BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
—oỏo—
HÔ THUỲ MINH
¡V<flIIÊN CỨU RỄ CÂY MỨC HOA TKẨN«
(HOLARKUKNA ANTIDYSKÌVTIỈRICA WALL.)
HỌ TRÚC »ÀO (APOCTNACKẠẸỊíP
Ấ^loíop
Tliư-ViEN
'-Ỉ:
\C'
.So a
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Dược
sĩKHOÁ 2002- 2007
Người hướng dẫn: GS. TS. Phạm Thanh Kỳ
ThS. Phí Tùng Lâm
Nơi thực hiện: Bộ môn dược liệu
Trường Đại học Dược Hà Nội
Thời gian thực hiện: 02- 5 / 2007
HÀ NỘI, 5/2007
LÙI c ả m ƠH
Trong quá trình thực hiện đề tài này tôi đã nhận được sự quan tâm giúp
đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các anh chị trong các bộ môn của trường.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn
GS.TS. Phạm Thanh Kỳ
ThS Phí Tùng Lâm
Những người đã trực tiếp hướng dẫn tận tình cho tôi trong suốt quá trình
thực hiện và hoàn thành luận văn.
Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn trân trọng tới:
PGS.TS. Chu Đình Kính - Viện hoá học - Viện khoa học và công nghệ

Việt Nam.
Tập thể cán bộ Bộ môn Dược liệu- Trường Đại học Dược Hà Nội
Tập thể cán bộ phòng thí nghiệm trung tâm - Trường Đại học Dược Hà Nội.
Gia đình, thầy cô và bè bạn
Đã luôn tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2007
Sinh viên
Hồ Thuỳ Minh
Trang
ĐẶT VẤN ĐÊ 1
PHẦN 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố chi Holarrhena 2
1.1.1. Đặc điểm thực vật chi Holarrhena. 2
1.1.2. Phân bố 2
1.1.3. Đặc điểm thực vật loài H. antidysenterica. 2
1.2. Những nghiên cứu về thành phần hoá học. 3
1.2.1. Alcaloid 4
1.2.2. Chất nhựa 4
1.2.3. Gôm 5
1.2.4. Glycosid 5
1.2.5 Các chất vô cơ 5
1.3. Tác dụng dược lý và công dụng. ^
1.3.1. Tác dụng dược lý 5
1.3.2. Độc tính 7
1.3.3. Công dụng 7
PHẦN 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT q u ả . 8
2.1. Nguyên liệu, phương tiện và phương pháp nghiên cứu. 8
2.1.1. Nguyên liệu 8
2.1.2. Phương tiện 8
2.1.3. Phương pháp nghiên cứu 8

2.2. Thực nghiệm và kết quả 10
MỤC LỤC
2.2.1. Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hoá học 10
2.2.2. Chiết xuất các chất trong dược liệu 17
2.2.3. Định lượng cắn các phân đoạn 19
2.2.4. Định tính cắn c và cắn D bằng SKLM. 20
2.2.5. Phân lập Aavonoid và alcaloid bằng sắc ký cột 24
2.2.5.1. Phân lập Aavonoid. 24
2.2.5.2. Phân lập alcaloid. 26
2.2.6. Nhận dạng các chất HMjVà RM2 28
2 .2 .6 .1. Nhận dạng chất HM J. 28
2.2.6.2. Nhận dạng chất RM2. 29
2.3. Bàn luận về kết quả. 30
PHẦN 3. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT. 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO.
PHU LUC.
Trang
Bảng 2.1: Kết quả định tính các nhóm chất chính trong vỏ rễ Mức 16
hoa trắng bằng phản ứng hoá học.
Bảng 2.2: Kết quả định tính các cắn A, B, c, D 19
Bảng 2.3: Hàm lượng các chất trong phân đoạn A, B, c, D 20
Bảng 2.4: Kết quả định tính flavonoid trong cắn c bằng SKLM. 21
Bảng 2.5: Kết quả định tính alcaloid trong cắn D bằng SKLM. 23
Bảng 2.6: Kết quả định tính HMj bằng SKLM. 25
Bảng 2.7: Bảng số liệu cộng hưởng từ hạt nhân của HMj 28
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 : Sơ đồ chiết suất các chất trong vỏ rễ Mức hoa trắng. 18
Hình 2.2: Ảnh sắc ký đồ cắn c khai triển ở hệ dung môi IV. 22
Hình 2.3: Ảnh sắc ký đồ cắn D khai triển ở hệ dung môi I. 23

Hình 2.4: Ảnh sắc ký đồ của HMj khai triển ở 3 hệ dung môi khác 25
nhau.
Hình 2.5: Ảnh sắc ký đồ của HMj, Ftp khai triển ở hệ dung môi IV 25
Hình 2 .6 : Cấu trúc hoá học của HMl 28
Hình 2.7: Cấu trúc hoá học của RMj 29
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MUC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
0
'^C-NMR:
Carbon (13) Nuclear magnetic resonance
DC:
Dịch chiết
dd:
dung dịch
P tp :
Flavonoid toàn phần
'H-NMR:
Proton nuclear magnetic resonance
H.:
Holarrhena
LD50:
Lethal dose 50%
IR:
Infrared
MS;
Mass spectrometry
NXB:
Nhà xuất bản
Pư:
Phản ứng

SKLM:
Sắc ký lớp mỏng
Thuốc thử
UV:
Ultraviolet
1.2.3. Gôm[l], [16], [22]
Chất gôm màu nâu, vị đắng, có tỷ trọng 1,092; chỉ số acid 65,28; chỉ số
ester 106; chỉ số xà phòng 171,42 và chỉ số acetyl 150,52.
1.2.4. Glycosid. [1], [22].
Gần đây, nhóm tác giả ở Pháp đã phân lập được từ vỏ 3 glycosid:
Normitiphyllin, holarosin A và B.
1.2.5. Các chất vô cơ.
Tro từ gỗ mức hoa trắng giàu chất Kali gồm 17,5% chất tan có: K2CO3
(10,82%), KCl (4,2%), K2SO4 (2,48%) và chất tro không tan 80,24%. [1],
[16], [2 2 ].
1.3. TÁC DỤNG DƯỢC LÝ VÀ CÔNG DỤNG.
1.3.1. Tác dụng dược lý [I],{17], [21],[22].
■ Alcaloid toàn phần của mức hoa trắng có tác dụng sau:
o Thí nghiệm trên ống nghiệm, thuốc có tác dụng diệt Entamoeba
moskowskii.
o Thí nghiệm trên mèo, thuốc gây hạ huyết áp và ức chế tim, tác
dụng này yếu so với emetin.
o Liều lượng lớn của thuốc trên súc vật thí nghiệm gây co giật
trước khi chết.
■ Cao cồn chiết từ quả mức hoa trắng có tác dụng chống ung thư và ức
chế tế bào Carcinom epidermoid từ họng hầu trên môi trường nuôi
cấy.
■ Cao chiết từ quả có tác dụng hạ đường huyết trên chuột cống trắng.
■ Cao chiết bằng chloroform và methanol từ hạt có tác dụng kháng
khuẩn đối với Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa và Staphylococcus aureus.
■ Conessin[l],[16],[22]:
Chất conessin rất ít độc. Với liều cao, tác dụng gần giống morphin, nó gây
liệt trung tâm hô hấp, giai đoạn đầu là kích thích, tiếp theo làm giảm hô hấp,
dùng với liều ngộ độc làm ngừng thở trước khi tim ngừng đập.
Nếu tiêm dưới da chuột lang, conessin gây tê tại chỗ (mạnh gấp 2 lần so
với cocain) nhưng lại kèm theo hiện tượng hoại thư nên tác dụng này không
được sử dụng trên lâm sàng. Đối với ếch, tiêm dưới da, thuốc có tác dụng gây
mê.
Đối với hệ tim mạch, conessin dùng liều lớn có tác dụng giống quinin,
phong bế dẫn truyền nhĩ- thất, gây hạ huyết áp và giảm nhịp tim.
Conessin dùng đường uống có tác dụng ức chế hoạt động các men ptyalin,
pepsin và trypsin.
Conessin kích thích sự co bóp ruột và tử cung.
Ngoài ra, conessin còn có tác dụng diệt côn trùng bằng cách làm bất dục và
gây biếng ăn, conessin có tác dụng trừ giun đối với chuột bạch.
Conessin có tác dụng diệt amip, thí nghiệm ngoài cơ thể nồng độ có hiệu
quả đối với Entamoeba histolytica của conesssin là: 1:71000 - 1:45000, còn
của emetin là: 1: 200000 - 1: 300000. Trên lâm sàng, người ta dùng conessin
chlohydrat hay bromhydrat chữa lỵ amíp. Nó tác dụng cả đối với kén và amip,
còn emetin chỉ tác dụng đối với amip. Hiện tượng không chịu thuốc rất ít hoặc
không đáng kể. Kết quả cho thấy tác dụng diệt amíp của conessin kém hơn
emetin, conessin có tác dụng diệt cả Trichomonas vaginalis và Trichomonas
intestinalis.
■ Kurchỉcin:
Chất kurchicin thí nghiệm trên động vật cũng có tác dụng ức chế tim,
đặc biệt là phong bế sự dẫn truyền bó Hiss, làm hạ huyết áp. Nó còn có tác
dụng kích thích cơ trơn, gây tăng co bóp đối với ruột và tử cung cô lập. [
2 2 ].
^ Định tính flavonoid và alcaloid trong dược liệu bằng sắc ký lớp mỏng, dùng

bản mỏng Silicagel GF254 (Merck) đã tráng sẵn.
^ Phân lập bằng sắc ký cột, chất hấp phụ là Silicagel có kích thước hạt 40 -
60 |am (Merck) và kích thước 15-40 ỊLim (Merck)
^ Nhận dạng các chất phân lập được dựa vào số liệu các phổ: phổ hồng ngoại
(IR), phổ tử ngoại (UV), phổ khối (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân
(NMR).
❖ Phản ứng với PeCls 5%:
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm 2-3 giọt dd. PeClg 5% thấy xuất
hiện màu xanh đen.
❖ Phản ứng với AICI3 3% trong cồn:
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm 2-3 giọt dd. AICI3 3% trong cồn
thấy xuất hiện màu vàng ánh xanh
Kết quả: Dịch chiết vỏ rễ có Aavonoid.
2.2.13. Định tính Saponin
❖ Hiện tượng tạo bọt:
Cho vào ống nghiệm to 0,5g bột dược liệu, thêm 5 ml nước, đun sôi nhẹ,
lọc nóng. Dịch lọc cho vào ống nghiệm to, thêm 10 ml nước. Lắc mạnh trong
5 phút theo chiều dọc ống nghiệm. Để yên, quan sát thấy cột bọt không bền
sau 15 phút.
❖ Quan sát hiện tượng phá huyết:
Cho Ig bột dược liệu vào 20ml dung dịch NaCl 0,9%, đun cách thuỷ trong
30 phút, lọc nóng lấy dịch lọc để làm thí nghiệm sau:
Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống Iml dung dịch máu 2%
Ống 1: thêm 2ml dịch lọc trên
Ống 2: thêm 2ml dung dịch NaCl 0,9%
Lắc đều cả 2 ống nghiệm. Quan sát thấy cả 2 ống nghiệm đều không có cắn.
Kết quả: Dịch chiết vỏ rễ không có Saponin.
2.2.1.4. Định tính Anthranoỉd:
❖ Phản ứng Borntrager;
Cho 3g bột dược liệu vào bình nón dung tích lOOml, thêm 50 ml dd. H2SO4

10%, đun sôi cách thuỷ trong 15 phút. Lọc nóng vào bình gạn. Để nguội rồi
lắc với 5 ml ether ethylic. Gạn lấy phần ether cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống
Iml dịch chiết.
• Ống 1: Thêm 1 ml NH4OH 10% -> 2 lớp dung môi trong suốt
• Ống 2: Thêm 1 ml NaOH 10% - > 2 lớp dung môi trong suốt
11
❖ Vi thăng hoa;
Cho khoảng Ig bột dược liệu vào một nắp nhôm. Hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn
cồn đến khi bay hoi hết nước trong dược liệu. Đặt lên miệng nắp nhôm một
lam kính, trên lam kính có để một miếng bông tẩm nước lạnh, Đốt nắp nhôm
trên ngọn lửa đèn cồn. Sau 5-10 phút, lấy lam kính ra để nguội. Soi dưới kính
hiển vi, không thấy có tinh thể.
Kết quả: Vỏ rễ dược liệu không có anthranoid.
2.2.1.5, Định tính Glycosid tìm
Cho lOg bột dược liệu vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 60 ml cồn
20°, lắc đều để qua đêm. Gạn lấy dịch chiết, loại tạp bằng chì acetat 30% dư.
Để lắng, lọc. Loại chì acetat thừa bằng dd. Na2S0 4 bão hoà đến khi không còn
tủa với Na2S0 4 nữa. Lọc lấy dịch lọc vào bình gạn. Lắc kỹ 2 lần với
chloroform, mỗi lần 20 ml. Gạn dịch chloroform vào cốc có mỏ, bốc hơi cách
thuỷ đến khô. Hoà tan cắn trong 5 ml cồn 90° để làm phản ứng:
❖ Phản ứng Liebermann:
Cho Iml dịch chiết vào ống nghiệm, cô cách thuỷ đến cắn. Thêm Iml
anhydrid acetic, lắc đều cho đến khi tan hết cắn. Đặt nghiêng ống nghiệm 45°,
thêm từ từ theo thành ống Iml dd. H2SO4 đặc để dịch lỏng trong ống nghiệm
chia thành 2 lớp. Thấy xuất hiện 1 vòng tím đỏ ỏ mặt phân cách giữa hai lớp
chất lỏng.
<♦ Phản ứng Baijet:
Cho Iml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 0, 5 ml thuốc thử Baijet mới pha
(gồm 1 phần dd. acid picric 1% và 9 phần dd. NaOH 10%), không thấy xuất
hiện màu đỏ cam.

❖ Phản ứng Legal;
Cho Iml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 5 giọt dd. Natri nitroprussiat 1%
và 2 giọt dd. NaOH 10%. Lắc đều, không thấy xuất hiện màu đỏ.
Kết quả: Dịch chiết vỏ rễ không có Glycosid tim.
12
2.2.L6. Định tính Coumarin
Cho 3g bột dược liệu vào bình nón lOOml, thêm 30ml cồn 90®. Đun
cách thuỷ sôi 5 phút. Lọc nóng, dịch chiết thu được dùng làm phản ứng:
❖ Phản ứng mở, đóng vòng lacton:
Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống Iml dịch chiết:
• Ống 1: Thêm 0,5ml dd. NaOH 10%
• Óng 2: Để nguyên
Đun cả hai ống nghiệm đến sôi, để nguội. Quan sát thấy:
• Ống 1; Trong
• Ống 2: Trong
Thêm vào cả 2 ống nghiệm, mỗi ống 2 ml nước cất. Lắc đều, thấy;
• Ổng 1: Trong suốt
• Ống 2; Trong suốt
Phản ứng diazo hoá:
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm 2 ml dd. NaOH 10%. Đun
cách thuỷ sôi 5 phút rồi để nguội. Thêm vài giọt TT. diazo mới pha, không
thấy xuất hiện màu đỏ gạch.
Kết quả: Dịch chiết vỏ rễ không có Coumarin.
2.2,1.7. Định tính Tanỉn
Cho vào ống nghiệm Ig bột dược liệu, thêm 10 ml nước cất, đun sôi
trực tiếp 5 phút. Lọc qua giấy lọc gấp nếp, Dịch lọc cho vào 3 ống nghiệm,
mỗi ống 1 ml dịch chiết.
❖ Phản ứng vối PcCIị:
• Ống 1: Thêm 2-3 giọt dd PeClg 5% thấy xuất hiện màu xanh
đen.

❖ Phản ứng với gelatin:
• Ống 2: Thêm 2-3 giọt dd. gelatin 1% thấy xuất hiện tủa bông.
13
*> Phản ứng với chì acetat:
• Ống 3: Thêm 2-3 giọt dd. chì acetat 10% thấy xuất hiện tủa.
Kết quả: Dịch chiết vỏ rễ có tanin
2.2.1.8. Định tính Acid hữu cơ
Cho Ig bột dược liệu vào ống nghiệm, thêm lOml nước cất. Đun sôi
trực tiếp 10 phút, để nguội, lọc. Thêm vào dịch lọc một ít tinh thể NajCOj.
Quan sát thấy có bọt khí COj.
Kết quả: Dịch chiết vỏ rễ có acid hữu cơ.
2.2.1.9. Định tính Acid amin
Cho Ig bột dược liệu vào ống nghiệm, thêm lOml nước cất, đun sôi 5
phút. Lọc nóng, lấy 2ml dịch chiết cho vào một ống nghiệm khác, thêm 2-3
giọt TT. Ninhydrin 3%, đun cách thuỷ sôi 10 phút, không thấy xuất hiện màu
tím.
Kết quả: Dịch chiết vỏ rễ không có acid amin.
2.2.1.10. Định tính đường khử
Cho 2ml dịch chiết nước vào ống nghiệm, thêm 3 giọt TT. Fehling A và
3 giọt TT. Fehling B. Đun cách thuỷ 10 phút, thấy có tủa đỏ gạch.
Kết quả: Dịch chiết vỏ rễ có đường khử.
2.2.1.11. Định tính chất béo
Cho lOg bột dược liệu vào bình nón dung tích 50ml, đổ ngập ether dầu
hoả, ngâm qua đêm, lọc. Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc, hơ nóng cho
bay hết dung môi, không thấy để lại vết mờ trên giấy lọc.
Kết quả: Dịch chiết vỏ rễ không có chất béo.
2.2.1.12. Định tính Steroid
Cho vào ống nghiệm Iml dịch chiết ether dầu hoả. Bốc hơi dung môi đến
khô. Thêm vào ống nghiệm 1 ml anhydrid acetic, lắc kỹ. Để nghiêng ống
nghiệm 45° rồi thêm Iml H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm, thấy mặt phân

cách giữa hai lớp chất lỏng có màu xanh.
Kết quả: Dịch chiết vỏ rễ có hợp chất steroid.
14
2.2.1.13. Định tính caroten
Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết ether dầu hoả, bốc hơi cách thuỷ đến
cắn. Thêm 2 giọt H2SO4 đặc vào cắn, không thấy ống nghiệm chuyển sang
màu xanh da trời.
Kết quả: Dịch chiết vỏ rễ không có caroten.
2.2.1.14. Định tính polysaccharìd
Cho 2g bột dược liệu vào một cốc có mỏ, thêm lOml nước cất, đun cách
thuỷ sôi 5 phút, lọc nóng. Cho vào 2 ống nghiệm:
• Ống 1: 4ml dịch chiết và 5 giọt TT. Lugol ( I2/K I)
• Ống 2: 4ml nước cất và 5 giọt TT. Lugol
Quan sát thấy ống 1 có màu đỏ đậm hơn ống 2.
Kết quả: Dịch chiết vỏ rễ có polysaccharid.
Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong vỏ rễ mức hoa trắng được
tóm tắt ở bảng 2.1
Nhân xét: Qua các phản ứng định tính, chúng tôi thấy:
Trong vỏ rễ Mức hoa trắng có chứa: alcaloid, flavonoid, tanin, acid hữu
cơ, đường khử, steroid, polysaccharide. Trong đó: alcaloid và flavonoid là 2
nhóm chất chính. Do đó, hướng nghiên cứu của chúng tôi tập trung vào nhóm
flavonoid và alcaloid trong vỏ rễ cây Mức hoa trắng.
15
Bảng 2.1: Kết quả định tính các nhóm chất chính trong vỏ rễ mức hoa
trắng bằng phản ứng hoá học
'1'1 Nhóm chất Phản ứng định tính
Kết quả Kết luận
1
Alcaloid
Pư với TT. Mayer

+++
Có
Pư với TT. Dragendorff
+++
Pư với TT. Bouchardat
+++
2 Flavonoid
Pư Cyanidin
+++
Có
Pư với kiềm
+++
Pư với FeClj
5 %
+++
Pư với AICI3
3 %
trong cồn
+++
3 Glycosid tim
Pư Liebermann
++
Không có
Pư Baijet
-
Pư Legal
-
4 Saponin
Hiện tượng tạo bọt
-

Không có
Hiện tượng phá huyết
-
5 Anthranoid
Pư Bomtrager
-
Không có
Vi thăng hoa
-
6 Coumarin
Pư mở đóng vòng lacton
-
Không có
Pư với TT. Diazo
-
7 Tanin
Pư với FeClj 5%
+++
Có
Pư với Pb(CH3COO)2 10%
+++
Pư với gelatin
1 %
+++
8 Acid hữu cơ
Pư với bột Na2 C0 3
+
Có
9 Acid amin
Pư với '11'. Ninhydrin 3% - Không có

1 0 Đường khử
Pư với TT. Fehling ++ Có
1 1 Chất béo
Vết mờ trên giấy lọc
- Không có
1 2
Steroid Pư Liebermann
++
Có
13
Carolen
Pư với H2SO4
-
Không có
14 Polysaccharid
Pư với 'rr. Lugol
++
Có
Ghi chứ: (-): Phản ứng âm tính. (+): Phản ứng dương tính.
(++): Phản ứng dương tính rõ. (+++): Phản ứng dương tính rất rõ.
16
Cân khoảng 20g bột dược liệu, chiết bằng methanol trong Soxhlet đến
khi dịch chiết trong suốt. Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm và cô cách
thuỷ đến cắn. Hòa cắn thu được nhiều lần trong nước nóng, lọc qua bông và
giấy lọc thu được dịch chiết nước. Dịch chiết thu được lắc với các dung môi có
độ phân cực tăng dần theo sơ đồ hình
2.1 trang 18.
2.2.2. Chiết xuất các chất trong dược liệu
17
Hình 2.1: Sơ đồ chiết xuất các chất trong dược liệu

18
Các cắn của bốn phân đoạn trên được định tính ílavonoid và alkaloid. Kết quả
được trình bày ở bảng 2 .2
Bảng 2.2: Kết quả định tính các cán A, B, c, D
STT Nhóm
chất
Phản ứng định tính
Cắn A CắnB
CắnC Cắn D
1
Flavonoid
Phản ứng Cyanidin
-
-
+++
-
Với NaOH
-
-
+++
-
Với NH3
- -
+++
-
2
Alcaloid
TT Dragendorff
-
+

-
+++
TT Mayer
-
+
-
+++
TT Bouchardat
-
+
-
+++
Kết quả: Flavonoid có ở cắn c. Trong cắn B và cắn D có Alcaloid nhưng ở cắn
D phản ứng lên rõ hơn.
2.2.3. Định iượng cắn các phân đoạn:
Cân chính xác 50g bột dược liệu đã xác định độ ẩm. Chiết xuất theo sơ đồ
ở hình 2.1. Cắn A, B, c, D thu được đem sấy ở 60° c tới khối lượng không đổi.
Cân cắn và tính ra hàm lượng trong các phân đoạn theo công thức:
a X 100
F% =
M X ( 100% - x% )
F: hàm lượng các chất trong phân đoạn (%)
a: khối lượng cắn (g)
M: khối lượng dược liệu đem chiết (g)
x: độ ẩm dược liệu (%)
Làm 5 lần, kết quả định lượng được ghi ở bảng 2.3
19
Hệ II: Ethylacetat: Acid formic: H2O (8 : 1: 1).
Hệ III; Toluen: Ethylacetat: Acid formic (5: 6 : 2, 5).
Hệ IV: Toluen: Ethylacetat: Acid formic : HjO (5: 6 : 1, 5 :1).

Hệ V: n-Butanol: Acid acetic: HjO (4: 1: 2, 5).
Hệ VI: Chloroform: Methanol (9: 1).
Hệ VII: Ethylacetat: Qiloroform: Acid formic (5:5: 1).
Bản sắc ký được sấy nhẹ 15 phút cho bay hết hơi dung môi.
❖ Hiện màu: Amoniac đặc. Sau đó quan sát dưới ánh sáng thường và đèn
tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366 nm.
Khai triển sắc ký qua 7 hệ dung môi chúng tôi nhận thấy hệ IV tách tốt nhất.
Kết quả SKLM chạy ở hệ dung môi IV được trình bày ở bảng 2.4 và hình 2.2.
Bảng 2.4 Kết quả định tính flavonoid trong cán c bằng SKLM
Vết
R.
Độ đậm
Màu sắc
AS thường Hơi NH3
uv 366nm
VI 0, 55
+ Vàng xám
Vàng xám Nâu
V2
0 ,4 6
++++
Vàng nâu Vàng nâu Đen
V3
0,41
+
Vàng nhạt Vàng nhạt Nâu
V4 0, 34
+++
Vàng nâu
Vàng nâu Đen

V5
0 , 26
++ Vàng nhạt
Vàng nhạt Đen
V6 0 , 1 1
++
Vàng nhạt
Vàng nhạt
Đen
Nhận xét: Dịch chiết flavonoid toàn phần trong vỏ rễ Mức hoa trắng có 6 vết,
trong đó vết V2 lớn nhất sau đó đến V4.
21
u v 366nm Ánh sáng thường Hơi NH3
Hình 2.2 : Sắc ký đồ cắn c khai triển ở hệ dung môi IV
2.2.4.2. Định tính alcaloid trong cấn D bằng SKLM
Cắn D được hoà tan trong methanol để chấm sắc ký.
❖ Chất hấp phụ: Bản mỏng Silicagel GF254 (Merck) hoạt hoá ở 110®c
trong 1 giờ. Để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm.
❖ Hệ dung môi: Chấm dịch chiết methanol ở trên lên bản mỏng. Sấy nhẹ
cho khô. Triển khai sắc ký vói các hệ dung môi sau:
Hệ I: Chloroform: Methanol: NH4OH (50: 9: 1).
Hệ II: Chloroform: Aceton: Methanol: Amoniac 25% (20: 20: 3: 1).
Hệ III: Chloroform: Methanol: NH4OH (9: 1: 1)
Hộ IV; n-Buthanol: acid acetic: H2O (4: 1: 5).
Hệ V: Chloroform: Methanol: NH4OH (19: 1: 0, 5)
Hệ VI: Chloroform: Methanol (9: 1).
❖ Hiện màu: Bản sắc ký để ở nhiệt độ phòng cho bay hết hơi dung môi.
Phun hiện màu bằng TT. Dragendorff quan sát dưói ánh sáng thường.
Sau nhiều lần triển khai cho thấy hệ I tách tốt nhất. Kết quả SKLM vói hệ
dung môi I được trình bày ở bảng 2.5 và hình 2.3

22
Bảng 2.5: Kết quả định tính alcaloid trong cắn D bằng SKLM triển khai
vớỉ hệ dung môi I:
Vết
Màu khi phun ri'
Dragendorff
Rf
Độ đậm
VI
Vàng cam
0, 73
++++
V2 Vàng cam
0 , 68 ++
V3 Vàng cam
0, 63
++++
V4 Vàng cam
0, 58
++
V5 Vàng cam
0,42
+++
V6
Vàng cam
0, 37
+++
Nhận xét: Dịch chiết cắn D của vỏ rễ cây Mức hoa trắng 6 vết alcaloid, trong
đó có vết VI,V3 là lớn nhất, sau đó đến V5, V6 .
Hình 2.3: Sắc ký đồ cắn D khai triển ở hệ dung môi I

23
2.2.5. Phân lập flavonoid và alcaỉoid bằng sắc ký cột
2.2.5.1. Phân lập flavonoid
• Chất nhồi cột là Silicagel có cỡ hạt 40 - 60 |am (Merck).
• Chuẩn bị cột sắc ký:
Cột sắc ký có kích thước 2 cm X 50 cm. Lắp thẳng đứng cột trên giá.
Vặn chặt khoá cột lại. Lót một lớp bông mỏng ở đáy cột. Cho từ từ sillicagel
trong chloroform vào cột. Mở khoá cho dung môi chảy qua cột nhiều lần. Để
cột ổn định 12 giờ.
♦> Tiến hành sắc ký cột:
Mở khoá cho dung môi chảy từ từ đến khi lớp chloroform cách bề mặt
silicagel khoảng Icm. Vặn khoá cột lại.
Cắn c được hoà tan hoàn toàn trong một lượng tối thiểu methanol, thêm
một ít Silicagen khô cho thấm đều dung dịch đậm đặc này, để ngoài không khí
cho bay hơi hết dung môi để phần Silicagen khô tcd như ban đầu. Cho từ từ lên
cột tránh bọt khí, sau đó phủ một lớp silicagel sạch lên bề mặt.
Rửa giải flavonoid trong cột bằng chloroform và ethylacetat, tăng dần tỷ lệ
ethyacetat.
Hứng dịch rửa giải vào các ống nghiệm, mỗi ống 1.5 ml.
Kiểm tra dịch rửa giải bằng SKLM, thu được kết quả như sau
• Từ ống 17 đến ống 22; Thu được 1 vết, ký hiệu HM3.
• Từ ống 23 đến ống 34: Thu được 2 vết, ký hiệu HM4, HM5.
• Từ ống 35 đến ống 38: Thu được 1 vết, ký hiệu HMị.
• Từ ống 39 đến ống 42: Thu được 2 vết HM| và HM2.
• Từ ống 43 đến ống 48: Thu được 1 vết, ký hiệu HM2.
Gộp các ống nghiệm đã kiểm tra có một vết cùng Rf với nhau. Để bay
hơi tự nhiên, kết tinh lại nhiều lần thu được 1 chất HM|
24
Kiểm tra độ tinh khiết của HMj phân lập được bằng SKLM:
Chấm dung dịch HMi lên bản mỏng, khai triển bằng 3 hệ dung môi

Hệ I: Chloroform: aceton: acid acetic (80: 20: 5).
Hệ IV: Toluen: Ethylacetat: Acid formic : HjO (5: 6 : 1, 5 :1).
Hệ V: n-Butanol: Acid acetic: H2O (4: 1: 2, 5).
Lấy các tấm sắc ký ra, sấy nhẹ cho bay hết hoi dung môi, quan sát dưới
ánh sáng thường. Kết quả cho thấy HMi chỉ xuất hiện một vết màu vàng nâu.
Do đó có thể kết luận HMi tương đối tinh khiết. Kết quả triển khai SKLM ở 3
hệ dung môi khác nhau được trình bày ở bảng 2.6 và hình 2.4
Bảng 2.6 : Kết quả định tính HMj bằng SKLM
Chất thử
Hệ dung môi
Rf
HMi
H ệl
0 ,11
Hệ IV
0,45
Hệ V
0, 67
t
Hệ I Hệ IV Hệ V
Hình 2.4: Sắc ký đồ của HMi
khai triển ở 3 hệ dung môi khác nhau
HMi Ftp
Hình 2.5: Sắc ký đồ của
HMi, Ftp trong hệ IV
25
2.2.5.2. Phân lập alcaloỉd
• Chất nhồi cột là Silicagel có cỡ hạt 40 - 60 |am (Merck).
• Qiuẩn bị cột sắc ký:
Cột sắc ký có kích thước 2 cm X 50 cm. Lắp thẳng đứng cột trên giá.

Vặn chặt khoá cột lại. Lót một lớp bông mỏng ở đáy cột. Cho từ từ sillicagel
trong chloroform vào cột. Mở khoá cho dung môi chảy qua cột nhiều lần. Để
cột ổn định 12 giờ.
• Tiến hành sắc ký cột:
Mở khoá cho dung môi chảy từ từ đến khi lớp chloroform cách bề mặt
silicagel khoảng Icm. Vặn khoá cột lại.
Cắn D được hoà tan hoàn toàn trong một lượng tối thiểu methanol, thêm
một ít Silicagen khô cho thấm đều dung dịch đậm đặc này, để ngoài không khí
cho bay hơi hết dung môi để phần Silicagen khô tơi như ban đầu. Cho từ từ lên
cột tránh bọt khí, sau đó phủ một lớp silicagel sạch lên bề mặt.
Rửa giải alcaloid trong cột bằng chloroform và methanol, tăng dần độ
phân cực bằng methanol theo tỷ lệ như sau:
CHCL3(9 9 , 5ml): MeOH (0, 5ml)
CHCL3(99ml): MeOH (Iml)
CHCL3 (98, 5ml): MeOH (1, 5ml)
CHCL3 (98ml): MeOH (2ml).
Hứng dịch rửa giải vào các ống nghiệm, mỗi ống 2 ml.
Kiểm tra dịch rửa giải bằng SKLM, thu được kết quả như sau:
• Từ ống 1 đến ống 10 : Thu được 4 vết giống nhau.
• Từ ống 12 đến ống 84: Thu được 2 vết giống nhau.
• Từ ống 85 đến ống 110: Thu được 3 vết giống nhau.
• Từ ống 11 Iđến ống 126: Thu được 3 vết giống nhau
• Từ ống 127 đến ống 142: Thu được 1 vết giống nhau.
26
Gộp các ống có vết cùng Rf, để bay hơi tự nhiên, thu được cắn. Gộp các ống từ
SỐ127 đến 142 để bay hơi tự nhiên thu được chất bột kí hiệu RMj.
Ống 1 2 -84 sau khi đã gộp để bay hơi còn cắn tiếp tục phân lập bằng sắc ký
cột lần 2 như trên, thu được kết quả sau:
, Từ ống 12 đến ống 58 có 1 vết.
Từ ống 59 đến ống 75 có 2 vết.

Phân đoạn từ ống 12 đến 58 để bay hơi dung môi thu được chất bột kí hiệu
RMj.
2.2.6. Nhận dạng các chất HM l và RMl
2.2.6.1. Nhận dạng HM l
Để xác định cấu trúc của hợp chất HMj các loại phổ đã được sử dụng là:
+ Phổ tử ngoại (UV) đo trong Methanol có đỉnh hấp thụ cực đại X niax
294nm; 258nm và 227nm.
+ Phổ khối lượng được ghi trên thiết bị 5989 B-HP-MS cho kết quả HM| có
M'^=154amu ứng với công thức cộng C7ĨỈ6O4 tra thư viện phổ thu được kết quả
HM| là 3,4-dihydroxy-benzoic acid với độ trùng hợp là 91%.
+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cho kết quả hoàn toàn phù hợp với kết quả
thư viện phổ cung cấp:
Phổ ^^C-NMR cho phép xác định HM] có 4 cacbon bậc 4 và 3 nhóm
-CH= trong đó cacbon bậc 4 có ỗ=167,276ppm rất đặc trưng cho cacbon
acid.
Phổ 'H-NMR bao gồm 3 pic đều đặc trưng cho proton nhân thơm và có
hằng số tương tác hoàn toàn phù hợp với cấu trúc đã được đưa từ phổ khối.
Kết hợp với phổ mô phỏng, số hiệu phổ NMR của hợp chất HM| được đưa ra
ở bảng 2.7
27