BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI







PHÙNG THỊ MỸ HẠNH





NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT ACID
SHIKIMIC TỪ ĐẠI HỒI




LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2013




BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI






PHÙNG THỊ MỸ HẠNH



NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT
ACID SHIKIMIC TỪ ĐẠI HỒI




LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC



CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM – BÀO CHẾ
MÃ SỐ: 60720402





Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Văn Hân







HÀ NỘI 2013


LỜI CẢM ƠN !


Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, trước tiên, em xin gửi lời cảm
ơn chân thành tới thầy giáo TS. Nguyễn Văn Hân, người đã trực tiếp hướng
dẫn, chỉ bảo tận tình và giúp đỡ em hoàn thành luận văn này.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện và
toàn thể các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên Bộ môn Công nghiệp
Dược đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em hoàn thành luận văn đúng thời
hạn.
Và em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trường Đại học
Dược Hà Nội, những người đã dạy dỗ và chỉ bảo em tận tình trong suốt

những tháng năm học tập tại trường.
Cuối cùng, với lòng biết ơn vô hạn, em xin phép được gửi lời cảm ơn
tới gia đình, người thân, bạn bè đã động viên và hỗ trợ em trong suốt thời
gian qua.
Do thời gian có hạn và trình độ bản thân còn hạn chế nên luận văn
không thể tránh khỏi những thiếu sót. Vì vậy, em rất mong nhận được sự chỉ
bảo tận tình của các thầy cô và sự góp ý chân thành của bạn bè.
Em xin chân thành cảm ơn !


Hà Nội, tháng 08 năm 2013

Học viên:

Phùng Thị Mỹ Hạnh
MỤC LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1. Tổng quan về cây hồi 3
1.1.1. Vị trí phân loại và phân bố 3
1.1.2. Đặc điểm thực vật 3
1.1.3. Bộ phận dùng, thu hái và chế biến 4
1.1.4. Thành phần hóa học và công dụng 5
1.1.5. Tinh dầu hồi 6
1.2. Tổng quan về acid shikimic 7
1.2.1. Công thức hóa học và tính chất 7
1.2.2. Kỹ thuật phân tích 8

1.2.3. Nguồn gốc acid shikimic 8
1.2.4. Vai trò acid shikimic 9
1.2.5. Một số nghiên cứu chiết xuất acid shikimic từ đại hồi 10
1.3. Nhận xét 11

CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13
2.1. Nguyên vật liệu 13
2.1.1. Nguyên liệu 13
2.1.2. Hóa chất, thiết bị, dụng cụ 14
2.2. Nội dung nghiên cứu 15
2.2.1. Lựa chọn phương pháp chiết xuất 15
2.2.2. Xây dựng phương pháp tinh chế acid shikimic từ dịch chiết nước 16
2 3. Phương pháp nghiên cứu 16
2.3.1. Phương pháp định lượng acid shikimic 16
2.3.2. Phương pháp chiết xuất acid shikimic và cất tinh dầu 18
2.3.3. Phương pháp tinh chế acid shikimic 19
2.3.4. Kiểm tra chất lượng sản phẩm 19

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 21
3.1. Hàm lượng acid shikimic trong đại hồi 21
3.2. Khảo sát giai đoạn chiết xuất 22
3.2.1. Chiết xuất theo phương pháp A 22
3.2.2. Chiết xuất theo phương pháp B 25
3.2.3. Đánh giá và lựa chọn phương pháp chiết xuất 29
3.3. Tinh chế acid shikimic 33
3.3.1. Khảo sát và lựa chọn dung môi tinh chế 34
3.3.2. Bước đầu khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến quá trình kết tủa acid shikimic
bằng isopropanol 41
3.4. Đề xuất phương pháp chiết xuất acid shikimic và kiểm tra chất lượng sản
phẩm 42

3.4.1. Đề xuất phương pháp chiết xuất acid shikimic 42
3.4.2. Kiểm tra chất lượng sản phẩm 44
3.5. Mở rộng quy mô 48
3.5.1. Mô tả quy trình 48
3.5.2. Kết quả 50

CHƯƠNG 4 : BÀN LUẬN 51
4.1. Về giai đoạn chiết xuất 51
4.2. Về giai đoạn tinh chế 52


KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT


AC : aceton
AS : acid shikimic
DD : dung dịch
DL : dược liệu
EtOH : ethanol
IPA : isopropanol
MeOH : methanol
PP : phương pháp
SP : sản phẩm
IR : phổ hồng ngoại
MS : phổ khối lượng

1
H-NMR : phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
13
C-NMR : phổ cộng hưởng từ hạt nhân
13
C


DANH MỤC CÁC BẢNG


Trang

Bảng 1.1. Vị trí phân loại của cây hồi (Illicium verum Hook. f.)…… … 3
Bảng 3.1. Kết quả hiệu suất chiết acid shikimic theo phương pháp A…… 24
Bảng 3.2. Nồng độ acid shikimic trong dịch chiết sau mỗi giờ theo PP B….27
Bảng 3.3. Kết quả hiệu suất 3 lần chiết acid shikimic bằng PP B………….28
Bảng 3.4. Kết quả xác định hệ số chọn lọc của 2 phương pháp…………….30
Bảng 3.5. Kết quả cất tinh dầu của hai phương pháp…………………… 31
Bảng 3.6. Bảng so sánh tốc độ cân bằng, hiệu suất chiết, hàm lượng AS
trong cắn (S), thể tích tinh dầu và thời gian chiết xuất……… 32
Bảng 3.7. Kết quả quá trình tinh chế
sử dụng các dung môi tinh chế khác nhau………………… 37
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát liên quan tới hàm ẩm của
cao trong nước đem tinh chế……………………………… 42
Bảng 3.9. Các dải hấp thụ đặc trưng trong phổ hồng ngoại………… 45
Bảng 3.10. Kết quả phân tích phổ
cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) ……………… 46
Bảng 3.11. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ carbon (13C-NMR) …….47
Bảng 3.12. Các thông số của quá trình chiết tách và phân lập

acid shikimic với cỡ mẻ 2kg………………………………….….48
Bảng 3.13. Kết quả chiết xuất acid shikimic với cỡ mẻ 2kg đại hồi….….….50
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ


Trang

Hình 3.1. Sắc ký đồ của mẫu dược liệu ………………………… … …21
Hình 3.2. Sắc ký đồ của acid shikimic chuẩn……………… ………… …21
Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn nồng độ của acid shikimic
theo thời gian của PP A……………… ………………….… …23
Hình 3.4. Sơ đồ quy trình chiết acid shikimic và cất tinh dầu
theo PP B……………… ……… ………….…………26
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn nồng độ acid shikimic theo thời gian của PP B 27
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn nồng độ AS theo thời gian của 2 phương pháp 29
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết của 2 phương pháp…………… 30
Hình 3.8. Sơ đồ quy trình tinh chế acid shikimic
sử dụng các loại dung môi……………………………………… 35
Hình 3.9. Hình ảnh sản phẩm thô và sản phẩm tinh chế…… …………… 38
Hình 3.10. Sơ đồ tinh chế acid shikimic…………………………… …… 43
Hình 3.11. Sản phẩm acid shikimic……………………… ……… …… 50

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây hồi (còn gọi là cây đại hồi, hồi hương, …), tên khoa học Illicium
verum Hook. f. là một loài cây phân bố chủ yếu ở Trung Quốc và khu vực
Đông Bắc Việt Nam. Quả chín phơi khô của cây hồi (đại hồi) được sử dụng
rộng rãi trong ẩm thực Trung Hoa, là hương liệu trong sản xuất rượu mùi và
nướng bánh ở các nước phương Tây, là một gia vị trong món phở của Việt

Nam,… Trong Đông y, dược liệu này chủ trị đau bụng, nôn mửa, đau nhức
cơ-khớp do lạnh [4], [5]. Đại hồi còn được biết đến là nguồn nguyên liệu sản
xuất acid shikimic, thành phần quan trọng trong bán tổng hợp sản xuất thuốc
chống virus điều trị cúm gia cầm type A và type B oseltamivir phosphat (tên
thương mại là Tamiflu) [7], [14]. Tamiflu đang được coi là dược phẩm có
triển vọng nhất để làm giảm tác hại của bệnh cúm gia cầm – loại bệnh vẫn
đang là mối lo ngại và tiềm ẩn nguy cơ bùng phát thành đại dịch cúm đối với
con người.
Ở Việt Nam và trên thế giới, nhiều nghiên cứu chiết xuất acid shikimic
từ đại hồi bằng dung môi ethanol, methanol, nước… cho hiệu suất khá cao
nhưng thao tác thực hiện phức tạp, thu hồi tái sử dụng dung môi khó khăn, sử
dụng dung môi tinh chế độc hại (methanol, formaldehyd,…) và hầu hết bỏ
qua vấn đề khai thác tinh dầu [6], [8], [10], [12], [22], [24], [25]. Giá trị của
đại hồi bị giảm đáng kể vì được sử dụng chủ yếu để lấy tinh dầu mà bỏ qua
acid shikimic. Thực tế ở Việt Nam, đại hồi cũng chỉ dùng để cất lấy tinh dầu
mà chưa tận thu được hoạt chất này. Trong khi đó, acid shikimic do Việt Nam
sản xuất lại có giá thành cao hơn acid shikimic do Ấn Độ sản xuất – quốc gia
phải nhập đại hồi. Đã có nhiều nghiên cứu nhằm tạo ra nguồn acid shikimic từ
các phương pháp tổng hợp hóa học hay lên men vi sinh,… tuy nhiên hiệu suất
không cao và giá cả không thể cạnh tranh với phương pháp chiết xuất từ dược
liệu [8], [15], [16].
2

Đề tài: “Nghiên cứu chiết xuất acid shikimic từ đại hồi” được thực
hiện nhằm góp phần tìm ra phương pháp chiết xuất acid shikimic từ đại hồi
đạt các tiêu chí: quy trình thao tác đơn giản, an toàn, chi phí thấp và kết hợp
thu tinh dầu; từ đó có thể triển khai áp dụng trong điều kiện thực tế tại Việt
Nam ở quy mô lớn hơn. Mục tiêu nghiên cứu đặt ra gồm có:
1. Khảo sát và lựa chọn được phương pháp chiết xuất acid
shikimic kết hợp thu tinh dầu từ đại hồi với dung môi nước.

2. Xây dựng được phương pháp tinh chế acid shikimic từ dịch
chiết nước.















3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về cây hồi
1.1.1. Vị trí phân loại và phân bố
Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan, cây hồi (Illicium
verum Hook. f.) có vị trí phân loại khoa học được thể hiện trong bảng dưới
đây [1], [9].
Bảng 1.1: Vị trí phân loại của cây hồi (Illicium verum Hook. f.)
Giới Thực vật - Plantae
Không phân hạng Nhóm thực vật có hoa - Angiospermae
Bộ Mộc lan dây - Austrobaileyales

Họ Hồi - Illiciaceae
Chi Hồi - Illicium
Loài I. verum
Chi Hồi (Illicium) có khoảng trên 40 loài, phân bố chủ yếu ở Đông
Nam Á, Đông Á và Bắc Mỹ. Ở Việt Nam chi Hồi có 16 loài [8]. Cây hồi
(Illicium verum Hook. f.) là một loại cây xanh quanh năm, phần lớn ở Trung
Quốc và Đông Bắc Việt Nam. Nó còn có tên gọi khác là cây đại hồi, bát giác
hồi hương, hồi hương, hồi sao, mác chác, mác hồi (Tày), pít cóc (Dao),… [2].
1.1.2. Đặc điểm thực vật
Cây gỗ nhỏ, cao 6 - 8m, có thể đến 10m hay hơn. Cành thẳng, nhẵn, lúc
non màu lục nhạt, sau chuyển sang màu nâu xám. Lá mọc so le, nhưng thường
tụ tập ở những mấu trông như mọc vòng, hình mác hoặc hình trứng thuôn, dài
8-12cm, rộng 3-4cm, đầu nhọn, mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới rất nhạt, gân
mờ, cuống lá ngắn [1], [2], [3].
4

Hoa mọc riêng lẻ hoặc 2-3 cái ở kẽ lá; đài 5 răng, dễ rụng, mép viền
hồng, cánh hoa 5-6, đều nhau, màu hồng sẫm dần về phía giữa; nhị thụt, nhẵn,
chỉ nhị rộng, mập, trung đới dày [1], [2].
Quả thường cấu tạo bởi 8 đại đều và rời nhau, có khi 9-12 đại (nhưng
hiếm), các đại hình thoi xếp tỏa tròn thành hình sao hay hình nan hoa, khi non
màu lục sau chuyển sang màu nâu sẫm, phần đính vào cuống rộng bản và dẹt,
đầu có mũi nhọn, ngắn, thẳng, khi chín nứt ở mặt trên; hạt hình trứng nhẵn
bóng, màu nâu. Toàn cây, nhất là quả có mùi thơm [1], [2].
1.1.3. Bộ phận dùng, thu hái và chế biến
1.1.3.1. Bộ phận dùng
Đại hồi (quả) – Fructus Illicium veri là quả chín đã phơi khô của cây
hồi - Illicium verum Hook. f. (họ Hồi – Illiciaceae).
Mô tả: Quả phức, thường gồm 8 đại, đôi khi nhiều đại hơn, màu nâu đỏ
đến nâu sẫm, xếp thành hình sao xung quanh một trụ trung tâm. Mỗi đại hình

lòng thuyền dài 1-2cm, rộng 0,5cm, cao 0,7-1cm. Bờ trên gần như thẳng,
nhẵn, có 1 đường nứt thành 2 mảnh để lộ ra 1 hạt. Bờ dưới hơi tròn và sần sùi.
Hai mặt bên nhăn nheo, tận cùng bởi 1 chỏm tù, ở 1 góc có khoảng nhẵn hơn
(nơi đính giữa các đại). Mặt trong màu vàng nhạt hơn và nhẵn bóng. Cuống
quả nhỏ và cong, đính vào trụ quả. Hạt hình trái xoan, màu vàng nâu, nhẵn
bóng. Quả có mùi thơm dễ chịu, vị ngọt [5].
1.1.3.2. Thu hái và chế biến
Hàng năm cây ra hoa kết quả theo 2 vụ, vụ chính thu hoạch vào tháng
8-10 (vụ mùa), vụ muộn thu hoạch vào tháng 2-4 năm sau (vụ tứ quý). Vụ
muộn cho năng suất thấp hơn. Cây trồng sau 5-6 năm bắt đầu cho thu hoạch.
Sau 15 năm mỗi cây có thể cho 10-20kg quả tươi/năm, sau 20 năm, năng suất
tương đối ổn định ở mức 20-30kg/năm [2].
Vào vụ thu hoạch, hái lấy quả từ màu lục biến thành vàng, nhúng qua
nước sôi, sấy nhẹ hoặc phơi trong bóng râm khoảng 5-6 ngày cho khô [5].
5

Trên thị trường, sản phẩm quả hồi khô được chia thành 3 loại:
- Loại 1 (hồi đại hồng): quả đủ 8 cánh to, đồng đều, không bị lép, màu
đỏ nâu, cuống ngắn (3-5 mm), không mốc. Đây là loại có phẩm cấp tốt nhất.
- Loại 2 (hồi xô): quả có cánh không đều, màu cánh gián, một số cánh
bị lép, giập, gãy.
- Loại 3: quả thu hái non, quả vụn, lép nhiều, màu nâu đen. Đây là loại
có chất lượng kém.
1.1.4. Thành phần hóa học và công dụng
1.1.4.1. Thành phần
- Tinh dầu: hàm lượng 3-3,5 % trong quả tươi, 9-10 % trong quả khô.
Chứa 80-90 % trans-anethol, ngoài ra còn có linalol, estragol, terpineol,
anysaldehyd… [8], [11].
- Acid hữu cơ: acid shikimic, protocatechic, anisatinic, isoanisatinic.
Trong đó quan trọng nhất là acid shikimic [2], [8].

- Ngoài ra còn 1 số chất thuộc nhóm flavonoid, tannin, sesquiterpen,
sesquiterpen lacton, sesquilignan, sesqui-neoliganan; dầu béo chủ yếu chứa
trong hạt [4], [8].
1.1.4.2. Công dụng
Đại hồi (quả) có vị cay, tính ôn, quy kinh can, thận, tỳ, vị. Nó có công
dụng giúp tiêu hóa, lợi sữa, giảm đau, giảm co bóp nhu động ruột, dùng chữa
ỉa chảy, ăn không tiêu, bụng đầy. Khi dùng ngoài, đại hồi có tác dụng chữa
đau nhức, thấp khớp, bong gân [4], [5]. Dạng dùng của loại dược liệu này là
bột, rượu thuốc. Ngày dùng 3-6 g.
Quả hồi và tinh dầu hồi được dùng làm gia vị và hương liệu cho rất
nhiều sản phẩm dùng trong kỹ nghệ thực phẩm: rượu mùi, kẹo gôm, bánh
kẹo, gelatin, pudding, thịt, sản phẩm từ thịt [4].
6

1.1.5. Tinh dầu hồi
Tên thương phẩm: Star Anis Essential Oil, Anise Star,…
1.1.5.1. Tính chất vật lí
Là chất lỏng không màu hay vàng nhạt , mùi đặc biệt, vị ngọt, kết tinh
khi để lạnh. Tỷ trọng ở 20
0
C: 0,978-0,988. Điểm đông đặc không nhỏ hơn
15
0
C [29].
1.1.5.2. Thành phần
Thành phần chủ yếu và quan trọng nhất của tinh dầu hồi là trans-
anethol (82,5 %). Ngoài ra còn có linalol (0,1-1,5 %), estragol (0,3-6 %),
terpineol (0,1-1,5 %), anysaldehyd (0,1-3,5 %). Và các thành phần khác: 1,4-
cineol, β-bisabolen, β-faruesen, α-copaen, caryophylen, nerolidol, methyl-
anisoat, trans-methyleugenol, cadimen, foeniculin, β-phellandren

hydroquinon, p-allylanisol, α-terpineol, α-bergamoten, anysyl-aceton, 1,8-
cineol, limonen, 1-phellandren, sabinen, α-pinen [8].
1.1.5.3. Công dụng
Tinh dầu hồi có tác dụng tương tự dược liệu, thường được phối hợp
trong nhiều thuốc khác. Ngoài ra tinh dầu còn dùng để tổng hợp các hormon
oestrogen (diethyl stilbestrol, diethyl stilbestrol propionat). Tinh dầu hồi được
dùng làm gia vị và hương liệu cho rất nhiều sản phẩm dùng trong kỹ nghệ
thực phẩm: rượu mùi, kẹo gôm, bánh kẹo, gelatin, pudding, thịt, sản phẩm của
thịt. Hàm lượng tinh dầu tối đa được phép đưa vào thực phẩm là 0,07%.
Ngoài ra tinh dầu còn được dùng trong kỹ nghệ sản xuất xà phòng, kem đánh
răng, thuốc lá…[4].
1.1.5.4. Chiết xuất tinh dầu từ đại hồi
Có thể cất tinh dầu khi quả còn tươi hay đã phơi khô. Đồng bào các dân
tộc ở Lạng Sơn thường cất tinh dầu hồi bằng các nồi cất thủ công, đơn giản,
7

tương tự như cất rượu. Thời gian cất có thể kéo dài từ 18-24 giờ. Để có hiệu
suất và chất lượng tinh dầu cao, cần sử dụng các thiết bị chưng cất liên tục
bằng hơi nước có hồi lưu với nồi hơi riêng. Bã còn lại sau khi cất tinh dầu có
thể dùng làm nhiên liệu để đun hoặc ủ trộn với phân súc vật để bón cho cây
trồng.
1.2. Tổng quan về acid shikimic
1.2.1. Công thức hóa học và tính chất

Acid shikimic có công thức hoá học và các tính chất cụ thể như sau [21], [26]:
Công thức cấu tạo:



Tên khoa học: acid (3R,4S,5R) – 3,4,5 – trihydroxy -1-cyclohexen -1-

carboxylic.
Công thức phân tử: C
7
H
10
O
5
.
Trọng lượng phân tử: 174,15.
Tính chất: Acid shikimic là một chất kết tinh màu trắng, rất dễ tan trong nước
(18%), tan trong ethanol tuyệt đối (2,25%), trong methanol, không tan trong
các dung môi ít phân cực ethyl acetat, aceton, cloroform, benzen, ether dầu
hỏa.
Nhiệt độ nóng chảy: 183 - 184,5
0
C.
Năng suất quay cực: []
18
= -183,8 (c = 4,03% trong nước).
2
3
1
4
5
6
8

Cực đại hấp thụ: Dung dịch acid shikimic trong ethanol có cực đại hấp thụ ở
213 nm.
1.2.2. Kỹ thuật phân tích

Denis V. Bochkov và cs. đã trình bày các kỹ thuật phân tích acid
shikimic trong bài tổng quan về hợp chất này [17]. Các kỹ thuật được nêu ra
gồm có:
- Sắc ký giấy.
- Phản ứng màu.
- Kỹ thuật phân tích định lượng.
- Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân.
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo.
- Một số kỹ thuật phân tích khác.
1.2.3. Nguồn gốc acid shikimic
Acid shikimic được Eykman F. và cộng sự phân lập lần đầu tiên vào
năm 1885 từ một loài hồi Nhật Bản (Illicium anisatum). Đến 50 năm sau cấu
trúc hóa học của acid shikimic mới được xác định [23]. Acid shikimic có
trong nhiều loài thực vật như đại hồi (Illicium verum), bạch quả (Gingko
biloba), quyển bá trường sinh (Selaginella tamariscina, Hoselaginellaceae),
kha tử (Terminalia chebula), chuối tiêu (Musa sapientum), hướng dương
(Heliantus annus), tiểu hồi (Foeniculum vulgare)… [27]. Nhưng hiện nay đại
hồi vẫn là nguyên liệu quan trọng để chiết xuất, bởi hàm lượng acid shikimic
trong quả hồi tương đối cao (5%-10%) [8].
Acid shikimic còn có nguồn gốc từ tổng hợp hoặc bán tổng hợp.
Raphael (1960) và Smissman (1959) đã tổng hợp acid shikimic từ 1,3-
butadien-1,4-diyl diacetate qua phản ứng Diels Alder. Grewe (1964) và cộng
sự tổng hợp acid shikimic từ 1,3-butadien. Ngoài ra, acid shikimic có thể
được tổng hợp từ benzen, bán tổng hợp từ acid quinic và D-manose [15].
Giáo sư Frost, trường đại học Michigan, đã nghiên cứu công nghệ sản
xuất acid shikimic bằng con đường lên men vi sinh sử dụng chủng
Escherichia coli tái tổ hợp, sau đó chiết xuất acid shikimic từ dịch lên men và
9

tinh chế. Tuy nhiên hiệu suất không cao và giá thành không thể cạnh tranh với

phương pháp chiết xuất từ đại hồi [16].
1.2.4. Vai trò acid shikimic
 Trong sinh học nói chung, acid shikimic đóng vai trò quan trọng trong
quá trình sinh tổng hợp các acid amin thơm như phenylalanin, tryptophan,
tyrosin; các alcaloid, hợp chất phenolic, các phenyl propanoid [28]. Nó là chất
trung gian hóa học quan trọng của các quá trình chuyển hóa trong thực vật và
vi sinh vật (con đường shikimat) [22], [23].
 Về tác dụng dược lý, acid shikimic có tác dụng chống viêm, giảm đau,
có khả năng ức chế ngưng tập tiểu cầu và bệnh tắc nghẽn động mạch do tác
động của acid arachidonic [24]. Các nhà khoa học đã chứng minh acid
shikimic có tác dụng giảm đau, chống viêm, chống co giật, chống oxy hóa,
kìm hãm phát triển tế bào ung thư

[2].
 Trong lĩnh vực tổng hợp hóa dược, acid shikimic được biết đến là
nguyên liệu tổng hợp (-)zeylenon, hoạt chất có hoạt tính kháng sinh, có tác
dụng chống virus, chống ung thư và được sử dụng cho bệnh nhân ung thư
trước khi tiến hành hóa trị liệu [18].
Đặc biệt trong những năm gần đây acid shikimic là nguyên liệu để bán
tổng hợp oseltamivir phosphat – một chất có vai trò ức chế neuraminidase,
một enzym cần cho quá trình giải phóng và lây lan virus từ các tế bào bị
nhiễm. Oseltamivir phosphat có tác dụng trên virus cúm type A và type B, đặc
biệt với chủng H5N1. Theo tổng hợp của Nguyễn Quyết Chiến [7]: Kim và
cộng sự (1997) đã tìm ra con đường tổng hợp oseltamivir phosphat từ acid
shikimic nhưng mới chỉ ở quy mô phòng thí nghiệm; Sau đó Rohloff và cộng
sự đã xây dựng được phương pháp tổng hợp có hiệu quả và có thể triển khai ở
quy mô pilot, hiệu suất tổng thể của quá trình là 21% với 10 công đoạn phản
ứng và vẫn qua công đoạn tạo azid, mặc dù được phép áp dụng trong sản xuất
nhưng nó luôn tiềm ẩn những nguy cơ do các tác nhân và các hợp chất azid
10


trung gian có độc tính cao và có khả năng gây nổ. Năm 2004, Harrington và
cộng sự đã nghiên cứu thành công phương pháp tổng hợp oseltamivir
phosphat và tránh được công đoạn tạo azid. Phương pháp này được các tác
giả gọi là “phương pháp thế hệ thứ 2”, hiệu suất tổng của phương pháp đạt
61% và được xem là phương pháp tối ưu nhất hiện nay

[14].
1.2.5. Một số nghiên cứu chiết xuất acid shikimic từ đại hồi
Khi đại dịch cúm gia cầm xảy ra, hãng Roche và thế giới lo lắng vì
không đủ acid shikimic để sản xuất. Nhiều nhóm nghiên cứu đã cố gắng tìm
ra acid shikimic với các phương pháp và nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau.
Payne R. và Edmonds M. (2005) tiến hành chiết acid shikimic từ đại
hồi bằng thiết bị Soxhlet với dung môi ethanol 95%. Dịch chiết được cất loại
ethanol. Hòa tan cắn vào nước nóng, gạn bỏ lớp dầu. Dung dịch được loại bớt
tạp bằng formaldehyd và lọc. Acid shikimic được tinh chế bằng phương pháp
trao đổi ion (dùng nhựa Amberlit IRA-400) và kết tinh lại trong ethyl actetat-
methanol. Hiệu suất đạt 2,4-7,0 % [24]. Nguyễn Quyết Chiến (2006) cũng
tiến hành và tinh chế acid shikimic từ đại hồi theo phương pháp tương tự.
Hiệu suất quá trình đạt 5,4%. Nhược điểm của phương pháp này là tinh chế
bằng nhựa trao đổi ion phức tạp và chi phí cao [6].
Nguyễn Đình Luyện và cộng sự (2006) chiết Soxhlet bằng cồn 95
0
,
chiết bằng nước ở 60
o
C và chiết hồi lưu trong cồn 90
0
và 95
0

, quy mô phòng
thí nghiệm (50 và 100g quả hồi khô), loại tạp với formaldehyd, tinh chế trên
cột anionit chứa 50g Amberlit và thu được acid shikimic với hiệu suất từ 5,0-
6,8 % [12]. Phương pháp này có cùng nhược điểm nêu trên.
Iyer Sankar V. (2007) công bố phương pháp chiết tách acid shikimic
gồm các bước [25]:
- Chiết hồi lưu nguyên liệu đại hồi (400g) với 2x2L isopropanol 95%.
- Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm để thu được dịch chiết đậm
đặc.
11

- Dung dịch đậm đặc được pha loãng với 900mL nước.
- Tiến hành loại tạp dung dịch nước lần lượt bằng ethyl acetat
(1200mL), dung dịch formaldehyd 37% và than hoạt (60g).
- Cô đặc dung dịch nước. Thêm 50mL methanol và cô đến cắn.
- Hòa cắn vào 40mL methanol, đun hồi lưu 45 phút, để lạnh (0-5
0
C)
cho acid shikimic kết tinh. Hiệu suất quá trình 3,5-5%.
Phương pháp của Iyer Sankar V. có ưu điểm là bước tinh chế không sử
dụng nhựa trao đổi ion. Nhưng quá trình tinh chế qua nhiều công đoạn và khá
phức tạp, tốn ethyl acetat và than hoạt; sử dụng formaldehyd 37% là dung môi
độc hại để loại tạp và hiệu suất thấp.
Gần đây, nhóm nghiên cứu của Hiroki Ohira (2009) - Trường Đại học
Tohoku, Trung tâm Nghiên cứu Công nghệ chiết xuất bằng khí hóa lỏng siêu
tới hạn (Research Center of Supereritical Fluid Tecnhnology) đã nghiên cứu
chiết xuất nhanh acid shikimic bằng nước nóng ở nhiệt độ 120
o
C trong 5 phút
với 0,5g hồi có hiệu suất 8% [22]. Hiệu suất chiết cao, thời gian chiết nhanh

nhưng kỹ thuật khá phức tạp, tốn kém, đòi hỏi trang thiết bị hiện đại.
Nguyễn Thượng Dong và cộng sự (2010) đã chiết xuất được acid
shikimic từ lá và quả đại hồi thu hoạch ở các tỉnh khác nhau ở Việt Nam bằng
dung môi nước và methanol, tinh chế bằng hỗn hợp ethyl acetat-methanol
(3:1) cho hiệu suất 0,985-1,33% trong lá và 4,47% trong quả [8].
Đỗ Thị Loan (2011) chiết xuất acid shikimic từ đại hồi bằng nước theo
phương pháp chiết nóng với nước ở 100
0
C, tinh chế bằng hỗn hợp dung môi
methanol-aceton cho hiệu suất cả quá trình đạt 6,61% [10].
1.3. Nhận xét
Cúm gia cầm có nguy cơ bùng phát thành đại dịch bất cứ lúc nào ở
nước ta và các nước khác trên thế giới. Chủ động nguồn nguyên liệu acid
12

shikimic để bán tổng hợp oseltamivir (hoạt chất có tác đụng chống cúm gia
cầm hiệu quả hiện nay) có ý nghĩa hết sức to lớn. Chiết xuất acid shikimic từ
đại hồi là phương pháp hiệu quả nhất tính đến thời điểm hiện tại để thu được
hoạt chất này. Giá trị kinh tế của đại hồi bị giảm đáng kể, do được sử dụng
chủ yếu để lấy tinh dầu mà bỏ qua hoạt chất acid shikimic. Thực tế ở Việt
Nam, đại hồi cũng chỉ dùng để cất lấy tinh dầu mà chưa tận thu được acid
shikimic. Các phương pháp chiết xuất hoạt chất này đã được công bố trước
đây thường phức tạp, khá tốn kém, thu hồi tái sử dụng dung môi khó khăn, sử
dụng dung môi tinh chế độc hại (methanol, formaldehyd,…) và hầu hết bỏ
qua vấn đề khai thác tinh dầu. Chính vì vậy, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu
chiết xuất acid shikimic từ đại hồi sử dụng dung môi chiết xuất là nước và kết
hợp chưng cất tinh dầu nhằm góp phần tìm ra phương pháp chiết xuất acid
shikimic từ đại hồi có thể áp dụng trong điều kiện thực tế tại Việt Nam.














13

CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật liệu
2.1.1. Nguyên liệu
Nguồn gốc
Đại hồi thu mua từ tỉnh Lạng Sơn.

Mô tả nguyên liệu
Quả phức, thường gồm 8 đại, màu nâu đỏ, xếp thành hình sao xung
quanh một trụ trung tâm. Mỗi đại hình lòng thuyền dài 1-2cm, cao dưới 1cm.
Bờ trên gần như thẳng, nhẵn, có 1 đường nứt thành 2 mảnh để lộ ra 1 hạt. Bờ
dưới hơi tròn và sần sùi, hai mặt bên nhăn nheo, mặt trong màu vàng nhạt hơn
và nhẵn bóng. Cuống quả nhỏ và cong, đính vào trụ quả. Hạt hình trái xoan,
màu vàng nâu, nhẵn bóng. Quả có mùi thơm dễ chịu, vị ngọt. Đặc điểm
nguyên liệu phù hợp với mô tả trong Dược điển Việt Nam IV [5].
14


Xử lí dược liệu
- Phương pháp chiết nóng kết hợp cất tinh dầu trước (phương pháp A):
Đại hồi loại bỏ tạp, sấy khô ở 50
0
C.
- Phương pháp ngâm lạnh kết hợp cất tinh dầu sau (phương pháp B):
Đại hồi loại bỏ tạp, sấy khô ở 50
0
C, xay, rây qua cỡ rây 2mm.
Hàm ẩm nguyên liệu xác định được là 3,26 %.
2.1.2. Hóa chất, thiết bị, dụng cụ
2.1.2.1. Hóa chất
TT Tên hóa chất Tiêu chuẩn, nguồn gốc
1 Ethanol 96% Việt Nam
2 Aceton P, Trung Quốc
3 Methanol P, Trung Quốc
4 Methanol HPLC, Merck
6 H
2
SO
4
P, Trung Quốc
7 Isopropanol P, Trung Quốc
8 NaCl công nghiệp Việt Nam
9 Acid shikimic chuẩn 99,0%, Merck
2.1.2.2. Thiết bị, dụng cụ
Máy móc
 Máy siêu âm Ultrasonic LC60H (Đức): Công suất P= 400W, tần số f =
35 kHz.
 Tủ sấy MEMMERT (Đức).

 Cân kỹ thuật điện tử Sartorius BP 20015 (Đức).
 Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S ( Thụy Sỹ).
15

 Máy cất quay chân không Büchi B-490 và R-220 (Thụy Sỹ).
 Máy khuấy từ Heidolph MR3001 (Đức).
 Bếp ôm bình cầu có bảo ôn Heating Mantle (Trung Quốc).
 Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao Shimadzu (Nhật Bản), bao gồm: bộ
phân loại khí DGU – 14A, bơm cao áp LC – 10ADVP, buồng chứa cột CTO
– 10AVP, bộ điều khiển SCL – 10AVP, detector dãy diod quang SPD –
M10AVP và phần mềm Class vp 6.14.
 Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ – Melt (Mỹ).
 Phân cực kế KRÜSS (Đức).
 Thiết bị xác định phổ hồng ngoại (IR) Perkin Elmer.
 Thiết bị xác định phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Bruker AM500
FT-NMR Spectrometer.
 Thiết bị xác định phổ khối lượng Varian 320 Ms (Mỹ).
Dụng cụ
 Hệ thống cất tinh dầu: Bình cầu 2L, sinh hàn, bếp ôm bình cầu có bảo
ôn, bình chứa tinh dầu.
 Sinh hàn hồi lưu.
 Bình cầu 250mL, 500mL, 2L.
 Cốc thủy tinh loại 100mL, 250mL, 500mL, 1000mL.
 Bình gạn 500mL.
 Bình định mức 10mL, 25mL, 50mL, 100mL.
 Pipet 1mL, 2mL, 5mL, 10mL.
 Ống đong 10mL, 50mL, 300mL, 500mL.
 Màng lọc cellulose acetat 0,45μm (Satorius).
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Lựa chọn phương pháp chiết xuất

16

Phương pháp chiết nóng kết hợp cất tinh dầu trước (phương pháp A) và
phương pháp ngâm lạnh kết hợp cất tinh dầu sau (phương pháp B) được khảo
sát. Nội dung này nhằm đánh giá tốc độ chiết hoạt chất, hiệu quả chiết xuất
acid shikimic, tính chọn lọc và lượng tinh dầu thu được. Từ đó có dữ liệu để
so sánh và lựa chọn phương pháp ưu việt hơn.
2.2.2. Xây dựng phương pháp tinh chế acid shikimic từ dịch chiết nước
- Khảo sát và lựa chọn dung môi tinh chế. Các dung môi nghiên cứu
gồm có: methanol, hỗn hợp methanol-isopropanol, hỗn hợp methanol-aceton,
isopropanol.
- Bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tinh chế sử
dụng dung môi đã lựa chọn.
- Đề xuất quy trình chiết xuất acid shikimic từ đại hồi. Quy trình này
được áp dụng với cỡ mẻ lớn hơn nhằm nâng cao tính thực tiễn của đề tài và sơ
bộ đánh giá hiệu quả của quy trình khi mở rộng quy mô.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp định lượng acid shikimic
Xác định hàm lượng acid shikimic trong dược liệu, trong dịch chiết và
sản phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
2.3.1.1. Điều kiện sắc ký
Tham khảo các tài liệu [19], [20] và qua thực nghiệm, điều kiện sắc ký
được xác định như sau:
- Cột: Supelco C8 (150 x 4mm, 5µm).
- Pha động: dung dịch acid sulfuric 0,01%.
- Bước sóng phát hiện: 210 nm.
- Tốc độ dòng: 0,8mL/phút.
- Thể tích mẫu tiêm: 5L.
- Nhiệt độ buồng cột: 30C.
17


2.3.1.2. Chuẩn bị mẫu
- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 25mg acid shikimic chuẩn vào bình
định mức 50mL, thêm nước cất, lắc hòa tan hoàn toàn. Thêm nước vừa đủ đến
vạch. Hút chính xác 5mL, cho vào bình định mức 25mL, thêm nước đến vạch,
lắc đều. Lọc qua màng 0,45µm. Dung dịch chuẩn có nồng độ 100µg/mL.
- Mẫu thử là dược liệu: Cân chính xác 250mg bột dược liệu, gói vào
giấy lọc, cho vào bình nón 100mL, thêm 50ml nước, ngâm trong 1 giờ cho
trương nở hoàn toàn. Siêu âm trong 30 phút. Gạn lấy dịch chiết, bã tiến hành
chiết lần 2, lần 3, mỗi lần 20mL nước, tiến hành như lần 1. Gộp dịch chiết cho
vào bình định mức 100mL, thêm nước đến vạch, lắc đều. Hút chính xác 10mL
cho vào bình định mức 25mL, thêm nước đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng
0,45µm.
- Mẫu thử là dịch chiết: Pha loãng dịch chiết đến nồng độ acid shikimic
trong khoảng 50 – 150µg/mL, lọc qua màng 0,45µm.
2.3.1.3. Công thức tính
 Hàm lượng acid shikimic trong đại hồi:

 
1 100%
C
.S
C
.f
C
.V
T
m
T
.S

T
.f
T
.a.V
C
m
X% 

Trong đó:
X%: hàm lượng acid shikimic trong đại hồi.
m
C
: Khối lượng acid shikimic chuẩn.
m
T
: Khối lượng đại hồi đem chiết.