BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
 0 

NGUYỄN THỊ THU HƯỜNG

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT
ALCALOID TOÀN PHẦN VÀ
PHÂN LẬP NUCIFERIN
TỪ LÁ SEN
(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ)




HÀ NỘI - 2014





BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
 0 



NGUYỄN THỊ THU HƯỜNG

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT ALCALOID
TOÀN PHẦN VÀ PHÂN LẬP NUCIFERIN
TỪ LÁ SEN
(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ)


Người hướng dẫn:
DS. Trần Ngọc Bảo
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp dược
Trường đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2014




LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình làm khóa luận, em đã nhận được rất nhiều sự
giúp đỡ, góp ý từ thầy cô, gia đình và bạn bè. Nhờ đó, em đã hoàn thành
khóa luận và có thêm sự hiểu biết về tư duy trong nghiên cứu khoa học.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến DS. Trần Ngọc Bảo - người
thầy trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho
em trong quá trình làm khóa luận.
Em xin trân trọng cám ơn TS. Nguyễn Văn Hân đã giúp đỡ hướng
dẫn, giúp cho em nâng cao nhận thức và phương pháp luận khi làm thực
nghiệm.
Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô bộ môn Công nghiệp Dược,

các anh chị kĩ thuật viên đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hoàn thành
khóa luận.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn bộ giảng viên và
cán bộ trong trường, những người đã dìu dắt, truyền cho em ngọn lửa đam
mê với khoa học trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã động
viên và giúp đỡ em rất nhiều để em hoàn thành tốt khóa luận.


Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2014.

Nguyễn Thị Thu Hường





MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Tổng quan về cây sen 2
1.1.1. Đặc điểm hình thái của cây sen 2
1.1.2. Phân bố 2
1.1.3. Bộ phận dùng, thu hái và chế biến 3
1.1.4. Thành phần hóa học 3
1.1.5. Tác dụng sinh học của lá sen 5
1.2. Tổng quan về nuciferin 6

1.2.1. Công thức hóa học, tính chất 6
1.2.2. Nguồn gốc 6
1.2.3. Tác dụng dược lí 6
1.3. Một số phương pháp chiết xuất alcaloid toàn phần và tinh chế
nuciferin từ lá sen 8
1.3.1. Phương pháp chiết alcaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ
không phân cực 8
1.3.2. Phương pháp chiết alcaloid dưới dạng muối bằng dung môi nước,
nước acid hoặc ethanol acid 8
1.3.3. Phương pháp tinh chế nuciferin 11
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 12
2.1.1. Nguyên vật liệu 12
2.1.2. Máy móc thiết bị 13
2.2. Nội dung nghiên cứu 14
2.2.1. Khảo sát quy trình chiết alcaloid toàn phần từ lá sen. 14


2.2.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết 14
2.2.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết 14
2.2.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết 14
2.2.2. So sánh phương pháp chiết bằng dung môi dầu hỏa và EtOH 96%
14
2.2.2.1. So sánh độ tan 14
2.2.2.2. So sánh hiệu suất chiết: 14
2.2.3. Tinh chế nuciferin 15
2.3. Phương pháp nghiên cứu 15
2.3.1. Phương pháp định lượng 15
2.3.1.1. Định lượng alcaloid toàn phần trong lá sen 15
2.3.1.2. Định lượng alcaloid toàn phần trong tủa thô bằng phương pháp
chuẩn độ acid - base 16

2.3.1.3. Định lượng nuciferin bằng phương pháp HPLC 16
2.3.1.4. Định lượng nuciferin bằng phương pháp đo quang 18
2.3.2. Phương pháp chiết xuất alcaloid toàn phần 18
2.3.2.1. Chiết bằng dung môi dầu hỏa 18
2.3.2.2. Chiết bằng dung môi EtOH 96% 19
2.3.3. Phương pháp tinh chế nuciferin 19
2.3.4. Kiểm tra độ tinh khiết, khẳng định cấu trúc sản phẩm 20
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22
3.1. Xác định hàm lượng alcaloid toàn phần trong lá sen 22
3.2. Khảo sát quy trình chiết alcaloid toàn phần từ lá sen. 22
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết 22
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết 24
3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết 25
3.3. So sánh phương pháp chiết bằng dung môi dầu hỏa và EtOH 96% 26
3.3.1. So sánh độ tan 26


3.3.1.1. Xác định khoảng tuyến tính 27
3.3.1.2. Kết quả đo độ tan 28
3.3.2. So sánh hiệu suất 28
3.4. Tinh chế nuciferin 29
3.5. Đánh giá độ tinh khiết, khẳng định cấu trúc sản phẩm. 31
3.6. Đề xuất quy trình chiết xuất alcaloid toàn phẩn, tinh chế nuciferin 35
3.6.1. Sơ đồ quy trình 35
3.6.2. Mô tả quy trình 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC












DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

STT
Kí hiệu, chữ viết tắt
Giải thích
1
ACN
Acetonitril
2
alc tp
Alcaloid toàn phần
3
dd
Dung dịch
4
DĐVN IV
Dược điển Việt Nam IV
5
DMSO
Dimethyl sulfoxid
6
1

H

– NMR
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
7
HPLC
High performance liquid chromatography
(Sắc kí lỏng hiệu năng cao)
8
IR
Phổ hồng ngoại
9
m
Khối lượng
10
MS
Phổ khối lượng
11
R
f
Hệ số lưu giữ
12
SKLM
Sắc kí lớp mỏng
13
Tb
Trung bình
14
TEA
Triethylamin









DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng
Nội dung bảng
Trang
2.1
Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu
12
2.2
Các máy móc, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực
nghiệm
13
3.1
Hàm lượng alcaloid toàn phần trong lá sen.
22
3.2
Hàm lượng alcaloid toàn phần và hiệu suất chiết theo
thời gian
23
3.3
Hàm lượng alcaloid toàn phần và hiệu suất chiết theo số
lần chiết.

24
3.4
Hàm lượng alcaloid toàn phần và hiệu suất chiết theo
nhiệt độ.
25
3.5
Độ hấp thụ của dung dịch nuciferin trong EtOH 96%
27
3.6
Độ tan của nuciferin trong dầu hỏa và trong EtOH 96%
28
3.7
So sánh 2 phương pháp chiết xuất bằng dung môi EtOH
96
0
và dung môi dầu hỏa
28
3.8
Khối lượng alcaloid toàn phần thu được, hàm lượng
nuciferin và hiệu suất tinh chế
30
3.9
Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của nuciferin (IR,
KBr)
32
3.10
Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
33




DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
STT
Danh mục các hình ảnh, đồ thị
Trang
1
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu suất chiết
vào thời gian chiết.
23
2
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu suất chiết
vào số lần chiết.
24
3
Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu suất chiết
vào nhiệt độ chiết.
26
4
Hình 3.4. Đồ thị biểu thị mối quan hệ giữa nồng độ và độ hấp
thụ
27
5
Hình 3.5. Sắc kí đồ của dung dịch nuciferin chuẩn.
30
6
Hình 3.6. Sắc kí đồ của mẫu nuciferin tinh chế.
31
7
Hình 3.7. Sắc kí đồ của mẫu alcaloid toàn phần.
31

8
Hình 3.8. Sắc kí đồ nuciferin tinh chế được với các hệ dung
môi.
32
9
Hình 3.9. Sơ đồ chiết xuất alcaloid toàn phần và tinh chế
nuciferin.
35
10
Hình 3.10. Hình ảnh alcaloid toàn phần.
36
11
Hình 3.11. Hình ảnh nuciferin tinh khiết.
37

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây sen (Nelumbo nucifera Gaertn, Nelumbonaceae) là một dược liệu
quý mà tất cả các bộ phận đều được dùng làm thuốc. Trong đó, lá sen là 1 vị
thuốc hay được dùng trong y học cổ truyền với tên gọi liên diệp. Trong y học
hiện đại, lá sen được sử dụng với các tác dụng: an thần, chống mất ngủ, chống
loạn nhịp tim. Nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước đã chỉ ra tác dụng an
thần, chống mất ngủ có liên quan đến alcaloid chính trong lá sen là nuciferin.
Ngoài ra, nuciferin còn có tác dụng giải thắt co cơ trơn, ức chế thần kinh
trung ương, chống viêm yếu, giảm đau, giảm ho, kháng serotonin và có hoạt
tính phong bế thụ thể adrenergic [4]. Trong ngành hóa dược, nuciferin là
nguyên liệu dùng để bán tổng hợp một số chất có hoạt tính sinh học cao.
Nguồn dược liệu lá sen ở nước ta rất dồi dào nên hiện nay trên thị
trường đã có nhiều sản phẩm thuốc an thần làm từ cao lá sen. Tuy nhiên, các

sản phẩm này không đảm bảo về tiêu chuẩn chất lượng, khó kiểm soát hàm
lượng, không an toàn cho người sử dụng. Dạng cao lá gây khó khăn trong quá
trình dập viên. Do đó, việc chiết xuất nuciferin tinh khiết là rất cần thiết.
Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu chiết xuất alcaloid toàn phần và tinh
chế nuciferin trong lá sen nhưng các nghiên cứu đó mới chỉ tập trung ở quy
mô phòng thí nghiệm, chủ yếu sử dụng dung môi chiết là ethanol với quy
trình tinh chế phức tạp, rất khó triển khai ở quy mô công nghiệp, chưa có
nghiên cứu về chiết xuất bằng dung môi dầu hỏa.
Vì vậy, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết xuất alcaloid
toàn phần và phân lập nuciferin từ lá sen” với mục đích làm cơ sở cho việc
ứng dụng chiết xuất trên quy mô công nghiệp. Đề tài gồm các mục tiêu sau:
1, Xây dựng được quy trình chiết alcaloid toàn phần từ lá sen bằng dầu
hỏa.
2, Xây dựng được quy trình tinh chế nuciferin.
2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về cây sen
Cây sen có tên khoa học là Nelumbo nucifera Gaertn, thuộc họ Sen
Nelumbonaceae. Ngoài ra, cây còn có tên gọi khác là Liên, Quỳ [6].
1.1.1. Đặc điểm hình thái của cây sen [4]
Cây thảo, sống ở nước, to khoẻ, cao hơn một mét. Thân rễ (ngó sen) mập,
mọc dài trong bùn, đính rễ ở những mấu, từ đó mọc lên thân và lá. Lá hình
tròn, vượt lên khỏi mặt nước, đường kính 30-40cm, màu lục xám, nếp nguyên
lượn sóng, giữa lá thường trũng xuống, mặt sau đôi khi điểm những đốm màu
tía, nhân hình khiên, hằng rõ. Cuống lá đính vào giữa lá, dài một mét hay hơn,
có nhiều gai cứng nhọn. Hoa to, mọc riêng lẻ trên cuống dài và thẳng, phủ
đầy gai nhọn, đường kính 8-12cm, màu hồng, đỏ hoặc trắng. Lá đài 3-5cm,
màu lục nhạt, rụng sớm. Cánh hoa nhiều, những cánh phía ngoài to, khum
lòng mán, cánh giữa ở trong nhỏ hẹp dần. Nhị rất nhiều, màu vàng, chỉ nhị

mảnh, có phần phụ (gạo sen) màu trắng và thơm. Bộ nhụy gồm nhiều lá noãn
rời nằm trên một đế hoa hình nón ngược (gương sen). Quả bế có núm nhọn,
thường gọi là hạt sen, phần ngoài mỏng và có màu lục tía, phần giữa mềm
chứa tinh bột màu trắng ngà và phần trong là lá mầm dài màu lục sẫm.
Mùa hoa: tháng 5-6, mùa quả: tháng 7-9.
1.1.2. Phân bố [4]
Trên thế giới, do ưa khí hậu nóng và ẩm của vùng nhiệt đới nên sen
được trồng ở hầu hết các nước khu vực Đông Nam Á đến Nam Á như
Campuchia, Thái Lan, Malaysia, Ấn Độ và một số tỉnh phía nam Trung Quốc.
Ở Việt Nam, sen mọc hoang dại và chủ yếu ở vùng Đồng Tháp Mười,
thuộc tỉnh Đồng Tháp và An Giang tạo nên cảnh quan sinh thái đặc biệt của
vùng ngập nước Đồng Tháp Mười. Bên cạnh quần thể hoang dại, sen cũng
3

được trồng phổ biến ở các tỉnh đồng bằng và trung du trong các vùng ao hồ
nước nông và trung bình.
1.1.3. Bộ phận dùng, thu hái và chế biến [2], [4]
 Lá sen thu hái vào mùa thu bỏ cuống (liên diệp).
 Quả thu hái lúc quả chín (liên thạch)
 Quả bóc vỏ ngoài lấy hạt (liên nhục).
 Tâm sen là chồi mầm trong hạt sen (liên tâm).
 Gương sen đã lấy quả (liên phòng).
 Tu sen bỏ hạt ở đầu (liên tu).
 Thân rễ gọi là ngó sen (liên ngẫu).
Tất cả đều phơi khô hay sấy khô.
1.1.4. Thành phần hóa học [2], [4], [8], [15]
Lá sen có nhiều alcaloid đã được phân lập và xác định cấu trúc:
nuciferin, anonain, roemerin, pronuciferin, N-nornuciferin, O-nornuciferin,
nepherin, liriodenin, dehydroemerin, armepavin, N-norarmepavin,
dehydronuciferin, dehydroanonain, N-methylisococlaurin, N-methylcoclaurin.

Trong đó, nuciferin là alcaloid chính.
Ngoài alcaloid, lá sen còn có các flavonoid: quercetin, isoquercitrin,
leucocyanidin, leucodelphinidin…

4

Công thức hóa học của một số alcaloid chính có trong lá sen:













R=
R
1
=
R
2
=
Liensinin
CH
3

H
H
Isoliensinin
H
H
CH
3

Neferin
CH
3

H
CH
3



R=
R
1
=
R
2
=
Armepavin
CH
3
CH
3


CH
3

N-methylcoclaurin
CH
3

H
CH
3

Neferin
H
CH
3

CH
3



R=
R
1
=
R
2
=
Nuciferin

CH
3
CH
3

CH
3

N- nornuciferin
CH
3

CH
3

CH
3

O- nornuciferin
H
CH
3

CH
3

Anoanin
- CH
2
-

H
Roemetin
- CH
2
-
CH
3


pronuciferin
liriodenin
5

1.1.5. Tác dụng sinh học của lá sen
Trong y học cổ truyền lá sen vị đắng, tính chát, quy vào 3 kinh can, tỳ,
thận. Công năng giải thử, kiện tỳ, lương huyết, chỉ huyết. Chủ trị trúng thử,
háo khát, ỉa chảy do thử thấp, huyết lị, nôn máu, đổ máu cam, đái máu do
huyết nhiệt. Liều dùng: ngày dùng từ 3-9g dược liệu khô, 15-30g dược liệu
tươi, dùng dạng thuốc sắc hoặc hoàn tán [3].
Theo Đỗ Huy Bích và cộng sự, dịch chiết và alcaloid toàn phần của tâm
và lá sen có tác dụng an thần, tăng trương lực và co bóp cơ tử cung thỏ, chống
co thắt cơ trơn ruột gây nên bởi lustamin và acetylcholine. Lá sen có tác dụng
chống choáng phản vệ. Tác dụng an thần của tâm sen yếu hơn lá sen [4].
Lá sen có tác dụng bảo vệ đối với các rối loạn nhịp tim gây nên do calci
clorid, làm giảm số chuột chết và chuột bị rung tâm thất. Lá sen cũng có tác
dụng chống loạn nhịp tim gây nên do bari clorid và kích thích điện. Cao cồn
có tác dụng mạnh hơn cao nước. Cơ chế chống loạn nhịp tim của lá sen là do
làm tăng ngưỡng kích thích tâm trương và tăng giai đoạn trơ của cơ tâm nhĩ
và tâm thất. LD
50

của lá sen tiêm phúc mạc trên chuột nhắt trắng là 17g/kg thể
trọng. Alcaloid toàn phần của lá sen có tác dụng ức chế loạn nhịp tim thực
nghiệm, tác dụng này của alcaloid lá sen có phần tốt hơn ajmazin [4].
Một trong những tác dụng của lá sen đang rất được quan tâm hiện nay
là tác dụng hạ mỡ máu, chống béo phì. Flavonoid ở dịch chiết lá sen có khả
năng ngăn ngừa mỡ máu và giảm nhẹ tác hại đến gan khi ăn chế độ nhiều chất
béo, tương tự như các thuốc hay dùng là sillymarin và simvastatin [13], [19].
Ngoài ra, các nghiên cứu trên thế giới gần đây cho thấy thành phần
trong dịch chiết lá sen còn có nhiều hoạt tính dược lí khác như viêm gan

[11];
chống oxy hóa

[12], [18]; chống ung thư [20]; kháng HIV

[23].
6

1.2. Tổng quan về nuciferin
1.2.1. Công thức hóa học, tính chất
 Công thức hóa học của nuciferin:
 Công thức phân tử: C
19
H
21
NO
2
.
 Phân tử lượng: 295,38.
 Tên khoa học: 1,2-dimethoxy-6-methyl-

5,6,6a,7-tetrahydro-4H-dibenzo[de,g]quinolin.
 Tính chất lí – hóa: Nuciferin là chất kết tinh, tinh thể hình khối, màu
vàng nhạt, không mùi, không vị, tan tốt trong cloroform, methanol,
ethanol nóng, hầu như không tan trong nước.
 Nhiệt độ nóng chảy T
0
nc
: 164 – 165
0
C .
 Phổ UV đo trong methanol cho λmax tại bước sóng 210nm, 228nm,
270nm [7].
1.2.2. Nguồn gốc
Nuciferin được tìm thấy ở các bộ phận của cây sen là tâm sen, lá sen
và gương sen. Tuy hàm lượng alcaloid toàn phần trong tâm sen là cao nhất
(1,23%), trong lá sen (0,89%) và gương sen (0,24%) nhưng hàm lượng
nuciferin trong lá sen lại nhiều hơn tâm sen do nuciferin là alcaloid chính
trong lá sen, alcaloid chính trong tâm sen là liensinin và neferin [8].
1.2.3. Tác dụng dược lí
Nuciferin chiết từ lá sen có tác dụng giải thắt co cơ trơn, ức chế thần
kinh trung ương, chống viêm yếu, giảm đau, giảm ho, kháng serotonin và có
hoạt tính phong bế thụ thể adrenergic. Nuciferin ít độc, liều LD50 là 330
mg/kg thể trọng chuột. Nuciferin có tác dụng tăng cường quá trình ức chế các
tế bào thần kinh vùng vỏ não cảm giác – vận động và thể lưới thân não trên
thỏ thí nghiệm, có tác dụng an thần và kéo dài giấc ngủ của pentobarbital trên
chuột thí nghiệm [2].


7


Tiến sĩ Nguyễn Thị Nhung năm 2001 đã tiến hành thử tác dụng sinh
học và kết luận nuciferin với liều 60 mg/kg thể trọng chuột nhắt trắng, không
gây đột biến nhiễm sắc thể. Nuciferin dùng cho chuột nhắt trắng có chửa với
3 liều 1,32 mg/kg trong 1, 2 hoặc 3 ngày liên tục không ảnh hưởng đến sức
khỏe của chuột mẹ và không gây những bất thường trong quá trình phát triển
của phôi thai. Kết quả thử tác dụng của nuciferin lên điện tim và điện não thỏ
cho thấy nuciferin với liều 100mg/kg thể trọng/ngày qua đường uống trong 4
ngày liền có tác dụng tăng cường ức chế các tế bào thần kinh vùng vỏ não
cảm giác – vận động và thể lưới thân não [8].
Trong một nghiên cứu năm 2012, các nhà khoa học đã chỉ ra nuciferin
chiết từ Nelumbo nucifera có tác dụng kích thích tiểu đảo tụy tiết insulin,
chống bệnh đái tháo đường theo cơ chế đóng các kênh K
+
-ATP. Tác dụng của
nuciferin bị bất hoạt bởi diazoxide và nimodipine; bị giảm bởi chất ức chế
protein kinase A, protein kinase C. Nuciferin kích thích tế bào INS – 1E tiết
insulin ở cả nồng độ glucose 3,3 và 16,7 mM. So với glibenclamid, nuciferin
có tác dụng mạnh hơn và ít độc với tế bào hơn. Tuy nhiên, khả năng gắn với
receptor sulfonylurea của nuciferin yếu hơn glibenclamid [14].
Theo Yoshiki Kashiwada và các cộng sự, nuciferin và 1 số alcaloid có
ở dịch chiết lá sen trong cồn 95% có tác dụng kháng HIV. Trong đó, nồng độ
50% tác dụng tối đa (EC
50
) = 0,8 µg/ml; chỉ số trị liệu (TI) = 36,3 [23].
* Với những tác dụng đó, cùng với nhu cầu sử dụng thuốc an thần và
thuốc hỗ trợ điều trị đái tháo đường ngày một tăng, nuciferin có tiềm năng trở
thành nguồn nguyên liệu đóng vai trò quan trọng trong ngành dược không chỉ
ở Việt Nam mà còn trên toàn thế giới.
8


1.3. Một số phương pháp chiết xuất alcaloid toàn phần và tinh chế
nuciferin từ lá sen
1.3.1. Phương pháp chiết alcaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ
không phân cực [1].
Sử dụng dung môi chiết là các dung môi hữu cơ. Trong phòng thí
nghiệm thường dùng benzen, cloroform, ether + cloroform. Trong sản xuất
công nghiệp, phải chú ý dùng dung môi rẻ tiền, ít độc, khó cháy. Có thể dùng
chiết nguội hoặc chiết nóng. Tinh chế thu các alcaloid bằng cách chuyển dạng
muối với acid – base và phân chia chúng giữa hai pha để loại tạp chất không
phải là alcaloid.
 Ưu điểm:
Hiệu suất chiết các hoạt chất từ dược liệu cao do dịch chiết rút ra sạch,
dễ tinh chế các loại tạp đi kèm. Các dung môi hữu cơ không phân cực
thường là dung môi có khả năng chiết chọn lọc đối với các alcaloid ở
dạng base.
 Nhược điểm:
Dung môi hữu cơ thường đắt tiền. Khi sử dụng các dung môi này chiết
đòi hỏi các thiết bị phức tạp, đầu tư cho thiết bị lớn. Một số dung môi
hữu cơ dễ cháy nổ.
1.3.2. Phương pháp chiết alcaloid dưới dạng muối bằng dung môi nước, nước
acid hoặc ethanol acid [1]
Các alcaloid trong dược liệu ở dạng muối tan trong các dung môi thân
nước, thông thường dùng nước nóng hoặc ethanol có các nồng độ khác nhau.
Dịch chiết sau đó đem lọc, kiềm hóa về dạng base, cô dung môi dưới áp suất
giảm. Dùng dung môi hữu cơ thích hợp để chiết lấy alcaloid dạng base. Cất
thu hồi dung môi hữu cơ rồi sấy khô sẽ thu được hỗn hợp alcaloid thô.
9

Chuyển dạng alcaloid từ base sang muối và ngược lại để loại tạp, thu lấy
alcaloid tinh khiết.

 Ưu điểm:
Thiết bị chiết xuất đơn giản, đầu tư ít. Nước ta lại có sẵn nguồn nguyên
liệu này.
 Nhược điểm:
Đối với các loại dược liệu chứa nhiều chất nhầy, việc sử dụng nước làm
dung môi chiết sẽ gặp khó khăn trong việc rửa dịch chiết và tinh chế.
* Hiện nay trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về chiết xuất alcaloid toàn
phần của lá sen với mục đích lựa chọn phương pháp chiết đạt hiệu suất cao,
an toàn, chi phí thấp. Có một số phương pháp đã được nghiên cứu như:
 Chiết bằng dung môi ethanol [5], [7], [8], [21]
Ở nước ta và trên thế giới, phần lớn các nghiên cứu đã công bố đều sử
dụng dung môi ethanol theo phương pháp đun nóng hồi lưu. Đây được coi
như phương pháp truyền thống để chiết alcaloid toàn phần từ lá sen. Quy trình
như sau: Bột dược liệu được sấy khô, làm ẩm với NH
4
OH. Đem đun hồi lưu
cách thủy với ethanol, để nguội, thu lấy dịch chiết. Lọc dịch chiết, đem cô thu
hồi dung môi để loại hết ethanol. Thêm HCl 5%, khuấy đều, đun nóng để tăng
độ tan của alcaloid dạng muối sau đó chiết 3 lần với ether dầu hỏa để loại tạp.
Lọc, kiềm hóa bằng NH
4
OH tới pH=10-11. Chiết 5 – 6 lần đồng lượng bằng
cloroform, cô đến cắn rồi đem sấy khô ở 60
0
trong 3 giờ thu được alcaloid
toàn phần.
Wang GH, Zhang BX, Nie QX, Li H, Zang C (2008) đã nghiên cứu
lựa chọn được các thông số để tiến hành chiết nuciferin bằng ethanol như sau:
+ Ethanol: 75% – 80%.
+ Tỷ lệ dược liệu/ dung môi (kg/l): gấp 20 – 25 lần so với dược liệu.

+ Thời gian chiết: 2 giờ, chiết 2 lần.
10

Ethanol là một dung môi ít độc, an toàn, có thể cất thu hồi để tái sử
dụng nhưng là dung môi không chọn lọc, sản phẩm chứa nhiều tạp gây khó
khăn cho quá trình tinh chế.
 Chiết bằng dung môi siêu tới hạn CO
2
[17]
Juan Xiao, Binqiang Tian, Bijun Xie, Erning Yang, John Shi, Zhida
Sun (2010) đã khảo sát phương pháp chiết xuất alcaloid toàn phần trong lá
sen bằng dung môi CO
2
siêu tới hạn, sử dụng HPLC để phân tích thành phần
dịch chiết. Các tác giả tìm ra điều kiện tối ưu cho quy trình chiết xuất là: áp
suất khí đẩy dòng CO
2
30 mPa, nhiệt độ chiết 70°C, chất cho thêm là 10%
diethylamine và 1% nước trong methanol, thời gian chiết là 2 giờ, tốc độ dòng
CO
2
là 1,2ml/phút.
Ưu điểm của phương pháp: thân thiện với môi trường, có thể áp dụng
cho hoạt chất không bền, khả năng hòa tan tốt một số chất và có thể tái sử
dụng. Nhược điểm: yêu cầu phải có thiết bị chuyên dùng, giá thành đắt; điều
kiện tối ưu để chiết thành công.
 Chiết xuất bằng vi sóng sử dụng dung môi ion lỏng [22]
Gần đây phương pháp chiết xuất bằng vi sóng sử dụng dung môi ion
lỏng đã được phát triển nghiên cứu để chiết xuất 3 alcaloid là N-nornuciferin,
O-nornuciferin và nuciferin từ lá sen. Quy trình chiết: trộn 0,5 g bột dược liệu

với 10 ml dung dịch ion lỏng thành hỗn dịch, chiết xuất hỗn dịch bằng cách
chiếu sóng ngắn vào hỗn dịch. Sau đó, làm lạnh xuống nhiệt độ phòng, rửa
giải bằng 50ml nước đã loại ion, lọc qua màng lọc 0,45 µm rồi đem phân tích
bằng HPLC.
Wenyan Ma, Yanbin Lu, Ruilin Hu, Jihang Chen, Zizhang Zhang,
Yuanjiang Pan đã nghiên cứu lựa chọn các thông số cho quy trình chiết như
sau: dung môi chiết 1-hexyl-3-methylimidazoliumbromid [C
6
MIM]Br, năng
lượng sóng 280W, thời gian chiết 2 phút, tỉ lệ dược liệu/dung môi = 1/30.
11

Phương pháp này không những đơn giản, cho hiệu suất cao, mà thời
gian giảm từ 2 giờ xuống 2 phút nên rất có tiềm năng phát triển rộng rãi tuy
nhiên ở nước ta vẫn còn khá mới mẻ.
* Qua tham khảo các tài liệu, ta thấy có rất nhiều các phương pháp
khác nhau để chiết alcaloid toàn phần từ lá sen, mỗi phương pháp đều có ưu
nhược điểm riêng. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu về phương pháp chiết lá
sen bằng dung môi dầu hỏa nên chúng tôi thực hiện nghiên cứu xây dựng quy
trình chiết bằng dầu hỏa để xem xét khả năng ứng dụng vào quy mô công
nghiệp.
1.3.3. Các phương pháp tinh chế nuciferin
Các tài liệu đã công bố chủ yếu sử dụng phương pháp sắc kí cột để
phân lập nuciferin từ alcaloid toàn phần.
 Hoàng Thị Tuyết Nhung (2011): Hòa tan alcaloid toàn phần trong
cloroform, nhồi cột silicagel, sử dụng hỗn hợp dung môi rửa giải là n-Hexan :
aceton : NH3 đặc (3 : 1 : 0,1) sau đó đem bốc hơi dung môi lấy cắn rồi đem
sấy khô thu được nuciferin [7].
 Nguyễn Thị Kiều Trang (2009): Cân cao khô alcaloid toàn phần, thêm
5 phần bột silicagel, trộn đều trong cối, đổ bột đó vào cột, dùng đũa san bằng,

lấy một ít ethylacetat rửa cối, chày, đổ vào cột. Rửa giải bằng ethylacetat, thu
lấy dịch đem đi kết tinh trong 24 giờ sau đó lọc tủa, sấy khô thu được
nuciferin tinh khiết [10].
* Các phương pháp tinh chế trên đều sử dụng thiết bị phức tạp và dung
môi độc hại, chi phí cao nên rất khó thực hiện trong quy mô công nghiệp. Vì
thế chúng tôi nghiên cứu thực hiện phương pháp kết tinh bằng cồn để tinh chế
nuciferin, đây là phương pháp đơn giản, sử dụng dung môi ít độc, chi phí
thấp, dễ ứng dụng trong công nghiệp.
12

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu
Lá sen được trồng ở Hà Đông, thu hái vào tháng 7 năm 2013.
Bảng 2.1. Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu
STT
Tên hóa chất
Nguồn gốc
1
Acid clohydric
Trung Quốc
2
Acid sunfuric
Trung Quốc
3
Acetonitril
Merck
4
Amoniac
Trung Quốc

5
Cloroform

Trung Quốc
6
Dầu hỏa
Việt Nam
7
Đỏ methyl
Trung Quốc
8
Ethanol 96%

Việt Nam
9
Methanol
Trung Quốc
10
Natri carbonat
Việt Nam
11
Natri hydroxyd
Trung Quốc
12
Nuciferin chuẩn 100,11%
Việt Nam
(Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương)
13
Nước cất
Việt Nam

14
Triethylamin
Merck
15
Thuốc thử Bouchardat
Trung Quốc
16
Thuốc thử Dragendorff
Trung Quốc

13

2.1.2. Máy móc thiết bị
Bảng 2.2. Các máy móc, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực nghiệm.
STT
Tên dụng cụ, thiết bị
Xuất xứ
1
Bản mỏng silicagel GF
254

Đức
2
Bình cầu 100mL
Đức
3
Bình định mức
Đức
4
Bình gạn

Trung Quốc
5
Bình sắc ký
Trung Quốc
6
Bình Soxhlet
Việt Nam
7
Buret
Đức
8
Cân kỹ thuật Sartorius BP 2001S, độ nhạy 10
-2

Thụy Sỹ
9
Cốc có mỏ 100ml, 1000ml
Trung Quốc
10
Đũa thủy tinh
Trung Quốc
11
Mao quản (chấm sắc ký, đo nhiệt độ nóng chảy)
Việt Nam
12
Máy cất quay chân không Buchi B480
Thụy Sỹ
13
Máy chiết và tinh chế dược liệu
Việt Nam

14
Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt
Mỹ
15
Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AV-
500MHz
Mỹ
16
Máy đo phổ hồng ngoại GX-Perkin Elmer
Mỹ
17
Máy đo phổ khối lượng Agilent 6310 Ion Trap
Mỹ
18
Máy đo quang phổ UV-VIS Hitachi
Mỹ
19
Máy HPLC Shimadzu SPD-M10 Avp
Nhật
20
Máy khuấy từ gia nhiệt IKA RJJ basic KT/C
Đức
21
Máy siêu âm Ultrsonic LC 60H
Đức
22
Pipet 1ml, 5ml, 10ml
Đức
23
Phễu lọc Buncher

Trung Quốc
24
Tủ sấy Memmert
Đức


14

2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Khảo sát quy trình chiết alcaloid toàn phần từ lá sen.
Để xây dựng quy trình chiết xuất alcaloid toàn phần từ lá sen trên quy
mô công nghiệp, ta thay đổi các điều kiện: số lần chiết, nhiệt độ, thời gian,
đem xác định hàm lượng. Từ đó, xác định hiệu suất chiết xuất để lựa chọn
được quy trình tối ưu.
2.2.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết
Để khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến hiệu suất; ta thay đổi
thời gian chiết và tiến hành trong cùng điều kiện, cùng dung môi, nhiệt độ, thể
tích, số lần chiết.
2.2.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết
Để khảo sát sự ảnh hưởng của số lần chiết nhằm chọn ra số lần chiết
thích hợp, ta khảo sát từ 1-4 lần chiết, tiến hành trong cùng điều kiện nhiệt độ,
thời gian.
2.2.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết
Để khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hiệu suất, ta thay đổi
nhiệt độ chiết, tiến hành trong cùng điều kiện dung môi, thể tích, số lần, thời
gian chiết.
2.2.2. So sánh phương pháp chiết bằng dung môi dầu hỏa và EtOH 96%
2.2.2.1. So sánh độ tan
Sử dụng phương pháp đo quang, tiến hành xác định độ tan của
nuciferin trong EtOH 96% ở 25

0
C và 78
0
C, trong dầu hỏa ở 25
0
C và 100
0
C.
2.2.2.2. So sánh hiệu suất chiết:
Chiết alcaloid toàn phần trong lá sen trong dung môi dầu hỏa và EtOH
96% theo mục 2.3.2 ; xác định khối lượng tủa alcaloid toàn phần, hàm lượng,
hiệu suất chiết từ đó lựa chọn dung môi chiết thích hợp.
15

2.2.3. Tinh chế nuciferin
Tiến hành tinh chế nuciferin từ alcaloid toàn phần bằng phương pháp
kết tinh trong EtOH 96%, gồm 3 bước:
- Hòa tan alcaloid trong EtOH 96%.
- Tẩy màu bằng than hoạt.
- Kết tinh sản phẩm.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp định lượng
2.3.1.1. Định lượng alcaloid toàn phần trong lá sen
Định lượng theo DĐVN IV, sử dụng phương pháp chẩn độ acid-base
[3]. Cách tiến hành như sau:
Cân chính xác khoảng 2,0g bột dược liệu, thấm ẩm bằng ammoniac
đậm đặc, để 1 giờ, sau đó cho vào túi làm bằng giấy lọc, đặt vào bình Soxhlet,
chiết bằng EtOH 96% cho đến kiệt alcaloid. Cất thu hồi dung môi, hòa tan
cắn trong dung dịch acid HCl 5% (5 lần, mỗi lần 5 ml). Lọc, rửa dịch lọc acid
bằng ether dầu hỏa 3 lần, mỗi lần 10ml. Kiềm hóa dịch chiết acid bằng

amoniac đậm đặc đến pH=10, sau đó lắc với cloroform 5 lần, mỗi lần 10ml.
Gộp dịch chiết cloroform, rửa dịch cloroform bằng nước cất đến pH trung tính
rồi bốc hơi dung môi tới khô. Hòa tan cắn với một lượng chính xác 10ml
dung dịch acid hydrocloric 0,1N. Thêm 5ml nước cất và 2 giọt đỏ methyl.
Chuẩn độ dung dịch acid hydroclorid 0,1N thừa bằng dung dịch natri
hydroxyd 0,1N.
Hàm lượng alcaloid toàn phần (X) trong lá sen tính bằng phần trăm
công thức:
X% =
(
10−𝑛
)
×2,95
𝑎

Trong đó:
16

n là số ml dung dịch natri hydroxyd 0,1N đã dùng.
a là khối lượng bột dược liệu đem định lượng đã trừ độ ẩm (g).
Dược liệu phải chứa ít nhất 0,8 % alcaloid toàn phần tính theo nuciferin
C
19
H
21
O
2
N trên dược liệu khô kiệt.
2.3.1.2. Định lượng alcaloid toàn phần trong tủa thô bằng phương pháp chuẩn
độ acid - base

Hòa tan khoảng 0,05 g tủa thô vào 10ml cloroform. Rửa dịch cloroform
bằng nước cất đến pH trung tính rồi bốc hơi dung môi tới khô. Hòa tan cắn
với một lượng chính xác 10ml dung dịch acid hydrocloric 0,1N. Thêm 5ml
nước cất và 2 giọt đỏ methyl. Chuẩn độ dung dịch acid hydroclorid 0,1N thừa
bằng dung dịch natri hydroxyd 0,1N.
Hàm lượng alcaloid toàn phần (X) trong tủa thô tính bằng phần trăm
công thức:
X% =
(
10−𝑛
)
×2,95
𝑎

Trong đó:
n là số ml dung dịch natri hydroxyd 0,1N đã dùng.
a là khối lượng tủa thô đem định lượng đã trừ độ ẩm (g).
Từ hàm lượng alcaloid toàn phần trong tủa thô tính được khối lượng
alcaloid toàn phần sau khi chiết thu được:
m
alc tp
= m
tủa cân
× X%
Trong đó: m
alc tp

, m
tủa cân
là khối lượng alcaloid toàn phần, khối lượng tủa đã

trừ độ ẩm.
2.3.1.3. Định lượng nuciferin bằng phương pháp HPLC
Tham khảo các tài liệu [5], [7], [9], [22], tiến hành chạy sắc kí với điều
kiện sau:
 Lựa chọn điều kiện sắc kí