1
TUYÊN BỐ BẢN QUYỀN


Tài liệu này thuộc loại sách giáo trình nên các nguồn thông tin có thể được
phép dùng nguyên bản hoặc trích dẫn dùng cho các mục đích về đào tạo và tham
khảo.
Mọi mục đích khác mang tính lệch lạc hoặc sử dụng với mục đích kinh
doanh thiếu lành mạnh sẽ bị nghiêm cấm.
Mã tài liệu: MĐ 02


2
LỜI GIỚI THIỆU
Pha chế dung dịch và chuẩn bị môi trường là bước rất quan trọng, ảnh
hưởng đến chất lượng sản phẩm vi nhân giống hoa. Modun Pha chế dung dịch
và chuẩn bị môi trường vi nhân giống nhằm trang bị cho học viên những kiến
thức và kỹ năng cơ bản:
- Trình bày được phương pháp xác định các hóa chất, xác định được danh
mục các hóa chất phù hợp và trình bày được phương pháp pha chế và bảo quản
dung dịch mẹ, môi trường vi nhân giống.
- Lựa chọn, pha chế và bảo quản được dung dịch, môi trường vi nhân giống hoa
Để đạt được mục tiêu của mô đun, với thời lượng 90 tiết, nội dung được
chúng tôi biên soạn bao gồm 03 bài:
- Bài 1: Xác định loại hóa chất dùng cho vi nhân giống
- Bài 2: Pha chế và bảo quản dung dịch mẹ.
- Bài 3: Pha chế và bảo quản môi trường vi nhân giống
Modun là cơ sở cho các giáo viên soạn bài giảng để giảng dạy, là tài liệu
nghiên cứu và học tập của học viên học nghề “Vi nhân giống hoa”. Các thông
tin trong modun có giá trị hướng dẫn giáo viên thiết kế và tổ chức giảng dạy các
bài một cách hợp lý. Giáo viên có thể vận dụng cho phù hợp với điều kiện và bối

cảnh thực tế trong quá trình dạy học.
Trong quá trình biên soạn nội dung modun chắc chắn không tránh khỏi
những sai sót, Ban chủ nhiệm và các tác giả mong nhận được nhiều ý kiến đóng
góp của các nhà khoa học, các cán bộ kỹ thuật, các đồng nghiệp để modun được
hoàn thiện hơn.
Xin chân thành cảm ơn!
Tham gia biên soạn
1. Trần Văn Dư - chủ biên
2. Kiều Thị Thuyên
3. Nguyễn Thị Thao
4. Nguyễn Quang Thạch
3
MỤC LỤC

LỜI GIỚI THIỆU 2
MỤC LỤC 3
MÔ ĐUN: PHA CHẾ D.DỊCH VÀ CHUẨN BỊ MT CHO VI NHÂN GIỐNG . 6
Bài 1. Xác định loại hóa chất dùng trong vi nhân giống 9
1. Các loại hoá chất cần dùng trong vi nhân giống. 9
2. Phân loại hóa chất: 10
2.1. Nhóm hóa chất khử trừng 10
2.2. Nhóm các nguyên tố tạo môi trường dinh dưỡng 11
2.3. Các chất bổ sung khác 11
2.4. Nhóm hóa chất làm đông cứng môi trường 11
3 . Vai trò đặc tính lý, hoá học và sinh học của các hoá chất dùng trong
vi nhân giống. 12
3.1. Nguyên tố đa lượng. 12
3.2. Nguyên tố vi lượng 12
3.3. Các vitamin 13
3.4. Nguồn các bon: 13

3.5. Các chất điều hoà sinh trưởng 13
3.6. Các chất bổ sung khác: 15
3.7. Chất làm đông cứng môi trường: 15
4. Danh mục các chất cho nuôi cấy cần dùng trong vi nhân giống. 16
Bài 2. Pha chế và bảo quản dung dịch mẹ 19
1. Pha chế bảo quản hoá chất. 19
2. Pha chế và bảo quản dung dịch mẹ. 20
2.1. Pha chế và bảo quản nguyên tố đa lượng. 20
2.2. Pha chế và bảo quản vi lượng 21
2.3. Pha chế và bảo quản vitamin 21
2.4. Pha chế và bảo quản chất điều hoà sinh trưởng. 22

Bài 3. Pha chế và bảo quản môi trường nuôi cấy 25
1. Pha chế môi trường nuôi cấy: 25
1.1. Chuẩn bị vật tư và dụng cụ để pha chế môi trường: 25
4
1.2. Các bước thực hiện pha chế môi trường 25
1.3. Pha chế một số loại môi trường nuôi cấy cụ thể 27
2. Khử trùng môi trường 28
3. Bảo quản môi trường 28



5
CÁC THUẬT NGỮ CHUYÊN MÔN, CHƯ
̃
VIÊ
́
T TĂ
́

T

MS
Môi trường Murashige & Skoog
VW
Vacin & Went
B5
Môi trường Gamborg B5 Medium
WP
Môi trường McCown Woody Plant Medium
IBA
3 –Indol butyric axit
IAA
Indo acetic axit
NAA
Napthyl acetic axit
Kinetin
6 – Furfuryl aminopurine- C
10
H
9
NO
5

BAP
6- benzyl amino purine
Zip
Izopentenyl adenin
GA3
Gibberellic axit 3








6
MÔ ĐUN: PHA CHẾ DUNG DỊCH VÀ CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG
CHO VI NHÂN GIỐNG
Mã mô đun: MĐ 02
Giới thiệu mô đun:
Mô đun nhằm trang bị cho học viên những kiến thức và kỹ năng xác định,
pha chế, bảo quản hóa chất và môi trường dùng trong nghề Vi nhân giống hoa.
Thời lượng của mô đun 90 giờ; lý thuyết 16; thực hành 66; kiểm tra 8 giờ.
Bài 1. Xác định loại hóa chất dùng trong vi nhân giống
Mã bài: MĐ 02 – 01

Giới thiệu:
Bài học này trang bị cho học viên về danh mục, tính chất và tác dụng của
các hóa chất dùng trong vi nhân giống.
Mục tiêu:
 Trình bày được vai trò, đặc tính lý, hóa học của từng loại hóa chất dùng
trong vi nhân giống
 Nhận biết được các hóa chất và phân theo nhóm: Nguyên tố đa lượng, Vi
lượng; Vitamin; Axit amin; Chất điều tiết sinh trưởng; Chất khử trùng;
Các chất sung khác
 Liệt kê được các loại hóa chất cần dùng trong vi nhân giống
A. Nội dung chính:
1. Các loại hoá chất cần dùng trong vi nhân giống.

Trong quá trình vi nhân giống môi trường nuôi cấy được xem là vấn đề
quyết định sự thành bại của quá trình nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy cung cấp
các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng trưởng và phân hoá trong suốt quá
trình nuôi cấy. Môi trường vi nhân giống tuy rất đa dạng nhưng đều gồm một số
thành phần cơ bản sau:
- Các muối khoáng đa lượng và vi lượng.
- Các vitamin
- Nguồn các bon: Một số loại đường
- Các chất điều hoà sinh trưởng
- Các chất bổ sung khác
- Chất làm thay đổi trạng thái môi trường: Các loại thạch
7




Hình 2.1: Một số loại hóa chất dùng trong vi nhân giống

2. Phân loại hóa chất:
Nhìn chung khó có thể phân loại một cách rõ ràng vì mỗi loại hóa chất
được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau nhưng có thể phân loại một cách
tương đối như sau:

2.1. Nhóm hóa chất khử trừng
Sự phát triển của nấm, vi khuẩn rất bất lợi cho quá trình vi nhân giống. Vì
vậy, mẫu cấy cần được khử trùng trước khi vào mẫu để tiến hành vi nhân giống. Một
số hóa chất khử trùng phổ biến:
2.1.1. Cồn
Cồn dùng để khử trùng mẫu cấy là loại cồn 70%. Cồn thương phẩm bán trên
thị trường thường là cồn 96%, nên khi sử dụng cần pha cồn từ 96%-70%.

8
Ngoài ra, cồn còn được dùng nhiều để vệ sinh tay, dụng cụ cấy…trong khi
tiến hành vi nhân giống.

2.1.2. Các hóa chất khử trùng khác
Các hóa chất khử trùng khác thường được sử dụng như: H
2
O
2
, NaClO,
Ca(ClO)
2
, HgCl
2
…
Các hóa chất này thường được dùng để khử trùng các loại mẫu cấy ở giai
đoạn vào mẫu(giai đoạn nuôi cấy khởi động).

2.2. Nhóm các nguyên tố tạo môi trường dinh dưỡng
Là nhóm các nguyên tố cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết
cho cây trong quá trình vi nhân giống.
- Nguồn cacbon: Các loại đường: Saccaroza, glucoza…
- Nhóm các nguyên tố đa lượng: Gồm 6 nguyên tố: Mg, Ca, P, S, N, K
- Nhóm các nguyên tố vi lượng: Gồm các nguyên tố: Fe, B, Cl, Cu, Mn, Mo,
Zn…
- Các Vitamin
- Nhóm chất điều tiết sinh trưởng
- Nhóm các chất auxin
- Nhóm các chất cytokinin
2.3. Các chất bổ sung khác

Dung dịch hữu cơ có thành phần không xác định như nước dừa, dịch chiết
nấm men được bổ sung vào môi trường…

2.4. Nhóm hóa chất làm đông cứng môi trường

Đối với nuôi cấy tĩnh nếu sử dụng môi trường lỏng, mô có thể bị chìm và
chết vì thiếu oxi. Để tránh tình trạng này môi trường nuôi cấy được làm đặc lại
bằng thạch agar ( một loại Polysacharid của tảo).

9
3 .Vai trò đặc tính lý, hoá học và sinh học của các hoá chất dùng trong vi
nhân giống.
3.1. Nguyên tố đa lượng.
Các nguyên tố đa lượng gồm 6 nguyên tố, Mg, Ca, P, N, S và K là cần
thiết và thay đổi tuỳ vào đối tượng nuôi cấy. Nhìn chung nhu cầu của thực vật
với các nguyên tố này ở nồng độ > 0,5 mM. Nguyên tố đa lượng có nồng độ cao
nhất trong các môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật.
Các nguyên tố đa lượng có chức năng cung cấp nguyên liệu để mô hoặc tế
bào thực vật xây dựng thành phần cấu trúc và chức năng trong sinh tổng hợp
protein( Như N và S), tổng hợp Nucleotit (như P, N, S), tổng hợp thành tế
bào(Ca) hoặc giúp cho quá trình trao đổi chất giữa tế bào thực vật với môi
trường được thuận lợi

Hình 2.2: Một số hóa chất thuộc nhóm đa lượng
3.2. Nguyên tố vi lượng
Nhóm các nguyên tố vi lượng gồm: Fe, Mn, Zn, Cu, Mo, Co, B, I, Ni, Cl,
Al bào chúng đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzim. Các
10
nguyên tố này được sử dụng ở nồng độ thấp (nồng độ < 0,5 mM) để bảo đảm sự
sinh trưởng và phát triển bình thường của cây.

3.3. Các vitamin
Tất cả các tế bào được nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại
vitamin cơ bản nhưng thường là với số lượng dưới mức yêu cầu. để mô có sức
sinh trưởng tốt phải bổ sung vào môi trường một hay nhiều loại vitamin. Các
vitamin là rất cần thiết cho các phản ứng sinh hoá.
Các vitamin sau đây được sử dụng phổ biến: inositol, thiamin HCl (B1),
pyridoxine HCl (B6), nicotinic axit trong đó vitamin B1 là không thể thiếu và
được sử dụng trong hầu hết các môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật.
Inositol thường được nói đến như một vitamin kích thích một cách tích
cực đối với sự sinh trưởng và phát triển của thực vật, mặc dù nó không phải là
vitamin cần thiết trong mọi trường hợp. Các vitamin khác đặc biệt là nicotinic
axit (B3), canxi pantothenate (B5) và biotin cũng được sử dụng để nâng cao sức
sinh trưởng của mô nuôi cấy. Ảnh hưởng của vitamin lên sự phát triển của tế
bào nuôi cấy in vitro ở các loài khác nhau nhau là khác nhau thậm chí nó còn có
thể gây hại.
3.4. Nguồn các bon:
Trong nuôi cấy mô, các tế bào chưa có khả năng quang hợp để tổng hợp
nên chất hữu cơ nên người ta phải đưa vào môi trường một lượng hợp chất
cacbon nhất định để cung cấp năng lượng cho tế bào và mô. Nguồn các bon ở
đây là các loại đường khoảng 20 – 30mg/l có tác dụng giúp đỡ mô tế bào thực
vật tổng hợp các chất hữu cơ, giúp tế bào tăng sinh khối, ngoài ra nó còn có vai
trò là chất thẩm thấu chính của môi trường. Người ta thường sử dụng hai loại
đường: Saccarose và glucoze.
3.5. Các chất điều hoà sinh trưởng.
Các phytohormon là những chất có tác dụng điều hoà sinh trưởng và phát
triển của thực vật. Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và
phát triển của thực vật như: Phân chia, biệt hoá tế bào Ngoài ra nó còn ảnh
hưởng đến quá trình lão hoá mô và nhiều quá trình khác. Các phytohormon có
thể chia thành 5 nhóm: Auxin, Cytokinin, Giberilin, Ethylen, Abscisic Axit.
11

Chúng là yếu tố rất quan trọng trong môi trường quyết định sự thành công của
kết quả nuôi cấy.
3.5.1. Nhóm các chất auxin
Nhóm này gồm có các chất chính là: IBA (3 –Indol butyric axit), IAA
(Indo acetic axit), NAA (Napthyl acetic axit) trong nuôi cấy mô thực vật
auxin thường được sử dụng để kích thích sự phân chia tế bào, biệt hoá rễ, hình
thành mô sẹo, kìm hãm sự phát triển chồi và tạo ra các rễ phụ.
3.5.2. Cytokinin.
Cytokinin được bổ sung vào môi trường chủ yếu để kích thích sự phân
chia tế bào và quyết định sự phân hoá chồi bất định từ mô sẹo và cơ quan. Các
hợp chất thường sử dụng là: Kinetin (6 – Furfuryl aminopurine- C
10
H
9
NO
5
),
BAP (6- benzyl amino purine), Zip (Izopentenyl adenin), Zeatin. Trong các chất
này thì kinitin và BAP được sử dụng phổ biến nhất vì chúng có hoạt tính cao mà
giá thành rẻ. Tuỳ vào từng hệ mô và mục đích nuôi cấy mà cytokinin được sử
dụng ở các nồng độ khác nhau. ở nồng độ thấp (10
-7
-10
-6
M) chúng có tác dụng
kích thích sự phân hoá tế bào, ở nồng độ 10
-6
-10
-5
M chúng kích thích sự phân

hoá chồi. Trong nuôi cấy mô để kích thích sự nhân nhanh người ta thường sử
dụng cytokinin với nồng độ 10
-6
-10
-4
M.
3.5.3. Giberellin
Nhóm này có khoảng 50 loại hormone khác nhau nhưng quan trọng nhất
là GA3 (Gibberellic axit 3). GA 3 có tác dụng kích thích nảy mầm của các loại
hạt khác nhau, kéo dài các lóng đốt thân cành. Bên cạch đó GA3 còn có tác
dụng phá ngủ các phôi , ức chế tạo rễ phụ, cũng như tạo chồi phụ. Ngoài ra nó
còn ảnh hưởng đến sự ra hoa của một số thực vật và có tác dụng rut ngắn thời
gian sinh trưởng sinh dưỡng của cây.
3.5.4. Abscisic Axit (ABA): Là chất ức chế sinh trưởng trong tự nhiên nhưng
vẫn được dùng trong nuôi cấy in vitro. ABA có ảnh hưởng âm tính đến mô nuôi
cấy in vitro. Khi ABA tương tác với BAP cho hệ số nhân chồi cao hơn khi dùng
BAP riêng rẽ.
3.5.5. Ethylen: có biểu hiện tác động hai chiều nó kìm hãm sự hình thành chồi ở
giai đoạn sớm nhưng lại kích thích phát triển chồi ở giai đoạn muộn. Trong một
12
số trường hợp ethylen có tác dụng kích thích hình thành rễ nhưng trong một số
trường hợp nó lại kìm hãm quá trình này.
3.6. Các chất bổ sung khác:
Dung dịch hữu cơ có thành phần không xác định như nước dừa, dịch
chiết nấm men được bổ sung vào môi trường có tác dụng kích thích sinh
trưởng mô sẹo và các cơ quan khác. Nước dừa được sử dụng vào nuôi cấy in
vitro từ năm 1941 và được ứng dụng khá rộng rãi trong các môi trường nhân
nhanh in vitro. Trong nước dừa thường chứa các axit amin, axit hữu cơ, đường,
ARN và AND. Đặc biệt trong nước dừa còn có chứa những hợp chất quan trọng
cho nuôi cấy mô đó là: Myo – inositol, các hợp chất có hoạt tính auxin, các

Gluxit của Cytokinin.
3.7. Chất làm đông cứng môi trường:
Đối với nuôi cấy tĩnh nếu sử dụng môi trường lỏng, mô có thể bị chìm và
chết vì thiếu oxi. Để tránh tình trạng này môi trường nuôi cấy được làm đặc lại
bằng thạch agar ( một loại Polysacharid của tảo) và mô được nuôi cấy trên bề
mặt của môi trường. Nồng độ agar trong môi trường dao động trong khoảng 6 -
10 g/ l tuỳ theo mục đích nuôi cấy.


Hình 2.3: Một số hóa chất vi lượng, chất điều tiết sinh trưởng
13
4. Danh mục các chất cho nuôi cấy cần dùng trong vi nhân giống.
Danh mục hoá chất cần dùng để pha chế một số môi trường
nuôi cấy mô tế bào thực vật phổ biến.
Thành phần
MS(1)
VW(2)
B5(3)
WP(4)
ĐA LƯợng
KNO
3

1900,00
525
2500

NH
4
NO

3

1650,00


400
MgSO
4
.7H
2
O
370
200
250
370
KH
2
PO
4

170
250

170
CaCl
2
.2H
2
O
440


150
96
(NH
4
)
2
SO
4


500
134

Ca(NO
3
)
2
.4H
2
O



556
K
2
SO
4





990
NaH
2
PO
4


250
150

Vi Lượng
KI
0,83

0,75

H
3
BO
3

6,2

0,75
6,2
MnSO
4

.4H
2
O
23,2
7,5
10

MnSO
4
.H
2
O



22,3
ZnSO
4
.7H
2
O
8,6

2
8,6
CuSO
4
.5H
2
O

0,025

0,025
0,025
CoCl
2
. 6H
2
O
0,025

0,025
0,025
Na
2
MoO
4
.2H
2
0;
0,25

0.25
0,25
FeSO
4
.7H
2
O
27,8




Na
2
EDTA.2H
2
O
37,3



Sodiumferric
EDTA

28

30
Vitamin và axit amin
Myo – inositol
100

100
100
pyridoxine HCl
0.5

1

Glycine

2
3


Nicotin axit
0,5

1

Thiamin HCl
0,1

10

Sucrose(g/l)
30
20
20
20
14
Chú thích: 1- Môi trường Murashige & Skoog
2- Vacin & Went
3- Môi trường Gamborg B5 Medium.
4- Môi trường McCown Woody Plant Medium

- Nguồn cacsbon bổ sung: Thường dùng là đường Sucrose, glucozơ.
- Các chất hữu cơ khác: Myo – inositol, pyridoxine HCl; IAA; Glycine; Nicotin
axit; thiamin HCl; Kinitin; Edamine.
- Chất làm đông cứng môi trường: agar


B. Bài tập và sản phẩm thực hành của học viên
Bài tập 1: Xác định các nhóm hóa chất dùng trong vi nhân giống? Cho biết vai
trò của các nhóm hóa chất trên?
- Cách thức: mỗi học viên được yêu cầu xác định đúng nhóm cho 1 hóa
chất và vai trò của nhóm hóa chất đó
- Thời gian hoàn thành: 5 phút/1 học viên
- Hình thức trình bày: vấn đáp
- Phương pháp đánh giá: đánh giá trên cơ sở lý thuyết
- Kết quả sản phẩm cần đạt được: Xác định đúng tên nhóm và vai trò của
nhóm hóa chất đó trong môi trường vi nhân giống hoa.
Bài tập 2: Thực hành xác định chủng loại và số lượng hóa chất cần dùng để pha
chế một số môi trường vi nhân giống phổ biến?
- Cách thức: chia các nhóm nhỏ (7 – 10 học viên/nhóm), mỗi nhóm nhận
nhiệm vụ xác định hóa chất cho một loại môi trường
- Thời gian hoàn thành: 1 giờ/1 nhóm
- Hình thức trình bày: thực hành tại chỗ
- Phương pháp đánh giá: kỹ năng vận dụng lý thuyết vào thực hành của
mỗi học viên trong nhóm và thái độ thực hành của học viên.
- Kết quả cần đạt được:
+ Chọn chính xác loại hóa chất theo danh mục,
+ Thực hiện thứ tự các bước lựa chọn theo quy trình,
+ An toàn đối với con người và môi trường làm việc
C. Ghi nhớ: Cần chú ý một số nội dung trọng tâm:
- Vai trò của các nhóm hóa chất
- Danh mục hóa chất cần dùng cho một số môi trường vi nhân giống phổ biến.



15




16
Bài 2. Pha chế và bảo quản dung dịch mẹ
Mã bài: MĐ 02 - 02
Giới thiệu:
Bài học này giúp cho học viên có thể xác định được các loại hóa chất,
pha chế và bảo quản được dung dịch mẹ.

Mục tiêu của bài:
 Trình bày được cách pha chế và bảo quản từng loại hóa chất
 Trình bày được cách pha chế và bảo quản dung dịch mẹ.
 Pha chế và bảo quản được các loại hóa chất theo đúng quy trình
 Pha chế và bảo quản được dung dịch mẹ theo đúng quy trình
A.Nội dung của bài:

1. Pha chế bảo quản hoá chất.
Để pha được dung dịch mẹ ta cần xác định được thành phần của môi
trường nuôi cấy. Đối với việc vi nhân giống thực vật thường sử dụng môi trường
chung là môi trường MS.
Thành phần môi trường MS ( Murashige & Skoog, 1962)
Các nguyên tố đa lượng: (Nồng độ (mg/l)
KNO
3
1900,00
NH
4
NO
3
1650,00

CaCl
2
. H
2
O 440,00
MgSO
4
.7H
2
O 370,00
KH
2
PO
4
170,00
Các nguyên tố vi lượng:
FeSO
4
.7H
2
O 27,8
Na
2
EDTA. 2H
2
O 37.2
KI 0,83
H
3
BO

3
6,2
MnSO
4
.4H
2
O 22,3
ZnSO
4
.7H
2
O 6,8
CuSO
4
.5H
2
O 0,025
CoCl
2
. 6H
2
O 0,025
Na
2
MoO
4
.2H
2
0; 0,025
17

Các vitamin
Myo – inositol 100,00
pyridoxine HCl 0,50
Glycine 2,00
Nicotin axit 0,50
Thiamin HCl 0,10
Các chất khác:
IAA 1- 30mg/l
Kinitin 0,04 -10
Edamine 1,00
Sucrose 30000
Agar 6500 - 10000
- Để pha các chất vi lượng, đa lượng, vitamin thì pha bằng dung dịch
nước cất hai lần.
- Các hoá chất được bảo quản nơi khô ráo, sạch sẽ
2. Pha chế và bảo quản dung dịch mẹ.

Để tiến hành pha môi trường nuôi cấy được nhanh chóng chính xác và tiện
lợi thì trước khi pha môi trường nuôi cấy người ta tiến hành phân chia hoá chất
để pha các dung dịch mẹ.
2.1. Pha chế và bảo quản nguyên tố đa lượng.
Stt
Thành phần
Khối lượng cho 1l
môi trường(mg/l)
Khối lượng cho
1l dd mẹ (mg/l)
Lượng lấy cho 1 l
môi trường(ml/l)
1

KNO
3

1900,00
19000
100
2
NH
4
NO
3

1650,00
16500
100
3
MgSO
4
.7H
2
O
370
3700
100
4
KH
2
PO
4


170
1700
100
5
CaCl
2

440
4400
100


Cách bảo quản dung dịch đa lượng: để bảo quản ở nhiệt độ từ 4 – 6
0
C.

18
2.2. Pha chế và bảo quản vi lượng
Các chất vi lượng được pha làm hai dung dịch mẹ là dung dịch vi lượng
và dung dịch sắt.

Stt
Thành phần
Khối lượng cho
1l môi trường
(mg/l)
Khối lượng
cho 1l dd
mẹ (mg/l)
Lượng lấy cho

1 l môi
trường(ml/l)
1
Dung dịch vi
lượng




KI
0,83
116
5

H
3
BO
3

6,2
1240
5

MnSO
4
.4H
2
O
22,3
4460

5

ZnSO
4
.7H
2
O
6,8
1360
5

CuSO
4
.5H
2
O
0,025
5
5

CoCl
2
. 6H
2
O
0,025
5
5

Na

2
MoO
4
.2H
2
0;
0,025
5
5
2
Dung dịch sắt




FeSO
4
.7H
2
O
27,8
5560
5

Na
2
EDTA.2H
2
O
37,2

7440
5

Chú ý: Vì FeSO
4
.7H
2
O khó tan nên khi pha phải pha trong nước ấm,
khuấy tan mới cho Na
2
EDTA.2H
2
O vào rồi chuẩn thể tích. Sau khi pha thấy
dung dịch có mầu vàng rơm là được.
- Cách bảo quản dung dịch vi lượng: để bảo quản ở nhiệt độ từ 4 – 6
0
C. Riêng
dung dịch sắt phải bảo quản trong bình tối hoặc bọc bình bằng túi bóng đen để
dung dịch không bị phân huỷ

2.3. Pha chế và bảo quản vitamin

Thành phần
Khối lượng cho
1l môi
trường(mg/l)
Khối lượng cho
500ml dd mẹ
(mg/l)
Lượng lấy cho

1l môi
trường(ml/l)
Myo – inositol
100,00
1000
5
pyridoxine HCl
0,50
50
5
19
Glycine
2,00
200
5
Nicotin axit
0,50
50
5
Thiamin HCl
0,10
100
5

Cách bảo quản dung dịch vitamin : để bảo quản ở nhiệt độ từ 4 – 6
0
C.
2.4. Pha chế và bảo quản chất điều hoà sinh trưởng.

chất kích thích

sinh trưởng
Cách pha dung dịch mẹ
BAP
Hoà 50mg trong 5 ml HCl 0,1 N rồi cho thêm nước cất hai lần
để được thể tích cuối cùng là 50ml
IAA
Hoà 50mg trong 5 ml NaOH 0,1 N rồi thêm nước cất hai lần
để được thể tích cuối cùng là 50ml
Kinitin
Hoà 50mg trong 10 ml NaOH 0,1 N rồi thêm nước cất hai lần
để được thể tích cuối cùng là 50ml
NAA
Hoà 50mg trong 5 ml NaOH 0,1 N rồi thêm nước cất hai lần
để được thể tích cuối cùng là 50ml
IBA
Hoà 50mg trong 5 ml NaOH 0,1 N rồi thêm nước cất hai lần
để được thể tích cuối cùng là 50ml

Cách bảo quản chất điều hoà sinh trưởng : để bảo quản ở nhiệt độ từ 4 – 6
0
C.
Chú ý khi tiến hành pha các dung dịch MS trên:
- Cân hóa chất trong bảng trên với số lượng đã ghi và trình tự tiến hành
theo thứ tự hóa chất đã ghi ở bảng trên.
- Với hoá chất cân với số lượng có đơn vị (g) thì có thể dùng cân kỹ thuật,
đối với đơn vị mg phải dùng cân phân tích.
- Khi pha dung dịch mẹ thì chúng ta chỉ pha với lượng vừa phải và tránh
hiện tượng kết tủa giữa các hoá chất trong cùng một dung dịch MS. Mỗi dung
dịch MS nên để trong một lọ đựng dung dịch riêng rẽ và được bảo quản trong tủ
lạnh ở ngăn 4

0
C để tránh hỏng hóa chất.
- Phải đánh tan từng hoá chất 1 trong các cốc thuỷ tinh nhỏ với 1 lượng
nước vừa đủ sau đó tráng lại kỹ( với tổng cộng lượng nước phải không lớn hơn
tổng thể tích MS cần thiết, ở đây là <=200ml)
20
- Riêng đối với dung dịch sắt phải cho vào trong lọ thủy tinh màu hoặc
bọc giấy hoặc nilon đen để bảo quản.
- Ghi nhãn dán trên thành bình hoá chất gồm tên nhóm pha, ngày pha,
nồng độ, tên hóa chất.
B. Bài tập và sản phẩm thực hành của học viên
Bài tập 1: Thực hành pha chế dung dịch mẹ cho MS?
- Cách thức: chia các nhóm nhỏ (5 – 7 học viên/nhóm), mỗi nhóm nhận
nhiệm vụ pha chế một loại dung dịch mẹ
- Thời gian hoàn thành: 2 giờ/1 nhóm
- Hình thức trình bày: thực hành tại chỗ
- Phương pháp đánh giá: kỹ năng vận dụng lý thuyết vào thực hành của
mỗi học viên trong nhóm và thái độ thực hành của học viên.
- Kết quả cần đạt được:
+ Chọn chính xác loại hóa chất để pha chế
+ Cân chính xác khối lượng hóa chất cần dùng
+ Thực hiện thứ tự các bước pha chế đúng theo quy trình,
+ An toàn đối với con người và môi trường làm việc
+ Dung dịch mẹ sau pha chế đạt yêu cầu cho sử dụng.
Bài tập 2: Thực hành pha chế các loại chất điều tiết sinh trưởng?
- Cách thức: chia các nhóm nhỏ (5 – 7 học viên/nhóm), mỗi nhóm nhận
nhiệm vụ pha chế một loại chất điều tiết sinh trưởng
- Thời gian hoàn thành: 2 giờ/1 nhóm
- Hình thức trình bày: thực hành tại chỗ
- Phương pháp đánh giá: kỹ năng vận dụng lý thuyết vào thực hành của

mỗi học viên trong nhóm và thái độ thực hành của học viên.
- Kết quả cần đạt được:
+ Chọn chính xác loại hóa chất để pha chế
+ Cân chính xác khối lượng hóa chất cần dùng
+ Thực hiện thứ tự các bước pha chế đúng theo quy trình,
+ An toàn đối với con người và môi trường làm việc
+ Dung dịch chất điều tiết sinh trưởng sau pha chế đạt yêu cầu cho sử dụng.
21
C. Ghi nhớ: Cần chú ý một số nội dung trọng tâm:
- Pha chế và bảo quản các loại dung dịch mẹ
- Pha chế và bảo quản một số chất điều tiết sinh trưởng phổ biến
22

Bài 3. Pha chế và bảo quản môi trường nuôi cấy
Mã bài: MĐ 02 - 03
Giới thiệu:
Bài học này giúp cho học viên xác định và pha chế được loại môi trường
dùng trong các giai đoạn vi nhân giống.

Mục tiêu của bài:
 Liệt kê được danh mục hóa chất dùng pha chế một số môi trường nuôi cấy
phổ biến (tên hóa chất, nồng độ và liều lượng)
 Trình bày được công thức, cách pha chế, khử trùng và bảo quản 3 loại
môi trường nuôi cấy
 Pha chế được 3 loại môi trường nuôi cấy theo công thức có sẵn
 Khử trùng và bảo quản được các loại môi trường dùng trong nuôi cấy theo
đúng quy trình
A.Nội dung của bài:
1. Pha chế môi trường nuôi cấy:
1.1. Chuẩn bị vật tư và dụng cụ để pha chế môi trường:

- Nước cất
- Chuẩn bị các loại dung dịch mẹ, một số chất bổ sung khác như: đường, agar,
Myo-inositol
- Các chất điều tiết sinh trưởng
- Vật liệu nuôi cấy như: Bình, ống nghiệm, nút giấy, nút bông sạch (đó sấy, hấp)
- Bếp điện, nồi nấu, ống đong, pipét các loại, cân phân tích, cân kỹ thuật
- Máy đo PH và các hoá chất điều chỉnh PH (HCl, NaOH)
* Yêu cầu: đầy đủ, sạch sẽ; các thiết bị phải đang ở tỡnh trạng hoạt động tốt
1.2. Các bước thực hiện pha chế môi trường
1.2.1- Xác định loại và lượng môi trường nuôi cấy cần pha chế
Ví dụ: Pha chế 2 lít môi trường nhân nhanh cây hoa cúc
1.2.2- Tính toán lượng dung dịch mẹ cần lấy cho thể tích môi trường cần pha
căn cứ vào nồng độ dung dịch mẹ
23
Ví dụ:
Tên dung dịch
mẹ
Nồng độ cho 1lít
MT
Lượng cần lấy cho 2L
MT
Đa lượng
Vi lượng
Vitamin
Sắt
100ml/l
5ml/l
5ml/l
5ml/l
200ml

10ml
10ml
10ml

1.2.3- Các hóa chất bổ sung khác

Ví dụ: Với môi trường MS
- Đường: 20 - 30 g/l
- Agar: 6,2 – 6,5 g/l
- Myo-inositol: 100 mg/l
1.2.4- Hút lần lượt các loại dung dịch mẹ vào một ống đong
(Sau khi hút chú ý để riêng tránh hút 2 lần hay bỏ sót một loại dung dịch
mẹ nào đó)
1.2.5- Tiến hành lên thể tích bằng nước cất tới đúng thể tích cần pha
(có thể để lại một phần thể tích nước để hoà tan agar)
1.2.6- Đun nóng dung dịch
(hay nước cất ) để hoà tan agar, đường
1.2.7- Bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng nếu có
1.2.8- Tiến hành đo và điều chỉnh PH cho môi trường

- PH thích hợp trong khoảng: 5,7 – 6,0
- PH<5,7 điều chỉnh bằng kiềm (NaOH)
- PH>6,0 điều chỉnh bằng axit (HCl)
Chú ý:
Cho từ từ từng giọt kiềm hay axit vào điều chỉnh và nên điều chỉnh theo
một chiều
1.2.9. Tiến hành đổ môi trường: môi trường được đổ vào bỡnh hoặc ống
nghiệm sạch với lượng vừa đủ, đậy nắp để chuẩn bị hấp khử trựng
24
1.3. Pha chế một số loại môi trường nuôi cấy cụ thể


- Căn cứ vào mục đích nuôi cấy người ta phân thành 3 loại môi trường sau: +
Môi trường nuôi cấy khởi đầu
+ Môi trường nhân nhanh
+ Môi trường tạo cây hoàn chỉnh (môi trường ra rễ)
Các loại môi trường này khác biệt chủ yếu ở loại và liều lượng các chất điều tiết
sinh trưởng bổ sung vào môi trường cơ bản.
Ví dụ: 3 loại môi trường nuôi cấy Cẩm chướng là:
+ Môi trường vào mẫu: MS
+ Môi trường nhân nhanh: MS + 0,5 mg/l BA
+ Môi trường tạo rễ: MS + 0,25 mg/l NAA + 5 g/l than hoạt tính
1.3.1. Pha chế môi trường nuôi cấy khởi đầu:
Môi trường nuôi cấy khởi đầu thường để tạo chồi, tạo củ, tạo callus
+ Yêu cầu: pha chế theo đúng nguyên lý pha chế mụi trường nói chung, thường
đổ môi trường vào ống nghiệm để tiết kiệm và hạn chế tỉ lệ mẫu nhiễm
+ Môi trường để tạo chồi: MTCB (môi trường cơ bản)
MTCB + Nồng độ thấp Cytokinin
+ Mt để tạo callus: MTCB + cytokinin + auxin
Vớ dụ hoa lyly: MS + 1 mg/l 2,4D + 0,1 mg/l BA
+ Mt để tạo củ: MTCB + auxin
tạo củ layơn, lyly: MS + 1mg/l IAA (hoặc IBA)
1.3.2. Pha chế môi trường nhân nhanh:
- Môi trường kích thích mô nuôi cấy phát sinh hỡnh thỏi và tăng nhanh số lượng
thông qua các con đường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô
tính
- Môi trường chung: MTCB + cytokinin
- Nghiên cứu để đưa ra nồng độ chất cytokinin (BA, Kinetin, Zeatin, …) thích
hợp nhất .
Với hoa cỳc: MS + 0,5 mg/l BA
- Để tăng hệ số nhân và chất lượng cây con sau nuôi cấy người ta thường bổ

sung vào môi trường nhân nhanh một số hợp chất dinh dưỡng như: nước dừa,
dịch nghiền khoai tây, cà rốt, chuối, pepton, …

25
1.3.3. Pha chế môi trường tạo cây hoàn chỉnh:
- Thường được bổ sung một lượng nhỏ auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ
ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường
không chứa chất điều tiết sinh trưởng
- Cụng thức chung: MTCB + auxin (IBA, IAA, NAA, 2,4D)
- Nên bổ sung các chất làm tối môi trường như than hoạt tính
- Nên đổ với lượng ít để tiết kiệm và thuận lợi khi ra cấy

2. Khử trùng môi trường
- Thao tác bắt buộc khi chuẩn bị môi trường nuôi cấy đảm bảo môi trường là vô
trùng hoàn toàn
- Các bước thực hiện:
+ Xác định số lượng môi trường cần khử trùng để tính toán số lần hấp, lượng
hấp trong một lần cũng như thời gian để hấp hết môi trường.
+ Xác định đúng chế độ hấp: áp suất, nhiệt độ, thời gian thường là 1,4atm,
121
0
C, 20 phút
+ Vận hành nồi khử trùng: đo, đọc các thông số trên thiết bị; kiểm tra nước, thời
điểm xả, xếp vào và tháo rỡ môi trường
+ Vận chuyển môi trường từ nồi khử trùng vào buồng nuôi cấy

3. Bảo quản môi trường
- Tính từ khi hấp xong đến khi cấy mẫu
- Hạn chế để môi trường quá lâu (dưới 15 ngày)
- Bảo quản nơi sạch sẽ, độ ẩm thấp, nhiệt độ thích hợp, thường xuyên kiểm tra

chất lượng môi trường, nếu không đạt phải có kế hoạch pha lại
- Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng môi trường: Chế độ hấp trước đó, các
điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, vệ sinh, …