1
TUYÊN BỐ BẢN QUYỀN


Tài liệu này thuộc loại sách giáo trình nên các nguồn thông tin có thể được
phép dùng nguyên bản hoặc trích dẫn dùng cho các mục đích về đào tạo và tham
khảo.
Mọi mục đích khác mang tính lệch lạc hoặc sử dụng với mục đích kinh
doanh thiếu lành mạnh sẽ bị nghiêm cấm.
Mã tài liệu: MĐ 05


2
LỜI GIỚI THIỆU

Để giúp học viên thành thạo các bước trong quy trình vi nhân giống một
số loại hoa, có cơ hội tìm hiểu và nắm bắt, ứng dụng kiến thức đã học vào thực
tế sản xuất. Chúng tôi biên soạn mo dun vi nhân giống hoa với một số loại hoa
chủ yếu như hoa Lili; hoa Hồng Môn; hoa Lan; hoa Cúc; hoa Đồng Tiền.
Tuỳ theo điều kiện của địa phương và yêu cầu mà học viên có thể lựa
chọn thực hành loại hoa phù hợp.
Mô đun là cơ sở cho các giáo viên soạn bài giảng để giảng dạy, là tài liệu
nghiên cứu và học tập của học viên học nghề “Vi nhân giống hoa”. Các thông
tin trong mô đun có giá trị hướng dẫn giáo viên thiết kế và tổ chức giảng dạy các
bài một cách hợp lý. Giáo viên có thể vận dụng cho phù hợp với điều kiện và bối
cảnh thực tế trong quá trình dạy học.
Trong quá trình biên soạn nội dung mô đun chắc chắn không tránh khỏi
những sai sót, Ban chủ nhiệm và các tác giả mong nhận được nhiều ý kiến đóng
góp của các nhà khoa học, các cán bộ kỹ thuật, các đồng nghiệp để mô đun được
hoàn thiện hơn.
Xin chân thành cảm ơn!

Tham gia biên soạn
1. Trần Văn Dư - chủ biên
2. Kiều Thị Thuyên
3. Nguyễn Thị Thao
4. Nguyễn Quang Thạch



3
MỤC LỤC
LỜI GIỚI THIỆU 2
MỤC LỤC 3
MÔ ĐUN: VI NHÂN GIỐNG MỘT SỐ LOẠI HOA 5
Bài mở đầu: Giới thiệu quy trình vi nhân giống hoa 8
Bài 1: Vi nhân giống hoa đồng tiền 12
1. Chuẩn bị các điều kiện cần thiết cho vi nhân giống hoa đồng tiền 12
1.1. Chuẩn bị trang thiết bị, dụng cụ phục vụ vi nhân giống 12
1.2. Kiểm tra các điều kiện cần thiết trong hệ thống phòng nuôi cấy, nhà
lưới, vườn ươm 13
1.3. Chuẩn bị môi trường để nuôi cấy 15
2. Tiến hành vi nhân giống hoa đồng tiền 16
2.1. Giai đoạn chuẩn bị 17
2.2. Tái sinh mẫu nuôi cấy 17
2.3. Nhân nhanh chồi đồng tiền 18
2.4. Tạo cây hoàn chỉnh. 19
2.5. Ra cây và chăm sóc cây con ngoài vườn ươm 19
Bài 2: Vi nhân giống hoa lan 22
1. Chuẩn bị các điều kiện cần thiết cho vi nhân giống hoa lan 22

1.1. Chuẩn bị trang thiết bị, dụng cụ phục vụ vi nhân giống 22
1.2. Kiểm tra các điều kiện cần thiết trong hệ thống phòng nuôi cấy, nhà
lưới, vườn ươm 23
1.3. Chuẩn bị môi trường để nuôi cấy 25
2. Tiến hành vi nhân giống hoa lan 26
2.1. Giai đoạn chuẩn bị 27
2.2. Tái sinh mẫu nuôi cấy 28
2.3. Giai đoạn nhân nhanh chồi 28
2.4. Tạo cây hoàn chỉnh 28
2.5. Kỹ thuật đưa cây ra vườn ươm 29

4
Bài 3: Vi nhân giống hoa lily 32
1. Chuẩn bị các điều kiện cần thiết cho vi nhân giống hoa lily 32
1.1. Chuẩn bị trang thiết bị, dụng cụ phục vụ vi nhân giống 32
1.2. Kiểm tra các điều kiện cần thiết trong hệ thống phòng nuôi cấy, nhà
lưới, vườn ươm 33
1.3. Chuẩn bị môi trường để nuôi cấy 35
2. Tiến hành vi nhân giống hoa lily 36
2.1. Giai đoạn chuẩn bị 37
2.2. Tái sinh mẫu nuôi cấy 37
2.3. Giai đoạn nhân nhanh chồi 37
2.4. Tạo cây hoàn chỉnh 38
2.5. Giai đoạn đưa cây ra vườn ươm 38
Bài 4: Vi nhân giống hoa hồng môn 41
1. Chuẩn bị các điều kiện cần thiết cho vi nhân giống hoa hồng môn 41
1.1. Chuẩn bị trang thiết bị, dụng cụ phục vụ vi nhân giống 41
1.2. Kiểm tra các điều kiện cần thiết trong hệ thống phòng nuôi cấy, nhà
lưới, vườn ươm 42
1.3. Chuẩn bị môi trường để nuôi cấy 44

2. Tiến hành vi nhân giống hoa hồng môn 45
2.1. Giai đoạn chuẩn bị 46
2.2. Tái sinh mẫu nuôi cấy 46
2.3. Giai đoạn nhân nhanh chồi 47
2.4. Tạo cây hoàn chỉnh 47
2.5. giai đoạn đưa cây ra đất 47
Bài 5: Vi nhân giống hoa cúc 50
1. Chuẩn bị các điều kiện cần thiết cho vi nhân giống hoa cúc 50
1.1. Chuẩn bị trang thiết bị, dụng cụ phục vụ vi nhân giống 50
1.2. Kiểm tra các điều kiện cần thiết trong hệ thống phòng nuôi cấy, nhà
lưới, vườn ươm 51
1.3. Chuẩn bị môi trường để nuôi cấy 53
5
2. Tiến hành vi nhân giống hoa cúc 54
2.1. Giai đoạn chuẩn bị 54
2.2. Tái sinh mẫu nuôi cấy 55
2.3. giai đoạn nhân nhanh chồi 55
2.4. Tạo cây hoàn chỉnh 55
2.5. giai đoạn đưa cây ra đất 55




6
MÔ ĐUN: VI NHÂN GIỐNG MỘT SỐ LOẠI HOA
Mã mô đun: MĐ 05
Giới thiệu mô đun:
Là mô đun cuối của chương trình đào tạo nhằm rèn luyện các kỹ năng
thực hiện các bước công việc vi nhân giống một số loại hoa Mô đun được biên
soạn dưới dạng quy trình Vi nhân giống cho 5 loại cây hoa Thời lượng của mô

đun 96 giờ; lý thuyết 10; thực hành 78; kiểm tra 8 giờ.

Bài mở đầu: Giới thiệu quy trình vi nhân giống hoa
Ở Việt Nam hiện nay, quy trình nuôi cấy mô, tế bào đã được áp dụng rộng
rãi và rất thành công trong nhân giống vô tính các loại hoa có giá trị như: cúc,
cẩm chướng, lily, đồng tiền, hồng môn…và mang lại hiệu quả kinh tế cao cho
các vùng sản xuất hoa chuyên canh vì phương pháp nhân giống này thể hiện
những ưu điểm vượt trội so với các phương pháp nhân giống truyền thống:
+ Đưa ra sản phẩm nhanh.
Theo lý thuyết, một quần thể có độ đồng đều cao có thể tái sinh từ bất kể cây
ưu việt chọn lọc nào. Do đó, người ta có thể chọn lọc một cây có tính trạng
mong muốn để nhân lên thành một số lượng lớn phục vụ cho mục đích thương
mại, cho dù cây đó là dị hợp tử về mặt di truyền. Nhân nhanh: trong một số
trường hợp kỹ thuật này đảm bảo cho tốc độ nhân nhanh giống cây, trong 1 -
2 năm có thể tạo ra hàng triệu cây. Hệ số nhân giống in vitro thường đạt
36 -1012/năm ở các loại cây khác nhau. Như vậy, không có một kỹ thuật
nhân giống vô tính nào khác lại có hệ số nhân giống cao hơn.
Sản phẩm cây giống đồng nhất: về cơ bản nuôi cấy mô là công nghệ nhân
dòng, do đó có thể tạo ra một quần thể có độ đồng đều cao hơn. Tiết kiệm được
không gian: vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng thí nghiệm nên không
có sự ảnh hưởng của thời tiết, các vật liệu khởi đầu có kích thước bé, mật độ cây
tạo nên trên một đơn vị diện tích lớn hơn nhiều so
với sản xuất trên đồng ruộng và trong nhà kính theo phương pháp truyền thống.
+ Tính khả thi rộng
Ví dụ: kỹ thuật giâm cành thì có thể ứng dụng thành công ở một số cây nhất
định, vì kích thướng 5 - 20 cm, khả năng tạo rễ phụ ở vùng mô thượng tầng
7
gần vết cắt hoặc khả năng đánh thức chồi phụ vẫn bị các vùng tế bào lân cận và
phần toàn bộ còn lại của đoạn giâm khống chế. Nếu tiến hành nuôi cây mô với
kích thước 5 - 10 mm thì tương tác giữa các tế bào và các loại mô đơn giản đi rất

nhiều, hiệu quả tác động của các biện pháp nuôi cấy sẽ phải cao hơn.
+ Có tiềm năng công nghiệp hoá cao
Nuôi cấy trong điều kiện chủ động hoàn toàn về môi trường dinh dưỡng,
chế độ chiếu sáng và nhiệt độ là tiền đề hoàn toàn thoát khỏi sự lệ
thuộc mùa vụ vẫn xảy ra trong sản xuất nông nghiệp và có thể công nghiệphoá
hoàn toàn công việc sản xuất giống trong một dây truyền sản xuất liên tục.
+ Nâng cao chất lượng sản phẩm:
Cải tiến kiểu gen của cây có thể được điều chỉnh bằng cách sử dụng các chất
điều tiết sinh trưởng, các kỹ thuật như chuyển nạp gen trong điều kiện nuôi cấy
in vitro. Bằng kỹ thuật này có thể chủ động làm thay đổi kiểu gen thực vật như
mong muốn dễ dàng hơn so với sử lý bằng các chất biến dị vào cây trồng so
với trên đồng ruộng hay trong nhà lưới, nhà kính.
+ Khả năng tiếp thị tốt:
Dạng sản phẩm linh hoạt, lợi thế vận chuyển, sản xuất quanh năm làm tăng
khả năng tiếp thị và kinh doanh của sản phẩm.
Tuy nhiên phương pháp nhân giống hoa này vẫn chưa được ứng dụng trên
quy mô hộ gia đình, giá thành cây giống còn cao do bên cạnh những ưu điểm
đó thì cũng có những nhược điểm mà công nghệ nuôi cây mô, tế bào gặp
phải như: đòi hỏi trình độ kỹ thuật cao, kinh phí đầu tư bước đầu cao, thực hiện
khó khăn đối với một số cây trồng, sản phẩm bị biến đổi kiểu hình.
Quy trình nuôi cấy mô, tế bào gồm 5 giai đoạn sau:
- Giai đoạn 1 : Giai đoạn chuẩn bị
Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giống invitro.
Mục đích của giai đoạn này là phải tạo được nguyên liệu thực vật vô trùng để
đưa vào nuôi cấy. Mẫu đưa từ bên ngoài vào phải đảm bảo các yêu cầu sau: tỷ
lệ nhiễm thấp; tỷ lệ sống cao; tốc độ sinh trưởng nhanh. Kết quả của giai đoạn
này phụ thuộc vào cách lấy mẫu, nồng độ và thời gian xử lý diệt khuẩn. Vật
8
liệu thường được chọn và đưa vào nuôi cấy là : Đỉnh sinh trưởng, chồi nách,
hoa tự, hoa, đoạn thân, mảnh, lá, rễ.

- Giai đoạn 2 : Tái sinh mẫu nuôi cấy
Mục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng sự phát
triển của mô nuôi cấy. Quá trình này được điều khiển chủ yếu bằng các chất
điều hòa sinh trưởng (tỷ lệ auxin/cytokinin) đưa vào môi trường nuôi
cấy.Tuy nhiên bên cạnh đó cũng phải quan tâm đến tuổi của mẫu đem vào nuôi
cấy. Thường các mô non, chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn những mô
đã chuyển hoá.
- Giai đoạn 3 : giai đoạn nhân nhanh chồi
Mục đích của giai đoạn này là tạo hệ số cao nhất. Chính vì thế giai
đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình nuôi cấy. Để tăng hệ số
người ta thường đưa vào môi trường nuôi cấy các chất điều hòa sinh trưởng
(auxin, cytokinin, …), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm
mem,…, kết hợp với các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ thích hợp. Tuỳ thuộc vào đối
tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng cách kích thích sự hình thành
các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay kích thích sự phát triển của các chồi nách
hoặc thông qua việc tạo thành cây từ phôi vô tính.
- Giai đoạn 4 : Tạo cây hoàn chỉnh
Khi đạt được kích thước nhất định các chồi được chuyển sang môi
trường ra rễ. Thường sau 2-3 tuần, các chồi riêng lẻ này sẽ ra rễ và trở thành
cây hoàn chỉnh. Ở giai đoại này người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy các
chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm auxin, là nhóm hormon thực vật quan
trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. Trong nhóm này các chất IAA,
IBA, NAA, 2.4-D được nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất để tạo rễ cho chồi.
- Giai đoạn 5 : giai đoạn đưa cây ra đất
Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình và nó quyết định khả năng
ứng dụng của quá trình nhân giống invitro trong thực tiễn sản xuất. Đây
là giai đoạn chuyển cây từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng hoàn
9
toàn. Do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh thích hợp để cây có thể đạt
tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như trong ruộng sản xuất.

Thực tế, khi áp dụng quy trình để nhân giống hoa, thì sẽ căn cứ vào đặc điểm
của về mô, tế bào của loài hoa cụ thể đó để lựa chọn vật liệu khởi đầu, môi
trường tái sinh, môi trường nhân nhanh, môi trường ra rễ và hỗn hợp tạo giá thể
ra cây tối ưu cho riêng loài hoa cần nhân giống. Đôi khi, cùng một loài hoa
chúng ta có thể áp dụng cùng lúc một số môi trường tối ưu. Dưới đây là quy
trình vi nhân giống áp dụng cho một số loại hoa phổ biến đang được trồng tại
Việt Nam.
10
Bài 1: Vi nhân giống hoa đồng tiền
Mã bài: MĐ 05 - 01
Mục tiêu
- Thành thạo các bước công việc thực hiện trình tự các giai đoạn vi nhân
giống cây hoa đồng tiền theo đúng quy trình
A. Giới thiệu quy trình vi nhân giống hoa đồng tiền



















B. Các bƣớc tiến hành vi nhân giống hoa đồng tiền
1. Chuẩn bị các điều kiện cần thiết cho vi nhân giống hoa đồng tiền
1.1. Chuẩn bị trang thiết bị, dụng cụ phục vụ vi nhân giống
Đây là bước đầu tiên đảm bảo cho quá trình vi nhân giống cây hoa được diễn ra
thuận lợi. Bước này bao gồm chuẩn bị thiết bị, dụng cụ, nguyên liệu và hóa chất.
* Chuẩn bị thiết bị, dụng cụ:
- Nồi autoclave, tủ cấy vô trùng
- Bếp gas (bếp từ hoặc lò vi sóng)
Nụ hoa non
Khử trùng HgCl
2
0,1% 20 phút
Môi trường tái sinh
(MS + 1ppm BAP + 0,2ppm Kinetin + 0,2ppm IAA + 25g/l Đường + 6,5g/l Agar)

Môi trường nhân nhanh
(MS + 1ppm Kinetin + 10% nước dừa + 25g/l Đường + 6,5g/l Agar)

Môi trường ra rễ
(MS + 0,1ppm α - NAA + 25g/l Đường + 6,5g/l Agar)

Vườn ươm
Callus + Chồi
Cụm chồi phát triển
Cây con
Đế hoa
Môi trường tái sinh
Lát mỏng

11
- Nồi nấu môi trường
- Cốc thủy tinh
- Ống đong
- Ống nghiệm, chai thủy tinh
- Đũa thủy tinh
- Cân kỹ thuật
- Máy đo pH, giấy đo pH
- Phễu, giá rót môi trường
- Bông không thấm nước
- Giấy báo, nilon, dây cao su
* Chuẩn bị nguyên liệu:
- Nước cất
- Các chất điều tiết sinh trưởng
- Nước dừa, cà rốt, khoai tây, (cho môi trường nhân giống hoa lan)
- Agar
- Đường glucose (hoặc saccarose)
- Các loại dung dịch mẹ (đa lượng, CaCl
2
, vi lượng, sắt, vitamin)
1.2. Kiểm tra các điều kiện cần thiết trong hệ thống phòng nuôi cấy, nhà
lƣới, vƣờn ƣơm
Trước khi tiến hành các thao tác pha chế môi trường và vi nhân giống cây hoa
yêu cầu: Phòng cấy, tủ cấy, dụng cụ cấy phải được khử trùng nhằm hạn chế sự
xâm nhiễm nguồn tạp nhiễm vào mẫu cấy trong quá trình vi nhân giống.
* Phòng cấy: phải luôn sạch sẽ vì vậy cần:
- Quét dọn lau sạch sàn, xung quanh tường bằng nước sạch (có thể xông formol
để khử trùng trước đó vài ngày)
12
- Bật quạt thông gió, điều hòa

* Tủ cấy:
- Dùng bông thấm cồn lau sạch bên trong, bên ngoài tủ
- Phủ màn tối kín tủ
- Bật đèn tử ngoại, quạt trong thời gian từ 15-30 phút
- Lấy mà che khỏi tủ
- Tắt đèn tử ngoại đợi sau thời gian 15-30 phút mới thực hiện các thao tác bên
trong tủ cấy.
Lưu ý khi sử dụng đèn tử ngoại:
- Trong thời gian bật đèn tử ngoại không được làm việc trong phòng
- Không được nhìn trực tiếp vào đèn khi đang bật
- Bật, tắt đèn theo đúng thời gian quy định mới được vào phòng làm việc
* Dụng cụ cấy: các dụng cụ sử dụng trong vi nhân giống hoa (Bình tam giác,
kéo, dao cấy các loại, ) được bao gói và khử trùng khô ở nhiệt độ 160-170
0
C
trong 1,5-2 giờ hoặc hấp khử trùng hơi nước trong nồi autoclave, dụng cụ sau
khử trùng phải để vào vị trí sạch sẽ nếu chưa sử dụng ngay.
Trước khi tiến hành ra cây vườn ươm cần xác định, kiểm tra các điều kiện
cần thiết của vươn ươm: mức độ cứng trắc của khung nhà lưới, khả năng điều
chỉnh ánh sáng của vật liệu làm mái che; ô, khoảnh được phân chia phải thuận
tiện cho việc chăm sóc cây mầm, đặc biệt là hệ thống cung cấp nước cho vườn
ươm hay nhà lưới có thể vận hành thử để tránh những rủi ro, tổn thất lớn có thể
xảy ra.
Kiểm tra số lượng, chất lượng các chất tham gia phối trộn làm giá thể ra cây
(đất, mùn, phân bón, cát, trấu hun, …)
Khi sử dụng thuốc phòng trừ sâu bệnh nhớ đọc kỹ hướng dẫn sử dụng trước khi
dùng, phải tuân theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
13
1.3. Chuẩn bị môi trƣờng để nuôi cấy
Quá trình vi nhân giống hoa thường sử dụng 3 loại môi trường chính là:

- Môi trường tái sinh
- Môi trường nhân nhanh
- Môi trường tạo cây hoàn chỉnh (môi trường ra rễ)
Các loại môi trường này chủ yếu khác nhau về thành phần, hàm lượng các chất
điều tiết sinh trưởng, phương pháp pha chế đều tuân thủ theo các bước sau đây:
Bước 1: Kiểm tra lại các dụng cụ, nguyên liệu
Bước 2: Căn cứ vào công thức của môi trường và thể tích cần pha tính toán toán
thể tích các dung dịch mẹ, agar, đường, chất điều tiết sinh trưởng, các phụ gia
khác
Bước 3: Đong chính xác các dung dịch mẹ vào ống đong, lên thể tích bằng nước
cất
Bước 4: Trộn hỗn hợp các dung dịch
- Đun nóng hỗn hợp đã lên thể tích trong nồi pha chế môi trường
- Khuấy tan đường
- Khuấy cho agar hòa tan
- Bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng theo công thức pha chế
Bước 5: Phân phối môi trường vào ống nghiệm hoặc chai thủy tinh
- Rót hỗn hợp môi trường vào cốc có miệng để dễ đổ vào ống nghiệm, chai
- Dùng phễu phân phối nhanh môi trường và các ống nghiệm: lượng môi trường
chiếm khoảng 1/7 ống nghiệm (tương đương khoảng 3-4ml/một ống nghiệm),
đối với chai thủy tinh từ 10-15ml nếu đổ vào ống nghiệm thì phễu được cố định
trên một giá đỡ.
Lưu ý:
- Thao tác cần nhanh gọn để hạn chế sự đông thạch
14
- Khi phân môi trường hạn chế môi trường dính trên miệng ống nghiệm, nếu bị
dính phải lau sạch.
Bước 6. Làm nút bông cho các ống nghiệm, chai thủy tinh đã có môi trường.
- Lấy một lượng bông vừa đủ sao cho nút bông sau khi làm xong không quá chặt
hay quá lỏng, phần nút bông trong ống nghiệm, chai thủy tinh tròn đều, phần

ngoài không bị xơ, kích thước nút bông bên trong ống nghiệm từ 3-4cm, kích
thước bên ngoài 2-3cm
Bước 7: Chuyển các ống nghiệm hoặc bình thủy tinh có môi trường vào nồi khử
trùng
Bước 8: Khử trùng môi trường
Các ống, chai môi trường sau khi đã được làm nút bông xong được đưa vào nồi
hấp khử trùng. Mục đích để tiêu diệt hoàn toàn các nguồn nhiễm tạp trong môi
trường, môi trường sau khi hấp khử trùng xong phải đảm bảo vô trùng tuyệt đối
và không làm giảm chất lượng môi trường.
Chế độ hấp khử trùng: thiết bị khử trùng thường áp dụng là nồi hấp autoclave ở
nhiệt độ 121
0
C trong 30 phút. Sau khi quá trình hấp thanh trùng kết thúc, lắc đều
môi trường trước khi để cố định tại một vị trí sạch sẽ.
2. Tiến hành vi nhân giống hoa đồng tiền
Hoa đồng tiền có thể nhân giống bằng các phương pháp là: phương pháp
hữu tính (nhân giống bằng hạt) và phương pháp nhân giống vô tính
(nhân giống bằng tách cây, cắm cành, nuôi cây mô tế bào). Các vùng trồng
hoa đồng tiền chủ yếu sử dụng giống từ nuôi cấy mô do sinh trưởng và
phát tiển khỏe, ít sâu bệnh và năng suất thu hái cao. Quy trình nhân giống hoa
đồng tiền gồm những giai đoạn chính sau:
15
2.1. Giai đoạn chuẩn bị
Nguồn mô ban đầu để tạo nguyên liệu
khởi đầu cho quá trình nuôi cấy trong ống
nghiệm là các đế hoa đồng tiền non. Mẫu nuôi
cấy nên được lấy ngoài đồng ruộng vào buổi
sáng của những ngày nắng, ít gió. Cắt lấy nụ có
đường kính khoảng 1cm của các cây đồng tiền
sinh trưởng và phát tiển khỏe, không bị nhiễm sâu bệnh, có kiểu hình phù hợp

với mục đích nhân giống. Nên lấy các nụ ở trên cao, không bị bám bùn đất hay
hóa chất. Sau đó lấy bông thấm muối rửa sạch, đưa vào tủ nuôi cấy mô đã vô
trùng. Nụ hoa đã rửa sạch cho vào dung dịch chlorua thuỷ ngân 0,1% tiêu độc
trong 20 phút, lấy ra dùng nước sạch rửa 3-4 lần. Lưu ý, toàn bộ các thao tác
khử trùng được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Mỗi loại hóa chất khử trùng có
tác dụng tiêu diệt đối với những loại vi sinh vật (nấm, khuẩn) khác nhau. Tác
dụng của mỗi loại hóa chất đối với vi sinh vật tùy thuộc vào nồng độ và thời
gian khử trùng bằng hóa chất đó. Vì vậy, việc lựa chọn loại hóa chất, nồng
độ và thời gian khử trùng bằng hóa chất đó cũng là rất quan trọng. Nó quyết
định đến sự thành công hay thất bại trong công tác khử trùng. Để giảm thiểu
lượng mẫu bị chết trong quá trình khử trùng có thể kết hợp Javen và HgCl
2
để
khử trùng kép nụ hoa theo đó nước Javen 1/8 sử dụng trong 10 phút, rửa bằng
nước cất vô trùng 2 lần rồi khử trùng tiếp lần 2 bằng dung dịch HgCl2 0,1%
trong 7 phút, rửa sạch mẫu bằng nước vô trùng 3 lần. HgCl
2
là hóa chất rất độc
nên phải chú ý đảm bảo an toàn trong và sau quá trình khử trùng.
Dùng panh và dao bóc vẩy, cắt bỏ tất cả hoa nhỏ, giữ lấy đế hoa, cắt đế hoa
thành từng miếng nhỏ vuông 2 - 3mm đưa vào môi trường tái sinh.
2.2. Tái sinh mẫu nuôi cấy
Môi trường tái sinh tối ưu có thể là:
- MS + 1ppm BAP + 0,2 ppm Kinetin+0,2ppm IAA + 25g/l Saccaroza + 6,5
g/l Agar
- MS + 4 mg/l BA + 0,2 mg/l NAA + 0,2 mg/l IAA
16
- MS + 0,2 mg/l TDZ + 0,1 mg/l NAA + 50 g/l đường + 6 g/l agar
- MS + 1,5 mg/l 2,4D + 30 g/l saccarose + 6,5 g/l agar
Tùy loại hóa chất phòng thí nghiệm sẵn có chúng ta có thể sử dụng một trong

các môi trường tái sinh nói trên. Nuôi cấy ở 24 ± 20
0
C, cường độ chiếu sáng
2.000 - 3.000lux. Mỗi ngày chiếu sáng 12 - 16 giờ.
Sau 8-10 tuần trên môi trường tái sinh các mẫu nuôi cấy sẽ hình thành chồi hay
callus. Để tăng cường nguồn mẫu ban đầu phục vụ cho quá trình nhân
nhanh tiếp theo chúng ta sẽ áp dụng phương pháp nuôi cây lát mỏng tế bào.
Lớp mỏng các giống được cắt với kích thước 0,5-0,7mm lấy từ những mẫu
đồng tiền rồi cấy trên môi trường tái sinh tối ưu: MS + 1ppm BAP + 0,2 ppm
Kinetin+0,2ppm IAA + 2,5% Saccaroza + 6,5 g Agar/l. Cấy 5 - 7 lát/bình
nuôi cấy. Sau 6 - 7 tuần nuôi cấy ta sẽ thu được lượng mẫu tăng 5 - 7 lần
so với dùng phương pháp nhân chồi thông thường.
2.3. Nhân nhanh chồi đồng tiền
Sau 4 tuần thân mầm được tách từ cụm chồi, loại bỏ các lá úa và phần callus còn
bám vào và chuyển sang môi trường nhân nhanh.
Các môi trường tối ưu sử dụng cho quá trình nhân nhanh:
- MS + 1 ppm Kinetin + 10% nước dừa + 2,5% Saccaroza + 6,5 g/l Agar
- MS + 1,5 mg/l BAP + 10% nước rừa + 1mg/l B1 + 50 g/l đường + 3 g/l agar
- MS + 1,5 mg/l BAP + 15% nước dừa + 30 g/l saccarose + 6,5 g/l agar
- MS + 5mg/l KT + 1 mg/l IAA
Các mẫu nuôi cấy sau một số lần nhân nhanh thì khả năng đẻ chồi tăng lên
nhưng chất lượng chồi giảm đi rất mạnh thể hiện là số chồi rất nhiều
nhưng chồi rất nhỏ, yếu, khả năng ra rễ kém khi ra vườn ươm tỷ lệ chết rất
cao. Chính vì vậy mà cần phải có quá trình vào mẫu liên tục để thay thế, các
mẫu qua cấy chuyển 8 - 10 lần. Các mẫu sau cấy chuyển 5-6 lần thì nên giảm
nồng độ chất điều tiết sinh trưởng 50%. Cụ thể là sau 6 lần cấy chuyển môi
trường tối ưu để tiếp tục cấy chuyển là:
MS + 0,5 ppm Kinetin+10% nước dừa+ 25g/l Saccaroza + 6,5 g/l Agar
17
Trên môi trường nhân này ta tiếp tục nhân các mẫu thêm 4 - 5 lần nữa rồi

chuyển toàn bộ mẫu cấy sang môi trường dinh dưỡng không có chất điều tiết
sinh trưởng cụ thể là
MS + 10% nước dừa+ 25g/l Saccaroza + 6,5 g Agar/l
2.4. Tạo cây hoàn chỉnh.
Chồi sau 4-5 lần cấy ta chọn lấy những chồi khỏe mạnh cao khoảng 2 cm, có từ
3 - 5 lá đủ tiêu chuẩn cắt, cấy sang môi trường tạo rễ rồi loại bỏ toàn bộ mẫu đó
thay thế bằng loạt mẫu mới.
Môi trường tốt nhất để tạo rễ cho chồi hoa đồng tiền là :
- MS + 0,1ppm NAA + 2,5% đường Saccaroza + 6,5g Agar/l
sau khoảng 4 tuần sẽ ra rễ dài 2 - 3cm.

2.5. Ra cây và chăm sóc cây con ngoài vƣờn ƣơm
Trước khi đưa cây con ra trồng
ngoài tự nhiên, người ta thường
tiến hành huấn luyện để cây
quen dần với điều kiện môi
trường bên ngoài. Thời gian này
có thể kéo dài khoảng 7 ngày và
tăng dần cường độ vào những
ngày cuối để tăng nhanh khả
năng thích nghi của cây. Cây
con trong bình cấy được rửa sạch những phần thạch hoặc đường bám vào vì
chúng thường là môi trường thích hợp cho nấm bệnh phát triển hoặc côn
trùng tấn công. Tiếp đó ngâm cây vào nước để tránh hiện tượng mất nước, rồi
đem trồng vào giá thể gồm:1 phần mùn cưa, 1 phần than bùn, 1 phần vụn đá
xốp hoặc hỗn hợp đất, cát, trấu và phân vi sinh Sông Gianh được trộn theo tỷ lệ
1:1:1:1/4 rồi dùng lưới cản quang che nắng, che mưa.
- Chế độ chăm sóc cây con trong giá thể: trong thời gian cây ở trong giá thể, giữ
ẩm độ giá thể khoảng 75 - 85%. Ở nơi độ ẩm không khí cao mỗi ngày phun
Hoa đồng tiền nuôi cấy mô sinh trƣởng trên giá thể trong

vƣờn ƣơm
18
nước 1 lần, 1 tuần phun dung dịch dinh dưỡng 1 lần, sau 2-3 tuần cây sẽ
sống, tăng dần cường độ chiếu sáng, chăm sóc 5 - 6 tuần có thể đưa ra trồng
ngoài ruộng. Ở nơi khô hạn cần tăng cường phun mù để nâng cao tỷ lệ cây sống.
C. Bài tập và sản phẩm thực hành của học viên
Bài tập 1: Thực hành pha chế các loại môi trường vi nhân giống cho đồng tiền
- Cách thức: chia các nhóm nhỏ (5 – 10 học viên/nhóm), mỗi nhóm nhận
nhiệm vụ pha chế một loại môi trường vi nhân giống cho đồng tiền
- Thời gian hoàn thành: 3 giờ/1 nhóm
- Hình thức trình bày: thực hành tại chỗ
- Phương pháp đánh giá: kỹ năng vận dụng lý thuyết vào thực hành của
mỗi học viên trong nhóm và thái độ thực hành của học viên.
- Kết quả sản phẩm cần đạt được:
+ Pha chế được môi trường vi nhân giống cho đồng tiền theo đúng quy
trình
+ Môi trường sau khi pha chế đủ tiêu chuẩn để sử dụng
Bài tập 2: Thực hành nuôi cấy khởi đầu hoa đồng tiền?
- Cách thức: chia các nhóm nhỏ (5 – 10 học viên/nhóm), mỗi nhóm nhận
nhiệm vụ nuôi cấy khởi đầu cho 5 đế hoa non
- Thời gian hoàn thành: 3 giờ/1 nhóm
- Hình thức trình bày: thực hành tại chỗ
- Phương pháp đánh giá: kỹ năng vận dụng lý thuyết vào thực hành của
mỗi học viên trong nhóm và thái độ thực hành của học viên.
- Kết quả cần đạt được:
+ Chọn được đế hoa đạt tiêu chuẩn để nuôi cấy
+ Thực hiện nuôi cấy khởi đầu đúng với quy trình
+ Mẫu sau khi cấy đảm bảo tỷ lệ sống và tỷ lệ vô trùng
Bài tập 3: Thực hành nhân nhanh chồi hoa đồng tiền?
- Cách thức: chia các nhóm nhỏ (5 – 10 học viên/nhóm), mỗi nhóm nhận

nhiệm vụ cấy chuyền, nhân nhanh 5 bình mẫu
- Thời gian hoàn thành: 3 giờ/1 nhóm
- Hình thức trình bày: thực hành tại chỗ
- Phương pháp đánh giá: kỹ năng vận dụng lý thuyết vào thực hành của
mỗi học viên trong nhóm và thái độ thực hành của học viên.
- Kết quả cần đạt được:
+ Chọn được bình mẫu đạt tiêu chuẩn để nhân nhanh
+ Thực hiện nhân nhanh chồi đúng với quy trình
19
+ Mẫu sau khi cấy đảm bảo hệ số nhân, chất lượng chồi, tỷ lệ sống và tỷ
lệ vô trùng
Bài tập 4: Thực hành tạo cây hoàn chỉnh cho chồi hoa đồng tiền nuôi cấy?
- Cách thức: chia các nhóm nhỏ (5 – 10 học viên/nhóm), mỗi nhóm nhận
nhiệm vụ tạo cây hoàn chỉnh cho 5 bình chồi mẫu
- Thời gian hoàn thành: 3 giờ/1 nhóm
- Hình thức trình bày: thực hành tại chỗ
- Phương pháp đánh giá: kỹ năng vận dụng lý thuyết vào thực hành của
mỗi học viên trong nhóm và thái độ thực hành của học viên.
- Kết quả cần đạt được:
+ Chọn được bình mẫu đạt tiêu chuẩn
+ Thực hiện tạo cây hoàn chỉnh đúng với quy trình
+ Mẫu sau khi cấy đảm bảo tỷ lệ ra rễ, số lượng rễ, chất lượng rễ, tỷ lệ
sống và tỷ lệ vô trùng
Bài tập 5: Thực hành ra cây và chăm sóc mầm hoa đồng tiền tại vườn ươm?
- Cách thức: chia các nhóm nhỏ (5 – 10 học viên/nhóm), mỗi nhóm nhận
nhiệm vụ ra cây và chăm sóc cho 5 bình đồng tiền đã có cây hoàn chỉnh
- Thời gian hoàn thành: 3 giờ/1 nhóm
- Hình thức trình bày: thực hành tại chỗ
- Phương pháp đánh giá: kỹ năng vận dụng lý thuyết vào thực hành của
mỗi học viên trong nhóm và thái độ thực hành của học viên.

- Kết quả cần đạt được:
+ Chọn được bình cây hoàn chỉnh đạt yêu cầu ra cây
+ Thực hiện ra cây và chăm sóc cây mầm ở vườn ươm đúng với quy trình
+ Cây mầm sau khi ra cây đảm bảo tỷ lệ sống và chất lượng cây con xuất vườn
D. Ghi nhớ: Cần chú ý một số nội dung trọng tâm:
- Môi trường vi nhân giống hoa đồng tiền
- Quy trình vi nhân giống hoa đồng tiền.
20
Bài 2: Vi nhân giống hoa lan
Mã bài: MĐ 05 – 02
Mục tiêu
- Thành thạo các bước công việc thực hiện trình tự các giai đoạn vi nhân
giống cây hoa lan theo đúng quy trình
A. Giới thiệu quy trình vi nhân giống hoa lan





B. Các bƣớc tiến hành vi nhân giống hoa lan
1. Chuẩn bị các điều kiện cần thiết cho vi nhân giống hoa lan
1.1. Chuẩn bị trang thiết bị, dụng cụ phục vụ vi nhân giống
Đây là bước đầu tiên đảm bảo cho quá trình vi nhân giống cây hoa được diễn ra
thuận lợi. Bước này bao gồm chuẩn bị thiết bị, dụng cụ, nguyên liệu và hóa chất.
* Chuẩn bị thiết bị, dụng cụ:
- Nồi autoclave, tủ cấy vô trùng
- Bếp gas (bếp từ hoặc lò vi sóng)
21
- Nồi nấu môi trường
- Cốc thủy tinh

- Ống đong
- Ống nghiệm, chai thủy tinh
- Đũa thủy tinh
- Cân kỹ thuật
- Máy đo pH, giấy đo pH
- Phễu, giá rót môi trường
- Bông không thấm nước
- Giấy báo, nilon, dây cao su
* Chuẩn bị nguyên liệu:
- Nước cất
- Các chất điều tiết sinh trưởng
- Nước dừa, cà rốt, khoai tây, (cho môi trường nhân giống hoa lan)
- Agar
- Đường glucose (hoặc saccarose)
- Các loại dung dịch mẹ (đa lượng, CaCl
2
, vi lượng, sắt, vitamin)
1.2. Kiểm tra các điều kiện cần thiết trong hệ thống phòng nuôi cấy, nhà
lƣới, vƣờn ƣơm
Trước khi tiến hành các thao tác pha chế môi trường và vi nhân giống cây hoa
yêu cầu: Phòng cấy, tủ cấy, dụng cụ cấy phải được khử trùng nhằm hạn chế sự
xâm nhiễm nguồn tạp nhiễm vào mẫu cấy trong quá trình vi nhân giống.
* Phòng cấy: phải luôn sạch sẽ vì vậy cần:
- Quét dọn lau sạch sàn, xung quanh tường bằng nước sạch (có thể xông formol
để khử trùng trước đó vài ngày)
22
- Bật quạt thông gió, điều hòa
* Tủ cấy:
- Dùng bông thấm cồn lau sạch bên trong, bên ngoài tủ
- Phủ màn tối kín tủ

- Bật đèn tử ngoại, quạt trong thời gian từ 15-30 phút
- Lấy mà che khỏi tủ
- Tắt đèn tử ngoại đợi sau thời gian 15-30 phút mới thực hiện các thao tác bên
trong tủ cấy.
Lưu ý khi sử dụng đèn tử ngoại:
- Trong thời gian bật đèn tử ngoại không được làm việc trong phòng
- Không được nhìn trực tiếp vào đèn khi đang bật
- Bật, tắt đèn theo đúng thời gian quy định mới được vào phòng làm việc
* Dụng cụ cấy: các dụng cụ sử dụng trong vi nhân giống hoa (Bình tam giác,
kéo, dao cấy các loại, ) được bao gói và khử trùng khô ở nhiệt độ 160-170
0
C
trong 1,5-2 giờ hoặc hấp khử trùng hơi nước trong nồi autoclave, dụng cụ sau
khử trùng phải để vào vị trí sạch sẽ nếu chưa sử dụng ngay.
Trước khi tiến hành ra cây vườn ươm cần xác định, kiểm tra các điều kiện
cần thiết của vươn ươm: mức độ cứng trắc của khung nhà lưới, khả năng điều
chỉnh ánh sáng của vật liệu làm mái che; ô, khoảnh được phân chia phải thuận
tiện cho việc chăm sóc cây mầm, đặc biệt là hệ thống cung cấp nước cho vườn
ươm hay nhà lưới có thể vận hành thử để tránh những rủi ro, tổn thất lớn có thể
xảy ra.
Kiểm tra số lượng, chất lượng các chất tham gia phối trộn làm giá thể ra cây
(đất, mùn, phân bón, cát, trấu hun, …)
Khi sử dụng thuốc phòng trừ sâu bệnh nhớ đọc kỹ hướng dẫn sử dụng trước khi
dùng, phải tuân theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
23
1.3. Chuẩn bị môi trƣờng để nuôi cấy
Quá trình vi nhân giống hoa thường sử dụng 3 loại môi trường chính là:
- Môi trường tái sinh
- Môi trường nhân nhanh
- Môi trường tạo cây hoàn chỉnh (môi trường ra rễ)

Các loại môi trường này chủ yếu khác nhau về thành phần, hàm lượng các chất
điều tiết sinh trưởng, phương pháp pha chế đều tuân thủ theo các bước sau đây:
Bước 1: Kiểm tra lại các dụng cụ, nguyên liệu
Bước 2: Căn cứ vào công thức của môi trường và thể tích cần pha tính toán toán
thể tích các dung dịch mẹ, agar, đường, chất điều tiết sinh trưởng, các phụ gia
khác
Bước 3: Đong chính xác các dung dịch mẹ vào ống đong, lên thể tích bằng nước
cất
Bước 4: Trộn hỗn hợp các dung dịch
- Đun nóng hỗn hợp đã lên thể tích trong nồi pha chế môi trường
- Khuấy tan đường
- Khuấy cho agar hòa tan
- Bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng theo công thức pha chế
Bước 5: Phân phối môi trường vào ống nghiệm hoặc chai thủy tinh
- Rót hỗn hợp môi trường vào cốc có miệng để dễ đổ vào ống nghiệm, chai
- Dùng phễu phân phối nhanh môi trường và các ống nghiệm: lượng môi trường
chiếm khoảng 1/7 ống nghiệm (tương đương khoảng 3-4ml/một ống nghiệm),
đối với chai thủy tinh từ 10-15ml nếu đổ vào ống nghiệm thì phễu được cố định
trên một giá đỡ.
Lưu ý:
- Thao tác cần nhanh gọn để hạn chế sự đông thạch
24
- Khi phân môi trường hạn chế môi trường dính trên miệng ống nghiệm, nếu bị
dính phải lau sạch.
Bước 6. Làm nút bông cho các ống nghiệm, chai thủy tinh đã có môi trường.
- Lấy một lượng bông vừa đủ sao cho nút bông sau khi làm xong không quá chặt
hay quá lỏng, phần nút bông trong ống nghiệm, chai thủy tinh tròn đều, phần
ngoài không bị xơ, kích thước nút bông bên trong ống nghiệm từ 3-4cm, kích
thước bên ngoài 2-3cm
Bước 7: Chuyển các ống nghiệm hoặc bình thủy tinh có môi trường vào nồi khử

trùng
Bước 8: Khử trùng môi trường
Các ống, chai môi trường sau khi đã được làm nút bông xong được đưa vào nồi
hấp khử trùng. Mục đích để tiêu diệt hoàn toàn các nguồn nhiễm tạp trong môi
trường, môi trường sau khi hấp khử trùng xong phải đảm bảo vô trùng tuyệt đối
và không làm giảm chất lượng môi trường.
Chế độ hấp khử trùng: thiết bị khử trùng thường áp dụng là nồi hấp autoclave ở
nhiệt độ 121
0
C trong 30 phút. Sau khi quá trình hấp thanh trùng kết thúc, lắc đều
môi trường trước khi để cố định tại một vị trí sạch sẽ.
2. Tiến hành vi nhân giống hoa lan
Lan là loại hoa vương giả, với vẻ đẹp vương giả, quý phái nên khắp nơi trên thế
giới ngày càng có nhiều người thích chơi hoa Lan. Chính vì vậy, hoa Lan là sản
phẩm trồng trọt luôn có giá trị kinh tế cao. Bắt kịp thị hiếu này, ngày nay đã xuất
hiện nhiều cơ sở kinh doanh hoa Lan với nhiều chủng loại, giá cả khác nhau. Do
đó, việc nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô in-vitro tạo ra hàng loạt cây con
ổn định về mặt di truyền và đáp ứng giá cả phải chăng là vô cùng hữu ích. Quy
trình cơ bản nhân giống Lan bằng phương pháp nuôi cấy mô in-vitro được được
tiến hành qua các giai đoạn sau:
2.1. Giai đoạn chuẩn bị
25
Nguồn mô để tạo nguyên liệu khởi đầu
cho vi nhân giống hoa lan là đỉnh sinh
trưởng của mầm chồi bên.
+ Cách lấy mẫu:
Mẫu được lấy vào buổi sáng các ngày
nắng, ít gió của mùa xuân hay đầu mùa
hè - thời điểm cây sinh trưởng và phát
triển mạnh nhất trong năm. Tách các vảy hành ra từ cây lan khỏe mạnh, không

bị nhiễm sâu bệnh, bám bùn đất hay hóa chất, bóc lần lượt các lá già cho đến khi
xuất hiện các mầm chồi bên mang đỉnh sinh trưởng. Ngoài ra, sử dụng cơ quan
nuôi cấy là mắt ngủ của cành hoa và hạt đều cho hiệu quả nuôi cấy cao.
+ Phương pháp khử trùng:
Cắt bỏ gốc của mỗi mầm, sau đó khử trùng bằng cách ngâm trong cồn 70
0
trong
30 giây, rửa sạch bằng nước cất vô trùng ngâm trong dung dịch Ca(OCl)2 2%
trong 25 phút, việc khử trùng được tiến hành trong tủ cấy. Mô được rửa lại với
nước cất vô trùng 4 - 5 lần.Mỗi mầm được đặt trong đĩa petri vô trùng và cẩn
thận tách các lá non. Sau mỗi lần tách, nhúng mầm vào cồn 70
0
trong 1 giây và
rửa với nước cất vô trùng. Chuyển sang một đĩa petri vô trùng khác, tách các lá
mầm bằng dao nhọn vô trùng. Dùng kìm nhọn tách các lớp lá, cắt đỉnh sinh
trưởng ra khỏi mô và cấy vào môi trường tái sinh. Nếu mẫu nuôi cấy là mắt ngủ
của cành hoa và hạt, chế độ khử trùng mẫu cây tốt nhất là khử trùng bằng dung
dịch HgCl2 0,1% với các khoảng thời gian tối ưu trong 10 phút. Tỷ lệ sống đạt
25,1%.
Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình vi nhân giống lan.
Mục đích của giai đoạn này là phải tạo được nguyên liệu ban đầu vô trùng để
đưa vào nuôi cấy. Mẫu đỉnh sinh trưởng sau quá trình khử trùng phải đảm bảo
các yêu cầu sau: tỷ lệ nhiễm thấp; tỷ lệ sống cao; tốc độ sinh trưởng nhanh.
2.2. Tái sinh mẫu nuôi cấy
Mục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng sự phát
triển của mô nuôi cấy. Quá trình này được điều khiển chủ yếu bằng các chất