Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
***


NGUYỄN CẨM HÀ



NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC SQUALENE TỪ MỘT SỐ
CHỦNG VI TẢO BIỂN PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC





Hà Nội, năm 2014

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
***


Nguyễn Cẩm Hà

NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC SQUALENE TỪ MỘT SỐ
CHỦNG VI TẢO BIỂN PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM


Chuyên ngành: Hóa sinh thực nghiệm
Mã số : 60.42.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC


NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. Đặng Diễm Hồng



Hà Nội, năm 2014

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này, Tôi xin bày tỏ lòng
kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Đặng Diễm Hồng – Trưởng phòng
Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi đều kiện, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi
hoàn thành luận văn này.
Tôi mong muốn gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Ban Lãnh đạo Viện Công
nghệ sinh học, Ban Lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Ban giám hiệu
Trường Đại học Thái Nguyên, cùng các thầy cô giáo tham gia giảng dạy đã tạo mọi

điều kiện giúp đỡ, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập và
nghiên cứu.
Bên cạnh đó, tôi cũng đã nhận được sự ủng hộ nhiệt tình và các ý kiến đóng
góp quý báu của tất cả các Anh/Chị và các Bạn đồng nghiệp của Phòng Công nghệ
Tảo. Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn mọi sự giúp đỡ quý báu đó.
Cuối cùng tôi xin được gửi lời cảm ơn đến người Mẹ của tôi, đến gia đình
người thân cũng như Bạn bè đã luôn ở bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ và tạo
điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận
văn của mình.
Hà Nội, ngày tháng năm 2014
Học viên cao học


Nguyễn Cẩm Hà


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn
toàn trung thực. Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và
các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.



Nguyễn Cẩm Hà












Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

MỤC LỤC

Trang
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT i
DANH MỤC BẢNG ii
DANH MỤC HÌNH iii
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Giới thiệu chung về squalene 3
1.1.1. Nguồn gốc squalene 3
1.1.2. Cấu trúc squalene 3
1.1.3. Tính chất hóa học của squalene 4
1.1.4. Con đường sinh tổng hợp cholesterol 5
1.2. Vai trò của squalene 6
1.2.1. Squalene là một tác nhân chống lão hóa 6
1.2.2. Vai trò của squalene đối với sức khỏe con người 9
1.2.2.1. Trong điều trị và ngăn ngừa bệnh ung thư 9
1.2.2.2. Vai trò của squalene trong giải độc 11
1.2.2.3. Đối với các bệnh khác 11
1.2.3. Vai trò của squalene trong công nghiệp mỹ phẩm 12

1.2.4. Vai trò của squalene đối với các ngành công nghiệp khác 14
1.3. Các nguồn khai thác squalene 14
1.4. Nghiên cứu khai thác squalene từ vi tảo trên thế giới 18
1.5. Một số hướng nghiên cứu về squalene trên thế giới 20
1.6. Nghiên cứu trong nước về squalene 21
1.7. Một số giới thiệu về chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium của Việt Nam 22
CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị 25
2.1.1. Chủng tảo và điều kiện nuôi cấy 25
2.1.2. Hóa chất 26

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

2.1.3. Thiết bị 26
2.2. Phương pháp 27
2.2.1. Xác định sinh trưởng qua mật độ tế bào 27
2.2.2. Xác định hình thái và kích thước tế bào bằng kính hiển vi quang học 27
2.2.3. Xác định sinh trưởng qua sinh khối khô 28
2.2.4. Phương pháp nhuộn lipid bằng Nile red 28
2.2.5. Tách chiết lipit 29
2.2.6. Định lượng squalene bằng phương pháp so màu 29
2.2.7. Tách chiết và tinh sạch squalene thô 30
2.2.7.1. Tách chiết squalene thô 30
2.2.7.2. Tinh sạch squalene thô 31
2.2.8. Xác định squalene bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng 31
2.2.9. Tinh sạch squalene bằng phương pháp sắc kí cột 32
2.2.10. Xác định squalene bằng sắc ký lỏng cao áp 32
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33
3.1. Nuôi trồng đủ sinh khối vi tảo biển quang tự dưỡng và dị dưỡng làm nguyên
liệu cho tách chiết squalene 33

3.2. Sàng lọc nhanh các chủng vi tảo có tiềm năng sản xuất squalene cao 36
3.2.1. Phát hiện nhanh lipit nội bào bằng nhuộm Nile Red 36
3.2.2. Phân tích lipit tổng số của các loài vi tảo biển được sử dụng trong nghiên cứu 38
3.2.3. Xác định hàm lượng squalene trong sinh khối tảo bằng phương pháp
so màu 38
3.2.4. Xác định hàm lượng squalene trong sinh khối bình lên men 30 lít bằng
sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng cao áp 43
3.2.4. 1. Tách chiết lipit không xà phòng hóa từ lipit tổng số 43
3.2.4.2. Xác định squalene bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng cao áp 43
3.2.4.3. Sử dụng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) - bản nhỏ để sàng lọc
nhanh chóng các chủng vi tảo biển chứa hàm lượng squalene cao 47
3.3. Tinh sạch squalene bằng phương pháp sắc kí cột 48
3.3.1. Xác định squalene bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng 48

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

3.3.2. Phân tách và tinh sạch squalene bằng sắc ký cột silicagel 49
3.4. Quy trình tách chiết squalene từ sinh khối tảo dị dưỡng S. mangrovei PQ6 50
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55
KẾT LUẬN 55
KIẾN NGHỊ 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

Nguyễn Cẩm Hà - K16
i
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

TT
Từ viết tắt
Viết đầy đủ

1
Cs
Cộng sự
2
DHA
Docosahexaenoic Acid (C22: 6n-3)
3
EPA
Eicosapentaenoic Acid (C20:5n-3)
4
GC
Gas chromatography (sắc ký khí)
5
GC-MS
Gas chromatography mass spectrometry
6
GOT
Glutamatoxaloacetat transaminase
7
GPT
Glutamate pyruvate transaminase
8
HCB
Hexan chloro benzene
9
HPLC
High performance liquid chromatography (sắc ký lỏng cao áp)
10
HMG-C
Hydroxy-methylglutaryl-coenzyme A

11
LDL-C
Low Density Lipoprotein –Cholesterol (lipoprotein tỷ trọng
thấp gắn với cholesterol)
12
MJA
Methyl jasmonate
13
PFAD
Palm fatty acid distillate
14
Ras
Rat sarcoma
15
Rf
Retention factor
16
17
SKK
SKT
Sinh khối khô
Sinh khối tươi
18

19
20
TLC

TBFN
VTB

Thin layer chromatography
(sắc ký lớp mỏng)
Terbinafine
Vi tảo biển





Nguyễn Cẩm Hà - K16
ii
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Các thông số lý hóa của squalene 5
Bảng 1.2. Thành phần bã nhờn ở người 13
Bảng 1.3. Hàm lượng squalene trong các loại dầu 16
Bảng 3.1. Danh sách 5 loài vi tảo biển quang tự dưỡng, 2 loài dị dưỡng và điều kiện
nuôi cấy chúng trong điều kiện phòng thí nghiệm 34
Bảng 3.2. Hàm lượng lipit của một số loài VTB đã được sử dụng trong nghiên cứu 38
Bảng 3.3. Hàm lượng squalene của 7 loài vi tảo biển nghiên cứu 41
Bảng 3.4. Hàm lượng squalene của chủng PQ6 được phân tích bằng TLC và HPLC 46




Nguyễn Cẩm Hà - K16
iii
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của squalene (C
30

H
50
) 4
Hình 1.2. Squalene synthase trong con đường sinh tổng hợp cholesterol 7
Hình 1.3. Mặt cắt các tuyến bã nhờn ở da người 13
Hình 1.4. Hình thái của tế bào Schizochytrium 23
Hình 3.1. Hình thái tế bào của 5 loài vi tảo biển quang tự dưỡng chụp dưới kính
hiển vi quang học 34
Hình 3.2. Hình chụp khuẩn lạc và tế bào của chủng Schizochytrium mangrovei PQ6
(A) và Thraustochytrium striatum (B) 35
Hình 3.3. Hệ thống nuôi trồng các loài vi tảo biển quang tự dưỡng ở các quy mô
bình từ 250 mL đến bình 10 lít 35
Hình 3.4. Hình ảnh minh họa nuôi trồng chủng Schizochytrium mangrovei PQ6 và 36
Hình 3.5. Ảnh chụp tế bào dưới kính hiển vi quang học (A) và kính hiển vi huỳnh
quang sau khi nhuộm Nile Red (B) của 5 chủng vi tảo quang tự dưỡng và 2
chủng vi tảo dị dưỡng với độ phóng đại 1500 lần. 37
Hình 3.6. Ảnh minh họa cho các giai đoạn khác nhau của phản ứng tạo màu đối với
squalene chuẩn (1, 2, 3, 4, 5, 6 tương ứng với các nồng độ 0,01; 0,04; 0,05;
0,06; 0,08; 0,10 mg) trong phương pháp xác định squalene bằng so màu. 39
Hình 3.7. Ảnh minh họa quá trình xác định hàm lượng squalene ở các loài tảo quang tự
dưỡng và dị dưỡng bằng phương pháp so màu 40
Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa hàm lượng squalene chuẩn và
OD
400
40
Hình 3.9. Ảnh minh họa cho quá trình phân tách lipit không xà phòng hóa từ lipit
tổng số 43
Hình 3.10. Sắc ký lớp mỏng mẫu lipit không xà phòng hóa tách chiết từ sinh khối
chủng PQ6 44
Hình 3.11. Đường chuẩn về mối tương quan giữa hàm lượng squalene và diện tích peak 45

Hình 3.12. Sắc ký đồ của squalene chuẩn xác định bằng sắc ký lớp mỏng TLC và
HPLC 45

Nguyễn Cẩm Hà - K16
iv
Hình 3.13. Sắc ký đồ của mẫu PQ6 squalene được phân tách bằng sắc ký lớp mỏng
và xác định bằng HPLC 46
Hình 3.14. Áp dụng phương pháp TLC (bản nhôm, bản nhỏ) để sàng lọc nhanh các
chủng vi tảo biển có hàm lượng squalene cao. Đường 0- saqualene chuẩn . 47
Hình 3.15. Sắc ký lớp mỏng xác định squalene từ mẫu chuẩn và mẫu lipit không xà
phòng hóa của chủng PQ6 với các hệ dung môi chạy khác nhau 49
Hình 3.16. Ảnh minh họa cho quá trình tinh sạch squalene từ lipit không xà phòng hóa 49
Hình 3.17. Sắc ký lớp mỏng (A) và sắc ký đồ (B) của mẫu squalene từ chủng PQ6
sau khi tinh sạch qua cột silicagel 50
Hình 3.18. Tách lipit tổng số từ sinh khối chủng PQ6 51
Hình 3.19 Tách squalene thô từ lipit tổng số của chủng PQ6 52
Hình 3.20. Tinh sạch squalene thô từ lipit tổng số 53







Nguyễn Cẩm Hà - K16
1
MỞ ĐẦU
Squalene là tiền chất steroit của động, thực vật, được ứng dụng rộng rãi trong
công nghiệp mỹ phẩm, có tác dụng chống khô da và làm mềm da, có vai trò bảo vệ
da khỏi các tác hại do ánh sáng, tia UV gây ra. Các nghiên cứu dịch tễ học đã cho

thấy squalene ức chế hiệu quả các tác nhân hóa học có khả năng gây ung thư ruột
kết, phổi, da ở động vật thực nghiệm. Squalene cần thiết cho cơ thể bởi nó là một
chất chống oxy hoá tự nhiên có vai trò bảo vệ các tế bào khỏi các gốc tự do và oxy
phân tử có hoạt tính cao, có khả năng tăng cường hoạt động của hệ miễn dịch. Việc
cung cấp thực phẩm chức năng có thành phần squalene cao (khoảng 500 mg/ngày)
đã được chứng minh là cần thiết cho sức khỏe dinh dưỡng của con người, làm giảm
đáng kể bệnh tim mạch và ung thư vì vậy chúng cũng được dùng phổ biến trong
dược phẩm.
Cho đến nay, các nguồn sản xuất squalene được biết đến nhiều nhất là các
loại dầu động, thực vật. Dầu o liu chứa hàm lượng squalene cao nhất trong khi một
số loại dầu khác như dầu cọ, dầu ngô, dầu vừng lại có hàm lượng squalene không
cao. Dầu gan cá mập là một nguồn nguyên liệu truyền thống cho tách chiết squalene
có hàm lượng và chất lượng cao. Tuy nhiên, việc duy trì nguồn cung cấp squalene
liên tục và lâu dài ngày càng gặp khó khăn do sự suy giảm nguồn cá trong tự nhiên
cũng như các vấn đề về thổ nhưỡng và mùa vụ của các loại cây trồng. Trong khi đó,
hiện nay, trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng, nhu cầu về squalene làm
nguyên liệu trong ngành công nghiệp dược phẩm và mỹ phẩm đang ngày càng tăng.
Do vậy, việc tìm kiếm và phát triển các nguồn nguyên liệu mới thay thế nguồn
truyền thống để tách chiết squalene là rất cần thiết và đang được các nhà khoa học
trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu. Trong đó, vi sinh vật nói chung và vi tảo
biển nói riêng là một nguồn tiềm năng cho sản xuất squalene trên qui mô lớn.
Tảo lục Botrycoccus braunii có khả năng tổng hợp squalene cao nhưng tốc
độ sinh trưởng rất thấp và là cơ thể quang tự dưỡng bắt buộc nên gây khó khăn cho
việc thương mại hóa sản phẩm này. Trong khi đó, một số các loài vi tảo biển dị
dưỡng như thraustochytrids được xem như là các nhà máy tế bào tiềm năng cho sản

Nguyễn Cẩm Hà - K16
2
xuất các chất có giá trị cao trong đó có squalene. Chi tảo thraustochytrid có hàm
lượng squalene cao, có tốc độ sinh trưởng cao trong điều kiện nuôi cấy dị dưỡng có

bổ sung nguồn cacbon hữu cơ và không cần có ánh sáng bởi vì cơ thể chúng có bộ
máy quang hợp đã bị thoái hóa. Do vậy, việc nâng cấp quy mô nuôi trồng chúng
bằng các hệ thống bình lên men khác nhau để bảo đảm cung cấp đủ nguồn nguyên
liệu cho sản xuất squalene hứa hẹn sẽ có thành công.
Phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam hiện đang có một tập đoàn giống vi tảo biển quang tự
dưỡng và dị dưỡng của Việt Nam. Nhiều loài vi tảo trong tập đoàn giống có thể
là nguồn cung cấp cho việc tách chiết squalene trên quy mô lớn. Chính vì vậy,
chúng tôi mong muốn tiến hành đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu sàng lọc
squalene từ một số chủng vi tảo biển phân lập ở Việt Nam” nhằm cung cấp cơ
sở khoa học ban đầu về hàm lượng squalene ở vi tảo biển Việt Nam, có được các
phương pháp nghiên cứu phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm về tách chiết,
xác định squalene trong sinh khối vi tảo biển để bước đầu tìm ra được một số
chủng tiềm năng cho việc nghiên cứu sâu hơn theo định hướng sử dụng squalene
làm thực phẩm chức năng và dược phẩm trong tương lai ở Việt Nam
Luận văn nghiên cứu có một số nội dung như sau:
1. Sàng lọc một số chủng vi tảo biển của Việt Nam có khả năng nuôi trồng trên
quy mô lớn và có hàm lượng squalene cao.
2. Xây dựng các phương pháp xác định nhanh chóng hàm lượng squalene phù
hợp với điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam để sử dụng cho việc sàng
lọc nhanh các chủng tiềm năng cho sản xuất squalene.
3. Bước đầu tách chiết và làm sạch squalene từ chủng tiềm năng lựa chọn được.
Công việc nghiên cứu được thực hiện tại phòng Công nghệ Tảo, Viện Công
nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.


Nguyễn Cẩm Hà - K16
3
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU


1.1. Giới thiệu chung về squalene
1.1.1. Nguồn gốc squalene
Mặc dù ở độ sâu từ 500m -1000m dưới lòng biển, nơi hầu như không có ánh
sáng mặt trời, không có thực vật, do đó hàm lượng oxy rất thấp, nhiệt độ trung bình
quanh năm khoảng 2°C, áp suất nước là 50-100kgf/cm
2
nhưng cá mập biển sâu vẫn
sống và tồn tại được. Một vấn đề được nêu ra là làm sao loài cá mập đại dương lại
có thể sinh tồn trong một môi trường sống khắc nghiệt như vậy được. Các nhà sinh
vật học đã nghiên cứu và nhận thấy ở loài cá mập đại dương này có bộ phận gan lớn
hơn rất nhiều so với gan của các loài cá khác. Trong đó, 80% gan cá này là dầu có
chứa một chất được xem là “thần bí”. Sau này, chất này được xác định là squalene.
Khả năng tồn tại được trong điều kiện sống bất lợi nêu trên đối với cá mập đại
dương liên quan nhiều đến sự có mặt squalene với hàm lượng cao ở gan của nó.
Squalene có khả năng nâng cao sức sống cho tế bào và tăng sức đề kháng của cơ thể
cá mập và chính những điều này đã giúp cho loài cá này có thể tự do sinh tồn trong
môi trường biển với độ sâu 500m – 1000m.
Dầu gan cá mập chứa khoảng 60-85% chất hữu cơ nêu trên trong khi ở dầu
oliu chất này có hàm lượng chỉ khoảng 0,4- 0,8 %. Cư dân của bán đảo Izu của Nhật
Bản đã uống một loại dầu được đặt tên địa phương là “Samedawa” có nghĩa là
“chữa được tất cả” các bệnh. Theo các dẫn chứng khoa học thì từ xa xưa, người
Nhật Bản chủ yếu đã sử dụng nhiều hải sản trong chế độ ăn uống của họ. Vì vậy,
không quá ngạc nhiên vào năm 1916, một nhà hóa học người Nhật Bản là Tiến sĩ
Tsujimoto đã chứng minh được rằng “Samedawa” chứa một lượng rất lớn các
hydrocacbon không bão hòa. Ông gọi nó là squalene do sự xuất hiện của nó trong
dầu gan cá mập, từ gốc Latin là “Squalus” (cá mập) [90].
1.1.2. Cấu trúc squalene
Mười năm sau phát hiện của Tiến sĩ Tsujimoto, cấu trúc của squalene đã
được xác định như một dihydrotriterpene và là một chất trung gian trong quá trình


Nguyễn Cẩm Hà - K16
4
sinh tổng hợp của steroit [39]. Năm 1934, Robinson đã công bố cấu trúc vòng của
squalene với phân tử steroit [78]. Tuy nhiên, đến năm 1936 công thức hóa học của
squalene mới được công bố đầy đủ do Karrer, (1943) – người cũng đã khám phá ra
cấu trúc hóa học của vitamin A và E.
Squalene từ dầu gan cá mập được đặt tên theo tiếng Latin là “squalene
oxogene oleum”. Trong y học nó được gọi là Spinacene hay Supraene.
Theo công bố của Kohno và cộng sự (1995) [52] thì squalene có cấu tạo:
(2,6,10,15,19,23–hexanmethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexane) - là một hydrocacbon
hợp chất béo không bão hòa (C
30
H
50
), với 6 liên kết đôi, chứa 6 đơn vị isoprene để
cung cấp bộ khung cho tổng hợp cholesterol axit mật và steroit, là một chất trao đổi
trung gian quan trọng trong sinh tổng hợp sterol và triterpenes ở động vật và thực vật
(Hình 1.1).
Do cấu trúc của liên kết đôi trong sáu nhóm CH
3
, các isoprenoit có tác
dụng chống oxy hóa tự nhiên một cách mạnh mẽ. Squalene có cấu trúc tương tự
như các isoprenoit khác như β-carotene, lycopene, vitamin A, vitamin E, và
coenzyme Q10 [24].

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của squalene (C
30
H
50
) [48]

Trên thực tế, squalene là một chất trao đổi trung gian và là tiền chất của quá
trình tổng hợp cholesterol. Trong cơ thể của con người, squalene được biến đổi
thành cholesterol chứa lipoprotein tỷ trọng cao nhờ đó mà cholesterol tốt tăng lên và
cholesterol xấu giảm đi.
1.1.3. Tính chất hóa học của squalene
Squalene không tan trong nước, tan ít trong rượu, axit axetic lạnh, tan vô hạn
trong ete, ete dầu hỏa, aceton và các dung môi hòa tan chất béo khác. Ở dạng tinh

Nguyễn Cẩm Hà - K16
5
khiết, nó gần như không màu, không mùi, không vị. Ngoài ra, squalene hấp thụ oxy
và trở nên sền sền trông gần giống như dầu hạt lanh (Bảng 1.1)
Bảng 1.1. Các thông số lý hóa của squalene
(
Trạng thái
Chất lỏng
Nhiệt độ nóng chảy (độ C)
-5
Điểm sôi (độ C)
429
Điểm chớp cháy (độ C)
254
Trọng lượng phân tử
410,73
Độ tan trong nước (g/l)
Không tan trong nước
Tỷ trọng tương đối (không khí =1)
> 1
Nhiệt độ bay hơi (kJ/mol)
65,8

Tỷ trọng hơi (không khí =1)
14,2

1.1.4. Con đƣờng sinh tổng hợp cholesterol
Kể từ khi được phát hiện vào đầu thế kỉ XX, squalene đã được công nhận là
mắt xích quan trọng trong con đường trao đổi chất, là một bước trung gian trong
quá trình sinh tổng hợp cholesterol và tất cả các hormone steroit. Cholesterol gắn
với lipoprotein có trọng lượng phân tử thấp (LDL-C, Low Density Lipoprotein -
Cholesterol) có hàm lượng cao là một nguy cơ đối với những người mắc bệnh tim.
Statins là một trong những loại thuốc làm hạ cholesterol máu, có tác dụng ngăn
chặn bệnh tim ở người bởi nó ức chế enzyme hydroxy-methylglutaryl-coenzyme A
reductase (HMG-CoA reductase) có vai trò xúc tác tạo ra cholesterol. Tuy nhiên,
statins có thể gây ra tác dụng phụ ở một số bệnh nhân và đối với một phạm vi người
nào đó thì nó lại không có hiệu quả. Thay thế cho statins, hiện nay, một số tác nhân
làm giảm cholesterol bằng cách ức chế trực tiếp quá trình sinh tổng hợp squalene
được cho là đầy hứa hẹn. Squalene được chứng minh là một chất ức chế hoạt tính

Nguyễn Cẩm Hà - K16
6
của nhóm HMG-CoA reductase và làm tăng hoạt động của Acyl CoA cholesterol
acyltransferase [53]. Trong thực tế, tổng hợp nội sinh của squalene bắt đầu bằng
việc sản xuất HMG-CoA. Giảm hàm lượng HMG-CoA sẽ kéo theo hình thành
mevalonate [7]. Cholesterol được tổng hợp theo con đường mevalonate. Sau các
phản ứng sinh hóa, các nhóm prenyl được bổ sung, các phân tử của nhóm trung gian
farnesyldiphosphate được tập hợp và giảm đi, kết quả là hình thành squalene. Sau
quá trình sinh tổng hợp, squalene có thể được vận chuyển tới các khu vực khác của
cơ thể trong các mô hoặc được chuyển hóa để cuối cùng cholesterol và các chất
chuyển hóa steroit của nó được tổng hợp [65]. Sự xuất hiện squalene trong các tế
bào ảnh hướng đến tốc độ tổng hợp enzyme HMG-CoA reductase do đó ảnh hưởng
đến toàn bộ quá trình tổng hợp của isoprenoit và cholesterol. Các nghiên cứu lâm

sàng đã cho thấy ức chế sinh tổng hợp squalene có tác dụng làm giảm hàm lượng
cholesterol cũng như LDL-C. Squalene synthase đóng một vai trò quan trọng trong
con đường sinh tổng hợp cholesterol vì nó chịu trách nhiệm phân bố các chất trung
gian của cả nhóm sterol và không sterol (Hình 1.2.). Tuy nhiên, tổng hợp squalene
nhiều có thể là một trong các nguyên nhân gây ra bệnh tăng cholesterol trong máu.
1.2. Vai trò của squalene
1.2.1. Squalene là một tác nhân chống lão hóa
Theo Tổ chức Y tế thế giới, “lão hóa” hoặc “quá trình lão hóa” là sự thay đổi
một loạt hình thái và sinh lý xuất hiện như một hệ quả tất yếu qua thời gian, giảm
khả năng thích ứng của các cơ quan và hệ thống cũng như khả năng đáp ứng với
những tác nhân có hại. Lão hóa là một quá trình phức tạp được thể hiện trong một
cơ thể sinh vật ở nhiều mức cấp độ: di truyền, phân tử, tế bào, trong các cơ quan và
hệ thống. Mặc dù các cơ chế phân tử của quá trình lão hóa vẫn chưa được biết rõ
nhưng ngày càng có nhiều bằng chứng chỉ ra vai trò của oxy và nito là một trong
những nhân tố quyết định chính trong quá trình lão hóa. Tình trạng stress oxy hóa
xảy ra ở con người có thể do chế độ ăn uống và hoạt động thể chất gây ra. Tình
trạng stress oxy hóa này cũng có thể giảm xuống mức độ bình thường thông qua

Nguyễn Cẩm Hà - K16
7
việc bổ sung các chất chống oxy hóa tự nhiên có vai trò ngăn chặn và bảo vệ cơ thể
chống lại các bệnh về tuổi tác [21].

Hình 1.2. Squalene synthase trong con đƣờng sinh tổng hợp cholesterol [28].

Nhiều kết quả nghiên cứu đã cho thấy chế độ ăn kiểu Địa Trung Hải trong
những năm 90s là rất tốt cho sức khỏe con người, giảm tỷ lệ mắc bệnh mạch vành
[47] và một số loại bệnh ung thư [94]. Đó là do trong thành phần thức ăn rất giàu
vitamin, chất chống oxy hóa và các chất béo không bão hòa đa nối đôi [58], [68].
Nghiên cứu được tiến hành trên người tình nguyện đã cho thấy một số thành

phần trong dầu ô liu (polyphenol, squalene) được con người sử dụng rất có lợi đối
với sức khỏe. Ăn nhiều thức ăn chứa nhiều chất béo thì tình trạng stress oxy hóa sẽ
gây ra viêm, rối loạn chức năng nội mô, tăng đông máu, xơ vữa động mạch nhưng
với một chế độ ăn có bổ sung chất chống oxy hóa có thể giảm thiểu tình trạng nêu
trên [67].

Nguyễn Cẩm Hà - K16
8
Squalene bảo vệ tế bào và màng sinh học của các cơ quan bào tương khỏi sự
oxy hóa cũng như góp phần duy trì ổn định quá trình chuyển hóa cholesterol và giữ
LDL-cholesterol ở mức tối thiểu [35]. Màng sinh học dễ bị tổn thương bởi các gốc
tự do, đặc biệt là ở nhóm kị nước giữa hai lớp lipidic. Squalene được quan tâm chú
ý bởi khả năng tuyệt vời của nó trong việc nhận và cho điện tử mà không gây ra bất
kỳ một sự thay đổi phân tử nào. Khả năng và hiệu quả chống oxy hóa ổn định là do
sáu đơn vị isoprenoit trong cấu trúc của squalene quyết định. Squalene có hai dạng
là dạng vòng và dạng không tạo vòng. Dạng không tạo vòng có tính kỵ nước hoàn
toàn và không tham gia vào màng sinh học. Nó bị thu hút do các nhóm giữa hai lớp
lipit, tích tụ ở đó và thực hiện nhiệm vụ chống oxy hóa, bắt giữ các gốc tự do [24].
Một số mô hình thí nghiệm đã chỉ ra rằng loại hydrocacbon như squalene khi
nằm ở giữa lớp màng lipit kép sẽ ức chế sự vận chuyển proton và việc này có thể
dẫn đến sự tiêu thụ không hiệu quả năng lượng tế bào [38]. Đặc biệt, các axit béo
không bão hòa đa nối đôi (bao gồm cả các thực phẩm có chứa lipit) dễ dàng bị oxy
hóa và quá trình trên có một vai trò quan trọng liên quan đến tính toàn vẹn của
màng sinh học. Thật tuyệt vời khi squalene có khả năng bảo vệ các axit linoleic,
linolenic, docosahexaenoic (DHA) và eicosapentaenoic (EPA) chống lại sự o xy
hóa phụ thuộc vào nhiệt độ [27].
Từ những năm 50s nhiều công bố đã cho thấy sự tạo vòng của squalene
với lanosterol để tạo thành oxydosqualene liên quan tới sự tổng hợp cholesterol
và hoạt động chống oxy hóa [95]. Ở một số điều kiện nhất định, squalene dạng
không vòng bị mất đi sự ổn định của nó và trở thành dạng vòng cùng với việc

khi đó khả năng chống oxy hóa bị giảm đi. Để ổn định, squalene cũng liên kết
với các ion hydro từ nước và axit trong cơ thể đi kèm với việc giải phóng oxy
trong cơ thể theo phản ứng sau:
C
30
H
50
(squalene) + 6H
2
O (nước) -> C
30
H
62
(squalane) + 3O
2
(oxy) [88]
Như vậy, squalene đã giúp cho việc bảo đảm oxy ở nồng độ nhất định trong
tế bào, và tình trạng này giúp cải thiện hơn nữa các chức năng của cơ quan thông
qua quá trình trao đổi chất hiếu khí, ngăn ngừa hội chứng bị axit hóa (acidotic)
trong tế bào - nơi các tế bào có tính axit có thể trở nên xấu đi và chết do thiếu oxy

Nguyễn Cẩm Hà - K16
9
[25]. Hai tác giả Alvaro và Eduardo cũng đã công bố squalene có tính chất hóa học
như isoprenoit, có cấu trúc tương tự với carotenoit như lycopene, với vitamins A và
E cũng như các chất chống oxy hóa nội sinh khác như glutathione, superoxide
dismutase và ubiquinone (coenzyme Q10) [7]. Tất cả các chất nêu trên đều có khả
năng chống oxy hóa cao.
Ở trong cơ thể người, squalene được vận chuyển trong máu bởi các
lipoprotein tỷ trọng thấp, nó phân bố chủ yếu trên da. Squalene dễ dàng xâm nhập

vào màng tế bào do tính chất kị nước và có thể được vận chuyển trong tế bào nhờ
các protein chuyên chở squalene tổng hợp trong gan. Chính vì vậy, squalene đóng
vai trò quan trọng như một chất chống oxy hóa trong màng tế bào cũng như ở các
bào quan khác nhau trong tế bào.
Nhìn chung có thể nói squalene có khả năng bổ sung dưỡng khí cho tế bào,
có tác dụng chống lại quá trình oxy hóa, bảo vệ các tế bào khỏi các tổn thương do
gốc tự do, tăng tốc độ tuần hoàn của máu, tăng khả năng tái sinh của tế bào, phòng
ngừa hiện tượng lão hóa của da và các cơ quan trong cơ thể, giúp cho làn da và cơ
thể hồi phục lại sức sống và nét thanh xuân.
1.2.2. Vai trò của squalene đối với sức khỏe con ngƣời
1.2.2.1. Trong điều trị và ngăn ngừa bệnh ung thư
Squalene đã được chứng minh là có hoạt tính bảo vệ chống lại một số chất
gây ung thư [83]. Năm 1996, Desai và các cộng sự của ông đã làm thử nghiệm trên
50 con chuột cái, gây thực nghiệm các khối u trên da bằng 7,12-dimethylbenz [a]
anthracene và 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate. Sau đó, chuột được điều trị
với 5% squalene đã làm giảm tỷ lệ mắc khối u ở nhóm này là 26,7% [26]. Squalene
có vai trò ngăn ngừa ung thư phổi trên chuột thực nghiệm cũng đã được công bố
[84]. Các nghiên cứu thực nghiệm đã cho thấy squalene có thể ức chế về mặt hóa
học một cách hiệu quả các khối u trên da ở loài gặm nhấm. Squalene cũng có vai trò
trong hóa trị liệu đối với ung thư tuyến tụy ở người. Việc bổ sung squalene vào
trong màng bụng để tăng cường chức năng của hệ thống lưới nội mô, đặc biệt là
kháng thế IgM đã cho thấy loài gặm nhấm cái có mang bướu thịt 180 có thể kéo dài
được sự sống của nó [66]. Hơn nữa, squalene cũng có tác dụng bảo vệ tế bào dựa

Nguyễn Cẩm Hà - K16
10
trên tế bào tạo máu đa năng có nguồn gốc từ tủy xương nhưng không bảo vệ được
các dòng tế bào của u nguyên bào thần kinh do cisplatin gây ra độc tính [25]. Khi
đó, squalene sẽ có hoạt tính bảo vệ đối với các tế bào bình thường trước những độc
tính do hóa trị liệu gây ra nhưng lại không bảo vệ được các tế bào ung thư.

Trong dầu gan cá mập đại dương có chứa hàm lượng squalene cao. Nghiên
cứu dịch tễ dân số của một số vùng Địa Trung Hải đã cho thấy hàm lượng squalene
cao là yếu tố chính làm giảm nguy cơ ung thư đối với người dân nơi đây.
Bên cạnh đó, trong dầu o liu còn chứa một lượng nhỏ (< 2%) các chất có
hoạt tính sinh học như polyphenol (100-500 mg/kg), flavonoit, lignans… cũng có
tác dụng chống ung thư rất tốt [19].
Các tác giả Alvaro Ronco và Eduardo De Stéfani (2013) cũng đã chỉ ra
rằng theo các tài liệu được chỉ ra trong Pubmed với thuật ngữ “squalene” đã có
3281 kết quả nghiên cứu cơ bản từ 1926 tới 2013 nhưng khi tìm kiếm thêm với
thuật ngữ “ung thư” thì kết quả hạn chế ở con số 203 và từ năm 1956 đến nay
chủ yếu liên quan đến tác dụng hiệu quả của squalene trong bảo vệ ung thư da
[7]. Ung thư da thường xẩy ra do sự tổn hại của màng sinh học khi bị oxy hóa
bởi các gốc oxy tự do, đặc biệt là ở các nhóm kị nước giữa lớp màng lipit kép –
nơi có squalene phân bố. Do sự có mặt của squalene ở những vị trí nêu trên trong
tế bào đã làm giảm đáng kể quá trình oxy hóa do khả năng chống oxy hóa rất tốt
của squalen được quyết định bởi đặc điểm cấu trúc của nó; giúp cho việc chống
ung thư có hiệu quả hơn.
Nhiều công bố đã khẳng định squalene có vai trò là chất chống oxy hóa
mạnh cũng như có hoạt tính chống ung thư thông qua con đường của các gen gây
ung thư thuộc họ ras (ras-oncogene pathway) (ras là tên viết tắt của Rat sarcoma -
được sử dụng để nói về họ gen mã hoá cho các protein GTPase nhỏ, tham gia vào
quá trình truyền tín hiệu trong tế bào) thể hiện tiềm năng chữa bệnh của nó [16].
Ras được tìm thấy ở 30% các bệnh ung thư. Tế bào ung thư kích hoạt gen ras
tổng hợp protein ras và thực hiện chức năng ras. Protein ras gây ung thư ở trạng thái
kích hoạt liên tục dẫn đến không kiểm soát được sự phân chia tế bào trong trường
hợp không có dấu hiệu tăng trưởng [40]. Sự kích hoạt của các protein này phụ thuộc

Nguyễn Cẩm Hà - K16
11
vào sự chuyển hóa isoprenoit trong các tế bào ung thư. Thông qua isoprenylation,

farnesylpyrophosphate đã sửa chữa protein ras và các protein quan trọng khác ở
màng tế bào hay màng nhân. Nếu thiếu bước quan trọng này thì các gen gây ung thư
đã không bị hạn chế hoạt động. Một lượng squalene được bổ sung hàng ngày đã có
thể ức chế sản xuất isoprenoit trong các tế bào ung thư và ngăn chặn khối u phát
triển. Đây là bằng chứng khoa học giải thích cho khả năng chống ung thư của dầu o
liu đã được khám phá vào năm 2007.
1.2.2.2. Vai trò của squalene trong giải độc
Nhiều bằng chứng thực nghiệm cho thấy squalene có tác dụng hỗ trợ để loại
bỏ các chất độc ưa mỡ ra khỏi cơ thể. Squalene là một chất không phân cực, khi có
mặt nó thì những tương tác thuộc dạng không ion hóa sẽ xuất hiện [46].
Squalene có tác dụng tăng cường loại bỏ hexanchlorobenzen (HCB). Chế độ
ăn có bổ sung squalene (8%) đã làm tăng rõ rệt sự bài tiết HCB theo phân cao gấp 3
lần và thời gian đào thải giảm đáng kể (từ 34-38 ngày so với 110 ngày ở đối chứng)
ở chuột sau 3 tuần thí nghiệm [74]. Tuy nhiên, tác dụng hữu hiệu này của squalene
khi HCB có hàm lượng cao lại phụ thuộc vào loại mô nhưng sự khác biệt về tác
dụng nêu trên lại không đáng kể ở mô gan và máu.
Trong vấn đề giải độc, squalene được xem là một ứng cử tốt để làm giảm độc
tính các chất đi vào cơ thể một cách ngẫu nhiên. Ví dụ như ở mô hình động vật thực
nghiệm, người ta đã nhận thấy sự đào thải phylline và schychnine theo phân tăng
lên khi chúng ăn thức ăn có bổ sung squalene [46].
1.2.2.3. Đối với các bệnh khác
Squalene có chức năng giống với tế bào hồng cầu như hấp thụ oxy. Nó có
khả năng liên kết với nguyên tử hydro trong phân tử nước để tạo ra oxygen mới,
được máu vận chuyển đến các tế bào giai đoạn cuối trong cơ thể; tăng tác dụng
của tổ chức oxygen; kháng lại những căn bệnh gây ra do cơ thể thiếu hụt oxy;
đồng thời nâng cao khả năng chịu đựng của cơ thể, cải thiện chức năng tim, tăng
cường thể chất.
Hơn nữa, squalene có khả năng hỗ trợ chức năng gan và sự bài tiết của dịch
mật, làm giảm hoạt độ glutamatoxalo acetat transaminase (GOT)/glutamate


Nguyễn Cẩm Hà - K16
12
pyruvate transaminase (GPT) cho những bệnh nhân viêm gan một cách rõ rệt, tăng
cảm giác thèm ăn, mang đến hiệu quả cao cho quá trình điều trị bệnh viêm gan. Ở
chuột thực nghiệm bị mắc các bệnh liên quan đến tim mạch, thức ăn có bổ sung
squalene đã có tác dụng làm giảm đáng kể hàm lượng mỡ trong gan do đó dẫn đến
giảm xơ vữa động mạch [57].
Bên cạnh đó, squalene có thể ức chế quá trình tổng hợp cholesterol, giảm
lượng mỡ cung cấp cho gan, phát huy mạnh hơn tác dụng của insulin, giảm lượng
đường trong máu [46], [57].
1.2.3. Vai trò của squalene trong công nghiệp mỹ phẩm
Squalene lần đầu tiên được tìm thấy trong cơ thể con người vào năm 1950
khi quá trình chuyển hóa cholesterol lần đầu tiên được xác định [61].
Ở người, thông thường squalene được hấp thụ và vận chuyển trong bã nhờn,
nó kết hợp với lipoprotein tỷ trọng thấp (VLDL). Nhiều nghiên cứu đã cho thấy
con người sử dụng squalene như một thành phần làm mềm da hay tóc, một chất
dưỡng da cho cơ thể hay bàn tay. Da của con người bao gồm toàn bộ bề mặt bên
ngoài cơ thể, là cơ quan lớn nhất và liên tục tiếp xúc với những điều kiện bất lợi
của ánh sáng mặt trời, bao gồm cả tia cực tím (UV). Tế bào da rất giàu lipit và
được cho là dễ bị oxy hóa bởi ánh sáng mặt trời. Tuyến bã nhờn là một loại tuyến
tiết trong cơ thể, thường đi kèm với một nang chân lông (nên gọi tắt là tuyến bã
nhờn lông) tiết ra chất bã nhờn (Sebum) có tác dụng làm trơn bề mặt da (Hình
1.3.). Ở người, tuyến bã nhờn lông được tìm thấy nhiều nhất trên mặt và da dầu,
mặc dù chúng được phân bố ở khắp các vị trí trên da ngoại trừ lòng bàn tay và
lòng bàn chân. Bã nhờn di chuyển tới bề mặt da, kết hợp với độ ẩm, không khí và
mồ hôi, từ đó tạo thành một lớp lipit, là hàng rào bảo vệ của da. Squalene là một
hợp chất triterpene có cấu trúc độc đáo, nó là một trong những thành phần chính
của các lipit trên bề mặt [70]. Hơn nữa, một con số đáng lưu ý là squalene được
tiết ra từ bề mặt da nằm trong khoảng từ 125 đến 475 mg/ngày [53]. Thông thường
nó được vận chuyển trong huyết thanh và được kết hợp với lipoprotein có trọng

lượng phân tử thấp, phân bố khắp nơi trong các tế bào mô người, tập trung lớn
nhất trong bã nhờn của da (13%) (Bảng 1.2) [73].

Nguyễn Cẩm Hà - K16
13








Hình 1.3. Mặt cắt các tuyến bã nhờn ở da ngƣời
(

Bảng 1.2. Thành phần bã nhờn ở ngƣời [73]
Các thành phần bã nhờn
Thành phần (%)
Wax esters
25
Squalene
13
Cholesterol
2
Triglycerides, free fatty acids, and diglycerides
57
Các thành phần khác
3


Squalene không dễ dàng bị peroxit hóa, nó xuất hiện trên bề mặt da như một
chất bảo vệ cho quá trình peroxit hóa các lipit do tiếp xúc với tia cực tím hay các
nguồn khác [48]. Squalene thực sự là một chất làm mềm da tuyệt vời của thiên
nhiên. Nó được hấp thụ một cách nhanh chóng và hiệu quả vào sâu trong da, phục
hồi độ mềm lành mạnh của da mà không để lại dư lượng dầu nào. Trong những năm
gần đây, các mỹ phẩm dạng nhũ tương với các phân tử sinh học trong đó có
squalene đã được nghiên cứu thử nghiệm và cho thấy độ ổn định và độ nhớt của nhũ
tương ảnh hưởng nhiều nhất lên tỷ lệ phần trăm của squalene [12].

Nguyễn Cẩm Hà - K16
14
Như vậy squalene là một chất làm mềm tự nhiên, có thể được sử dụng trong
các sản phẩm chăm sóc da, giúp da duy trì độ ẩm, mềm mại hơn mà không cảm thấy
nhờn hay sử dụng trong chăm sóc tóc để nuôi dưỡng và cung cấp độ bóng cho tóc.
Nhiều thành phần khác có cấu trúc tương tự như squalene tồn tại trong tự
nhiên cũng có tác dụng sinh lý trực tiếp lên da, bao gồm β-carotene, coenzyme Q10
và vitamin A, E, K1.
1.2.4. Vai trò của squalene đối với các ngành công nghiệp khác
Ngày nay, squalene được sử dụng với một số lượng lớn để làm nguyên liệu
trung gian trong ngành công nghiệp dược phẩm. Nhiều công bố cũng chỉ ra rằng
squalene được sử dụng làm chất chất diệt khuẩn hữu hiệu; còn là chất trung gian
trong sản xuất các hợp chất hữu cơ, cao su hóa chất, chất thơm hay các chất có hoạt
tính hoạt động bề mặt [8], [43].
Hiện nay, trên thế giới ngày càng xuất hiện nhiều sản phẩm chứa squalene ở
dạng mỹ phẩm hay thực phẩm chức năng, có giá trị thương mại cao. Việc bổ sung
squalene vào chế độ ăn uống cũng được quan tâm đáng kể trong những năm gần
đây. Ví dụ như người dân ở vùng Địa Trung Hải có được một lối sống lành mạnh là
do trong chế độ ăn uống của họ có thành phần squalene chứa trong dầu oliu. Lượng
tiêu thụ dầu o liu ở những đất nước này khá lớn [69]. Cũng theo khảo sát USDA
thực hiện trong những năm 2000s, tiêu thụ squalene mỗi ngày trong chế độ ăn trung

bình của người Mỹ dao động 24-38 mg/2000 calo từ các thực phẩm khác nhau.
Để đáp ứng được nhu cầu ngày càng tăng về squalene trong các ngành dược
phẩm, công nghiệp, mỹ phẩm…đối với nhu cầu cuộc sống con người nên các nhà
khoa học trên thế giới đã và đang nghiên cứu để có thể tách chiết và tinh sạch được
một lượng lớn squalene từ các nguồn nguyên liệu khác nhau.
1.3. Các nguồn khai thác squalene
Hiện nay, các viên dầu squalene trên thị trường chủ yếu có nguồn gốc từ dầu
gan cá mập và dầu của các hạt thực vật. Nguồn truyền thống ban đầu được biết đến
là dầu gan cá mập. Với dầu gan cá mập, squalene là thành phần chính, chiếm tới