ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM




ĐINH THỊ THỦY


Tên đề tài:
“NHÂN NHANH GIỐNG LAN HỒ ĐIỆP (P.TAI-LIN RED ANGEL)
NHẬP NỘI BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO”




KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC





Hệ đào tạo :

Chính quy
Chuyên ngành :

Công nghệ Sinh học
Khoa :

CNSH - CNTP
Khóa học :

2010 - 2014








Thái Nguyên, 2014


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM



ĐINH THỊ THỦY


Tên đề tài:
“NHÂN NHANH GIỐNG LAN HỒ ĐIỆP (P.TAI-LIN RED ANGEL)
NHẬP NỘI BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO”





KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC




Họ và tên :

Đinh Thị Thủy
Hệ đào tạo :

Chính quy
Chuyên ngành :

Công nghệ Sinh học
Khoa :

Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm
Khóa học :

2010 - 2014
Người hướng dẫn :

1.
TS. Hà Thị Thúy
Vi
ện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam
2.
Ths. Lương Thị Thu Hường
Khoa CNSH & CNTP

- ĐH Nông Lâm Thái Nguyên




Thái Nguyên, 2014

LỜI CẢM ƠN

Với tấm lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn TS. Hà
Thị Thuý, phó Viện trưởng Viện Di truyền Nông nghiệp, người đã tận tình chỉ bảo
và tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn cô ThS. Lương Thị Thu Hường đã hướng dẫn,
giúp đỡ tôi thực tập và hoàn thành khoá luận.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới chị Phạm Thị Phương đã tận
tình chỉ bảo tôi trong suốt thời gian thực tập cùng toàn thể các cô chú, anh chị làm
việc tại Trạm thực nghiệm Công nghệ cao Văn Giang - Hưng Yên, trực thuộc Viện
Di truyền Nông Nghiệp Việt Nam.
Tôi xin gửi lời tri ân và biết ơn sâu sắc nhất tới các thầy cô khoa Công nghệ
Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã
hướng dẫn giảng dạy tôi trong suốt quá trình học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè, những người luôn
hỗ trợ, giúp đỡ tôi và động viên tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày 02 tháng 06 năm 2014
Sinh viên


Đinh Thị Thủy


DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 4.1: Kết quả nghiên cứu nguồn vật liệu khởi đầu là hạt theo phương
pháp nhân giống hữu tính (sau 30 ngày ) 25
Bảng 4.2: Kết quả nghiên cứu nguồn vật liệu khởi đầu là cơ quan sinh dưỡng
theo phương pháp nhân giống vô tính (sau 90 ngày) 26
Bảng 4.3: Kết quả ảnh hưởng của Kinetin lên sự phát sinh hình thái của lát
mỏng (sau 30 ngày nuôi cấy). 27
Bảng 4.4: Kết quả ảnh hưởng của 2,4 - D lên sự phát sinh hình thái của lát
mỏng (sau 30 ngày nuôi cấy). 29
Bảng 4.5: Ảnh hưởng của Ki và 2,4 - D lên khả năng phát sinh hình thái của
lát mỏng (sau 30 ngày nuôi cấy) 30
Bảng 4.6: Kết quả ảnh hưởng của nguồn mẫu khác nhau đến sự phát sinh hình
thái của lát mỏng (sau 30 ngày nuôi cấy) 32



DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang
Hình 4.1: Protocorm 25
Hình 4.2: Kết quả nghiên cứu nguồn vật liệu khởi đầu là cơ quan sinh dưỡng
đến tỷ lệ tạo chồi và tỷ lệ tạo protocorm của lan Hồ Điệp 26
Hình 4.3: Chồi hình thành từ mắt ngủ ngồng hoa non 27
Hình 4.4: Kết quả ảnh hưởng của Kinetin đến tỷ lệ tạo chồi, tỷ lệ tạo
protocorm của lát mỏng (sau 4 tuần nuôi cấy) 28
Hình 4.5: Kết quả ảnh hưởng của 2,4-D đến tỷ lệ tạo chồi, tỷ lệ tạo protocorm
của lát mỏng (sau 30 ngày nuôi cấy) 29
Hình 4.6: Ảnh hưởng của Ki và 2,4 - D lên tỷ lệ tạo chồi và tỷ lệ tạo

protocorm của lát mỏng (sau 4 tuần nuôi cấy) 31
Hình 4.7: Kết quả ảnh hưởng của nguồn mẫu khác nhau đến sự phát sinh hình
thái của lát mỏng (sau 4 tuần nuôi cấy) 32
Hình 4.8: Protocorm 33


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

CT : Công thức
MS : Murashinge and Skoog, 1962
Ki : Kinetine
Cs : Cộng sự
Đ/C : Đối chứng
Nxb : Nhà xuất bản
KT : Khoai tây
PSHT : Phát sinh hình thái
ĐTST : Điều tiết sinh trưởng
2,4-D : Acid 2,4 dichloro phenol acetic

MỤC LỤC

Trang
PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích nghiên cứu 2
1.3. Yêu cầu của đề tài 2
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 3
2.1.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 3

2.1.2. Tính toàn năng của tế bào thực vật. 3
2.1.3. Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào thực vật 4
2.1.4. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 5
2.1.4.1. Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật 5
2.1.4.2. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 6
2.1.5. Các công đoạn của nuôi cấy mô tế bào 10
2.2. Lan Hồ Điệp hoa tím đậm (P.Tailen Red Angle) 11
2.2.1. Lịch sử phát hiện lan Hồ Điệp 11
2.2.2. Đặc điểm hình thái của lan Hồ Điệp 11
2.3. Yêu cầu về hệ sinh thái 13
2.3.1. Các phương pháp nhân giống 14
2.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước 15
2.3.2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 15
2.3.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 17
PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
3.1. Đối tượng (vật liệu) và phạm vi nghiên cứu 20
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 20
3.3. Nội dung nghiên cứu 20
3.4. Phương pháp nghiên cứu 20
3.4.1. Cách bố trí thí nghiệm 20
3.4.2. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 22

3.4.3. Phương pháp khử trùng mẫu cấy 23
3.5. Chỉ tiêu theo dõi 23
3.6. Xử lý số liệu 24
PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25
4.1. Kết quả nghiên cứu xác định nguồn vật liệu thích hợp để đưa vào nhân giống 25
4.1.1. Kết quả nghiên cứu nguồn vật liệu khởi đầu là hạt 25
4.1.2. Kết quả nghiên cứu nguồn vật liệu khởi đầu là cơ quan sinh dưỡng 26
4.2. Nghiên cứu cải tiến giai đoạn nhân nhanh bằng phương pháp cắt lát mỏng để

gia tăng hệ số nhân 27
4.2.1. Kết quả ảnh hưởng của Kinetin lên sự phát sinh hình thái của lát mỏng (sau 4
tuần nuôi cấy) 27
4.2.2. Kết quả ảnh hưởng của 2,4 - D lên sự phát sinh hình thái của lát mỏng (sau 4
tuần nuôi cấy) 28
4.2.3. Ảnh hưởng của Ki và 2,4 - D lên khả năng phát sinh hình thái của lát mỏng
(sau 4 tuần nuôi cấy) 30
4.2.4. Kết quả ảnh hưởng của nguồn mẫu khác nhau đến sự phát sinh hình thái của
lát mỏng 32
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34
5.1. Kết luận 34
5.2. Đề nghị 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO 34
I. Tiếng Việt 35
II. Tiếng Anh 36


1
PHẦN 1
MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Lan Hồ Điệp có tên khoa học Phalaenopsis Blullle, 1825. Họ phụ
Vandoideae. Tông Vandeae. Có tên từ chữ Phalaina nghĩa là “con bướm” và opsis
có nghĩa là “giống như”. Giống Hồ Điệp có khoảng trên 60 loài và ngày càng
được lai tạo ra rất nhiều cây lai hoa rất đẹp và quý phái.
Hồ Điệp được khám phá năm 1750, đầu tiên được ông Rumphius đặt tên là
Angraecum album. Năm 1753, Linne đổi tên thành Epidendrum. Năm 1825, nhà
thực vật Hà Lan định danh lại là Phalaenopsis.
Hồ Điệp phân bố chủ yếu ở các nước Đông Nam Á như: Malaysia, Indonesia,

Philipin, phía đông Ấn Độ và Úc. Ở Việt Nam có 107 loài và 1 thứ, phân bố ở các
vùng núi từ Bắc vào Nam và trên một số đảo ven biển. Tuy nhiên, do nhiều nguyên
nhân khác nhau, đến nay nhiều loài đã bị tuyệt chủng hoặc bị đe dọa tuyệt chủng. Một
số loài nằm trong danh lục Đỏ của “ Sách đỏ Việt Nam”. Ở Việt Nam cũng có một số
loài vì có hoa nhỏ nên được gọi là tiểu Hồ Điệp (Phalaenopsis manni, gibbosa, lobbi,
fuscata, cornucervi). Hồ Điệp có thể mọc ở khí hậu nhiệt đới và đồi núi cao 2000m nên
vừa chịu được khí hậu nóng ẩm vừa chịu được khí hậu mát.
Các loài này đều có hoa nhỏ nhưng màu sắc đẹp, cấu trúc kỳ diệu, rất dễ
thương và có hương thơm nên hấp dẫn đối với giới sưu tầm lan rừng nguyên thủy.
Đây cũng là nguồn gen quý để phát triển công nghệ lai tạo hoa lan Việt Nam. Tuy
nhiên, Hồ Điệp là loài lan khó nhân giống, hiện tại chỉ có một số cơ sở trường Đại
học, Viện nghiên cứu có hướng phát triển trên những kĩ thuật mới như: Kỹ thuật
nuôi cấy quang tự dưỡng, Bioreactor… nhưng vẫn chưa đưa ra áp dụng rộng rãi.
Công nghệ nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào là một trong
những phương pháp nhân giống vô tính với những ưu điểm nổi trội là: Cho hệ số nhân
giống rất cao, sản xuất quanh năm không phụ thuộc vào mùa vụ, cần ít diện tích sản
xuất và vật liệu nhân giống ban đầu, cây giống sản xuất hoàn toàn sạch bệnh, đồng nhất
về mặt di truyền (Nguyễn Quang Thạch, 1995)[12], việc vận chuyển cây giống đi xa
thuận tiện, tổn thất ít, chất lượng cây được đảm bảo do đó đáp ứng được các yêu cầu về
sản xuất cây giống với số lượng mang tính công nghiệp.


2
Trên cơ sở đó tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nhân nhanh giống lan Hồ
Điệp (P.Tai-Lin Red Angel) nhập nội bằng phương pháp in vitro”.
1.2. Mục đích nghiên cứu
Hoàn thiện các khâu kỹ thuật nhân giống in vitro cho cây lan Hồ Điệp, từ lựa
chọn vật liệu đưa vào nuôi cấy, cải tiến phương pháp khử trùng đến cải tiến phương
pháp nhân nhanh và môi trường nhân nhanh để gia tăng hệ số nhân và chất lượng
cây hình thành. Trên cơ sở các biện pháp kỹ thuật, tìm ra quy trình phù hợp ứng

dụng trong sản xuất giống hoa lan Hồ điệp có chất lượng, góp phần phát triển cây
lan Hồ điệp giúp các cơ sở sản xuất kinh doanh áp dụng tiến bộ kỹ thuật một cách
khoa học và có hiệu quả nhất.
1.3. Yêu cầu của đề tài
- Xác định được nguồn vật liệu thích hợp để đưa vào nhân giống.
- Cải tiến môi trường nuôi cấy khởi động tái sinh mẫu để gia tăng nguồn
mẫu ban đầu.
- Cải tiến môi trường nhân nhanh để gia tăng hệ số nhân.
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
* Ý nghĩa khoa học
- Thông qua đề tài, tìm hiểu được vai trò của một số chất kích thích sinh
trưởng đối với quá trình tái sinh, nhân nhanh của cây lan Hồ Điệp.
- Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng phát sinh hình
thái của lát mỏng.
* Ý nghĩa thực tiễn sản xuất
Sản xuất được cây con sinh trưởng, phát triển tốt, đồng đều và sạch bệnh với
khối lượng lớn. Thuận tiện cho việc áp dụng các biện pháp kỹ thuật trong giai đoạn sản
xuất hoa thương phẩm, giảm được giá thành, từ đó kích thích sản xuất hoa phát triển.






3
PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.1.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nhân giống vô tính là hình thức nhân giống thông qua các cơ quan dinh dưỡng
(thân, lá, vỏ, củ,…) bao gồm các phương pháp giâm cành, chiết cành, mắt ghép và nuôi
cấy in vitro. Trong đó nuôi cấy in vitro được coi là phương pháp hữu hiệu nhất.
Nhân giống vô tính in vitro được tiến hành trên nguyên tắc cắt nuôi đoạn thân
có mang chồi ở nách lá, đoạn rễ hay mảnh củ, cánh hoa, có kích thước nhỏ phù hợp với
điều kiện vô trùng của ống nghiệm (Ngô Xuân Bình và cs, 2003)[10].
Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung cho các kỹ thuật nhân giống vô
tính cổ điển như: giâm, chiết, ghép, tách dòng. Một kỹ thuật tiến bộ với những ưu điểm
như: Tốc độ nhân giống cao từ 33 đến 1012 một năm (Ngô Xuân Bình và cs,
2003)[10], ví dụ trong 1ml dung dịch môi trường có từ 100.000- 1000.000 tế bào
nuôi nếu ở điều kiện thích hợp mỗi tế bào có thể chuyển hóa tạo phôi và mọc cây,
từ 1ml dung dịch môi trường có thể tạo ra cả rừng cây (Đỗ Năng Vịnh, 2005)[7];
Chủ động sản xuất, không phụ thuộc vào điều kiện thời tiết, mùa vụ; Có khả năng
công nghiệp hóa cao do nuôi cấy trong điều kiện ổn định về môi trường dinh dưỡng,
nhiệt độ, ánh sáng, do đó có thể công nghiệp hóa hoàn toàn từ khâu nhân cây giống
với số lượng lớn đến khi ươm trồng trong nhà lưới.
Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật dựa trên học thuyết
về tính toàn năng của tế bào.
2.1.2. Tính toàn năng của tế bào thực vật.
Cuối thế kỉ XIX đầu thế kỉ XX nhà sinh lý thực vật người Đức Haberlandt đã
phát biểu tính toàn năng của tế bào như sau: Mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật
đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh (Lê Trần
Bình và cs, 1997)[17].
Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa
đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật
đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể
hoàn chỉnh. Cho đến nay con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái


4

sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ (Lê Trần Bình và cs,
1997)[17].
Trong nuôi cấy in vitro, tế bào thực vật thể hiện tính toàn năng thông qua sự
phản phân hóa và phân hóa tế bào.
2.1.3. Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào thực vật
Cơ thể thực vật trưởng thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ
quan chức năng khác nhau. Tuy nhiên ở tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ
một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia
hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyển hóa).
Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế
bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau.
Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô
chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau của cơ thể.
Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào phân hóa có chức năng riêng biệt.
Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên biệt,
chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp cần
thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân
chia mạnh mẽ cho ra các tế bào mới có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Quá
trình đó gọi là phản phân hóa tế bào.
Sự giãn tế bào: Tế bào giãn ra cả về chiều ngang và chiều dọc làm tăng kích
thước của từng cơ quan nói riêng và toàn bộ cơ thể nói chung. Sau hai giai đoạn này
cùng với quá trình biệt hóa tế bào phân hóa thành các mô chức năng chuyên hóa
chuyên biệt, đảm nhận các vai trò khác nhau trong cùng một cơ thể sống.
Phân hóa

Tế bào phôi sinh

Tế bào dãn

Tế bào chuyển hóa


Phản phân hóa



5
Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức
chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số
gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, còn một
số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã
được mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào khiến quá trình sinh
trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa. Mặt khác, khi tế bào nằm
trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách
riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho
sự hoạt hóa các gen của tế bào.
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết
quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào (Lê Trần Bình và cs, 1997)
[17].

2.1.4. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, yếu tố quyết định cho sự phân
hóa tế bào và cơ quan nuôi cấy.
2.1.4.1. Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật
* Điều kiện vô trùng
Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm bảo tốt
điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy hoặc môi trường sẽ bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết.
Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô in vitro.
Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa
học, tia cực tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn.
Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết

định. Tuy vậy, nếu tìm được nồng độ và thời gian xử lý thích hợp sẽ cho tỷ lệ sống
cao, thông thường hay sử dụng một số hóa chất như: HgCl
2
0,1%, nước Clolox, cồn
76
0
, Ca(ClO)
2
, để khử trùng.
Phương tiện khử trùng: Nồi hấp vô trùng, tủ sấy, buồng và bàn cấy vô trùng,
phòng nuôi cấy (Nguyễn Quang Thạch, 1995)[12].
* Điều kiện ánh sáng và nhiệt độ
Ánh sáng:
Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như:
Thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng. Thời gian chiếu
sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Với đa số các loài cây, thời
gian chiếu sáng thích hợp là 8-12h/ ngày (Nguyễn Quang Thạch, 1995)[12].


6
Cường độ ánh sáng cũng là yếu tố quan trọng tác động đến quá trình phát
sinh hình thái của mô nuôi cấy, cường độ ánh sáng cao kích thích sự tạo chồi trong
khi cường độ ánh sáng thấp sẽ hình thành mô sẹo (Ann Tuskes and Paul, 2002)[27].
Nhìn chung cường độ ánh sáng thích hợp cho nuôi cấy mô là 1000-2500 lux (Đỗ
Năng Vịnh, 2002)[6]. Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình
thái của mô thực vật in vitro. Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao thân chồi hơn so với
ánh sáng trắng. Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vươn cao nhưng
lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo. Hiện nay các phòng thí nghiệm
nuôi cấy mô đã cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ 2000-2500 lux, người ta sử
dụng các đèn huỳnh quang đặt cách các bình nuôi cấy từ 35-40 cm.

Nhiệt độ:
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng
tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hóa trong cây. Tùy thuộc vào xuất xứ
của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp. Nhìn chung nhiệt độ thích
hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây là 25±2
0
C.

2.1.4.2. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát triển
hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy mô là thành phần môi trường
nuôi cấy.
Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo loài
và bộ phận nuôi cấy. Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí
nghiệm thì thành phần môi trường cũng sẽ thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của
mẫu cấy.
Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy thực
vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử dụng cho mục
đích này, trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụng rất phổ biến như MS,
LS, WP. Ví dụ môi trường MS (Murashige&Skoog, 1982)[34] là môi trường được
sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, môi trường MS thích hợp
cho cả thực vật 1 lá mầm và 2 lá mầm.
Tuy có nhiều loại môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật nhưng đều gồm
một số thành phần cơ bản sau (Ngô Xuân Bình và cs, 2003)[10].
- Các muối khoáng đa lượng và vi lượng.


7
- Các vitamin và các amino axít.
- Nguồn các- bon: một số các loại đường.

- Các chất điều hoà sinh trưởng.
- Chất làm thay đổi trạng thái môi trường: các loại thạch (agar).
* Các muối khoáng đa lượng và vi lượng
Đối với cây trồng, các chất vô cơ đóng vai trò rất quan trọng. Ví dụ, Mg là
một phần của phân tử diệp lục, Ca là thành phần của màng tế bào, N là thành phần
quan trọng của amino axít, vitamin, protein và các axít nucleic. Tương tự, Fe, Zn và
Mo cũng là thành phần của một số enzym ( Nguyễn Đức Lượng, 2002)[11].
Các môi trường khác nhau có hàm lượng và thành phần chất khoáng khác
nhau, ví dụ thành phần và nồng độ khoáng của môi trường White hoặc Knop khá
nghèo nàn, nhưng lại rất giàu ở môi trường MS và B5.
Các ion của các muối hoà tan đóng vai trò quan trọng ổn định áp suất thẩm
thấu của môi trường và tế bào, duy trì thế điện hoá của thực vật. Ví dụ, K và C rất
quan trọng trong điều hoà tính thấm lọc của tế bào, duy trì điện thế và tham gia hoạt
hoá nhiều enzym ( Nguyễn Đức Lượng, 2002)[11].
*Nguồn cacbon ( Trần Văn Minh, 1999)
[
24
]

Các mô và tế bào thực vật trong môi trường nuôi cấy ít có khả năng tự dưỡng và
vì thế cần thiết phải bổ sung nguồn carbon bên ngoài để cung cấp năng lượng. Thậm chí
các mô bắt đầu lục hóa hoặc hình thành diệp lục tố dưới các điều kiện đặc biệt trong suốt
quá trình nuôi cấy đã không tự dưỡng carbon. Việc bổ sung nguồn carbon bên ngoài vào
môi trường làm tăng phân chia tế bào và tái sinh các chồi xanh.
Đường sucrose (saccharoza) là nguồn cacbon chủ yếu và được sử dụng
thường xuyên trong hầu hết các môi trường nuôi cấy mô, kể cả khi mẫu nuôi cấy là
các chồi xanh có khả năng quang hợp. Khi khử trùng, đường sucrose bị thuỷ phân
một phần, thuận lợi hơn cho cây hấp thụ.
*Các vitamin và acid amin
Tất cả các tế bào được nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại

vitamin cơ bản nhưng thường là với số lượng dưới mức yêu cầu. Để mô có sức sinh
trưởng tốt phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin. Các
vitamin là rất cần thiết cho các phản ứng sinh hoá. Linsmaier và Skoog đã khẳng


8
định vitamin B1 là cần thiết cho cho sự sinh trưởng của cây sau khi nghiên cứu kỹ
lưỡng về sự có mặt của nó trong môi trường MS ( Nguyễn Đức Lượng, 2002)[11].
Các amino acid được bổ sung riêng lẻ thường hạn chế sự sinh trưởng của tế
bào trong khi hỗn hợp của chúng lại có hiệu quả hơn. Bổ sung vào môi trường
adenine sulphate có thể kích thích sinh trưởng của tế bào hoặc làm tăng khả năng
tạo chồi ( Trần Văn Minh, 1999)[24].
*Các chất bổ sung
Nước dừa (Ngô Đăng Vịnh và cs, 2003)[7] : Công bố đầu tiên về sử dụng
nước dừa trong nuôi cấy mô thuộc về Van Overbeek và cộng sự. Sau đó, tác dụng
tích cực của nước dừa trong môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã được nhiều
tác giả ghi nhận. Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất
khoáng và chất kích thích sinh trưởng. Nước dừa đã được sử dụng để kích thích
phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loài cây. Nước dừa thường được lấy từ quả
của các giống và cây chọn lọc để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản. Nước dừa thường
được sử dụng ở nồng độ từ 5 đến 20 %.
Dịch chiết nấm men ( Trần Văn Minh, 1999)[24] : Với dịch nấm men, năm
1934 White lần đầu tiên nuôi thành công rễ cà chua trong ống nghiệm kéo dài vô
thời hạn. Thành phần hóa học của dịch nấm men ít được chú ý phân tích. Chủ yếu
chứa: đường, nucleic acid, amino acid, vitamin, auxin, muối khoáng. Tác dụng với
rễ rất tốt nhưng với callus thì không rõ ràng.
Agar : Đối với nuôi cấy tĩnh, nếu sử dụng môi trường lỏng, mô có thể bị
chìm và sẽ chết vì thiếu ôxy. Để tránh tình trạng này, môi trường nuôi cấy được làm
đặc lại bằng agar; một loại tinh bột được chế từ rong biển và mô được cấy trên bề
mặt của môi trường. Agar thường được sử dụng ở nồng độ 0,6 đến 1%.

pH môi trường : Với mỗi loại cây trồng yêu cầu một loại môi trường khác
nhau nhưng pH của môi trường là 5,6-6,0 (Đỗ Năng Vịnh, 2005)[5].
*Các chất kích thích sinh trưởng
- Auxin ( Dương Công Kiên, 2002)[3] :
Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng thường
xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần
khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền
phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được phối hợp sử


9
dụng với các cytokinin. Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi
cấy phụ thuộc vào:
- Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu
- Hàm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy
- Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy
- Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh
- Đặc tính của auxin: Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào.
Auxin có khả năng khởi đầu sự phân chia tế bào. Đặc điểm chung của các
auxin là tính chất phân chia tế bào. Các hormone thuộc nhóm này có các hoạt tính
như: tăng trưởng chiều dài thân, long (gióng), tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế
ngọn, tạo rễ và phân hóa mạch dẫn. Nói chung các auxin được hòa tan hoặc trong
ethanol hoặc trong NaOH loãng.
-Cytokinin ( Dương Công Kiên, 2002)[3] :
Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormone liên quan chủ
yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi
cấy mô. Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là 6-benzylaminopurine
(BAP) hoặc kinetin, và zeatin. Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn BA và
kinetin là các cytokinin nhân tạo. Nói chung, chúng được hòa tan trong NaOH hoặc
HCl loãng.

Cytokinin liên quan tới sự phân chia tế bào, phân hóa chồi v.v… Trong môi
trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô
sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ.
- Gibberellin :
Gibberellin được phát hiện vào những năm 1930. Lịch sử phát hiện nhóm
hormone này bắt đầu từ 1895 khi người Nhật nói về bệnh lúa von. Năm 1926, xác
định được bệnh đó là do loài nấm Gibberella fujikuroi gây ra. Đến những năm 30,
mới phân lập và tinh chế được hoạt chất, được gọi là gibberellin. Mãi sau chiến tranh
thế giới thứ II năm 1950, người Anh và người Mỹ mới biết đến công trình này của
người Nhật. Tới nay, người ta đã phát hiện được trên 60 loại thuộc nhóm gibberellic
acid. Loại gibberellic acid thông dụng nhất trong nuôi cấy mô thực vật là GA3.
- Ethylene ( Dương Công Kiên, 2002)[3] :
Ethylene là chất kích thích sinh trưởng ở dạng khí. Ethylene có rất nhiều tác


10
dụng với hoạt động sinh lý và trao đổi chất ở thực vật. Các chức năng cơ bản của
ethylene: Gây già hoá lá, kích thích sự rụng lá và quả, làm chín quả,
2.1.5. Các công đoạn của nuôi cấy mô tế bào (Dương Công Kiên, 2003)
[
4
]

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm 5 giai đoạn sau:
- Giai đoạn 1: Giai đoạn chuẩn bị
Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giống in vitro.
Mục đích của giai đoạn này là phải tạo được nguyên liệu thực vật vô trùng để đưa
vào nuôi cấy.
Mẫu đưa từ bên ngoài vào phải đảm bảo các yêu cầu sau: Tỷ lệ nhiễm thấp,
tỷ lệ sống cao, tốc độ sinh trưởng nhanh.

Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy mẫu, hàm lượng và thời
gian xử lý diệt khuẩn. Vật liệu thường được chọn để đưa vào nuôi cấy là: Đỉnh sinh
trưởng, chồi nách, phát hoa, đoạn thân, mảnh lá, rễ.
- Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy
Mục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng sự phát triển của
mô nuôi cấy. Quá trình được điều khiển chủ yếu bằng các chất điều hòa sinh trưởng
(tỷ lệ Auxin/Cytokinin) đưa vào môi trường nuôi cấy.
Tuy nhiên cũng phải quan tâm đến tuổi của mẫu.
- Giai đoạn 3: Giai đoạn nhân nhanh chồi
Mục đích của giai đoạn này là tạo hệ số cao nhất. Chính vì thế giai đoạn này
được coi là giai đoạn then chốt của quá trình nuôi cấy.
Để tăng hệ số người ta thường đưa vào môi trường nuôi cấy các chất điều
hòa sinh trưởng, nước dừa, dịch chiết nấm men,
- Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh
Khi đạt được kích thước nhất định các chồi được chuyển sang môi trường ra
rễ. Thường sau 2-3 tuần, các chồi riêng lẻ này sẽ ra rễ và trở thành cây hoàn chỉnh.
ở giai đoạn này người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất kích
thích sinh trưởng thuộc nhóm Auxin, là nhóm hoocmon thực vật quan trọng có chức
năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. Trong nhóm này các chất IAA, IBA, NAA, 2,4-D
được nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất để tạo rễ cho chồi.
- Giai đoạn 5: Giai đoạn đưa cây ra đất
Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình và nó quyết định khả năng ứng


11
dụng của quá trình nhân giống in vitro trong thực tiễn sản xuất. Đây là giai đoạn
chuyển cây từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng hoàn toàn. Do đó
phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh thích hợp để cây có thể đạt tỷ lệ sống cao
trong vườn ươm cũng như trong sản xuất (Ngô Xuân Bình và cs, 2003)[10].
2.2. Lan Hồ Điệp hoa tím đậm (P.Tailen Red Angle)

2.2.1. Lịch sử phát hiện lan Hồ Điệp
Lan Hồ Điệp có tên khoa học là Phalaenopsis sp, là loại lan có hoa lớn, đẹp,
bền. Lan Hồ Điệp có màu sắc phong phú, không thua kém giống lan nào khác từ
trắng, hồng, đỏ, vàng, tím đến các loại lan Hồ Điệp có sọc nằm ngang hoặc thẳng
đứng hoặc có đốm to hay nhỏ. Giống Phalaenopsis có khoảng 70 loài, trong đó có
44 chủng loại, mọc từ dãy Hymalaya đến châu Á có hơn 20 loài lan ưa nóng có ở
các nước Đông Nam Á như bán đảo Mã Lai, Indonesia, Philippine, đông Ấn Độ.
Lan Hồ Điệp được khám phá vào năm 750, đầu tiên được ông Rumphius xác
định dưới tên là Angraecum album. Đến năm 1753, Linne đổi lại là Epidenndrum
amabilis vào năm 1825, Blume một nhà thực vật Hà Lan định danh một lần nữa là
Phalaenopsis amabilis Bl và tên đó được dùng cho đến ngày nay.
Lan Hồ Điệp sống ở độ cao 200- 400 m nên vừa chịu khí hậu nóng ẩm vừa
chịu khí hậu mát, nhiệt độ trung bình từ 20
0
C - 30
0
C, trong đó khí hậu lý tưởng cho
việc nuôi trồng loại lan này là 22
0
C - 27
0
C.
Việt Nam có khoảng 5- 6 giống nguyên chủng, gồm Phalaenopsisi gibbosa
Sweet, Phalaenopsis manniiRchob.f, Phalaenopsis braceana(Hook.f) christenson,
phalaenopsis fuscataRchob.f, Phalaenopsis lobbii (Rchob.f.). Hầu hết có hoa nhỏ
nhưng màu sắc sặc sỡ, hương thơm độc đáo.
2.2.2. Đặc điểm hình thái của lan Hồ Điệp (Nguyễn Quang Thạch, 2003)
[
12
]


* Rễ
Hệ rễ của lan Hồ Điệp không phân chia thành rễ chính, rễ phụ, rễ nhánh,
lông hút rõ ràng. Hệ rễ của lan Hồ Điệp thường có dạng hình tròn, to, mập, có
nhánh hoặc không phân nhánh. Rễ thường có màu trắng, đầu rễ có màu xanh, màu
vàng trắng hoặc màu đỏ tối. Rễ của lan Hồ Điệp thường mọc tràn ra ngoài chậu,
buông lơ lửng ra không khí, có lợi cho việc hút O
2
và nước. Có những nghiên cứu
cho thấy rễ lan Hồ Điệp cũng như phong lan có khả năng quang hợp.
Rễ của lan Hồ Điệp cũng như một số loài lan khác có nấm cộng sinh. Do hạt


12
của hoa lan nói chung đều không có nội nhũ, không được cung cấp đủ dinh dưỡng
khi nảy mầm, trong điều kiện nảy mầm tự nhiên, cần dựa vào các nấm cộng sinh để
hút chất dinh dưỡng. Trong quá trình sinh trưởng của cây, các loài nấm này sống
cộng sinh tại rễ của cây lan để hỗ trợ lẫn nhau, vì thế rễ của cây lan còn được gọi là
rễ nấm. Nên việc tưới và bón phân cho cây lan Hồ Điệp cần cẩn thận chính là vì
trên rễ cây có nấm cộng sinh.
* Thân
Lan Hồ Điệp thuộc loại lan đơn thân, tức là thân của chúng rất ngắn không
hề có giả hành, cũng không có thời kỳ ngủ nghỉ rõ rệt. Lan đơn thân sinh trưởng rất
chậm chạp, thân chính của nó trong môi trường thuận lợi hàng năm lại mọc ra các lá
mới, chúng mọc theo hướng cao hơn theo phương thẳng đứng còn cành hoa thì mọc
ở rìa thân hoặc nảy ra từ nách lá, lá mọc xếp thành hai hàng, xen kẽ nhau. Theo sự
sinh trưởng của cây, các lá già ở dưới gốc dần dần già héo và rụng đi, đến khi có
chồi nách mọc ra, nhưng thường không mọc dài ra được. Vì cây lan thường rất khó
ra chồi nhánh nên không dùng phương pháp tách cây để nhân giống. Thân của lan
Hồ Điệp, ngoài tác dụng giữ cho cây thẳng đứng, còn có chức năng tích trữ chất

dinh dưỡng và nước cho cây.
* Lá
Lá của lan Hồ Điệp to dày, đầy dặn, lá mọc đối xứng, ôm lấy thân cây. Số lá
trên thân cây thường không nhiều, thông thường 1 cây lan trưởng thành có từ 4 lá
trở lên. Trong nách lá có 2 chồi phụ, chồi phụ trên to hơn là chồi sơ cấp, bên dưới là
chồi dinh dưỡng sơ cấp. Các chồi sơ cấp này sinh trưởng đến một mức độ nào đó thì
bắt đầu đi vào giai đoạn ngủ nghỉ. Màu sắc của lá gồm 3 loại: lá màu xanh, mặt trên
lá và mặt dưới lá màu đỏ, mặt trên lá đốm và mặt dưới lá màu đỏ. Căn cứ vào màu
sắc lá có thể phân biệt được màu sắc hoa của chính nó, lá màu xanh thường ra hoa
màu trắng hoặc hoa nhạt màu, còn các lá màu khác thường cho hoa màu đỏ.
Lan Hồ Điệp để thích nghi với điều kiện sinh thái nguyên sinh, thông thường
bề mặt trên của lá không có khí khổng, chỉ có mặt dưới của lá mới có khí khổng.
Lan Hồ Điệp là loại thực vật CAM, giống như các thực vật CAM khác nên khí
khổng mở ra vào ban đêm để thu nhận CO
2
để tạo ra chất dự trữ trong cơ thể, vào
ban ngày CO
2
được sử dụng cho quá trình quang hợp. Ưu điểm của loại thực vật
này là khí khổng không mở vào ban ngày nên cây không bị mất nước do quá trình


13
thoát hơi nước. Điều kiện này đối với cây không được cung cấp nước thường xuyên
là rất có lợi. Khi cây có đủ nước thì khí khổng cũng mở ra vào ban ngày để hút khí
CO
2
tiến hành quang hợp bình thường. Nếu gặp phải điều kiện khô hạn nghiêm
trọng thì khí khổng sẽ đóng lại, quá trình quang hợp diễn ra chỉ vừa đủ cho lượng
CO

2
tạo ra trong quá trình hô hấp. Đây chính là nguyên nhân khiến cho cây lan Hồ
Điệp mặc dù không có giả hành nhưng lại có khả năng chịu hạn tốt.
* Hoa
Cành hoa của lan Hồ Điệp mọc ra từ nách lá, thông thường đếm theo thứ tự
từ trên xuống thì cành hoa bắt đầu mọc ra từ lá thứ 3 hoặc thứ 4. Các cành hoa có
thể phân nhánh hoặc không phân nhánh. Hoa lan to thường ít phân nhánh còn lan
hoa nhỏ phân nhánh rất rõ thậm chí một số giống hoa lan nhỏ có thể nở đến 200
bông hoa. Cành hoa khi chưa phân hóa các đốt hoa thường ở dạng tiền chồi nách
hoặc tiền chồi hoa, ở nhiệt độ dưới 15
0
C và bị bấm ngọn có nảy thành chồi hoa,
nhưng nếu nhiệt độ cao quá 28
0
C thì chỉ có thể nảy thành chồi nách.
Đa số các giống hoa đơn cây chỉ ra một cành hoa, còn một số giống khác hoặc
trong điều kiện tốt cho chồi hoa phân hóa có thể mọc ra 2 hoặc 3 cành hoa. Nói chung,
hoa lan Hồ Điệp đơn cây nếu phân hóa số cành hoa càng nhiều hoặc cành nhánh càng
nhiều thì hoa nhỏ do bị hạn chế dinh dưỡng. Để trồng được lan có bông hoa to đẹp, cần
phải khống chế số bông trên một cành, hoặc cắt bớt đi một số cành nhánh.
* Quả và hạt
Hoa lan Hồ Điệp chỉ tạo quả qua thụ phấn nhân tạo hoặc thụ phấn nhờ côn
trùng. Vỏ quả có hình que, phát triển chậm thường qua 4 tháng mới chín và tách vỏ.
Số lượng hạt trong một quả khác nhau do sự khác nhau về bố mẹ đem thụ phấn.
Những hạt của chúng thường rất nhỏ, có dạng bột, không có phôi nhũ, trong điều
kiện tự nhiên rất khó tự nảy mầm thành cây con, thường phải gieo hạt trong môi
trường vô trùng thích hợp mới có thể thu được cây con.
2.3. Yêu cầu về hệ sinh thái
Là loại lan phân bổ chủ yếu ở vùng nhiệt đới, Hồ Điệp thích nghi với điều
kiện nóng ẩm.

* Nhiệt độ
Lan Hồ Điệp thích nghi nhiệt độ dao động từ 27
0
C đến 29
0
C ( Lopez và
Runkle, 2005)[35]. Tuy nhiên, trong điều kiện khó khăn lan Hồ Điệp có thể chịu


14
được nhiệt độ từ 32
0
C đến 35
0
C ( Lopez và Runkle, 2005)[35]. Để bắt đầu phát
triển, lan Hồ Điệp phải có một thời kỳ nhiệt độ vừa phải dưới 26
0
C trong 3-5 tuần
(Texas A&M Cục trồng trọt, 2007)[36]. Sau khi cụm hoa phát triển cho đến nở nụ
đầu tiên phụ thuộc vào nhiệt độ trung bình hàng ngày, từ 14
0
C đến 26
0
C ( Lopez và
Runkle, 2005)[35].
Vì vậy, nếu nhiệt độ thấp được tăng lên đến 26
0
C, các hoa bắt đầu nở sớm
hơn. Tuy nhiên, nếu nhiệt độ quá cao sẽ ức chế sự ra hoa rõ ràng sự phát triển và nở
hoa của lan Hồ Điệp phụ thuộc nhiều vào khoảng nhiệt độ nhất định nhưng nó cũng

phụ thuộc vào cường độ ánh sáng.
* Ánh sáng
Cường độ ánh sáng vừa phải và thoáng mát là lý tưởng cho lan Hồ Điệp phát
triển. Tuy nhiên, nếu để trong bóng tối dài, lan Hồ Điệp sẽ bắt đầu mất màu lá. Để có
hoa lan Hồ Điệp đẹp, sặc sỡ, khi trồng thương mại giai đoạn đầu có thể để trong bóng
tối sau đó chuyển chúng ra ánh sáng.
Nói chung, lan Hồ Điệp nhạy cảm với cường độ ánh sáng cao. Vì vậy, trong
quá trình sản xuất không nên để lan tiếp xúc với cường độ ánh sáng và nhiệt độ cao.
Bóng mát là điều kiện cần thiết nên trồng lan Hồ Điệp trong nhà có mái che
( TAMU Cục tròng trọt, 2007)[36].
* Ẩm độ
Ẩm độ rất cần thiết trong quá trình phát triển của lan Hồ. Lan Hồ Điệp phát
triển tốt trong khoảng ẩm độ 50-85% ( TAMU Cục tròng trọt, 2007)[36]
* Gió
Đối với Hồ Điệp, sự thông gió tối cần thiết. Độ thông gió càng nhiều cây
càng ít bệnh. Tốc độ gió khoảng 10- 15 km/ giờ là tốt nhất (Jabu Reza, 2004)[29].
* Dinh dưỡng
Hồ Điệp cần được cung cấp dinh dưỡng quanh năm vì bản thân cây Hồ Điệp
không dự trữ được chất dinh dưỡng.
Lan Hồ Điệp vừa chịu được khí hậu nóng ẩm lại vừa chịu được khí hậu mát
nên Việt Nam được xem là địa điểm lý tưởng để nuôi trồng Hồ Điệp. Khi gặp điều
kiện thuận lợi và chăm sóc tốt cây sẽ có hoa quanh năm (Jabu Reza, 2004)[29].
2.3.1. Các phương pháp nhân giống
*Phương pháp nhân giống truyền thống


15
Nhân giống bằng phương pháp tách bụi
Thường được sử dụng cho các giống lan đa thân Cattleya, Bendrobium,
Cymbidium, và những giống tương tự : ở mỗi gốc giả hành có ít nhất một chồi

ngủ, mỗi gốc giả hành đó là một đơn vị để trồng.
Ưu điểm: dễ làm, nhanh, cây giữ được các dặc tính quý của cây mẹ.
Nhược điểm: hệ số nhân không cao, cây có thể không ra hoa do làm không
đúng kỹ thuật.
Nhân giống bằng phương pháp giâm cành
Là các chồi “ mắt ngủ” có thể sản xuất ra một hoặc nhiều cây trong điều kiện
thích hợp.
Ưu điểm: Hệ số nhân giống cao, cây con sẽ giữ lại được những đặc tính quý
giá của cây mẹ.
Nhược điểm: Rất tốn thời gian.
Nhân giống bằng phương pháp gieo hạt
Là phương pháp lấy hạt giống cho nảy mầm thành cây con, hạt giống được thu từ
quả đã chín thuần thục, trong điều kiện thích hợp nảy mầm hình thành cây.
Ưu điểm: cây mọc từ hạt có sức sống tốt, bộ rễ khỏe.
Nhược điểm: Trong thực tế phương pháp này thường khó thành công vì phần
lớn hạt thường chết do khó gặp nấm cộng sinh cần thiết để nảy mầm. Trong điều
kiện ẩm ướt như ở rừng già hay các vùng nhiệt đới hạt mới dễ nảy mầm.
*Phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô
Nhân giống in vitro là hình thức sử dụng chồi đỉnh, mắt ngủ ngồng hoa,
lát mỏng, nuôi dưỡng trong các điều kiện đặc biệt để hình thành một cơ thể
mới hoàn chỉnh.
Ưu điểm: hệ số nhân giống cao, đồng đều, sạch bệnh, chủ động trong việc
sản xuất cây con phục vụ cho công tác giống.
Nhược điểm: cây con có kích thước nhỏ, xảy ra đột biến biến dị làm xuất
hiện những cây không mong muốn, cần trang thiết bị đặc biệt.
2.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước
2.3.2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Hầu hết các cây Hồ điệp thương mại được tạo ra từ hạt và là dị hợp tử. Tuy
nhiên, khi nhân giống bằng hạt, cây con thu được sẽ không đồng nhất về mặt di



16
truyền, nhất là sự phân ly tính trạng màu sắc hoa. Đã có nhiều phương pháp vi
nhân giống lan hồ điệp như nuôi cấy cuống hoa với chồi nách, mô phân sinh, đỉnh
chồi của chồi cuống hoa, đốt cuống hoa, đoạn cắt lá và chóp rễ. Tuy nhiên các
phương pháp này chưa ứng dụng rộng rãi trong sản xuất thương mại vì chúng khác
nhau về tỷ lệ sống sót, sự hình thành thể giống protocorm (PLB) và khả năng tái
sinh cây con. Đối với các loài lan, đã nuôi cấy thành công trên quy mô công nghiệp
loài Phalaenopsis và Dendrobium thông qua hệ thống bioreactor(Young, 2000)[42],
( Chung, 2005)[28].
Năm 1949, ông Rotor là người đầu tiên nhân giống lan Hồ Điệp bằng cách
sử dụng cành phát hoa. Và được coi là phương pháp chính để nhân giống vô tính lan
hồ điệp. Phương pháp này vẫn tồn tại một tỷ lệ cao các chồi duy trì trạng thái ngủ
hoặc có thể phát triển thành cuống hoa hay chồi sinh dưỡng. Tanaka và cs
(1976)[38] đã sử dụng đỉnh rễ của cây lai Phalaenopsis tạo protocorm. Ông là người
đầu tiên nghiên cứu tập trung trên việc tối ưu hóa quy trình tạo chồi dinh dưỡng và
nuôi lá ở nhiều yếu tố như protocorm, ánh sáng, nhiệt độ. Tuy nhiên, hiệu suất vẫn
chưa cao đồng thời không ứng dụng được trên nhiều giống.
Các thí nghiệm của Tanaka và Sakanishi (1977)[38] cho thấy chồi ở các
phần phía trên có xu thế duy trì trạng thái ngủ bất chấp ảnh hưởng của nhiệt độ. Các
chồi nẩy mầm đặt ở 20
0
C hoặc 25
0
C sẽ tăng trưởng sinh sản (trừ một số chồi ở phần
gốc) và ở 28
0
C các chồi đều tăng trưởng sinh dưỡng. Chồi nuôi cấy đang ở trạng
thái ngủ sẽ được kích thích nẩy mầm nếu bổ sung BA vào môi trường.
Năm 1991, Sajise và Sagawa đã đưa ra báo cáo đầu tiên về sự hình thành mô

sẹo tạo phôi (embryogenic) và Tokuhara và Mii (2001)[41] đã thực hiện cảm ứng
thành công mô sẹo tạo phôi từ các mẫu cấy đỉnh chồi trên cuống hoa lan hồ điệp
trên môi trường NDM (New Dogashima Medium) và cấy chuyền thành công mô
sẹo sang dạng huyền phù trong môi trường NDM lỏng. Năm 2000, Young, Murthy
và Yoeup[42] đã thành công trong việc sử dụng bioreactor để nuôi cấy PLB từ các
đoạn cắt lá, sau 8 tuần nuôi cấy, họ đã thu được khoảng 18.000 PLB từ khoảng
1.000 PLB ban đầu trong 2 lít môi trường Hyponex. Các PLB này được chuyển
sang môi trường Hyponex rắn để tạo cây con.


17
Năm 2002, Park So Young và cs [37], khảo sát tối ưu hóa quá trình tạo
protocorm từ lá, đưa ra quá trình hoàn chỉnh và kiểm chứng trên nhiều giống lan Hồ
Điệp khác nhau.
Theo nhiều tác giả khi tái sinh thành cây con từ protocorm chỉ cần sử dụng các
môi trường khoáng có bổ sung nước dừa, khoai tây…mà không sử dụng bất kỳ chất
điều hòa tăng trưởng nào. Tanaka và Sakanishi (1985)[39] và Tanaka (1987)[40] đã sử
dụng môi trường Knudson C cải tiến, còn Haas-von Schmude (1983) [31], Haas-von
Schmude (1985) [32] sử dụng môi trường MS trong việc tái sinh cây con từ protocorm.
Griesbach (1983)[30] sử dụng môi trường Murashige và Skoog cho việc tái sinh cây
con từ protocorm trong khi Lin (1986) sử dụng môi trường Knudson C cải tiến có bổ
sung BA (1mg/l) để chuyển protocorm thành cây con.
Hiện đã có hơn 200 công trình quốc tế thực hiện trên lan Hồ Điệp ở rất nhiều
nội dung khác nhau từ sinh lý, sinh hóa, sinh học phân tử. Phần lớn các công trình
nghiên cứu có nguồn gốc từ Đài Loan, Hàn Quốc, Nhật Bản, vốn là những quốc gia
gắn liền với xuất xứ lan Hồ Điệp.
Những hướng nghiên cứu được quan tâm hơn trong thời gian gần đây là xây
dựng các qui trình chuyển gen, thiết kế các hệ thống nhân giống có qui mô lớn.
Các nghiên cứu về chuyển gen cho phép đưa các tính trạng đặc biệt vào lan
Hồ Điệp như khả năng tổng hợp sRNA kháng virus gây cháy lá, khả năng tổng hợp

chất cây trong mù tạt để kháng bệnh. Có thể trong tương lai, thế hệ lan Hồ Điệp mang
gen kháng acetylene có hoa lâu tàn sẽ được sản xuất và bán rộng rãi trên thị trường.
Tuy vậy, lan Hồ điệp cũng như các cây trong họ hoa lan thường khó chuyển
gen hơn các loại cây trồng khác do có đặc điểm: phát triển rất chậm, khó thao tác
trong nuôi cấy mô, chưa có quy trình tái sinh từ các dòng tế bào đã biệt hóa, ít nhạy
cảm với các loại kháng sinh chọn lọc, tiết ra môi trường một lượng lớn các hợp chất
phenol gây độc cho tế bào, cấu trúc đa tế bào của vùng mô phân sinh làm cây
chuyển gen dễ bị khảm.
2.3.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Bước đầu tìm hiểu về sự nuôi cấy in vitro lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp), năm
1996, Võ Thị Bạch Mai và Lê Văn Hướng [20] cho rằng dưới tác động của auxin và
cytokinin được bổ sung riêng lẻ hay kết hợp vào môi trường MS cải tiến. Khi có bổ sung