BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA-VŨNG TÀU







ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP




LÊN MEN MALOLACTIC
TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG CACAO


Trình độ đào tạo: Đại học
Ngành: Công nghệ kĩ thuật hóa học
Chuyên ngành: Hóa dầu


Giảng viên hướng dẫn: Th.S Chu Thị Hà
Sinh viên thực hiện : Ngô Tiến Việt Anh
MSSV: 1052010007 Lớp: DH10H1

Bà Rịa-Vũng Tàu, tháng 7 năm 2014
BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA VŨNG TÀU

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập- Tự do- Hạnh phúc
NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Họ và tên sinh viên: Ngô Tiến Việt Anh
Ngày sinh: 03/02/1992
Ngành: Công nghệ kĩ thuật Hóa học
Mã số SV: 1052010007
Nơi sinh: TP. Hải Phòng
I. TÊN ĐỀ TÀI: Lên men malolactic trong sản xuất rượu vang cacao.
II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG
‒ Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của
vi khuẩn Leuconostoc oenos.
‒ Khảo sát tỉ lệ giống vi khuẩn Leuconostoc oenos thích hợp bổ sung vào dịch
vang non.
‒ Khảo sát thời điểm bổ sung giống vi khuẩn Leuconostoc oenos.
‒ Khảo sát tỉ lệ chất làm trong bentonite.
‒ Lên men malolactic với các thông số tối ưu đã nghiên cứu.
III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN : tháng 9/2013
IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN : tháng 7/2014
V. HỌ VÀ TÊN CÁC BỘ HƯỚNG DẪN : Th.S Chu Thị Hà


Vũng Tàu, ngày 20 tháng 7 năm 2014
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(Kí và ghi rõ họ tên)




Th.S Chu Thị Hà
SINH VIÊN THỰC HIỆN
(Kí và ghi rõ họ tên)




Ngô Tiến Việt Anh

TRƯỞNG BỘ MÔN
(Kí và ghi rõ họ tên)




TS. Lê Thanh Thanh

TRƯỞNG KHOA
(Kí và ghi rõ họ tên)





PGS.TS. Nguyễn Văn Thông



LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng đây là đồ án của tôi, có sự hỗ trợ từ giảng viên hướng
dẫn là Th.S Chu Thị Hà. Các số liệu và kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa
từng được ai công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào trước đây. Các thông
tin, tài liệu trích dẫn trong tài liệu tham khảo.

TP. Vũng Tàu, tháng 7 năm 2014.
Ngô Tiến Việt Anh


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên em xin chân thành cám ơn quý thầy cô trong Bộ môn Công nghệ
kĩ thuật Hóa học, Công nghệ Thực phẩm nói riêng và các thầy cô trong khoa Hóa học
và Công nghệ Thực phẩm nói chung đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận
lợi giúp em hoàn thành tốt đồ án này.
Em xin cảm ơn cô Chu Thị Hà – người đã tận tình theo sát, chỉ bảo, giúp đỡ,
tạo cho chúng em sự say mê trong học tập và nghiên cứu.
Con xin cám ơn gia đình đã luôn theo sát, ủng hộ, khích lệ và động viên trong
suốt quãng đường mà con đã đi.
Cuối cùng, xin gửi những lời thân thương nhất đến tất cả những người đã sát
cánh cùng tôi trong thời gian qua.

TP. Vũng Tàu, tháng 7 năm 2014.
Ngô Tiến Việt Anh
i

MỤC LỤC
Trang
MỤC LỤC i
DANH MỤC CÁC BẢNG iv
DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ, HÌNH ẢNH v
LỜI MỞ ĐẦU 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Giới thiệu về cây cacao 3
1.1.1. Đặc điểm của cây cacao 3
1.1.2. Các giống cây cacao 3
1.1.3. Cấu tạo quả cacao 5
1.1.4. Thành phần hóa học của nước cacao 6
1.2. Giới thiệu quá trình lên men malolactic 6
1.2.1. Khái niệm lên men malolactic 6
1.2.2. Vị trí của lên men malolactic trong quy trình sản xuất rượu vang cacao
7
1.2.3. Mục đích và ứng dụng của quá trình lên men malolactic 7
1.2.4. Các kiểu lên men malolactic 9
1.2.5. Giới thiệu một số loại vi khuẩn lên men malolactic 12
1.2.6. Các biến đổi diễn ra trong quá trình lên men malolactic 16
1.3. Giới thiệu quá trình làm trong rượu vang 29
1.3.1. Mục đích của quá trình làm trong rượu vang 29
1.3.2. Một số tác nhân làm trong 30
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34
2.1. Vật liệu nghiên cứu 34
2.1.1. Dịch quả cacao 34

2.1.2. Rượu vang non 34
2.1.3. Giống vi sinh vật 34
2.1.4. Môi trường nuôi cấy 35
2.1.5. Hóa chất 35
2.1.6. Thiết bị và dụng cụ 35
ii

2.2. Phương pháp nghiên cứu 36
2.2.1. Phương pháp lên men malolactic 36
2.2.2. Phương pháp làm trong rượu 36
2.2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 36
2.2.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm 38
2.2.5. Các phương pháp phân tích 41
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 45
3.1. Các yếu tố ảnh hướng đến sinh triển và phát triển của chủng vi khuẩn
Leuconostoc oenos. 45
3.1.2. Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Leuconostoc oenos. 46
3.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ cồn đến sự sinh trưởng của Leuconostoc
oenos. 48
3.1.4. Ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ đến sự sinh trưởng và phát triển của
Leuconostoc oenos. 49
3.1.5. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn
Leuconostoc oenos. 51
3.1.6. Ảnh hưởng của thành phần đường đến sự sinh trưởng và phát triển của
vi khuẩn Leuconostoc oenos. 53
3.2. Tỉ lệ giống thích hợp bổ sung vào dịch vang non 55
3.2.1. Sự thay đổi pH 56
3.2.2. Sự thay đổi độ acid tổng 57
3.2.3. Sự thay đổi độ cồn và hàm lượng chất khô 57
3.3. Thời điểm bổ sung giống vi khuẩn 58

3.3.1. Sự thay đổi pH 59
3.3.2. Sự thay đổi hàm lượng chất khô 60
3.3.3. Sự thay đổi độ acid tổng 61
3.3.4. Sự thay đổi độ cồn 61
3.4. Tỉ lệ chất làm trong bentonite 61
3.5. Lên men malolactic với các điều kiện nghiên cứu 63
3.6. Đánh giá cảm quan 64
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66
4.1. Kết luận 66
iii

4.2. Kiến nghị 66
TÀI LIỆU THAM KHẢO 68
PHỤ LỤC 70
iv

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của nước cacao. 6
Bảng 1.2. Phân loại các vi khuẩn Lactobacillus 13
Bảng 1.3. Tốc độ phát triển vi khuẩn malolactic theo nhiệt độ 26
Bảng 2.1. Các chỉ tiêu của rượu vang non 34
Bảng 2.2. Thành phần môi trường MRS 35
Bảng 3.1. Định lượng vi khuẩn Leuconostoc oenos 47
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ cồn đến vi khuẩn Leuconostoc oenos. 48
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ đến vi khuẩn Leuconostoc oenos. 50
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của pH đến vi khuẩn Leuconostoc oenos 52
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thành phần đường đến vi khuẩn Leuconostoc oenos 54
Bảng 3.6. Quá trình lên men malolactic với các nồng độ vi khuẩn bổ sung khác nhau
56

Bảng 3.7. Sự thay đổi độ cồn và hàm lượng chất khô sau quá trình lên men malolactic
ứng với các tỉ lệ giống khác nhau. 58
Bảng 3.8. Sự thay đổi các yếu tố sau quá trình lên men theo các thời điểm bổ sung
giống khác nhau. 59
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của hàm lượng bentobite tới hiệu quả lắng trong của rượu vang
62
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của hàm lượng bentonite tới chất lượng cảm quan của rượu
vang. 63
Bảng 3.11. Kết quả các chỉ tiêu của rượu vang cao cao khi lên men ở điều kiện tối ưu
64
v

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ, HÌNH ẢNH
Trang
Hình 1.1. Giống Criollo. 4
Hình 1.2. Giống Forastero. 5
Hình 1.3. Giống Trinitario. 5
Hình 1.4. Cấu tạo quả cacao 6
Hình 1.5. Các loại vi khuẩn Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc. 12
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 37
Hình 3.1. Hình ảnh của vi khuẩn Leuconostoc oenos dưới kính hiển vi 45
Hình 3.2. Khuẩn lạc của vi khuẩn Leuconostoc oenos trên môi trường MRS – Agar
có bổ sung dịch vang cacao non 46
Đồ thị 1.6. Đường cong sinh trưởng của các vi khuẩn chính trong lên men rượu 17
Đồ thị 1.7. Sự phát triển của vi khuẩn malolactic trong suốt quá trình lên men rượu
và lên men malolactic 19
Đồ thị 1.8. Sự phát triển của vi khuẩn malolactic trong suốt quá trình lên men rượu
và lên men malolactic có kiểm soát bằng cách cấy giống trước khi lên men rượu .19
Đồ thị 1.9. Sự phát triển của vi khuẩn malolactic trong suốt quá trình lên men rượu
và lên men malolactic có kiểm soát bằng cách cấy giống sau khi lên men rượu 20

Đồ thị 1.10. Một số nhân tố chính ảnh hưởng đến quá trình lên men malolactic 27
Đồ thị 3.3. Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Leuconostoc oenos 47
Đồ thị 3.4. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ cồn đến OD vi khuẩn
Leuconostoc oenos. 49
Đồ thị 3.5. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ đến OD vi khuẩn
Leuconostoc oenos. 50
Đồ thị 3.6. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của pH đến OD của vi khuẩn Leuconostoc
oenos 52
Đồ thị 3.7 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thành phần đường đến OD của vi khuẩn
Leuconostoc oenos. 54
Đồ thị 3.8. Sự thay đổi pH của các mẫu ứng với các tỉ lệ giống khác nhau theo thời
gian trong quá trình lên men malolactic. 56
Đồ thị 3.9. Sự thay đổi nồng độ acid tổng của các mẫu ứng với các tỉ lệ giống khác
nhau theo thời gian trong quá trình lên men malolactic 57
vi

Đồ thị 3.10. Sự thay đổi độ cồn và hàm lượng chất khô sau quá trình lên men
malolactic ứng với các tỉ lệ giống khác nhau. 58
Đồ thị 3.11. Sự thay đổi các yếu tố sau quá trình lên men theo các thời điểm bổ sung
giống khác nhau 59
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT

Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 1 Khoa Hóa học & CNTP
LỜI MỞ ĐẦU
Rượu vang là một loại thức uống có cồn thu được từ quá trình lên men nước ép
nho hoặc một số loại trái cây khác. Lên men rượu là một hình thức rất cổ xưa trong
công nghệ thực phẩm trên thế giới, nó đã có cách đây hàng ngàn năm. Việc sản xuất
rượu vang đã trở thành một hình thức kinh doanh toàn cầu, nó đã và đang ảnh hưởng
đáng kể đến nền kinh tế của nhiều nước trên thế giới (Walker, 2000). Việc lên men
rượu vang (lên men chính) được thực hiện bằng cách bổ sung thêm giống nấm men

vào nước trái cây. Giống vi sinh vật tốt nhất dùng cho quá trình này là Saccharomyces
cerevisiae, được sử dụng rộng rãi để chuyển hóa ethanol từ đường trong nước ép trái
cây (Klingshirn, 2002) [9].
Một nhóm vi sinh vật khác liên quan đến quá trình lên men rượu vang đó chính
là vi khuẩn lactic, chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men rượu lần hai
hay còn gọi là lên men malolactic. Hiệu suất của quá trình lên men malolactic phụ
thuộc vào đặc điểm của từng loại quả (Bozoğlu và Yurdugül, 2000), đặc biệt là lượng
acid malic có trong quả. Nếu hàm lượng acid malic quá cao thì việc lên men
malolactic là cần thiết để chuyển acid L-malic thành acid L-lactic, kết quả là làm
giảm lượng acid trong rượu, giảm được vị chua gắt, cải thiện được hương vị của rượu
vang (Steinkraus, 1992) [9].
Lên men malolactic là một quá trình quan trọng trong sản xuất rượu vang hay ít
nhất là những loại rượu vang có hàm lượng acid cao ở những vùng có khí hậu mát
mẻ. Lợi ích của quá trình lên men malolactic bao gồm: giảm lượng acid trong những
loại rượu vang có nồng độ acid cao, cải thiện hương vị đặc trưng của rượu vang nhờ
sự hoạt động của vi khuẩn và ổn định hệ vi sinh vật có trong rượu vang (Bozoğlu
vàYurdugül, 2000). Vi khuẩn acid lactic tham gia vào quá trình lên men malolactic
được gọi là vi khuẩn malolactic, thuộc chi Leuconostoc, Pediococcus và
Lactobacillus (Lonvaud-Funel, 2000; Văn Vuuren và Dicks, 1993; Versari,
Parpinello, và Cattaneo, 1999), chúng có khả năng chuyển hóa trực tiếp acid malic
thành acid lactic và CO
2
nhờ malate carboxylase hay còn gọi là enzyme malolactic
(MLE) (Bozoğlu and Yurdugül, 2000; Fugelsang, 1997; Renault et al., 1988; Salema
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT

Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 2 Khoa Hóa học & CNTP
et al., 1996). Quá trình này có thể xảy ra tự phát trong thời gian lưu trữ rượu hoặc
được điều khiển bởi các tác nhân vi sinh vật [9].
Ở Việt Nam, hầu hết các sản phẩm rượu vang đều trải qua 2 giai đoạn, đó là giai

đoạn lên men rượu và lên men phụ nhằm lắng trong cũng như ổn định chất lượng
rượu vang mà không có quá trình lên men malolactic. Chính điều này cũng đã góp
phần làm hạn chế chất lượng cũng như mùi vị của sản phẩm, đặc biệt là đối với những
loại quả có hàm lượng acid malic cao. Vì vậy chúng tôi nghiên cứ quá trình lên men
malolactic trong sản xuất rượu vang cacao, nhằm khắc phục những khuyết điểm đã
nêu trên.
Trong đồ án này, chúng tôi nghiên cứu những nội dung sau:
‒ Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của
vi khuẩn Leuconostoc oenos.
‒ Khảo sát tỉ lệ giống vi khuẩn Leuconostoc oenos thích hợp bổ sung vào
dịch vang non.
‒ Khảo sát thời điểm bổ sung giống vi khuẩn Leuconostoc oenos.
‒ Khảo sát tỉ lệ chất làm trong bentonite.
‒ Lên men malolactic với các thông số tối ưu đã nghiên cứu.
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT

Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 3 Khoa Hóa học & CNTP
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về cây cacao
1.1.1. Đặc điểm của cây cacao [4]
Cacao thuộc họ Sterculiaceae, giống Theobroma, loài Cacao, có nguồn gốc từ
miền nam châu Phi.
Cacao là cây công nghiệp dài ngày, trồng thích hợp ở vùng nhiệt đới, thân gỗ,
cao 5 – 7 m (thường phát triển dưới tán). Sau khi trồng 3 – 4 năm, cây bắt đầu ra trái,
sau 10 năm thì cây phát triển hoàn thiện. Cây ca cao có thể cho thu hoạch quả đến
50 năm.
Hoa nhỏ, đường kính khoảng 15mm, có màu vàng, đỏ, trắng hay tím tùy theo
loài. Hoa mọc trực tiếp từ thân và cành, thuộc loại lưỡng tính và thụ phấn chủ yếu là
nhờ côn trùng. Có khoảng 0,5% hoa nở tạo quả, trong đó 90% quả non sẽ bị khô và

rụng.
Điều kiện canh tác: t
0
= 20 – 30
0
C, lượng mưa 1500 – 2000 mm/năm, pH của
đất: 6,5 – 6,7, phân bón: đạm, kali và các khoáng vi lượng.
1.1.2. Các giống cây cacao
Cây cacao (Theobroma Cacao L.) thuộc họ Sterculiceae và còn được chia ra
làm nhiều loại khác nhau, quan trọng nhất là các loại Criollo, Forastero và Trinitario
[15].
1.1.2.1. Giống Criollo [4]
Xuất xứ: Trung Mỹ.
Đặc điểm trái:
‒ Nhị lép có màu hồng nhạt.
‒ Trái có màu nâu hoặc xanh trước khi chín.
‒ Trái có dạng dài và có đỉnh nhọn rất rõ ở cuối trái, mang mười rãnh đều
nhau đôi khi chia thành hai dãy. Ta có thể phân biệt được hai nhóm do một trong năm
rãnh không rõ nét.
‒ Vỏ thường sần sùi, mỏng, dễ cắt, lớp trong mỏng và ít mô gỗ.
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT

Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 7 Khoa Hóa học & CNTP
1.2.2. Vị trí của lên men malolactic trong quy trình sản xuất rượu vang cacao [1]
Trong công nghiệp sản xuất rượu vang, quá trình lên men malolactic được tiến
hành sau khi lên men chính, dịch lên men thu được gọi là “vang non” được tiến hành
lắng gạn cặn và được chuyển sang bồn chứa để sang giai đoạn lên men tiếp theo. Quá
trình này lên men rất chậm nhằm phân giải những gram đường cuối cùng, song song
với quá trình này vi khuẩn lactic sẽ phân giải acid malic thành acid lactic làm cho
rượu vang chuyển từ vị chua gắt sang vị chua nhẹ dễ chịu, CO

2
tiếp tục được giải
phóng nhưng có xu hướng giảm dần, hương vị rượu vang dần được hoàn thiện. Dung
dịch lên men ở trạng thái tĩnh lặng, xác nấm men lắng xuống đáy bồn lên men. Tiếp
theo, dịch vang được lắng gạn tiếp vài lần, mỗi lần từ 20 đến 30 ngày để ổn định
thành phần của rượu vang rồi tiếp tục vào giai đoạn ủ chín.
1.2.3. Mục đích và ứng dụng của quá trình lên men malolactic [1]
1.2.3.1. Mục đích
Lên men malolactic là một quá trình rất quan trọng trong sản xuất các loại rượu
vang đỏ hoặc các loại rượu vang có độ chua cao. Quá trình này hoàn toàn không gây
nguy hiểm đối với chất lượng vang vì quá trình lên men vi khuẩn lactic chỉ sử dụng
acid malic là chính mà không tác động gì tới các cấu tử và thành phần có trong rượu
vang. E. Peymand (2002) đã xếp mức độ nguy hiểm cho chất lượng rượu vang do tác
động của vi khuẩn lactic theo chiều tăng dần lên như sau:
‒ Lên men đường arabinose, acid citric và đường xylose tạo thành một lượng
không lớn lắm các acid bay hơi và làm giảm chất lượng rượu vang không đáng kể.
‒ Lên men acid tartaric, glycerin, glucose, fructose làm thay đổi khá rõ các
hợp phần có trong vang và làm giảm chất lượng của vang.
Mức độ gây xấu hay ảnh hưởng không tốt chất lượng rượu vang phụ thuộc và
đặc tính của chủng vi khuẩn lactic và đặc điểm của vang. Quá trình lên men malolactic
có ba ý nghĩa quan trọng với rượu vang:
a. Làm giảm độ acid của dịch vang lên men
Trước hết, về mặt hóa học, quá trình lên men malolactic làm cho pH của môi
trường lên men tăng lên khoảng từ 0,1- 0,3 đơn vị và làm giảm độ acid tổng xuống
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT

Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 8 Khoa Hóa học & CNTP
khoảng 0,01 đến 0,03 g/L (tính theo acid tartaric) bởi quá trình decarboxyl hóa một
gốc acid và chuyển acid malic thành acid lactic có độ acid yếu hơn. Tuy nhiên, không
phải tất cả các acid malic đều được chuyển hóa thành acid lactic mà chỉ 2/3 chúng

được chuyển hóa, còn lại bị phân giải hoặc bị oxi hóa thành CO
2
thoát khỏi dịch men.
b. Điều chỉnh hương vị đặc trưng cho vang
Sự chuyển hóa acid malic thường đi kèm với quá trình lên men các loại đường
còn lại để tạo ra rất nhiều sản phẩm là những hợp chất dễ bay hơi như acetandehyde,
diacetyl, acetoin, acid acetic, 2-3 butadiol, ethyl lactate và các rượu bậc cao… Tất cả
các hợp chất này tạo nên một tổ hợp các hương vị đặc trưng góp phần tạo nên chất
lượng của rượu vang thành phẩm.
c. Làm ổn định về mặt vi sinh cho rượu vang thành phẩm
Cuối cùng, về mặt bảo quản, quá trình lên men malolactic góp phần tạo nên tính
ổn định về chất lượng cảm quan và vi sinh. Điều này có ý nghĩa là sự hiện diện của
quá trình lên men malolactic có khả năng ức chế sự sinh trưởng của các vi sinh vật
khác. Sự ức chế này được giải thích bởi các nguyên nhân sau:
‒ Một số vi khuẩn không mong muốn có khả năng sử dụng acid malic làm
nguồn chất dinh dưỡng. Vì thế, việc giảm hàm lượng acid malic trong dịch lên men
sẽ đem lại kết quả tốt để giảm thiểu rủi ro về mặt vi sinh.
‒ Vi khuẩn lactic sinh trưởng trước trong môi trường pH thấp và chúng sử
dụng các chất dinh dưỡng như: amino acid, các base nitơ, vitamin làm cho môi trường
ngày càng nghèo nàn những chất này. Từ đó giới hạn được sự sinh trưởng và phát
triển của các vi sinh vật khác.
‒ Một số vi khẩn malolactic có thể sản sinh ra độc tố (bacteriocin) có thể ức
chế sinh trưởng của những vi sinh vật khác mà không gây ảnh hưởng gì về mặt cảm
quan và sức khỏe con người.
Người ta nhận thấy rằng những loại rượu vang không có quá trình lên men
malolactic hay quá trình này không được kiểm soát chặt chẽ thì sau một thời gian
đóng chai và bảo quản thường xảy ra hiện tượng bị đục dịch vang hay đôi khi hình
thành nên cặn lắng hay sủi bọt nhẹ và có khi kèm theo mùi lạ gần giống với mùi món
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT


Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 9 Khoa Hóa học & CNTP
dưa cải bắp truyền thống của Đức. Dù ít hay nhiều thì điều này cũng làm ảnh hưởng
đáng kể đến chất lượng của rượu vang thành phẩm. Vì vậy, nếu quá trình lên men
malolactic được thực hiện một các có kiểm soát thì những rủi ro này có thể bị loại
trừ.
1.2.3.2. Ứng dụng
Hiện nay, quá trình lên men malolactic được xem như một công nghệ quan trọng
nhằm cải thiện chất lượng của rượu vang. Người ta cho rằng, hầu hết các loại rượu
vang đỏ và khoảng 20% rượu vang trắng trên thế giới đều trải qua quá trình lên men
này.
Đứng trên phương diện thành phần hóa học, lên men malolactic chỉ thích hợp
cho sản xuất các loại rượu vang có độ pH thấp, tức là có hàm lượng acid cao. Hầu hết
các loại rượu vang đỏ trên thế giới đều được nâng cao chất lượng thông qua quá trình
lên men malolactic. Ví dụ các loại rượu vang đỏ: Pinot Noir, Merlot và Cabernet đều
được tiến hành lên men malolactic gần như hoàn toàn. Quá trình lên men malolactic
xảy ra hầu hết ở vang đỏ bởi vì ở các vang này có hàm lượng acid malic khá cao.
Acid malic có thể bị phân giải bởi vi khuẩn lactic thành acid lactic làm giảm vị chua
gắt khó chịu cho vang. Hàm lượng acid malic trong dịch quả còn tùy thuộc vào từng
loại quả, điều kiện trồng trọt và thời tiết. Đối với những loại rượu vang được sản xuất
ở vùng khí hậu lạnh, đặc biệt là Đức, Pháp và miền đông nước Mỹ, thường có hàm
lượng acid malic khá cao nên cần thực hiện quá trình lên men malolactic. Ở vùng có
khí hậu ấm áp hơn thì ngược lại. Hầu như hàm lượng acid malic sẽ giảm cùng với
quá trình chín của quả. Do đó, thông thường, ở các vùng này, không cần quá trình lên
men malolactic.
1.2.4. Các kiểu lên men malolactic [2]
1.2.4.1. Lên men tự nhiên
Sản xuất rượu vang theo truyền thống thì lên men malolactic diễn ra tự phát
trong suốt quá trình bảo quản vang non trong vài tháng hoặc vài năm. Vi khuẩn có
nguồn gốc trên vỏ quả nho hoặc thùng gỗ. Tuy nhiên trong công nghệ sản xuất vang
hiện đại với quá trình chế biến sạch hơn và thời gian bảo quản cần giảm thối thiểu thì

Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT

Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 10 Khoa Hóa học & CNTP
quá trình lên men như vậy là quá chậm và không đủ độ tin cậy. Leuconostoc oenos
sinh trưởng cực kì chậm chạp và đôi khi không phát triển ở vang có pH từ 3.0 – 3.8;
cồn 10 – 14%V; 10 – 100ppm SO
2
và hàm lượng đường sót thấp. Ngoài ra trong lên
men malolactic tự phát ngoài tác nhân là vi khuẩn Leuconostoc oenos còn rất nhiều
vi khuẩn lactic khác vì thế luôn có nhửng rủi ro do việc trao đổi không hoàn toàn của
acid malic hay các sản phẩm có mùi lạ hoặc sự hình thành các amin do vi khuẩn lactic
decarboxyl hóa các amino acid. Đặc biệt Pediococcus được coi là yếu tố quan trọng
nhất sinh ra hitsamine. Do đó vang có độ pH cao thúc đẩy sự sinh trưởng của các
giống này trong quá trình lên men malolactic thì chắc chắn chứa lượng hitsamine
không mong muốn.
Biện pháp lên men tự nhiên cũng có những ưu điểm là thuận lợi và không đắt
tiền, nó được áp dụng khá rộng rãi ở Pháp. Nhiều năm kinh nghiệm đã chỉ ra rằng
thành phần vang và điều kiện môi trường đã thúc đẩy sự sinh trưởng của Leuconostoc
oenos có mặt tự nhiên trong vang vùng Bordeaux của Pháp và thông thường lên men
malolactic bắt đầu trong vòng 1 – 4 tuần sau khi lên men rượu kết thúc. Thành phần
và điều kiện đó bao gồm: SO
2
tổng thấp (<40 – 50mg/l); duy trì pH > 3.2 – 3.3; duy
trì nhiệt độ của vang khoảng 16 – 25
0
C. Tuy nhiên những biện pháp để thúc đẩy sự
sinh trưởng của vi khuẩn tự nhiên để lên men malolactic thành công hoàn toàn không
phải luôn luôn xảy ra và các phương pháp khác để thúc đẩy lên men malolactic trở
nên cần thiết.
Như vậy lên men malolactic tự nhiên tuy có những ưu điểm là thuận lợi và rẻ

nhưng nhược điểm cũng rất nhiều đó là khó khởi động, diễn ra rất chậm chạm và khó
kiểm soát được các chủng vi khuẩn tham gia vào quá trình dẫn đến tạo các sản phẩm
phụ không mong muốn. Để khắc phục các nhược điểm này, hiện nay, người ra thường
áp dụng phương pháp chủ động đưa vi khuẩn Leuconostoc oenos thuẩn chủng vào
môi trường để thực hiện lên men malolactic. Việc cấy vi khuẩn có thể diễn trong quá
trình lên men rượu hoặc sau khi hoàn thành quá trình lên men rượu.
1.2.4.2. Lên men một giai đoạn
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT

Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 11 Khoa Hóa học & CNTP
Lên men một giai đoạn có nghĩa là người ta cấy nấm men và vi khuẩn đồng thời
trong quá trình lên men rượu. Phương pháp này có những ưu điểm là vi khuẩn sẽ có
điều kiện sinh trưởng tốt hơn trong môi trường có nồng độ cồn thấp và khi hàm lượng
cồn tăng dần trong suốt quá trình lên men rượu thì vi khuẩn sẽ dần thích nghi được
với môi trường chứa rượu chứ không bị sốc khi đột ngột gặp môi trường có nồng độ
cồn cao. Hơn nữa khi môi trường còn đang giàu chất dinh dưỡng nên thuận lợi cho
sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Nuôi cấy hỗn hợp còn tạo điều kiện cho sự
lên men malolactic xảy ra đồng thời với lên men rượu, nếu lên men maloatic không
xảy ra tức thời thì có thể do tỷ lệ vi khuẩn trong dịch lên men quá ít hoặc do hàm
lượng SO
2
quá cao đã ức chế vi khuẩn.
Nhưng phương pháp này còn có những hạn chế như cạnh tranh nguồn dinh
dưỡng và sự tương tác giữa các chủng vi khuẩn vi sinh vật. Sự chuyển hóa đường của
vi khuẩn lactic để sinh ra acid lactic và acid axetic gây ảnh hưởng đến hiệu suất quá
trình lên men rượu và chất lượng vang. Phương pháp này chỉ nên thực hiện khi các
chủng vi sinh vật đã được lựa chọn kĩ, không tính đối kháng và lượng tế bào cần có
của mỗi chủng đã được xác định.
1.2.4.3. Lên men hai giai đoạn tách riêng
Lên men hai giai đoạn tách riêng là tiến hành lên men rượu và lên men

malolactic riêng biệt. Sau khi lên men rượu bởi nấm men kết thúc, tiến hành lắng gạn
cặn và xác nấm men ra khỏi dịch vang non, sau đó đưa vi khuẩn vào thực hiện giai
đoạn lên men malolactic.
Phương pháp này có rất nhiều những ưu điểm như sau:
‒ Cho phép điều chỉnh dễ dàng các yếu tố môi trường phù hợp cho từng loài.
Điều này giúp có thể rút ngắn thời gian lên men mỗi giai đoạn.
‒ Không ảnh hưởng đến hiệu suất sinh cồn vì nuôi cấy hai chủng ở hai giai
đoạn riêng biệt.
‒ Cuối quá trình lên men do nồng độ đường còn rất thấp nên lúc này vi khuẩn
lactic buộc phải sử dụng các acid hữu cơ làm nguồn cơ chất chính để sinh tồn. pH
dịch lên men sẽ giảm đến mức thích hợp cho việc chuyển hóa acid malic.
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT

Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 14 Khoa Hóa học & CNTP
nuôi cấy giống vi khuẩn này rất khó khăn vì chúng đòi hỏi môi trường nuôi cấy cần
vài chất dinh dưỡng đặc biệt như β-D-glucopyranosyl- D- pantothenic, nguồn acid
béo sử dụng là Tween 80 và chất ức chế nấm men cycloheximide. Người ta có thể
nuôi cấy chúng trong dịch ép cà chua, táo hoặc nho. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu
cho thấy rằng chỉ có một loài của Leuconostoc được tìm thấy và phân lập từ vang
nho, đó là Leuconostoc oenos.
1.2.5.2. Sơ lược về vi khuẩn Leuconostoc oenos
Năm 1995 một số nhà phân loại vi sinh vật học đã đề xuất và thống nhất đặt
chủng Leuconostoc oenos với tên mới là Oenococcus oeni. Cho đến nay, cách phân
loại này được nhiều nhà khoa học chấp nhận và Oenococcus oeni đã trở thành cái tên
chính thức cho loài vi khuẩn này. Leuconostoc oenos có hình cầu dài, nối với nhau
thành chuỗi. Loài này có đặc điểm hoàn toàn khác với những loài vi khuẩn khác thuộc
nhóm này là chúng có thể phát triển ở nồng độ ethanol cao (> 10%) và pH thấp (<4,2).
Qua rất nhiều nghiên cứu người ta thấy rằng vi khuẩn Leuconostoc oenos là loài
có khả năng sinh trưởng mạnh mẽ nhất (chịu đựng và thích nghi tốt nhất trong môi
trường rượu vang). Đồng thời chúng còn có khả năng cải thiện hương và vị làm tăng

chất lượng cho sản phẩm. Các chủng vi khuẩn còn lại tuy vẫn có khả năng chuyển
hóa acid malic, làm giảm vị chua cho rượu vang nhưng chúng không có khả năng
điều chỉnh hương vị, thậm chí có thể là nguyên nhân gây ra các biến đổi không mong
muốn trong giai đoạn tàng trữ và bảo quản sản phẩm. Vì thế, trong công nghiệp sản
xuất rượu vang Leuconostoc oenos là loài mang lại nhiều đặc tính mong muốn nhất
cho chất lượng rượu vang.
a. Đặc tính sinh học [2]
Leuconostoc oenos là một loại liên cầu khẩu Gram dương (Gr
+
) nằm trong hệ
vi khuẩn sinh acid lactic chịu được độ cồn và acid tương đối cao như ở rượu vang và
sâm – panh. Có nhiều loại Leuconostoc nhưng chỉ có Leuconostoc oenos mới có giá
trị ứng dụng trong công nghiệp, đặc biệt là trong công nghiệp sản xuất rượu vang.
Leuconostoc oenos có kích thước nhỏ nhất trong các loại vi khuẩn lactic có
trong rượu vang, đường kính tế bào của chúng thường nhỏ hơn 0.7 micromet.
Đồ án tốt nghiệp Đại học khóa 2010 – 2014 Trường ĐHBRVT

Ngành Công nghệ Kĩ thuật Hóa học 15 Khoa Hóa học & CNTP
Leuconostoc oenos tạo ra các khuẩn lạc rất bé màu trong mờ sau 2 – 3 ngày nuôi cấy
trên môi trường đặc. Các tế bào vi khuẩn có thể đứng riêng lẻ hoặc kết thành chùm
2, 3 tế bào hoặc kết thành chuỗi, các tế bào đều là vi khuẩn Gram dương, không
chuyển động, không sinh bào tử. Leuconostoc oenos thường phát triển thích hợp trên
các môi trường acid nhưng rất khó nuôi cấy trên các môi trường nhân tạo.
Trong cùng loài Leuconostoc oenos khả năng lên men đường của mỗi chủng
cũng khác nhau. Có chủng lên men được hoàn toàn L – arabinoza và D – fructose ở
các pH 4,5,7 nhưng có chủng lại không lên men được L – arabinoza và chỉ lên men
yếu ớt D – fructose. Đối với các loại đường khác thì tác dụng của Leuconostoc oenos
rất yếu hoặc không xác định được. Nhìn chung, người ta sẽ dựa vào khả năng lên mên
D – glucose và sự tạo thành acid D – lactic để phân biệt Leuconostoc với các loài
khác. Trong khi trên môi trường thực nghiệm dùng D – glucose không chứa fructose

và acid malic thì Leuconostoc onenos cần có khoảng thời gian 15 ngày để chuyển hóa
glucose rồi ngừng phát triển còn các loại vi khuẩn lactic khác chỉ cần có 2 ngày mà
thôi. Ở đây lượng acid D – lactic tạo thành so với lượng lactic tổng ở loài Leuconostoc
oenos đạt tỉ lệ 95% trở lên, còn các loài khác chỉ từ 25 – 44%.
Sơ đồ chuyển hóa glucose ở Leuconostoc oenos như sau:
Glucose  Ethanol + acid lactic + CO
2
+ axetat
b. Enzym trong Leuconostoc oenos [2]
Leuconostoc oenos có nhiều loại enzym. Hoạt tính enzym của loài này gần như
hoạt tính enzym của trực khuẩn và cầu khuẩn. Thế nhưng hoạt tính một số loại enzym
của các chủng trong loại Leuconostoc oenos có sự khác nhau khá rõ. Người ta nhận
thấy khoạt lực enzym glucosidaza ở các chủng thuộc loài Leuconostoc oenos đều rất
mạnh, đặc biệt là α – D- galactosidaza, α – D- arabinoza. α và β – D- glucosidaza, β
– D- xylosidaza. Các β- glucpsidaza tác dụng ngược lên trên các cơ chất và thủy phân
các antocyamin có trong nước ép nho hoặc trong vang đỏ. Do vậy vang đỏ thường bị
giảm màu và có sự tích lũy không ổn định glucose và fructose trong quá trình lên men
malolactic. [2], [5]