methanol, methanol –
dichloromethan (1:1) hoặc isopropanol, được chạy qua hết bản mỏng. Bản mỏng đã
rửa, sau đó được hoạt hóa lại trong tủ sấy [18].
b. Chấm mẫu:
Chấm mẫu bằng phương pháp thủ công, bán tự động, hay tự động đều có thể
được dùng. Về mặt cơ bản, dịch thử và dịch chuẩn được chấm bằng ống mao quản.
Tuy nhiên, nên sử dụng phương pháp bán tự động hoặc tự động để phun mẫu.
Khoảng cách từ vị trí chấm mẫu đến rìa dưới của bản mỏng phụ thuộc vào kích
13

thước của bản mỏng. Nhìn chung, khoảng cách nên là 10-15mm đối với bản tiện
dùng (conventional plate) và 8-10mm đối với bản hiệu năng cao (high performance
plate). Phần lớn sử dụng bản có kích thước 10mm. Ngày nay, người ta thường chấm
theo băng, độ dài băng khoảng từ 8-10mm đối với bản tiện dùng và 5-8mm đối với

bản hiệu năng cao. Khoảng cách giữa các điểm/băng thường là 5, 8, 10mm, tùy
thuộc vào điều kiện làm việc thực tế. Để có được kết quả tốt nhất, băng nên mỏng
nhất có thể, thường nhỏ hơn 1mm. Chú ý không làm hỏng bề mặt bản mỏng trong
lúc phun mẫu [18].
c. Khai triển:
Bản mỏng sau khi được phun mẫu được đặt vào bình khai triển đã bão hòa
dung môi khai triển trong 15 phút. Thể tích pha động khoảng 8 -10ml đối với bản
10cm x 10cm. Thông thường, khoảng khai triển nên là 70-90mm đối với bản tiện
dùng và khoảng khai triển hợp lí và lí tưởng nhất trên bản hiệu năng cao là 50-
70mm [18].
d. Hiện màu:
Nếu các vết chấm sắc kí có màu thì hình ảnh có thể được ghi lại dưới ánh
sáng trắng. Nếu vết chấm sắc kí có huỳnh quang UV thì quan sát dưới ánh đèn tử
ngoại là cần thiết. Đối với một số chất khác, cần phun hoặc nhúng vào thuốc thử
đặc trưng để hiện màu và quan sát trực tiếp hoặc sau khi sấy. Phương pháp nhúng
có ưu điểm là tạo một màu đồng nhất cho cả bản mỏng nhưng lại dễ hòa tan chất
phân tích vào dung dịch thuốc thử hoặc làm cho vết bị kéo đuôi. Việc giữ ổn định
thời gian và nhiệt độ làm nóng đặc biệt quan trọng. Tro hóa bản mỏng dễ dàng xảy
ra nếu nhiệt độ quá cao hoặc thời gian quá lâu. Nếu acid sulfuric được dùng làm
thuốc thử hiện màu thì bản mỏng rất dễ bị tro hóa. Một số chất bị biến màu theo
thời gian, đặc biệt là sau khi đã phun thuốc thử [18].
1.2.2.4. Các yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình sắc ký
a. Xử lý mẫu và chuẩn bị dung dịch thử
Thông thường, dược liệu thường chứa nhiều hợp phần phức tạp của các chất
đã được biết đến hoặc chưa được biết đến nên sắc ký bản mỏng thể hiện được càng
14

nhiều thông tin hóa học càng tốt. Tuy nhiên, để có thể có một bản sắc ký rõ ràng và
“sạch sẽ” với độ phân giải cao các chất mục tiêu thì mẫu nên được tinh khiết hóa và
xử lý trước khi tiến hành TLC. Dung môi lý tưởng sử dụng trong chuẩn bị dung

dịch thử nên có độ hòa tan chọn lọc đối với chất phân lập và độ nhớt thấp hơn cũng
như là điểm sôi thấp hơn. Trong trường hợp này, methanol và ethanol thường được
coi là một dung môi tối ưu cho chiết mẫu trong TLC. Sau đó, tinh chế hoặc rửa dịch
chiết toàn phần thường được tiến hành để tách hợp chất mong muốn ra khỏi nhiều
tạp chất không mong muốn [18].
b. Kỹ thuật chấm mẫu
Đây là một bước quan trọng trong phân tích sắc ký lớp mỏng để có được bản
sắc ký có độ phân giải cao. Độ chính xác của các phân tích định lượng cũng bị ảnh
hưởng nhiều bởi bước này và chấm mẫu không đạt yêu cầu chính là một trong
những nguyên nhân gây sai số. Trong kỹ thuật chấm mẫu, cần chú ý một số điểm
như sau:
Lượng mẫu chấm: Khả năng chứa mẫu của bản mỏng là có giới hạn. Nếu
lượng mẫu vượt quá khả năng này thì khả năng tách sẽ giảm đáng kể. Đặc biệt là
các bản mỏng thương mại hiện nay, được tráng sẵn bởi các tiểu phân silicagel mịn
(11-12m và 5-7m), cải thiện được khả năng tách nhưng lại giới hạn khả năng
chứa mẫu. Do đó, cần thăm dò lượng mẫu chấm hợp lý để có được độ phân giải và
độ lặp lại cao nhất [18].
Độ hút ẩm của dung môi dịch chiết sẽ có thể làm thay đổi khả năng khai
triển. Nếu dung môi dịch chiết thân nước, thì sau khi chấm, điểm chấm sẽ hấp phụ
độ ẩm từ không khí đặc biệt là trong điều kiện khí hậu ẩm ướt và ảnh hưởng lớn tới
phân tích sắc ký lớp mỏng. Do đó, sau khi chấm cần sấy khô loại bỏ ẩm ngay từ đầu
nhưng tránh nhiệt độ quá cao làm biến đối chất phân tích.
Hỏng cơ học trên bề mặt bản mỏng do thiết bị chấm mẫu cũng là một trong
những nguyên nhân gây nên kết quả sắc ký không tốt trong phân tích định lượng.
Tuy nhiên, các bản mỏng thương mại có độ chắc cao và thiết bị phun mẫu bán tự
15

động hay tự động có thể hoàn toàn loại bỏ khả năng làm hỏng bề mặt bản mỏng
[18].
c. Ảnh hưởng của sự hấp phụ và độ ẩm tương đối đến sắc ký

Hoạt động của chất hấp phụ được quyết định bởi năng lượng bề mặt và diện
tích bề mặt của nó. Năng lượng bề mặt càng lớn, diện tích bề mặt càng rộng thì khả
năng hấp phụ càng cao. Khả năng hấp phụ ở silicagel là do nhiều nhóm silanol trên
bề mặt của nó, những nhóm hydroxyl hoạt hóa và hydroxyl tự do có thể tạo liên kết
hydro với các chất phân cực hoặc chưa bão hòa. Số lượng nhóm hydroxyl hoạt động
và hydroxyl tự do sẽ quyết định hoạt động của silicagel. Silanol là nhóm thân nước
và nó có thể dễ dàng liên kết với nước để tạo thành nhóm silanol hydrat hóa và mất
khả năng hấp phụ. Do đó, bản mỏng cần được hoạt hóa ở nhiệt độ cao để chuyển
hết các nhóm silanol hydrat hóa thành silanol tự do, tối ưu hóa khả năng hấp phụ
của bạn mỏng. Đây là quá trình thuận nghịch. Nhiệt độ hoạt hóa thường là 105-
110
0
C, và bản mỏng sau khi hoạt hóa phải tránh tiếp xúc với môi trường thí nghiệm
trước khi tiến hành chấm mẫu.
Độ ẩm ảnh hưởng lớn tới quá trình sắc ký. Một vài thành phần và hệ dung
môi pha động sử dụng có thể có ảnh hưởng tới độ ẩm tương đối. Điều kiện độ ẩm
30-70% sẽ đảm bảo sự ổn định của quá trình chạy sắc ký. Để có được độ lặp lại cao
giữa các phòng thí nghiệm khác nhau, trong các mùa khác nhau thì nên kiểm soát
độ ẩm trong quá trình thí nghiệm [18].
d. Vai trò của bay hơi dung môi:
Không giống như sắc ký cột, trong sắc ký bản mỏng tồn tại một pha hơi hay
còn gọi là “pha thứ ba” (third phase). Trong khoảng không gian của buồng khai
triển, pha hơi đóng vai trò quan trọng và tham gia vào quá trình khai triển. Do đó
dung môi pha động cần được bão hòa trong khoảng thời gian nhất định, thông
thường là 20 phút, để đảm bảo quá trình khai triển đạt kết quả tối ưu [18].
e. Ảnh hưởng của nhiệt độ trong phân tích sắc ký lớp mỏng:
Trong một điều kiện độ ẩm tương đối nhất định, R
f
có xu hướng cao hơn khi
khai triển mẫu trong nhiệt độ cao. Tuy nhiên, dao động giá trị R

f
nói chung không
16

vượt quá ±0.02 nếu thay đổi trong nhiệt độ khai triển rơi vào trong khoảng ±5
0
C.
Như vậy, ảnh hưởng của nhiệt độ trong sắc ký lớp mỏng không quá lớn. Tuy vậy,
nếu sự dao động nhiệt độ khai triển đạt tới mức cao thì kết quả sắc kí bản mỏng sẽ
bị ảnh hưởng lớn. Thứ nhất, điểm sôi, áp suất hơi và khối lượng riêng của mỗi dung
môi trong pha động thay đổi dẫn đến thay đổi trong tỷ lệ mỗi phần trong dung môi
khai triển. Thứ hai, nhiệt độ thay đổi chắc chắn sẽ thay đổi phần nước trong pha
động hai pha dẫn đến thay đổi độ phân cực của pha động và thay đổi phân tích sắc
ký [18].
f. Vật liệu làm bản mỏng và vật liệu tráng bản mỏng.
1.2.3. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (High performance thin layer
chromatography – HPTLC)
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là một hình thức tân tiến nhất của
công cụ TLC nhưng nó không đơn giản ám chỉ TLC công cụ tiến hành trên bản
mỏng có hiệu suất đặc biệt cao. HPTLC là một khái niệm lớn bao gồm phương
pháp luận được tiêu chuẩn hóa dựa trên cơ sở khoa học và những phương pháp định
tính, định lượng chính thống. Dụng cụ tinh vi được điều khiển bởi một phần mềm
tích hợp đảm bảo tính ứng dụng, độ tin cậy và độ lặp lại cao nhất của các số liệu
đưa ra. Trong phân tích HPTLC, các thông số của quá trình phân tích được ghi lại
và được kiểm soát chặt chẽ, do đó, đảm bảo được độ lặp lại cao. Đồng thời, các
bước của quá trình phân tích bao gồm phun mẫu, khai triển mẫu và nhận diện vết
được tiến hành bán tự động, giảm thiểu tối đa các sai số có thể gặp phải. Quá trình
phun mẫu được tiến hành bán tự động, đảm bảo chính xác thể tích mẫu phun, tốc độ
phun và không có nguy cơ hỏng cơ học bản mỏng. Trong quá trình khai triển, điều
kiện khai triển về nhiệt độ và độ ẩm được kiểm soát chặt chẽ và ghi lại đầy đủ, đảm

bảo độ lặp lại của kết quả khi tiến hành ở những phòng thí nghiệm khác nhau. Hệ
thống đèn UV tích hợp máy ảnh và hệ thống phần mềm giúp phân tích số liệu ứng
dụng trong định tính và định lượng.
Ngày nay, khi phân tích TLC được tiêu chuẩn hóa, ứng dụng của phương
pháp này ngày càng lớn. Nhiều nghiên cứu sử dụng HPTLC trong xây dựng
17

fingerprint xác định các marker hóa học đặc trưng của các loài thực vật cũng như
phân loại các loài và dưới loài và xây dựng thành bộ cơ sở dữ liệu để tra cứu [42].