MỤC LỤC

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3

1.1. Dịch tễ học của các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh nhiễm
khuẩn huyết ở người 3

1.1.1. Dịch tễ học của vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh nhiễm
khuẩn huyết trên thế giới 3

1.1.2. Dịch tễ học của vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở Việt
Nam 7

1.2. Đặc điểm của một số loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở người. 8

1.2.1. Vi khuẩn Escherichia coli 8

1.2.2. Klebsiella pneumoniae 9

1.2.3. Salmonella sp 10

1.2.4. Proteus mirabilis 12

1.2.5. Nhóm các vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaece 12

1.3.Phương pháp chẩn đoán xác định vi khuẩn gây bệnh 13

1.3.1. Kỹ thuật xét nghiệm truyền thống phát hiện vi khuẩn 13

1.3.2. Phương pháp sử dụng sinh học phân tử phát hiện vi khuẩn 14

1.3.2.1.Kỹ thuật PCR 14

1.3.2.2. Kỹ thuật PCR đa mồi (PCR đa mồi) 16

1.3.3. Tách chiết ADN sử dụng công nghệ loại bỏ ADN người 17

1.3.3.1. Sự cần thiết của công nghệ loại bỏ ADN người trong chẩn đoán tác nhân
gây bệnh nhiễm khuẩn huyết 17

1.3.3.2. Cơ sở lý thuyết của công nghệ loại bỏ ADN người ”làm giàu” ADN vi
khuẩn …………………………………………………………………………….18

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1. Đối tượng nghiên cứu 20

2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 20

2.3. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 21

2.3.1. Các hoá chất, sinh phẩm 21

2.3.2. Các máy và thiết bị chính 21

2.4.1.Sơ đồ nghiên cứu 22

2.4.2. Thiết kế các cặp mồi sử dụng trong PCR và PCR đa mồi 23

2.4.3. Quy trình tách chiết ADN từ các chủng vi khuẩn nghiên cứu 26


2.4.4. Tách chiết ADN từ các mẫu bệnh phẩm 27

2.4.5. Phương pháp xác định nồng độ và đo độ tinh sạch bằng máy quang phổ 28

2.4.6. Kỹ thuật PCR và PCR đa mồi 28

2.4.8. Giải trình tự gen 30

2.4.9. Đánh giá độ nhạy, đặc hiệu phản ứng PCR đa mồi 31

2.4.10. Phương pháp xử lý số liệu bằng toán thống kê 33

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI PHÁT
HIỆN VI KHUẨN 34

3.1.1. Kết quả tách chiết ADN trên chủng vi sinh 34

3.1.2. Kết quả PCR đơn mồi từ các mầm bệnh đơn lẻ 34

3.1.3.Kết quả giải trình tự gen các mầm bệnh 35

3.1.3.1. Kết quả xác định trình tự đoạn gen 16S ribosomal RNA của họ
Enterobacteriaceae 36

3.1.3.2. Kết quả xác định trình tự đoạn gen flagellin của vi khuẩn Salmonella 37

3.1.3.3. Kết quả xác định trình tự gen aldehyde dehydrogenase của vi khuẩn K.
pneumoniae 38


3.1.3.4. Kết quả xác định trình tự gen UreR của vi khuẩn Proteus mirabilis 39

3.1.3.5. Kết quả xác định trình tự gen S-uidA của vi khuẩn E. coli 40

3.1.4. Kết quả PCR đa mồi phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae 42

3.1.5.Kết quả PCR đa mồi phát hiện đồng thời các tác nhân gây bệnh 43

3.1.6. Đánh giá hiệu quả và tính ứng dụng của phương pháp trên panel chuẩn
dương ……………………………………………………………………………….44

3.1.6.1. Độ nhạy, độ đặc hiệu trên các mẫu chứng âm và chuẩn dương 44

3.2. THIẾT LẬP CÔNG NGHỆ LOẠI BỎ ADN NGƯỜI KẾT HỢP ‘’LÀM
GIÀU’’ ADN VI KHUẨN 47

3.2.1. So sánh hiệu suất tách và chất lượng ADN cũng như khả năng loại bỏ ADN
người bằng các dung môi khác nhau 47

3.2.2. Kết quả so sánh nồng độ ADN tách chiết bằng phương pháp thông thường
so với phương pháp phá bạch cầu làm giàu ADN vi khuẩn 48

3.2.3. Kết quả realtime PCR định lượng nồng độ ADN so sánh các phương pháp
tách chiết.……………………………………………………………………………… 50

3.2.3.1. So sánh tính chất loại ADN bằng dung môi MCLB1 với phương pháp
tách ADN không qua xử lý. 50

3.2.3.2. So sánh tính chất loại ADN bằng dung môi MCLB1 với phương pháp sử

dụng kit thương mại MolYsis 50

3.2.3.3.Kiểm chứng hàm lượng ADN vi khuẩn thu nhận sau khi xử lý bằng dung
môi phá bạch cầu 52

3.3. KẾT QUẢ SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN VI
KHUẨN GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT 52

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

KIẾN NGHỊ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC


DANH MỤC HÌNH

Hình.1 Các giai đoạn tổng hợp của phản ứng PCR 15

Hình 2. Mô hình thí nghiệm thực hiện quá trình tối ưu hóa PCR đa mồi 22

Hình 3. Mô hình nghiên cứu thiết lập phương pháp loại bỏ ADN người 23

Hình.4. Hình ảnh mô phỏng cho quá trình thiết kế mồi phát hiện vi khuẩn gây bệnh24

Hình 5. Hình ảnh mô phỏng kết quả điện di các sản phẩm PCR phát hiện vi khuẩn
gây bệnh 26


Hình.6.Kết quả PCR các mồi đơn trên ADN mẫu được tách chiết từ mẫu chuẩn
dương trong điều kiện PCR chuẩn 35

Hình.7. Hình ảnh phổ sắc ký đọc theo trình tự đoạn gen đặc trưng cho họ
Enterobacteriaceae 36

Hình 8. Kết quả giải trình tự đoạn gen đặc trưng cho vi khuẩn Salmonella sp 37

Hình 9. Kết quả giải trình tự đoạn gen đặc trưng cho vi khuẩn K. pneumoniae 38

Hình 10. Kết quả giải trình tự đoạn gen đặc trưng cho vi khuẩn Proteus mirabilis 39

Hình 11. Kết quả giải trình tự đoạn gen S-uidA đặc trưng cho vi khuẩn E. coli 41

Hình 12. Kết quả PCR đa mồi phát hiện họ vi khuẩn Enterobacteriaceae và mồi nội
chuẩn 42

Hình 13. Kết quả PCR đa mồi phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ
Enterobacteriaceae 43

Hình 14. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của bộ mồi trên ADN tác nhân gây bệnh
khác 45
Hình 15. Kết quả xác định ngưỡng phát hiện của PCR đa mồi trên các mẫu chuẩn
dương…………………………………………………………………………….46
Hình16. Kết quả realtime PCR mồi betaglobin định lượng nồng độ ADN 50

Hình 17: Hiệu quả loại ADN người (thông qua tồn dư beta globin) giữa các Kit
(SHPT108@dehuman ADN), Kit MolYsis 51

Hình.18. Kết quả PCR mồi đơn E. coli-SuidA trên ADN được xử lý bằng dung môi

SHPT108@dehumanDNA 52

Hình. 19. Sơ đồ so sánh kết quả PCR đa mồi và cấy máu 54



DANH MỤC BẢNG
Bảng 1
.
Sự phân bố các mầm bệnh gây NKH từ năm 1990 đến 2010 của 17 nghiên
cứu khác nhau ở khu vực gần Việt Nam (Nam và Đông Nam Châu
Á) 4

Bảng 2. Danh mục các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 21

Bảng 3. Danh mục các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 21

Bảng.4. Trình tự mồi trong phản ứng PCR đa mồi phát hiện tác nhân vi khuẩn gây
bệnh 25

Bảng 5. Công thức tính độ nhạy, độ đặc hiệu phương pháp 32

Bảng 6. Kết quả đo OD các mẫu ADN sử dụng trong nghiên cứu 34

Bảng 7. Kết quả độ nhạy, độ đặc hiệu bộ mồi Ent/beta và EPKS thiết kế trên các
loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriacae và ADN khác 44

Bảng8: Hàm lượng và chất lượng ADN thu nhận từ 1ml máu ngoại vi chứa vi khuẩn
E.coli 48


Bảng 9. Kết quả đo OD các ADN tách chiết từ mẫu máu có vi khuẩn sử dụng các
phương pháp tách chiết 49

Bảng 10. So sánh kết quả nuôi cấy và PCR đa mồi trên mẫu nhiễm khuẩn
huyết…………………………………………………………………………………
53

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid deoxyribonucleic
aldA Aldehyde dehydrogenase A
Bộ mồi EPKS
Gồm các gen đích phát hiện vi khuẩn E. coli, Proteus
mirabilis, K. pneumoniae, Salmonella. sp
bp base pair
dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate
DTCS Dye Terminator Cycle Sequencing
EBV Epstain BarrEpptabar virus
HBV Hepatis B virus
HSV Herpes simplex Virus
kDa Kilodalton
M100 Ladder marker 100
M50 Ladder Marker 50 bp
MCLB1 Manmanlian cellular lysis Buffer 1
NKH Nhiễm khuẩn huyết
OD Optical Density
PCR Polymerase Chain Reaction
Pol polymerase
SD Standard Deviation
Se Độ nhạy

Sp Độ đặc hiệu
X

Giá trị trung bình

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Nhiễm trùng là một bệnh lý thường gặp, trong đó nhiễm trùng đường máu
(nhiễm khuẩn huyết) gây biến chứng và nguy cơ tử vong cao nhất. Có nhiều căn
nguyên khác nhau gây ra bệnh lý nhiễm trùng như vi khuẩn, kí sinh trùng và nấm.
Tuy nhiên, các nghiên cứu ở Việt Nam cũng như trên thế giới chỉ ra rằng tác nhân
gây bệnh chủ yếu là vi khuẩn trong đó nhiều nhất là các loài thuộc họ
Enterobacteriaceae như Escherichia coli, Klebsiella. sp và Staphylococcus aureus.
Việc xác định căn nguyên gây nhiễm khuẩn là cần thiết cho việc chỉ định
đúng kháng sinh trong điều trị. Cho đến nay cấy khuẩn vẫn là phương pháp được
áp dụng thường quy trong chẩn đoán các mầm bệnh gây nhiễm trùng. Tuy nhiên
phương pháp kinh điển này đang thể hiện một số điểm yếu trong chẩn đoán, đó là i)
thời gian cấy khuẩn dài (từ 18-72h). Trong khoảng thời gian này tình trạng của bệnh
nhân có thể chuyển sang một pha mới nguy hiểm hơn, ii) các quy trình cấy khuẩn
không được tối ưu cho nuôi cấy mọi vi khuẩn, đặc biệt là các vi khuẩn yếm khí
cộng thêm việc xử lý kháng sinh phổ rộng trước đó cũng gây áp lực áp chế sự hình
thành khuẩn lạc sau nuôi cấy, iii) Chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết đòi hỏi một lượng
máu lớn sẽ là thách thức đối với bệnh nhân nhi sơ sinh hoặc người cao tuổi. Do đó,
việc triển khai những kỹ thuật chẩn đoán mới bổ trợ cho phương pháp cấy khuẩn
kinh điển là điều cần làm.
Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction) không còn
là điều mới mẻ trong sinh học phân tử, tuy nhiên ứng dụng của nó trong chẩn đoán,
đặc biệt là chẩn đoán các mầm bệnh gây nhiễm trùng vẫn dừng ở mức tiềm năng là
vì: i)Mỗi một phản ứng PCR chỉ xác định được 01 loài vi sinh vật, trong khi đó nếu

số cặp mồi quá nhiều trong một phản ứng (PCR đa mồi) chúng có thể triệt tiêu lẫn
nhau làm giảm độ nhạy kỹ thuật của phản ứng. ii) Các chất ức chế vốn có trong
bệnh phẩm hoặc bản thân lượng dư thừa ADN người trong bệnh phẩm cũng là
những tác nhân kìm hãm phản ứng PCR; iii) Ngoài ra, do tính chất bảo tồn tiến hóa
giữa các loài, một tỷ lệ nhất định các vật chất di truyền của vi khuẩn sẽ được bảo
tồn và có trình tự gần giống một phần bộ gen của sinh vật bậc cao (trong đó có con
2

người) vì thế nếu đoạn mồi được thiết kế hướng vào các khu vực bảo tồn này, hiện
tượng bắt chéo của mồi vào ADN gen người sẽ diễn ra gây nên dương tính giả. Để
giảm thiểu các nguy cơ nói trên, trong nhiều trường hợp việc tách và loại bỏ ADN
người trước khi thực hiện phản ứng PCR là cần thiết.
Vì vậy trong khuôn khổ luận văn này tôi tiến hành tối ưu hóa các tham số
nhằm xây dựng một quy trình PCR đa mồi phát hiện một số vi khuẩn gây bệnh
thuộc họ Enterobacteriaceae. Quy trình không chỉ hướng tới thiết lập phản ứng
PCR đa mồi phát hiện đặc hiệu cho các vi sinh vật thuộc họ này mà còn cần thiết
lập một phương pháp loại bỏ ADN người kết hợp làm giàu ADN vi khuẩn ở mức độ
chấp nhận được. Do vậy để nâng cao chất lượng chẩn đoán các mầm bệnh vi sinh
gây bệnh, chúng tôi đề xuất đề tài “Xây dựng quy trình phát hiện một số vi khuẩn
thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở người bằng phương pháp PCR đa mồi”
với các mục tiêu như sau:
a) Xây dựng quy trình phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ
Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella sp,
Proteus mirabilis) gây bệnh ở người bằng phương pháp PCR đa mồi và thiết lập
công nghệ loại bỏ ADN người.
b) Bước đầu đánh giá giá trị của PCR đa mồi trong phát hiện một số vi
khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây nhiễm khuẩn huyết trong thực hành tại
Bệnh viện 108.
3


CHƯƠNG 1.
TỔNG QUAN
1.1. Dịch tễ học của các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh nhiễm
khuẩn huyết ở người
1.1.1. Dịch tễ học của vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh nhiễm
khuẩn huyết trên thế giới
Nhiễm khuẩn huyết (NKH) là một trong những bệnh lý được quan tâm bởi tỷ
lệ mắc bệnh, tử vong cao. Một trong những nguyên nhân gây tử vong cao đó là do
các vi khuẩn đa kháng kháng sinh. Triệu chứng lâm sàng của NKH không đặc hiệu
và không khẳng định, thường chỉ biểu hiện rõ trong giai đoạn trễ. Các marker sinh
học - đặc biệt là các cytokin có vai trò quan trọng, giúp phát hiện và đánh giá mức
độ nặng của tình trạng viêm, phân biệt tác nhân là vi khuẩn, góp phần giúp thầy
thuốc chẩn đoán và điều trị kịp thời NKH trong giai đoạn “giờ vàng”, rút ngắn thời
gian nằm viện và giảm tỉ lệ tử vong của bệnh nhân. NKH có xu hướng gia tăng và
do các nguyên nhân xác định. Trong đó, bệnh lý nhiễm trùng đường hô hấp luôn là
nguyên nhân phổ biến dẫn tới NKH hay sôc nhiễm khuẩn [30]. Nhìn chung, nhiễm
trùng đường hô hấp chiếm khoảng một nửa số ca NKH. Ngoài ra, còn có các
nguyên nhân khác như nhiễm khuẩn đường sinh dục, nhiễm khuẩn ổ bụng. Với các
nguyên nhân gây bệnh khác nhau nhưng việc sử dụng kháng sinh sớm là điều tiên
quyết trong điều trị khỏi bệnh cho bệnh nhân. Nghiên cứu của Houck PM ở những
bệnh nhân viêm phổi và bệnh nhân NKH chỉ ra rằng việc sử dụng kháng sinh chậm
trễ trong điều trị kháng sinh nguy cơ dẫn tới tử vong tăng lên đáng kể. Đặc biệt với
nhiễm khuẩn, nguy cơ tử vong tăng lên khoảng 10% trong mỗi giờ chậm trễ [21].
Song song với việc sử dụng kháng sinh sớm thì việc lựa chọn kháng sinh thích hợp
cũng rất quan trọng. Cùng với đó, việc điều trị kháng sinh hiện nay nếu chờ đợi dựa
vào kết quả cấy máu thì quá lâu nên nhiều khi các bác sỹ lâm sàng buộc phải điều
trị bệnh nhân theo kinh nghiệm tích lũy. Như vậy mặt tích cực là sử dụng kháng
sinh sớm nhưng lại trở nên gặp khó khăn trong việc lựa chọn sử dụng kháng sinh
thích hợp để điều trị. Do vậy, nhờ sự phát triển của nền sinh học phân tử hiện đại,
4


những kỹ thuật tiên tiến nhất để phát hiện vi khuẩn gây NKH được đề xuất đáp ứng
nhu cầu chẩn đoán nhanh tác nhân vi sinh gây bệnh.
Tỷ lệ NKH thay đổi theo từng quốc gia, theo mùa, theo từng cơ quan xâm nhập và
tùy từng đối tượng bệnh nhân. Vào những thập niên 1970 tại Mỹ hàng năm xảy ra
khoảng 164000 ca NKH/năm. Tuy nhiên 15 năm gần đây đã có 750000 ca
NKH/năm, số ca tử vong tăng từ 18500 ca lên 31000 ca NKH/năm chiếm khoảng
2% số bệnh nhân nhập viện và chiếm 75% các trường hợp nằm ở khoa Hồi sức tích
cực [40]; Một nghiên cứu tại Hàn Quốc thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Gram âm trên
tổng số ca NKH là 43%, trong khi đó chỉ có 20,4% là vi khuẩn Gram dương. Người
ta cũng ghi nhận nhiễm hơn một mầm bệnh là 3,6%; nhiễm nấm là 0,7% và vi
khuẩn kỵ khí là 0,6%. Tần suất bắt gặp các mầm bệnh ở các khu vực là khác nhau.
Khi phân tích trên từng khu vực người ta thấy Staphylococcus aureus và
Streptococcus pneumoniae là phổ biến nhất ở Châu Phi, trong khi đó Klebsiella gặp
tỷ lệ cao nhất ở Đông Nam Á, đồng thời tỷ lệ kháng thuốc gặp nhiều nhất ở
Klebsiella [41]. Một nghiên cứu đa trung tâm tại Hàn Quốc gần đây cho thấy trong
số 1192 bệnh nhân NKH là người lớn được điều trị tại 22 đơn vị hồi sức cấp cứu từ
2005 đến 2009 thì có 740 (62,1%) bệnh nhân bị shock nhiễm khuẩn. Trong đó có
422 (35,4%) bệnh nhân xác định được vi khuẩn trong máu, tỷ lệ tử vong là 28%
[32]. Về tỷ lệ phân bố các mầm bệnh phụ thuộc vào vùng địa lý, đặc điểm, điều kiện
kinh tế, xã hội. Trong nghiên cứu tại Hàn Quốc, một nước phát triển thấy tỷ lệ vi
khuẩn gram âm là 43%, trong khi đó chỉ có 20,4% là vi khuẩn gram dương. Người
ta cũng ghi nhận nhiễm hơn một mầm bệnh là 3,6%; nhiễm nấm là 0,7% và vi
khuẩn kỵ khí là 0,6%. Các vi khuẩn nhiễm nhiều nhất là Escherichia coli (22,1%),
tiếp theo là Klebsiella sp (12,6%) và Staphylococcus aureus (8,4%) [32]. Nghiên
cứu của Deen và cộng sự về sự phân bố các mầm bệnh gây NKH từ năm 1990 đến
2010 là báo cáo tổng hợp của 17 nghiên cứu khác nhau tại khu vực Nam và Đông
Nam Châu Á lại cho thấy tác nhân gây nhiễm khuẩn huyết thường gặp nhất là loài
Salmonella enteric serotype Typhi với 532/1798 tổng số ca dương tính (chiếm 30%)
ở người lớn và 432/1723 tổng số ca dương tính (chiếm 25%) ở trẻ em. Ngoài ra, các

5

mầm bệnh vi sinh khuẩn khác thường gặp ở người lớn như S. aureus, E. coli và
nhóm vi khuẩn Gram âm khác. Vi khuẩn thường gặp ở trẻ em như S. pneumoniae,
H. influenzae. Kết quả được thể hiện ở Bảng 1 dưới đây:
Bảng 2
.
Sự phân bố các mầm bệnh gây NKH từ năm 1990 đến 2010 của 17
nghiên cứu khác nhau ở khu vực gần Việt Nam (Nam và Đông Nam Châu Á)
[12]

Tính chung
(n; %)
Người lớn
(n; %)
Trẻ em
(n; %)
Enterobacteriaceae Gram âm 2132 (60,6) 1392 (77,4) 740 (42,9)
Salmonella enteric
S enterica serotype Typhi 964 (27,4) 532 (29,6) 432 (25,1)
Non-typhoidal Salmonella 170 (4,8) 148 (8,2) 22 (1,3)
Non-Salmonella Enterobacteriaceae
Escherichia coli 240 (6,8) 215 (12,0) 25 (1,5)
Klebsiella sp 156 (4,4) 137 (7,6) 19 (1,1)
Enterobacter sp 29 (0,8) 26 (1,4) 3 (0,2)
Proteus sp 10 (0,3) 8 (0,4) 2 (0,1)
Citrobacter sp 8 (0,2) 8 (0,4) 0 (0)
Shigella sp 3 (0,1) 1 (0,1) 2 (0,1)
Other Enterobacteriaceae 11 (0,3) 5 (0,3) 6 (0,3)
Các VK Gram âm khác,

Haemophilus influenzae 144 (4,1) 0 (0) 144 (8,4)
Acinetobacter sp 18 (0,5) 6 (0,3) 12 (0,7)
Burkholderia pseudomallei 15 (0,4) 13 (0,7) 2 (0,1)
Pseudomonas sp 209 (5,9) 183 (10,2) 26 (1,5)
Neisseria sp 7 (0,2) 1 (0,1) 6 (0,3)
Aeromonas hydrophilia 6 (0,2) 5 (0,3) 1 (0,1)
6


Tính chung
(n; %)
Người lớn
(n; %)
Trẻ em
(n; %)
Moraxella catarrhalis 24 (0,7) 0 (0) 24 (1,4)
Các Gram âm khác 7 (0,2) 1 (0,1) 6 (0,3)
Không xác định 111 (3,2) 103 (5,7) 8 (0,5)
Gram dương
626 (17,8) 305 (17,0) 321 (18,6)
Staphylococcus aureus 298 (8,5) 227 (12,6) 71 (4,1)
Streptococcus pneumoniae 235 (6,7) 15 (0,8) 220 (12,8)
Group A streptococcus (S
pyogens)
12 (0,3) 3 (0,2) 9 (0,5)
Group B streptococcus (S
agalactiae)
1 (<0·1) 1 (0,1) 0 (0)
Enterococcus spp (group D
streptococcus)

24 (0,7) 22 (1,2) 2 (0,1)
Other streptococci 27 (0,8) 10 (0,6) 17 (1,0)
Các Gram dương khác 17 (0,5) 16 (0,9) 1 (0,1)
Không xác định 12 (0,3) 11 (0,6) 1 (0,1)
Nấm
43 (1,2) 43 (2,4) 0 (0)
Cryptococcus spp 33 (0,9) 33 (1,8) 0 (0)
Candida spp 2 (0,1) 2 (0,1) 0 (0)
Histoplasma capsulatum 4 (0,1) 4 (0,2) 0 (0)
Penicillium marneffei 4 (0,1) 4 (0,2) 0 (0)
Mycobacteria
57 (1,6) 57 (3,2) 0 (0)
Mycobacterium
tuberculosis complex
27 (0,8) 27 (1,5) 0 (0)
Mycobacterium avium complex 24 (0,7) 24 (1,3) 0 (0)
Other mycobacteria 6 (0,2) 6 (0,3) 0 (0)
Nguyên nhân khác
663 (18,8) 1 (0,1) 662 (38,4)
7

Như vậy, các nghiên cứu trên cũng đã phản ánh rõ ràng về tần suất xuất hiện
các vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm cao hơn nhóm vi khuẩn Gram dương,
đặc biệt là họ vi khuẩn Enterobacteriaceae như Escherichia coli, Klebsiella spp,
Enterobacter spp, Proteus spp, Salmonella sp và Enterobacteriaceae khác là những
tác nhân hàng đầu gây bệnh lý NKH.
1.1.2. Dịch tễ học của vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở Việt
Nam
Tại Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu về các căn nguyên vi sinh vật gây
bệnh ở người trên các thể bệnh khác nhau như viêm tiết niệu, nhiễm trùng vết mổ,

NKH. Nhìn chung các vi khuẩn gây bệnh rất đa dạng, tuy nhiên các loài vi khuẩn
thường gặp gây bệnh được thống kê vẫn phổ biến nhất là các loài thuộc họ
Enterobacteriaceae. Tác giả Trần Thị Ngọc Anh năm 2007, tại Viện Nhi Đồng 2
phân lập được 2738 chủng vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng. Vi khuẩn thường
gặp nhất là: E. coli (14,6%), K. pneumoniae (11,7%), S. aureus (11,4%), P.
aeruginosa (5,1%), S. pneumoniae (3,7%), Enterococci (4%), Acinetobacter baumanii
(2,4%). Trong đó, hầu hết các chủng vi khuẩn phân lập được có tính kháng với
nhóm kháng sinh betalactam, kháng và nhạy với carbapenem, tỷ lệ tụ cầu vàng
kháng methiciline là 33,5% trong tổng số các chủng vi khuẩn phân lập được [1]
Do vậy, trong thực hành lâm sàng, việc xác định căn nguyên vi khuẩn gây bệnh
nhanh chóng và xác định tính kháng kháng sinh sẽ trở nên hữu ích và cần thiết cho
các bác sĩ trong việc điều chỉnh phác đồ điều trị cho bệnh nhân. Thống kê của
chương trình giám sát quốc gia về tính kháng thuốc của vi khuẩn năm 1996 thu
được 1082 chủng từ các đơn vị tham gia trên toàn quốc chỉ ra rằng tỷ lệ NKH chiếm
21,6% trong số các loại bệnh phẩm thu được [7]. Phạm Văn Ca nghiên cứu trong
thời gian 5 năm tại Bệnh viện Bạch Mai (1989-1993), tỷ lệ bệnh nhân cấy máu
dương tính là 11,8 % ; Phạm Hùng Vân và cộng sự trong kết quả nghiên cứu từ 16
bệnh viện trên toàn quốc thu được 1602 chủng từ nhiều nguồn bệnh phẩm khác
nhau trong đó có 188 bệnh phẩm máu chiếm tỷ lệ 11.7% [3]; Nghiên cứu của
8

Nguyễn Thanh Liêm và cs tại Bệnh viện Nhi đồng I từ năm 1999 đến 2004 nhóm vi
khuẩn gây bệnh Gram âm chiếm tới (61.3%), trong đó hàng đầu là Klebsiella spp
(44%), E. coli (19%) [4]. Một nghiên cứu về các căn nguyên gây NKH tại Bệnh
viện TƯQĐ 108 do tác giả Bùi Thanh Thuyết trên 8.134 mẫu máu từ năm 2010 đến
năm 2013 có 952 mẫu cấy máu dương tính (chiếm 11,7%). Trong đó, các vi khuẩn
thường gặp là E. coli (25,84%), K. pneumoniae (15,02%), P. aeruginosa (9,87%) và
hầu hết các vi khuẩn này là vi khuẩn đa kháng thuốc, chúng kháng lại với đa số các
kháng sinh thường dùng trong bệnh viện [6].
Như vậy, không chỉ ở trên thế giới mà cả ở Việt Nam, dịch tễ học các căn

nguyên chính gây nhiễm khuẩn huyết thường gặp nhất, mức độ gây hại lớn vẫn tập
trung vào nhóm vi khuẩn Gram âm, đặc biệt là các loài vi khuẩn thuộc họ
Enterobacteriaceae. Điều này cho thấy, trong thực hành lâm sàng tại Bệnh viện,
việc chẩn đoán xác định chính xác và nhanh chóng chúng là việc làm rất cần thiết.
1.2. Đặc điểm của một số loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở
người.
Enterobacteriaceae là các chi vi khuẩn đường ruột Gram âm có hình que,
chiều dài điển hình từ 1 μm đến 5 μm kị khí không nghiêm ngặt, lên men đường
thành acid lactic. Hầu hết chúng khử nitrat thành nitrit, ngoại trừ một số vi khuẩn
như Photorhabdus. Trong lâm sàng vi khuẩn Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae, Proteus mirabilis và Salmonella sp chiếm trên 90% số các vi khuẩn
thuộc họ Enterobacteriaceae đã được nhận diện.
1.2.1. Vi khuẩn Escherichia coli
Vi khuẩn E. coli được Theodor Escherich tìm ra năm 1885 và mang tên
chính thức là Escherichia coli năm 1919. Vi khuẩn E. coli thường sống trong ruột.
Đây là trực khuẩn Gram âm điển hình với kích thước trung bình từ 2-3 µm x 0.5
µm, có lông quanh thân nên di động được, không có bào tử, có một tỷ lệ nhỏ các
chủng có vỏ. Vừa ưa khí, vừa kỵ khí, dễ nuôi, phát triển dễ dàng trên các môi
trường thông thường mọc được ở nhiệt độ từ 5 đến 40
0
C, thuận lợi ở 37
0
C, pH thích
9

hợp 7,0 đến 7,2, nhưng vẫn phát triển ở pH 5,5 đến 8,0. Trên môi trường thạch
thường sau 8-10 giờ nuôi cấy đã có thể nhìn thấy khuẩn lạc riêng rẽ qua kính phóng
đại. Khuẩn lạc to dần, tròn, lồi, hơi phồng, đường kính 1,5mm, mặt nhẵn, bờ đều
[37]. Vi khuẩn E. coli là một trong những thành viên chính của hệ vi khuẩn bình
thường ở ruột. Tuy nhiên, trong những điều kiện thuận lợ, chính E. coli lại là căn

nguyên gây nhiều bệnh nguy hiểm như các hội chứng viêm đường ruột và các bệnh
cấp tính nguy hiểm như viêm màng não, viêm van tim, NKH. Ở Việt Nam, NKH do
E. coli luôn là vấn đề quan trọng và khả năng vi khuẩn kháng lại nhiều loại kháng
sinh (trong đó có các kháng sinh có hoạt lực mạnh) là một khó khăn thực sự trong
quá trình điều trị [24].
Các chủng E. coli gây NKH do chúng có

đặc tính sau: có hoạt tính tan máu
(Hemolysin); có khả năng tạo Colixin V; có khả năng gây độc của kháng nguyên K
tạo cho vi khuẩn xâm nhập sâu hơn và lan rộng hơn; có khả năng kết dính hồng cầu
cũng như nhiều tế bào có khả năng miễn dịch làm giảm khả năng hoạt động bình
thường của chúng, chính vì vậy sẽ tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển nhanh và
mạnh hơn [28].
Các yếu tố độc lực chủ yếu làm cho vi khuẩn này có khả năng xâm nhập vào
máu trong điều kiện và hoàn cảnh thuận lợi. Trong 20 năm gần đây phần lớn các
công trình nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy E. coli là vi khuẩn thường gặp
nhất trong NKH do vi khuẩn Gram âm. Theo tác giả Canada cho biết tỷ lệ NKH do
E. coli ở Canada là 52,5%. ở Pháp khoảng 20%, và ở Mỹ khoảng từ 12 đến 25 %,
tỷ lệ nhiễm trùng do vi khuẩn này tùy thuộc vào mắc phải ở cộng đồng hay nhiễm
trùng bệnh viện[26].
1.2.2. Klebsiella pneumoniae
Klebsiella là một trong những chi quan trọng của họ vi khuẩn đường ruột,
được đặt theo tên nhà vi khuẩn người Đức, Edwin Klebs (1834-1913). Trong chi
này thì loài quan trọng nhất và cũng là đại diện điển hình của chi này là Klebsiella
pneumoniae. Đây là trực khuẩn Gram âm, thường đứng thành đôi, không di động,
10

có vỏ polysacharide đặc trưng. Lớp áo này giúp vi khuẩn tránh được hàng rào
phòng vệ của tế bào chủ. K. pneumoniae sống kị khí tùy ý: mọc dễ dàng và nhanh
trên các môi trường nuôi cấy thông thường[24]. Các tính chất hóa sinh của loài vi

khuẩn này khá đa dạng.

Klebsiella pneumoniae chủ yếu gây bệnh cơ hội, ở cộng
đồng hoặc trong bệnh viện - là một căn nguyên gây viêm phổi và thường gặp ở trẻ
sơ sinh, tỷ lệ tử vong cao nếu không được điều trị sớm [5], [37]. Ngoài ra nó còn có
khả năng gây NKH, viêm màng não, viêm tai giữa, viêm xoang, nhiễm khuẩn
đường tiết niệu,…Theo các tác giả Mỹ cho thấy Klebsiella spp đóng vai trò quan
trọng trong NKH cả bệnh viện và cộng đồng chiếm tỷ lệ 4- 17% trong các trường
hợp NKH nói chung. Tỷ lệ tử vong do Klebsiella sp cao từ 20-60 % tùy đối tượng
và địa phương khác nhau. Theo Hang J.B cho thấy tỷ lệ Klebsiella spp gây NKH ở
Nauy từ 4,1đến 8,5 %.
Nguồn lây vi khuẩn này chủ yếu từ đường ruột hoặc có thể xâm nhập theo các
đường khác nhau như dụng cụ phẫu thuật, ống dẫn lưu, ống thông tiểu. Klebsiella
bám vào niêm mạc đường hô hấp, đường tiết niệu nhờ fimbriae và một số kết dính
có khả năng ức chế manose.Vi khuẩn này có khả năng xâm nhập vào mô hoặc tuần
hoàn gây ra tình trạng bệnh nghiêm trọng. Một điều đáng lưu ý, song song với cơ
chế gây độc thì vi khuẩn này còn có sự đề kháng kháng sinh mạnh, đặc biệt là đối
với những bệnh nhân sử dụng kháng sinh không phù hợp [5].
1.2.3. Salmonella sp
Salmonella là một trong những tác nhân hàng đầu gây bệnh ở đường ruột ở
các nước. Salmonella là trực khuẩn Gram âm, kích thước trung bình dài khoảng 2-3
µm và rộng khoảng 0,5-1,0 µm. Chi này hiếu khí tùy tiện, phát triển được trên môi
trường nuôi cấy thông thường, không lên men lactose, lên men đường glucose
thường sinh hơi…
Salmonella là một trong những chi quan trọng nhất thuộc họ vi khuẩn đường
ruột. Đến nay hơn 2500 type huyết thanh Salmonella đã được xác định. Những
Salmonella gây bệnh ở người thường được xếp thành hai loại: các Salmonella gây
11

bệnh thương hàn (Salmonella Typhi) và Salmonella gây bệnh khác. Các Salmonella

gây bệnh thường gặp ở người như: S. typhi, S. paratyphi A, S. sendai và S.
choreraesuis là căn nguyên thường gặp trong các NKH do Salmonella gây nên ở
nước ta. Cơ chế gây bệnh thương hàn do S. typhi và các S. typhi A, B, C gây ra: Các
yếu tố độc lực chính của vi khuẩn thương hàn bao gồm khả năng bám và xâm nhập
vào tế bào vật chủ, khả năng xâm nhập và nhân lên trong đại thực bào và nội độc
tố. Kháng nguyên Vi ở S. typhi và S. paratyphi C là yếu tố độc lực quan trọng
những chủng vi khuẩn thương hàn không có kháng nguyên này thì số lượng cần
thiết để gây bệnh cao hơn nhiều. Kháng nguyên Vi được mã hóa bởi các gen nằm
trên SPI-7 (Salmonella Pathogenicity Island 7) [37]. Vi khuẩn theo đường tiêu hóa
xuống ruột non và nhân lên ở vùng này. Tiếp đó vi khuẩn thương hàn vào hạch mạc
treo ruột nhờ các tế bào M (đại thực bào của mảng Peyer). Từ máu, vi khuẩn đến
lách và cơ quan khác. Tại ruột vi khuẩn chết giải phóng nội độc tố. Nội độc tố kích
thích thần kinh giao cảm ở ruột gây ra hoại tử, chảy máu và có thể gây thủng ruột.
Những trường hợp nặng có thể có dấu hiệu ly bì, hôn mê, trụy tim mạch, không
được chữa kịp thời có thể dẫn tới tử vong[24].
Đối với khả năng gây bệnh nhiễm khuẩn và nhiễm độc thức ăn, chủ yếu là vi
khuẩn S. enteritidis và S. typhimurium. Nhiều Salmonella như S. typhimurium, S.
choleraesuis, S. dublin có các plasmid mang các gen độc lực spv (Salmonella
Plasmid Virulence). Các gen spv định vị trên một regulon gồm gen điều hòa spvR và
bốn gen cấu trúc spvA-B-C-D. Các gen spv giúp tăng cường sự phát triển của
Salmonella trong đại thực bào và các tế bào thực bào khác. Sự hủy hoại của tế bào
và sự chết của vi khuẩn giải phóng độc tố gây tổn thương cho cơ thể chủ và tạo nên
các triệu chứng lâm sàng.
Các phương pháp chẩn đoán vi khuẩn này hiện nay ở các trung tâm xét
nghiệm vẫn sử dụng là nhuộm soi trực tiếp từ bệnh phẩm, cấy máu, cấy phân hoặc
tiến hành chẩn đoán gián tiếp bằng phản ứng Widal (phản ứng ngưng kết phát hiện
kháng thể chống vi khuẩn thương hàn trong huyết thanh). Tuy nhiên, với mức độ
nguy hiểm của loài vi khuẩn này, thì việc chẩn đoán sớm là yếu tố tiên quyết giảm
12


thiểu nguy cơ biến chứng cho bệnh nhân. Chính vì vậy ngày nay các phương pháp
sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử lại được chú ý đến bởi tính nhanh, nhạy và đặc
hiệu. Đối với vi khuẩn này, có nhiều dấu ấn sinh học phân tử để nhận biết đó là các
gen độc lực, gen mã hóa cho các kháng nguyên đặc trưng, một số phải kể đến như
gen Salmonella plasmid virulence (spv), invA gen, 16s rRNA [19]…
1.2.4. Proteus mirabilis
Proteus là trực khuẩn, Gram âm, kích thước dài khoảng từ 0,4 đến 0,8 µm và
rộng khoảng từ 1,0 đến 3,0 µm, di động dễ dàng bằng các tiên mao. Kỵ khí tùy tiện,
là vi sinh vật dị dưỡng, có cả hai kiểu trao đổi chất: hô hấp và lên men. Nhiệt độ
tăng trưởng tối ưu là 37
0
C. Proteus thuộc ngành Proteobacteria, lớp Gamma
Proteobacteria, dòng Enterobacteiales, họ Enterobacteriaceae. Dựa vào tính chất
sinh vật hóa học người ta phân loại Proteus thành các loài: Proteus mirabilis,
Proteus vulgaris, Proteus myxofaciens, Proteus penneri, Proteus là vi khuẩn “gây
bệnh cơ hội”. Có khả năng gây bệnh cho con người, tạo ra enzyme protease phân
giải protein làm nhiễm trùng ống niệu, và gây ra những thương tổn khác cho cơ thể.
Ngộ độc Proteus vi khuẩn này nhiễm trong thịt và các sản phẩm thịt có thể gây ngộ
độc cho người. Ngoài enzyme protease, vi khuẩn này còn có các yếu tố độc lực và
các nội độc tố khác như hemolysin, flagella, immunoglobulin A(IgA),….[24]
Như đã nói đến ở trên, vi khuẩn Proteus mirabilis là vi khuẩn cơ hội thường
gây viêm tiết niệu, đây cũng được xác định là một cửa vào gây NKH trong trường
hợp nhiễm trùng đường niệu nặng, có tổn thương. Do vậy, việc xác định vi khuẩn
này sớm giúp ích cho việc điều trị cho bệnh nhân.
1.2.5. Nhóm các vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaece
Ngoài các vi khuẩn kể tên trên như E. coli, K. pneumoniae, Samonella sp,
Proteus sp còn có các vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaece như Citrobacter
sp, Enterobacter spp, Shigella sp, Yersinia sp…Những vi khuẩn này thường gây
bệnh đường ruột mà ít khi là tác nhân gây NKH [20].
13


1.3.Phương pháp chẩn đoán xác định vi khuẩn gây bệnh
1.3.1. Kỹ thuật xét nghiệm truyền thống phát hiện vi khuẩn
a. Xét nghiệm trực tiếp
- Nhuộm Gram: nói chung, theo phương pháp thông thường, xét nghiệm trực
tiếp các bệnh phẩm từ họng, mũi thường ít giá trị trong việc xác định căn nguyên
gây bệnh vì lẫn nhiều loại vi khuẩn. Chỉ các tiêu bản của các bệnh phẩm là máu,
dịch não tủy hay các dịch cơ thể mới có giá trị trong chẩn đoán căn nguyên phế cầu.
Nhuộm Gram tiêu bản đờm cũng có giá trị xác định căn nguyên [37].
- Thử nghiệm sinh hóa: với mỗi loại vi khuẩn có các thử nghiệm sinh hóa
khác nhau, phân biệt dựa vào các đặc điểm của từng loài như khả năng lên men
đường, hay không lên men, khả năng sản sinh những chất hóa học đặc trưng hay
khả năng thủy phân, khả năng phát quang khi nhuộm hóa chất…[23], [37].
b. Nuôi cấy phân lập
- Tùy theo từng loại bệnh phẩm để có các cách xử lý và nuôi cấy phù hợp.
- Các mẫu bệnh phẩm được nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy thích hợp.
Phương pháp xác định vi khuẩn qua quan sát hình thái khuẩn lạc và các đặc tính
sinh hóa của từng loài vi khuẩn khác nhau.
Nuôi cấy phân lập dương tính được coi là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán
bệnh. Một bệnh nhân được tiến hành cấy máu trong trường hợp có sốt hoặc nghi
NKH. Cấy máu theo một chu trình kín vô khuẩn (lấy 3-5ml máu tĩnh mạch cấy vào
canh thang brain-heart infusion hay canh thang thioglycolate theo tỷ lệ 1 phần máu
10 phần canh thang hoặc cho vào chai cấy máu do các hãng sản xuất sẵn, sau đó ủ ở
37
0
C/ 5% CO
2
/18-24 giờ. Nếu dương tính cấy chuyển sang các môi trường thạch
(thạch máu 5%, thạch sôcôla) [24].
14


c. Chẩn đoán ngưng kết
- Thử nghiệm ngưng kết trên phiến kính: Dựa trên nguyên lý của phản ứng kết
hợp kháng nguyên vỏ của vi khuẩn với kháng thể đặc hiệu tương ứng tạo sự ngưng
kết. Trên thị trường thương mại các sinh phẩm sử dụng cho thử nghiệm ngưng kết
trên phiến luôn có sẵn, giúp cho việc xác định các khuẩn lạc nghi ngờ có phải là vi
khuẩn nào gây bệnh.
- Chẩn đoán huyết thanh học: Phương pháp chơng pn huyết bchơng pếchthanh
của bệnh nhân, dựa trên cơ sở: huyết thanh người mắc bệnh có chứa kháng thể phản
ứng đặc hiệu với yếu tố gây bệnh (kháng nguyên), thường là vi khuẩn (phản ứng
ngưng kết kháng nguyên - kháng thể) được gọi là thử nghiệm Elisa. Phức hợp
kháng nguyên-kháng thể sẽ được nhận biết bởi cộng hợp kháng huyết thanh tương
ứng gắn với enzyme peroxidaza hoặc phosphataza gây chuyển mầu cơ chất phù
hợp. Kết quả phản ứng được đo bằng thiết bị đo quang phổ và thông qua độ đậm
đặc khác nhau của mầu sắc mà đánh giá mức độ phản ứng của mẫu xét nghiệm [23],
[37].
1.3.2. Phương pháp sử dụng sinh học phân tử phát hiện vi khuẩn
1.3.2.1.Kỹ thuật PCR
Polymerase Chain Reaction (PCR) là một kỹ thuật cho phép khuếch đại các
trình tự ADN đặc hiệu được Kary Mullis phát minh vào năm 1985 và được Saiki và
cộng sự phát triển sau này. Kỹ thuật đã được áp dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh
vực như khoa học hình sự, mô bệnh học, các chẩn đoán trước sinh và chẩn đoán các
mầm bệnh.
Nguyên lý cơ bản của PCR
Đây là kỹ thuật in vitro cho phép nhân nhanh một đoạn gen mong muốn lên
hàng triệu lần trong một thời gian ngắn nhờ hai đoạn mồi oligonucleotide gắn với
hai đầu 3’ ở cả hai sợi của đoạn ADN đích (target sequence) với sự tham gia của
15

ADN polymerase. Phản ứng PCR là một chuỗi chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ

gồm 3 bước:
Bước 1: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết
cho sự sao chép, phân tử ADN được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng
chảy (Tm) của phân tử, thường là 94
o
C đến 95
o
C trong vòng 30 giây đến 1 phút.
Đây là giai đoạn biến tính (Denaturation).
Bước 2: Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của mồi) cho phép các mồi bắt
cặp với ADN khuôn, nhiệt độ này giao động trong khoảng từ 40
0
C đến 70
0
C tuỳ
thuộc vào Tm của mồi, thời gian gắn mồi kéo dài từ 30 giây đến 1 phút 30 giây.
Đây là giai đoạn lai (Anealing).
Bước 3: Nhiệt độ tăng lên đến 72
o
C giúp cho ADN polymerase hoạt động
tổng hợp tốt nhất, thời gian tùy thuộc vào độ dài của trình tự ADN cần khuếch đại.
Thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Đây là giai đoạn tổng hợp hoặc kéo dài
(Extension).

Hình.1 Các giai đoạn tổng hợp của phản ứng PCR [10], [36]
Một chu kỳ gồm 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần sẽ làm
tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân, theo
tính toán sau 30 chu kỳ sự khuếch đại sẽ là 10
6
so với lượng mẫu ban đầu.

16

Do kỹ thuật và phản ứng PCR rất nhạy nên phải tránh sự nhiễm chéo giữa
các ADN khác có trong phòng thí nghiệm và điều kiện làm việc thực hiện các phản
ứng phải nghiêm ngặt.
1.3.2.2. Kỹ thuật PCR đa mồi (PCR đa mồi)
PCR là một trong những kỹ thuật phổ biến hiện nay trong nghiên cứu và
được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán. Tuy nhiên, chẩn đoán bằng PCR có nhược
điểm là chỉ thực hiện được phản ứng đơn lẻ phát hiện một tác nhân vi khuẩn gây
bệnh, như vậy giá thành sẽ cao. Để tăng cường khả năng chẩn đoán và vượt qua
những thiếu sót của PCR, Chamberlain và cộng sự là những người đầu tiên mô tả,
phát triển kỹ thuật PCR đa mồi vào năm 1988. Trong kỹ thuật PCR đa mồi, nhiều
gen đích được khuếch đại cùng một lúc bằng nhiều cặp mồi trong cùng một phản
ứng. Kỹ thuật PCR đa mồi tiết kiệm thời gian, công sức và đóng vai trò rất quan
trọng trong chẩn đoán phân tử bao gồm phân tích đột biến gen, tính đa hình ADN,
phân tích định lượng, phân tích đột biến [10]
Trong lĩnh vực bệnh truyền nhiễm, kỹ thuật này rất có giá trị trong chẩn đoán
xác định virut, vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng và xác định kiểu gen [9, 17, 39]. Xét
nghiệm chẩn đoán xác định sự có mặt của mầm bệnh dựa trên sự tồn tại của axit
nhân của vi sinh vật trong chẩn đoán NKH có thể được chia ra thành 2 nhóm: (i)
xác định ADN của mầm bệnh từ chai nuôi cấy và (ii) xác định vi sinh vật trực tiếp
từ máu, huyết thanh/huyết tương. Hiện nay, người ta có thể chia thành ba chiến lược
khác nhau trong thiết kế các xét nghiệm xác định các ADN của mầm bệnh. Chiến
lược thứ nhất là thiết kế các bộ mồi (primers) đặc hiệu cho từng mầm bệnh; chiến
lược thứ hai là thiết kế các bộ mồi có thể bắt cặp với một đoạn gen chung cho nhiều
mầm bệnh như khu vực 16S, 5S, và 23S của rRNA hoặc 18S; 5,8S; và 28S
ribosomal của DNAs (rDNAs); chiến lược thứ ba là áp dụng PCR đa mồi để phát
hiện đồng thời nhiều mầm bệnh. Việc nghiên cứu phân tử rRNA là phương pháp
hữu hiệu nhất được sử dụng để xác định mối quan hệ, tiến hóa của các vi sinh vật,
vì rRNA có mặt ở tất cả các loại vi sinh vật, có khả năng xác định, có tính bảo thủ

17

cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm vi sinh vật. Trong ba gen mã hóa
rRNA của vi khuẩn như 5S rRNA, 16S rRNA và 23S rRNA thì gen mã hóa 16S
rRNA có tính đặc hiệu cao. Gen này có kích thước khoảng 1500 nucleotid, ít thay
đổi và phổ biến trong các loài vi khuẩn cho phép xác định có họ vi khuẩn này hay
không trong một mẫu bệnh phẩm. Do vậy, trong đề tài này chúng tôi thiết kế một
cặp mồi bắt trình tự bảo tồn của khu vực 16S rRNA phát hiện các tác nhân vi khuẩn
thuộc họ vi khuẩn Enterobacteriaceae. Tương tự với các loài vi khuẩn khác thuộc
họ này qua tham khảo các tài liệu, chúng tôi sử dụng gen đích là uidA mã hóa cho
enzyme beta-D-glucuronidase để phát hiện sự có mặt của vi khuẩn E. coli [8], [13],
[16], [26]. Với vi khuẩn Klebsiella pneumoniae để xác định sự có mặt của vi khuẩn
này bằng PCR người ta sử dụng gen mã hóa cho enzyme ldehyde dehydrogenase A
(aldA) làm gen đích [17], [23], [27], [36]. Vi khuẩn Samonella có nhiều loài khác
nhau. Nhóm gây bệnh thương hàn và phó thương hàn ở người là S. typhi, S.
paratyphi A, S. paratyphi. Việc chẩn đoán không phân biệt ba loài vi khuẩn trên,
người ta sử dụng gen đích là 16S rRNA [11], [19]. Đối với vi khuẩn Proteus
mirabilis người ta sử dụng gen đích phổ biến nhất là gen UreR mã hóa cho enzyme
Urease [18], [22], [24], [34], [35].
1.3.3. Tách chiết ADN sử dụng công nghệ loại bỏ ADN người
1.3.3.1. Sự cần thiết của công nghệ loại bỏ ADN người trong chẩn đoán tác nhân
gây bệnh nhiễm khuẩn huyết
Để giảm thiểu ảnh hưởng của các yếu tố bất lợi quá trình PCR đa mồi cần phải
được cân nhắc từ khâu thiết kế mồi, quy trình tách và làm sạch ADN bệnh phẩm
cho đến việc thay đổi các thành phần phụ gia cho phản ứng. Một khó khăn nữa
trong việc triển khai kỹ thuật PCR vào chẩn đoán tác nhân vi sinh vật gây NKH đó
là lượng ADN người có trong mẫu bệnh phẩm máu: thông thường một bệnh nhân
NKH (nhiễm E. coli) sẽ có những biểu hiện lâm sàng đầu tiên khi mật độ vi khuẩn
trong máu ở mức 100-1000CFU/ml [2], [25]. Trong khi đó một phản ứng PCR sử
dụng ADN thu nhận từ Kit tách Qiagen, chỉ có thể phát hiện được ribosomal 16S

DNA vi khuẩn nếu mật độ của chúng vượt quá ngưỡng 500 CFU/ml. Vì thế với
18

trường hợp bệnh nhân nhiễm khuẩn nhập viện có mật độ vi khuẩn trong máu quá
thấp dưới ngưỡng phát hiện, khi đó phương pháp này sẽ không thể phát hiện được,
gây nên hiện tượng âm tính giả. Ở một khía cạnh khác, các giả thuyết gần đây cho
rằng sự tiến hoá hình thành tế bào nhân chuẩn (bao gồm cả tế bào người) là kết quả
của sự lai ghép giữa nhóm archaeal với proteobacterial hoặc cyanobacterial
prokaryote, điều này có nghĩa sẽ tồn tại các trình tự tương đồng có tính bảo tồn cao
giữa các nhóm tế bào vi khuẩn, nấm men và tế bào động vật có vú bao gồm cả tế
bào người [16], [29], [33], [38]. Vì thế nếu phản ứng PCR sử dụng các chuỗi mồi có
trình tự bắt cặp và khuếch đại các khu vực bảo tồn cao (thuật ngữ tiếng Anh là
highly conserved motif), hiện tượng dương tính giả sẽ xuất hiện. Để hạn chế các
hiện tượng âm tính giả do độ nhạy kỹ thuật thấp và dương tính giả do bắt cặp của
mồi vào khu vực bảo tồn giữa các loài, người ta có thể sử dụng các Kit loại bỏ ADN
người kết hợp làm giàu ADN vi khuẩn sau đó mới thực hiện các phản ứng PCR đặc
hiệu [16].
Thông thường một Kit loại bỏ ADN người thường bao gồm các thành phần i)
giúp phá vỡ tế bào máu tổng số đồng thời gây đứt gãy ADN người, thông thường
các hoá chất này sẽ không làm tổn thương tế bào vi khuẩn ii) thu nhận và tách đặc
hiệu ADN vi khuẩn. Hiện nay Kít làm giàu ADN vi khuẩn do hãng MolYsis, có thể
cho hiệu quả làm giàu 40000 lần nhưng giá thành rất cao (khoảng £10/lần tách) [31]
vì thế rất khó được chấp nhận ở những nước thu nhập thấp trong đó có Việt Nam.
Để khắc phục những khó khăn trên, chúng tôi thiết lập phương pháp loại bỏ ADN
người kết hợp làm giàu ADN vi khuẩn: Ý tưởng kỹ thuật này là một điểm mới chưa
từng được triển khai tại bất cứ phòng thí nghiệm hay trung tâm chẩn đoán nào ở
nước ta. Các bệnh phẩm máu ngoại vi hoặc các dịch cơ thể có nghi ngờ mang vi
khuẩn được rửa bằng dịch phá bạch cầu Mammalian cellular lysis (MCLB1) [14],
[31], nhờ đó loại bỏ các thành phần ức chế phản ứng PCR như heparin, huyết sắc tố.
1.3.3.2. Cơ sở lý thuyết của công nghệ loại bỏ ADN người ”làm giàu” ADN vi

khuẩn
Mục đích: tạo ra một loại dung môi có khả năng phá bỏ tế bào người nhưng
bảo tồn được tế bào vi khuẩn trong một thời gian nhất định.