Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria .
- -
1

MỤC LỤC
Lời nói đầu
1. Giới thiệu

1
1.1 Probiotic 1
1.1.1 Lịch sử, khái niệm và các loài Bifidobacteria 1
1.1.2 Nguyên tắc phân loại 2
1.2 Bifidobacteria 2
1.2.1 Khái niệm và các chủng của loài Bifidobacteria 2
1.2.2 Các chủng có giá trị thương mại 8
1.2.3 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi khuẩn 10
2. Quá trình công nghệ thu nhận probiotic bifidobacteria
12
2.1 Môi trường nuôi cấy và các điều kiện 12
2.1.1 Môi trường nuôi cấy tiêu chuẩn 12
2.1.2 Môi trường nuôi cấy thay thế 13
2.2 Lên men 16
2.2.1 Các hình thức lên men 16
2.2.2 Canh trường tế bào lên men tự do truyền thống 20
2.2.3 Ảnh hưởng các tính chất công nghệ đến đặc tính của tế bào 22

2.3 Vi lọc

24
2.3.1 Mô hình sợi 24
2.3.2 Hệ thống thiết bị phản ứng sinh học membrane 25

2.4 Rửa và bổ sung phụ gia 25
2.5 Hình thành sản phẩm 26
2.5.1 Môi trường dạng lỏng 26
2.5.2 Môi trường dạng lạnh đông 26
2.5.3 Môi trường dạng sấy khô 27
3. Tiêu chuẩn chất lượng
29
4. Thành tựu công nghệ
30
4.1 Đánh giá chủng Bifidobacteria spp trong việc sản xuất các probiotic tiềm
năng trên môi trường đồ uống malt – base 30
4.2 Đánh giá tính an toàn của probiotic bifidobacteria bằng cách phân tích hoạt
tính thủy phân mucin và khả năng chuyển vị 32
5. Phụ lục
37
5.1 Tác dụng của probiotic đối với sức khỏe con người 37
5.2 Bảo quản sản phấm 40
5.3 Những sản phẩm công nghệ bổ sung probiotic bifidobacteria 42
6. Tài liệu tham khảo
47



Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria .
- -
2

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1. Những tế bào Bifidobacterium trên biểu mô ruột 3

Hình 2. Mối quan hệ giữa các chủng của loài bifidobacteria 6
Hình 3. Bifidobacterium adolescentis 7
Hình 4. Bifidobacterium bifidum 8
Hình 5. Bifidobacterium breve 9
Hình 6. Bifidobacterium longum 10
Hình 7. Quá trình lên men liên tục hai giai đoạn để sản xuất probiotic thích ứng
với stress. 19
Hình 8. Cấu tạo mô hình sợi 1 24
Hình 9. Cấu tạo mô hình sợi 2 24
Hình 10. Thiết bị phản ứng sinh học membrane 25
Hình 11. Sản phẩm Activia dạng chai và Activia yogurt 42
Hình 12. Sản phẩm Align 43
Hình 13. Sản phẩm Bifidus yogurt 43
Hình 14. Sản phẩm Good start natural cultures 44
Hình 15. Sản phẩm Nutrish 44
Hình 16. Pobiotic ice-cream, Nước giải khát probiotic whey, Bio-kefir 45
Hình 17. Sản phẩm Teddy 45
Hình 18. Sản phẩm Yo-plus yogurt 46



Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria .
- -
3

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1. Những vi sinh vật được sử dụng làm probiotic ở người 2
Bảng 2. Các chủng của loài bifidobacteria 4
Bảng 3. Các nhà cung cấp vi sinh vật sản xuất probiotic 7

Bảng 4. Môi trường nuôi cấy chuẩn 12
Bảng 5. Ảnh hưởng các yếu tố sinh trưởng lên sự phát triển của Bifidobacterium
trong môi trường whey bơ 15
Bảng 6. Dữ liệu sản xuất Bifidobacteria trong những hệ thống lên men và điều
kiện môi trường khác nhau 20
Bảng 7. Một số phụ gia chống đông có thể sử dụng được 26
Bảng 8. Những tiêu chuẩn mong muốn và then chốt trong việc lựa chọn những
probiotic trong ứng dụng thương mại 29
Bảng 9. Các thông số động lực cho sự phát triển của Bifidobacterium spp 31

















Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria .
- -
4


1. Giới thiệu
1.1 Probiotic
1.1.1 Lịch sử, khái niệm và các tính chất
1.1.1.1 Lịch sử
• Probiotic được dùng để chỉ những vi sinh vật có lợi cho người và động vật
do Dr.Eli Metchinikoff, một nhà khoa học người Nga đạt giải Nobel năm
1908, đưa ra khi ông nghiên cứu về vai trò của những vi khuẩn có lợi trong
đường ruột.
•
Cũng vào thời điểm đó, Henry Tissier, một bác sĩ khoa nhi người Pháp, đã
quan sát trong phân những đứa trẻ bị tiêu chảy có một số lượng ít vi khuẩn
lạ, hình Y, là những vi khuẩn “bifid” ngược lại chiếm số lượng lớn trong
những đứa trẻ khỏe mạnh. Và ông cho rằng những con vi khuẩn này có
khả năng chống lại bệnh tiêu chảy giúp khôi phục hệ thống vi sinh vật
đường ruột khỏe mạnh.


1.1.1.2 Khái niệm
• Có thể định nghĩa probiotic như sau:
“Probiotic là một hay hỗn hợp nhiều vi khuẩn mà khi cung cấp cho người hay
động vật thì mang lại những hiệu quả có lợi cho vật chủ bằng cách tăng cường các đặc
tính của vi sinh vật trong hệ tiêu hóa”.
• Đặc điểm cơ bản probiotic
o Probiotic là những vi sinh vật sống.
o Khi các probiotic được cung cấp với liều lượng thích hợp thì mang lại
những hiệu quả mong muốn.

1.1.1.3 Vai trò
 Thủy phân lactose, tăng sự hấp thu lactose.
 Tăng “thành bảo vệ” miễn dịch, một số có khả năng kích thích cả miễn dịch

đặc hiệu và không đặc hiệu, cùng với việc sinh ra S-IgA ở màng nhầy.
 Kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn, virus, nấm có hại.
 Có khả năng chịu được acid dạ dày, muối mật, có khả năng xâm chiếm đường
ruột, bám vào màng nhầy ruột do đó hạn chế sự có mặt của vi sinh vật có hại.
 Sinh ra các chất chống lại vi sinh vật gây bệnh (như Samonella, E.coli,
Clostridium…)
 Phòng và chữa một số bệnh đường tiêu hóa: tiêu chảy, táo bón, ung loét dạ
dày…
 Giảm triệu chứng dị ứng, triệu chứng không dung nạp được lactose.
 Tổng hợp một số vitamin, giảm cholesterol
Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria .
- -
5

 Ngăn chặn ung thư đường ruột, ung thư ruột kết.

1.1.2 Nguyên tắc phân loại
Hiện nay, các chủng vi khuẩn được sử dụng với vai trò là các probiotic chủ
yếu thuộc Lactobacillus và Bifidobacterum, ngoài ra Enterococcus và Streptococus
cũng được sử dụng ít hơn. Những vi khuẩn này thường cư trú trong ruột.
Một số chủng tiêu biểu bao gồm Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei,
Lactobacillus gasseri, Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium
bifidum. Bên cạnh những vi khuẩn còn có nấm men Saccharomyces boulardii cũng
được xem là probiotic.

Bảng 1: Những vi sinh vật được sử dụng làm probiotic ở người
Chủng
Lactobacillus
Chủng
Bifidobacterium

Các chủng vi khuẩn lactic
khác
Các loài vi sinh vật
khác
L. acidophilus
L. amylovocus
L. casei
L. crispatus
L. gallinarum
L. gasseri
L. johnsonii
L. paracaseii
L. plantarum
L. reuteri
L. rhamnosus
L. salivarius
B. adolescentis
B. alimalis
B. bifidum
B. breve
B. infantis
B. lactis
B. longum
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
Lactococus lactis
Leuconostoc mesenteroides
Pediococus acidilactici
Sporolactobacillus inulinus
Streptococus thermophilus

Bacillus cereus
Escherichia coli
Propionibacterium
freudenreichii
Saccharomyces
cerevisiae
Saccharomyces
boulardii
(Taylor & Francis, 2004)

1.2 Bifidobacteria
1.2.1 Khái niệm và các loài bifidobacteria

1.2.1.1 Khái niệm
Chủng bifidobacterium theo truyền thống được xếp chung với LAB, là hệ thống
phát sinh liên quan đến LAB thật. Nó thuộc ngành Atinobacteria, lớp Actinobacteria,
bô bifidobacteriales, họ bifidobacteriaceae. Họ hàng của nó là Aeriscardovia, Gardnerella,
Parascardovia, và Scardovia. Những loài của chủng đó sử dụng con đường trao đổi
chất để phân hủy hexoses nên được gọi là “bifid shunt”, đó là sự khác biệt với
Lactobacillus và các chủng liên quan. Enzym được xem như là đặc tính phân loại
của nhóm là fructose-6-phosphoketolase(EC 4.1.2.2). Chủng hiện tại bao gồm
khoảng 30 loài.
Thành phần GC trong hệ gen khác nhau từ 42-67%mol, thuộc nhóm vi khuẩn
gram dương cao GC. Nhóm vi khuẩn có những đặc tính probiotic thuộc các loại
Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria .
- -
6

Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum,
Bifidobacterium breve và Bifidobacterium longum.



Hình 1: Những tế bào bifidobacterium trên biểu mô ruột (Trích từ Centre of
Excellence for Knowledge Transfer, Research and Education in Food and
Health for Central and Eastern Europe)

• Bifidobacteria có chủ yếu ở trong ruột kết của người và động vật, nhất là ở
trẻ mới sinh được nuôi bằng sữa mẹ. Số lượng của chúng trong ruột kết
khá ổn dịnh cho đến khi về già thì số lượng giảm đi.
• Một số tính chất chung của các loài thuộc Bifidobacteria:
o Gram dương, kị khí, không chuyển động, không sinh bào tử, catalase
âm
o Có nhiều hình dạng: que cong ngắn, hình gậy, hình chữ Y.
o Sinh acid lactic, không tạo CO
2
trừ quá trình phân giải gluconate.
• Nhiệt độ và pH tối ưu
o Nhiệt độ tối ưu cho Bifidobacteria phá triển: T
opt
: 37 – 41
o
C và không
thể phát triển dưới 20
o
C và trên 46
o
C. Sự phát triển tại nhiệt độ là
Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria .
- -
7


45
o
C dường như có thể phân biệt rõ ràng giữa chủng Bifidobacteria
từ người và từ vật. Chỉ trừ trường hợp của B. thermacidophilum có
thể phát triển tại điều kiện nhiệt độ 49.5
o
C (ưa ấm).
o Bifidobacteria là vi khuẩn đường ruột chịu được acid. pH
opt
vào
khảng 6.5 -7.0, không phát triển tại khoảng pH được ghi nhận là
dưới 4.5 (trừ B. thermacidophilum có thể sống ở pH xuống khoảng 4)
và trên 8.5. Bifidobacteria là vi sinh vật kỵ khí tuy nhiên độ nhạy với
oxy có thể khác nhau tùy loài.
• Cho đến nay đã có 30 loài thuộc Bifidobacteria được phân lập. Bifidobacteria
được sử dụng như các probiotic gồm Bifidobacterium adolescentis,
Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium thermophilus, Bifidobacterium breve,
Bifidobacterium longum…

1.2.1.2 Các chủng của loài bifidobacteria

Bảng 2: Các chủng của loài bifidobacteria
Loài Bifidobacteria Nguồn
B. adolescentis Phân của trẻ em và người lớn, ruột thừa
B. angulatum Phân người lớn
B. animalis Phân của thỏ, chuột, gà, bê
B. asteroids Mật ong
B. bifidum Phân của trẻ em và người lớn
B. boum Chất cặn trong dạ cỏ của động vật nhai lại

B. breve Phân trẻ em
B. catenulatum Phân trẻ em và người lớn
B. choerinum
B. coryneforme Mật ong
B. cuniculi Phân thỏ
B. denticolens Răng sâu của con người
B. dentium Răng sâu của người, phân người lớn
B. gallicum Phân người trưởng thành
B. gallinarium Phân gà
B. infantis Phân trẻ em
B. inopinatum Răng sâu của người
B. lactis Sữa đã lên men
B. longum Phân người lớn và trẻ em
B. magnum Phân thỏ
B. merycicum Dạ cỏ động vật nhai lại
B. minimum Nước cống
B. pseudocatenulatum Phân trẻ em
B. pseudolongum ssp. Phân của chuột, gà, bê, dạ cỏ của động vật nhai lại
Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria .
- -
8

B. psychraerophilum Manh tràng của heo
B. pullorum Phân gà
B. ruminantium Dạ cỏ của động vật nhai lại
B. saeculare Phân thỏ
B. scardovii Phân người trưởng thành
B. subtile Nước cống
B. suis
B. thermacidophilum Kỵ khí trong hệ tiêu hóa

B. thermophilum Phân gà, bê, dạ cỏ của động vật nhai lại
B. thermacidophilum ssp.
porcinum


Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria .
- -
9


Hình 2: Mối quan hệ giữa các chủng của loài Bifidobacteria

Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria .
- -
10

1.2.1.3 Các nhà cung cấp vi sinh vật sản xuất probiotic

Bảng 3: Các nhà cung cấp vi sinh vật sản xuất probiotic
Nhà sản xuất Chủng probiotic
Cargill (Minneapolis, Mỹ) Bifidobacterium animalis subsp. Lactis Bf-6
Bifidobacterium bifidum BF2
Bifidobacterium breve BR2
Bifidobacterium infantis BT
Bifidobacterium lactis BL2
Cell Biotech Europe
(Copenhagen, Đan Mạch)
Bifidobacterium longum BG3
Chr Hansen (Hφrsholm, Đan Mạch)


Bifidobacterium lactis BB12
Bifidobacterium animalis subsp. Lactis B-420

Danisco (Copenhagen, Đan Mạch)
Bifidobacterium lactis HN019
DSM (Heerlen, Hà Lan) Bifidobacterium LAFTI B94
Bifidobacterium breve M16V
Bifidobacterium infantis M-63
Bifidobacterium longum BB536
Morinaga (Tokyo, Nhật Bản)
Bifidobacterium pseudolongum M-602

1.2.2 Các loài có giá trị thương mại
1.2.2.1 Bifidobacterium adolescentis
Thuộc nhóm được tách ra từ phân của người lớn, trẻ em và ruột thừa. Hệ
thống phân nhóm liên quan đến Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium
catenulatum, Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium merycicum, Bifidobacterium
pseudocatenulatum and Bifidobacterium ruminantium và rất khó khăn để phân biệt
kiểu hình của nó với Bifidobacterium dentium. Nó được đặc trưng bởi thành phần
gen GC khoảng 58% trong khi amino acid thành tế bào chứa amino acid Lys (Orn)
– D-Asp. Chủng được tách từ ruột người là ATCC 15703
T
(= DSM 20083
T
= LMG
10502
T
).



Hình 3: Bifidobacterium adolescentis


Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria .
- -
11

1.2.2.2 Bifidobacterium animalis
Mô tả chủng này dựa vào sự phân lập từ phân của các loài động vật khác
nhau. Ở một số tài liệu thì nó được mô tả như Bifidobacterium lactis, được tách ra
từ các sản phẩm bơ sữa. Quá trình tách subsp. Lactis thì chịu áp lực oxy nhiều
hơn subsp. Animalis và điều đó có lợi trong ứng dụng của probiotic, nó cho phép
chúng có thể tồn tại trong điều kiện không kị khí của sản phẩm thương mại, và
điều khác biệt nữa giữa 2 chủng là sự sinh trưởng của chúng trong sữa.
Bifidobacterium animalis thuộc nhóm Bifidobacterium pseudolongum, bao gồm
Bifidobacterium choerinum, Bifidobacterium cuniculi, Bifidobacterium gallicum và
Bifidobacterium pseudolongum. Thành phần DNA G+C của loài này chiếm 61%. Một
loại Bifidobacterium animalis subsp. animalis là ATCC 25527
T
(= LMG 10508
T
= DSM
20104
T
), tách từ phân chuột, một loại B. Animalis subsp. lactis là LMG 18314
T

(=DSM 10140
T
), được tách từ sữa đã lên men.


1.2.2.3 Bifidobacterium bifidum
Bifidobacterium Bifidum cực kì kị khí. Nó là một trong số những loài được
nhận biết dựa vào dấu hiệu quá trình lên men và nó khác hoàn toàn so với những
loài khác trong nhóm bifidobacteria. Trong điều kiện đặc biệt những tế bào có
hình dáng riêng giống “amphora” và cũng thường xuất hiện như một nhánh que.
Loài này được phân lập từ phân của cả người lớn và trẻ em, phân động vật,
nhưng nó được sử dụng trong những sản phẩm của quá trình lên men bơ sữa cho
mục đích probiotic. Một loại của chủng này là ATCC 29521
T
(= DSM20239
T
= LMG
10645
T
), tách ra từ phân của em bé nuôi bằng sữa mẹ.
• B. bifidum là vi khuẩn chiếm đa số ở ruột già người.
• Bảo vệ cơ thể chống sự phá hoại của rotavirus gây tiêu chảy, và điều chỉnh
lại hệ vi sinh vật đường ruột
• Tăng miễn dịch cơ thể, đặc biệt liên quan đến sức khoẻ đường ruột, ngăn
chặn ung thư, không gây hiệu ứng phụ.
• Chống các viêm loét, bảo vệ cơ thể chống lại các vi sinh vật gây bệnh như
Samonella, hạn chế hoạt động của E.coli
• Giảm đáng kể lượng nội độc tố trong ruột tạo thành từ các thành

Hình 4: Bifidobacterium bifidum
Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria .
- -
12


1.2.2.4 Bifidobacterium breve
Loài này được đặc trưng bởi kích thước ngắn, có hay không có sự rẽ nhánh,
với lysine và glycine như là amino acid trong peptidoglycan và có thành phần gen
GC chiếm 58%. Loài này được tách ra từ ruột người, nước cống và trong hệ thống
loài thì liên quan đến Bifidobacterium longum. Loại chủng này là ATCC 15700
T

(=DSM20213
T
= LMG 11042
T
).


Hình 5: Bifidobacterium breve

1.2.2.5 Bifidobacterium longum
Khác với Bifidobacterium breve, tế bào của loài này có hình dạng dài và
mỏng, ít phân nhánh. Nó kị khí và được xem là một trong những loài phổ biến
của bifidobacteria, được tách ra từ phân của người lớn và cả phân của động vật.
Loài gần nó nhất trong hệ thống phân loài là Bifidobacterium breve. Thành phần
gen GC của nó chiếm 60% và sự hiện diện của nhiều plasmid, tính chất duy nhất
trong số những bifidobacteria tách ra từ phân. Một loại của subsp. longum là ATCC
15707
T
(=DSM 20219
T
= LMG 13197
T
), tách ra từ phân của người lớn.

• Giảm lượng nitrate sinh ra trong quá trình tiêu hóa thức ăn.
• Ngăn chăn hoạt động của các vero cytotoxin sinh ra bởi một số chủng
thuộc E.coli, gây bệnh viêm, xuất huyết đường ruột do có khả năng sinh ra
các hợp chất kết hợp với các vero cytotoxin.
• Ngoài ra, Bifidobacterium longum còn hiệu quả trong việc bảo vệ cơ thể
chống lại sự nhiễm Samonella typhimurium.

Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria .
- -
13

Hình 6: Bifidobacterium longum

1.2.3 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi khuẩn
1.2.3.1 Về mặt sản xuất
− Có thể phát triển nhanh chóng với số lượng lớn trong điều kiện lên men
đơn giản và rẻ.
− Có thể tồn tại và phát triển trong điều kiện kị khí hoặc vi hiếu khí.
− Có thể sống sót qua quá trình ly tâm, lọc, đông lạnh hoặc sấy lạnh mà
không mất số lượng đáng kể.
− Có khả năng hoạt hóa nhanh sau khi được sử dụng.
− Có thể sống sót dưới những điều kiện biến đổi khác nhau trong chế biến
thực phẩm bao gồm cả các quá trình nhiệt độ cao trên 45
0
C cũng như chịu đựng
được nồng độ ethanol và sodium cloride cao.

1.2.3.2 Khả năng sống sót trong ruột
− Khả năng chịu được các dịch tiêu hoá: acid trong dạ dày và muối mật.
− Khả năng cư trú trong ruột: khả năng bám chặt và làm giảm số lượng

mầm. bệnh bám trên bề mặt thành ruột.

1.2.3.3 Đặc tính riêng
− Có khả năng sử dụng prebiotic (oligosaccharides, inulin, tinh bột) để
phát triển.
− Khả năng tổng hợp hay sử dụng vitamine (Nhóm B, folate, vitamin K).
− Có khả năng ngăn chặn các mầm bệnh: Samonella typhimurium,
Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Escherichia coli, Candida albicans…
− Có hoạt tính β– galactosidase.
− Có khả năng tổng hợp acid, hydrogen peroxide, các bacteriocin.
Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria .
- -
14

− Khả năng sinh D-lactic acid.
− Có thể sử dụng kết hợp với các vi sinh vật khác.

1.2.3.4 Tính an toàn
− Không gây độc, không ảnh hưởng xấu đến sức khỏe.
- Kiểm tra bằng liều gây chết trên động vật.

































Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria .
- -
15

2. Qui trình công nghệ thu nhận probiotic
bifidobacteria
2.1 Môi trường nuôi cấy và các điều kiện
2.1.1 Môi trường nuôi cấy tiêu chuẩn


Bảng 4: Môi trường nuôi cấy chuẩn
Môi trường Tên Chất thêm vào
MRS De Man Rogosa Sharpe
TPY Tryptone Phytone Yeast
BL Glucose Blood-Liver
CLB Columbia
LCL
Liver Cysteine Lactose
(Blaurock)

RCM Reinforced Clostridia Medium
mMRS Modified MRS L-cysteine HCL, 0.05%
mMRS +
máu
Modified MRS
L-cysteine HCL, 0.05% máu cừu
10 ml
X-a-Gal MRS X-a-Gal
mBL Modified BL without blood L-cysteine HCL, 0.05%
mRCM Modified RCM Lactose 1.0% máu người 50ml
RCPB RCM Prussian Blue 0.03%

2.1.1.1 Môi trường MRS
(g/l)
+ Peptone 10.0g
+ Baptist Meat extract 8.0g
+ Baptist yeast powder 4.0g
+ Glucose 20.0g
+ K

2
HPO
4
2.0g
+ Diammonium hydrogen citrate 2.0g
+ Sodium 5.0g
+ MgSO4 0.2g
+ Manganese sulfate 0.04g
+ Agar 14.0g
+ PH 5.7 +/- 0.2

2.1.1.2 Môi trường TPY
(g/l)
+ Hydrolyzed casein 10.0g
+ Soya Peptone 5.0g
+ Baptist yeast powder 2.0g
+ Glucose 5.0g
Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria .
- -
16

+ L-cysteine 0.5g
+ K
2
HPO
4
2.0g
+ Magnesium chloride 0.5g
+ Zinc sulfate 0.25g
+ Calcium chloride 0.15g

+ Ferric chloride 1.0ug
+ Agar 20.0g
+ Soil temperature 80 1.0g
+ PH 6.5 +/- 0.1

2.1.1.3 Môi trường BL
(g/l)
+ Baptist liver powder 4.0g
+ Peptone 5.0g
+ Baptist Meat extract 3.0g
+ Baptist yeast powder 2.0g
+ Enzymatic digest of casein 5.0g
+ Soluble starch 0.5g
+ L-cysteine 0.5g
+ Glucose 10.0g
+ KH
2
PO
4
1.0g
+ K
2
HPO
4
1.0g
+ Soya Peptone 3.0g
+ MgSO
4
0.2g
+ Ferrous sulfate 0.01g

+ NaCl 0.01g
+ Agar 20.0g
+ Manganese sulfate 0.0067g
+ Tween 80 1.0g
+ PH 7.2 +/- 0.1

2.1.2 Môi trường nuôi cấy thay thế
Môi trường tổng hợp và bán tổng hợp có chứa lactose( 3-7%), proteins,
amino acid, vitamin B, casein trong hệ tiêu hóa bò đang được phát triển để nuôi
cấy bifidobacteria. Ngoài ra còn có thể nuôi cấy bifidobacteria trên môi trường
sữa có bổ sung chất dinh dưỡng.
Môi trường nuôi cấy thương mại như MRS, TPY thì rất mắc tiền vì vậy môi
trường nuôi cấy dựa trên thành phần chủ yếu nước whey được đề ra.

Vi sinh vật: Bifidobacteria bifidum
Chuẩn bị chủng : B.bifidum được phát triển trong môi trường nước thịt MMRS có
bổ sung casein-HCl 0.05% ở 37
0
C trong 24h.

Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria .
- -
17

Whey từ phô mai
Chứa 4.65% lactose và 0.8% proteins tổng.

Chuẩn bị phô mai
Từ sữa bò, 1% môi trường nuôi cấy được thêm vào và được ủ ở 37
0

C trong 24h.
Men dịch vị lấy từ dạ dày bò sẽ được thêm vào để acid hóa khối đông và được ủ ở
37
0
C trong 45 phút. Khối đông mềm dẻo sẽ được cắt ra và thu nhận nước whey.

Tiệt trùng nước whey
Nước whey được tiệt trùng autoclave ở 121
0
C trong 15 phút. Những yếu tố
sinh trưởng sẽ được bổ sung trong quá trình tiệt trùng autoclave : chất chiết nấm
men, casein từ bò, casein từ hệ tiêu hóa của bò, tryptone, peptone, N-acetyl-D-
glucosamine. Những yếu tố sinh trưởng sẽ được thêm vào với nồng độ 10mg/ml
ngoại trừ glucosamine với nồng độ 1mg/ml.

Ảnh hưởng của điều kiện kị khí
Điều kiện kị khí được thực hiện bằng cách thêm vào 0.05% cystrine-HCl,
0.2% ascorbic acid và 0.1% sodium thioglycolate. Dung dịch sẽ được tiệt trùng
autoclave ở 121
0
C trong 15 phút.

Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ
Whey phô mai sẽ được điều chỉnh đến pH 6.6 , 6.8,7.0, 7.2 và 7.4.
50ml nước whey được cấy B. bifidum sẽ được ủ ở nhiệt độ 35, 37, 40 hay 43
0
C

Sự phát triển của vi khuẩn
Ống nghiệm chứa vi sinh vật sẽ được đặt trong tủ ấm N

2
-CO
2
ở 37
0
C trong
18h. pH tại thời điểm đó không quá thấp và tỉ lệ phát triển của vi sinh vật được
giới hạn bởi hàm lượng các yếu tố sinh trưởng trong môi trường. pH cuối không
được thấp hơn 4.8. Vi sinh vật sẽ được đếm trong môi trường MMRS agar ở 37
0
C
sau 72h.

Kết quả
a. Ảnh hưởng của các yếu tố sinh trưởng










Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria .
- -
18

Bảng 5: Ảnh hưởng của các yếu tố sinh trưởng lên sự phát triển của B. bifidum

trong môi trường whey bơ

b. Ảnh hưởng của môi trường kị khí
Không có sự khác nhau trong hoạt động của 3 tác nhân. Số lượng vi sinh vật
trong 1 ml khoảng 2,4.10
-7
. Nước whey bổ sung sodium thioglycolate là môi
trường tốt hơn so với hai tác nhân còn lại. Bifidobacteria là vi khuẩn kị khí bắt
buộc. Sụ phát triển của sinh vật trong môi trường đặc cần một lượng nhỏ khí CO
2

và chịu đựng 3% oxy khí quyển nhưng khi phát triển trong môi trường lỏng chỉ
chịu đựng oxy khí quyển mà không cần CO
2
.
c. Ảnh hưởng của pH
Không có sự khác biệt trong sự phát triển của vi sinh vật khi thay đổi pH. Số
lượng vi sinh vật dao động trong khoảng 2.3 đến 2,4.10
-7
cfu/ml. Khi pH đến 7.6 thì
số lượng vi sinh vật giảm.
d. Ảnh hưởng của nhiệt độ
B. bifidum phát triển tốt trong khoảng nhiệt độ 35-37
0
C. Nhiệt độ trên 37
0
C sẽ
làm giảm số lượng vi sinh vật.














Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria .
- -
19

Lược đồ quy trình sản xuất probiotic



2.2 Lên men
2.2.1 Các hình thức lên men
Lên men theo mẻ hoặc lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất là những quá
trình sản xuất được ưa thích hơn cả trong công nghiệp sữa, bởi vì lên men liên tục
đòi hỏi những bước cô đặc có chi phí cao; tuy nhiên, có những phát triển mới
trong những lĩnh vực này. Với phương pháp lên men theo mẻ, tất cả cơ chất và
giống vi sinh vật được trộn trong thiết bị lên men. Thiết bị lên men có nhiệt độ và
pH được điều khiển cho phù hợp với những điều kiện phát triển tối ưu. Khi nồng
độ probiotic đạt đến mức mong muốn, quá trình sẽ dừng lại, tất cả các tế bào
Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria .
- -

20

được thu gom và quá trình lại được lặp lại. Tùy thuộc vào khối lượng được yêu
cầu mà các thiết bị lên men có thể lớn đến 10000 L. Lên men theo mẻ có bổ sung
cơ chất cho phép thêm vào một lượng giới hạn cơ chất trong suốt quá trình lên
men, và kỹ thuật này thường được sử dụng để gia tăng nồng độ vi khuẩn. Việc
sản xuất môi trường probiotic trong phương pháp lên men theo mẻ có bổ sung cơ
chất có điểm thuận lợi là các exopolysaccharide ít được tạo thành và do đó sản
phẩm ít bị nhớt (Champagne và cộng sự, 2007). Lên men theo mẻ có bổ sung cơ
chất cũng có thể được ứng dụng để gây stress vi khuẩn vào cuối quá trình lên
men nhằm đem lại phản hồi stress (chẳng hạn sự phản hồi stress thẩm thấu hoặc
hòa tan) để bảo vệ chúng khỏi những bước sản xuất tiếp theo)
Do những khó khăn trong việc nhân giống dòng tế bào trên quy mô công
nghiệp, những giống từ sản xuất chuyển thành dạng giống DVS (direct vat set)
được ưa thích hơn trong ngành công nghiệp sữa. Giống DVS là những giống được
làm lạnh khô có nồng độ cao (khoảng 10
11
cfu/g) hoặc đông lạnh (khoảng 10
10

cfu/g) mà có thể được sử dụng để cho trực tiếp vào thiết bị lên men (Honer, 1995;
Oberman và Libudzisz, 1998)
pH thấp là một trong những nguyên nhân chính ức chế sự phát triển, và do
đó, bằng việc kiểm soát pH, có thể đạt được hiệu suất sinh khối cao. Trong những
quá trình theo mẻ, kiểm soát pH đạt được kết quả bằng việc canh chỉnh pH vối
một base (chẳng hạn: ammonium hoặc sodium hydroxide), hoặc sử dụng một
chất đệm phù hợp [như là: N-Tris(hydroxymethyl) methyl-3-
aminopropanesulfonic acid (TAPS) hoặc đệm phosphate]. Khi các vi khuẩn phát
triển, urease thủy phân urea thành acid amonia trung tính. Những kỹ thuật khác
bao gồm việc sử dụng dung dịch muối bão hòa (như là CaCO

3
) hòa tan và trung
hòa dần dần khi đó pH sẽ giảm, kỹ thuật này cũng phù hợp cho việc kiểm soát
pH trong các đĩa agar. Việc tăng sinh khối gấp 10 lần có thể đạt được khi việc
kiểm soát pH được sử dụng trong lên men. Khi các vi khuẩn phát triển với pH
được kiểm soát, tỉ lệ acid hóa đặc hiệu sẽ thấp hơn khi không có sự kiểm soát pH,
điều này có nghĩa phải cần một thể tích giống cao hơn và thời gian lên men lâu
hơn (Salvoie và cộng sự, 2007)
Ngoài lên men theo mẻ (có bổ sung cơ chất), còn có những phương pháp
khác để sản xuất môi trường vi khuẩn nồng độ cao. Chẳng hạn, Doleyres và cộng
sự (2004a) xem xét phương pháp lên men liên tục và mô tả những lợi ích tiềm
năng. Công nghệ này có thể cho hiệu suất tế bào cao, và giảm quá trình cô đặc sau
này được thực hiện trên B. longum ATCC15707 (Doleyres và cộng sự, 2002b). Tuy
nhiên, nguy cơ nhiễm cũng gia tăng khi áp dụng công nghệ này vào quy mô công
nghiệp (Lacroix và Yildirim, 2007). Taniguchi và cộng sự (1987) đã báo cáo về
nồng độ của B. longum cao hơn gấp 7 lần khi sử dụng bình lên men sinh học trong
suốt quá trình lên men. Thiết bị lên men này cung cấp thức ăn là môi trường mới
liên tục, trong khi đó các vi khuẩn được giữ trong thiết bị phản ứng bằng màng
siêu lọc hoặc vi lọc. Vì thế, những chất trao đổi ngăn cản sự phát triển được
chuyển dời ra khỏi hệ thống mà cho phép nhiều hơn sự phát triển của vi khuẩn.
Corre và cộng sự (1992) cũng đã báo cáo về hiệu suất tế bào cao hơn khi sử dụng
Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria .
- -
21

thiết bị phản ứng có membrane tương phản với lên men B. bifidum tế bào cố định.
Schiraldi và cộng sự (2003) báo cáo về nồng độ tế bào được gia tăng và sản xuất có
sự trao đổi chất trong một thiết bị phản ứng có màng membrane tương tự.
Những hướng nghiên cứu khác đang gia tăng trong việc thực hiện quá
trình lên men là cố định các vi khuẩn trong thiết bị lên men. Các vi khuẩn được cố

định trên trái cây (táo và quả mộc qua) được sử dụng để sản xuất số lượng lớn các
acid lactic dùng trong thực phẩm (Kourkoutas và cộng sự, 2005). Những tế bào cố
định được sử dụng trong những lần lên men mẻ sau mà không có sự thất thoát
đáng kể nào về hoạt tính sản sinh acid. Dạng cố định khác có thể đạt được kết quả
bằng cách gắn vi khuẩn vào các hạt gel. Điều này đạt được kết quả bằng cách bẫy
vi khuẩn trong các hạt polymer hình cầu với đường kính khoảng từ 0,3 đến 3 mm
(Champagne và cộng sự, 1994; Lacroix, 2005). Sinh khối hoạt tính được cố định
bằng sự hóa keo bởi nhiệt (κ-carrageenan, gellan, agarose, gelatine) hoặc sự hóa
keo bởi ionic (alginate, chitosan). Sự phát triển được quan sát theo hướng hướng
vào tâm các hạt gel. Sự phát triển giống như màng sinh học này có kết quả trong
việc giải phóng nhiều tế bào vào môi trường, nguyên nhân là do những tác động
va chạm song song trong thiết bị phản ứng (Doleyres and Locroix, 2005). Dựa trên
những kỹ thuật này, nhiều nghiên cứu đã cho thấy hiệu suất sinh khối probiotic
cao. Quellette và cộng sự (1994) đã sản xuất sữa gầy lên men liên tục sử dụng B.
infantis cố định trên κ-carrageenan / những hạt locust bean gum. Số tế bào đếm
được lên tới 2,2.10
9
cfu/ml và năng suất thể tích tối đa khoảng 10
9
cfu/ml.h. Trong
một nghiên cứu khác, B. longum được cố định trên những hạt gellan gum (7.10
9

cfu/g) trong môi trường MRS có bổ sung whey permeate, mà hướng đến việc sản
xuất tế bào nồng độ cao, khoảng 3,5 đến 4,9.10
9
cfu/ ml với D (tỉ lệ pha loãng)
tuần tự 2 – 0,5 h
– 1
(Doleyres và cộng sự, 2002b). Nghiên cứu này cũng trình bày

năng suất theo thể tích cao nhất đối với B. longum là 6,9.10
9
cfu/ml/h. Tuy nhiên,
nồng độ cao này đạt được bằng cách sử dụng tỉ lệ pha loãng khoảng 2 h
–1
mà điều
này làm cho tế bào không được thành.
Trong quá trình lên men hai giai đoạn, dòng lưu chất từ thiết bị lên men
thứ nhất chảy vào thiết bị lên men thứ hai. Lên men hai giai đoạn có thể gia tăng
số lượng tế bào và khả năng sống trong suốt quá trình sản xuất lần sau. Doleyres
và cộng sự (2004a) sử dụng lên men liên tục hai giai đoạn để sản xuất canh trường
bị pha lẫn vào nhau có nồng độ cao (B. longum). Trong thiết bị lên men thứ nhất,
các chủng được cố định tách biệt nhau trên κ-carrageenan / những hạt locust bean
gum; thiết bị lên men thứ hai nhận các tế bào tự do từ thiết bị lên men thứ nhất.
Bố trí như vậy cho phép sản xuất liên tục những tế bào có nồng độ cao, trong khi
tỉ lệ vi khuẩn có thể được kiểm soát bằng nhiệt độ (Doleyres và cộng sự, 2002a,
2004a). Phương pháp sản xuất này cũng cải thiện khả năng chịu đựng những tác
động trong các quá trình tiếp sau này (Doleyres và cộng sự, 2004b).
Một vấn đề trong việc nuôi cấy canh trường có probiotic trong công nghiệp
là tạp chất sinh ra bởi vật ăn vi khuẩn (bacterophages), đặc biệt khi lên men với các
sản phẩm sữa nguyên liệu, mà được sử dụng trong ngành công nghiệp bơ. Cho
đến năm 1995, bifidobacteria được cho rằng không tác động đối với các phage,
Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria .
- -
22

nhưng Ventura và các đồng sự nhận thấy phage giống những thành phần trong
các chủng bifidobacterium (Tamine và cộng sự, 1995; Ventura và cộng sự, 2005). Để
ngăn cản tạp chất phage, hai biện pháp được áp dụng: (1) thực hiện luân phiên
chủng vi khuẩn, điều bất lợi của biện pháp này là những chủng mới không có

cùng những đặc điểm sinh học và những lợi ích về sức khỏe; (2) thêm vào các
probiotic chỉ ở bước sản xuất cuối cùng, điều bất lợi của phương pháp này là tỉ lệ
nhiễm cao hơn , vì không có sự phát triển của probiotic, và điều này sẽ dẫn đến
chi phí sản xuất cao hơn. Do đó, sự kháng lại các phage có thể là một tiêu chuẩn
lựa chọn probiotic phù hợp hơn nữa (Mattila – Sandholm và cộng sự, 2002)


Hình 7: Quá trình lên men liên tục hai giai đoạn để sản xuất các probiotic thích
ứng với stress, với thiết bị phản ứng đầu tiên (R1) thực hiện với tế bào tự do
hoặc cố định và thiết bị phản ứng thứ hai (R2) được tiêm những tế bào tự do
được sản xuất ở R1. (a) Thiết bị phản ứng R1 thực hiện với tế bào tự do (ở mức
độ pha loãng thấp để sản xuất các tế bào ở cuối của pha phát triển theo hệ số
mũ); trong hình bên trái chỉ ra ảnh chụp hiển vi của Bifidobacterium longum
được sản xuất trong hệ thống này. (b) Thiết bị phản ứng thứ nhất R1 thực hiện
với các tế bào cố định ở tỷ lệ pha loãng và mật độ tế bào cao, hình bên trái chỉ ra
hình ảnh vi quang của chủng được chọn Lactococcus lactis được cố định trên
hạt (1,4.10
11
đơn vị /hạt).
Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria .
- -
23

2.2.2 Canh trường tế bào tự do truyền thống
Hầu hết các chủng bifidobacteria không thể phát triển trong môi trường
tổng hợp hoàn toàn và đòi hỏi những cơ chất giàu nguồn nitrogen như các chất
thủy phân casein bò, sữa whey hoặc dịch chiết nấm men (Poch & Bezkorovainy,
1998; Petschow & Talbott, 1990). Sự phát triển của bifidobacteria trong sữa
nguyên kem nhìn chung là chậm và khác biệt rất lớn giữa các chủng. Chẳng hạn,
B. longum và B. bifidum được sử dụng trong canh trường thuần khiết để sản xuất

sữa lên men thì không phát triển trong sữa, trong khi nồng độ tế bào B.
aldolescentis tăng lên chỉ 5 lần trong suốt 48h ủ (Samona và cộng sự, 1996). Mặc dù
sữa chứa những dưỡng chất thiết yếu cho bifidobacteria, sự phát triển của chúng
tương đối chậm vì bị giới hạn nồng độ của các acid amin và các peptide mạch
ngắn. Bổ sung dịch chiết nấm men vào sữa, mà chứa các vitamin hòa tan, khoáng,
acid amin và peptide cũng như nước cốt MRS (de Man, Rogosa & Sharpe, 1960)
cải thiện sự phát triển (Roy, Dussault & Ward, 1990). Thêm vào đó, môi trường
dựa trên sữa phải được bổ sung với những cơ chất có khả năng oxy hóa khử thấp
như là cysteine hoặc acid ascorbic để giảm khả năng oxy hóa cao của sữa và để
đạt được yêu cầu kỵ khí của bifidobacteria (Roy và cộng sự, 1990). Bởi vì những
yêu cầu dinh dưỡng và tính cạnh tranh thấp của chúng khi trộn với LAB khác,
bifidobacteria thường được nhân giống trong canh trường thuần khiết và cuối
cùng mới trộn với những canh trường (Tamine, Marshall & Robinson, 1995).

Bảng 6: Dữ liệu sản xuất bifidobacteria trong những hệ thống lên men và điều
kiện môi trường khác nhau


Trong phương pháp lên men tế bào tự do theo mẻ cổ điển của sữa với canh
trường thuần khiết của bifidobacteria có hoặc không có kiểm soát pH, những yếu
tố chính giới hạn sự phát triển là sự tích lũy những sản phẩm cuối của quá trình
Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria .
- -
24

trao đổi chất như lactic, acid acetic, và việc tháo xả nước cốt môi trường
(Desjardins, Roy, Toupin & Goulet, 1990). Những nghiên cứu về bifidobacteria
phát triển trong sữa gầy đã được lọc siêu không có kiểm soát pH cho kết quả sản
lượng tế bào tối đa của những chủng khác nhau phổ rộng từ 6,2.10
8

đến 1,7.10
9

cfu/ml đối với sữa gầy và từ 2,9.10
9
đến 3,6.10
9
cfu/ml đối với sữa gầy cô đặc 5 lần
bằng siêu lọc (Ventling & Mistry, 1993). Số lượng tế bào lớn đạt được với lọc siêu
được kết hợp với thể tích đệm làm gia tăng thêm do nồng độ cao của protein và
các muối không hòa tan, mà vẫn duy trì pH của sữa ở giá trị hỗ trợ sự phát triển
bifidobacteria trong thời gian dài.
Môi trường dựa trên whey cũng được phát triển để sản xuất bifidobacteria
(Core, Madec & Boyaval, 1992). Trong nghiên cứu này, whey được bổ sung thêm
acid casamino hoặc dịch chiết nấm men và một chất khử, như acid ascorbic hay
cysteine, là môi trường thích hợp cho B. bifidum phát triển trong suốt quá trình lên
men theo mẻ không có sự điều chỉnh pH. Tuy nhiên, lượng tế bào tối đa (9.10
8

cfu/ml) thấp hơn môi trường MRS-cysteine giá trị cao (1,4.10
9
cfu/ml), trong đó
việc nhân giống bifidobacteria được thực hiện trong phòng thí nghệm. Lượng
bifidobacteria cao trong môi trường MRS cho kết quả với bốn chủng của B.
longum, với nồng độ tế bào tối đa là 3,3; 8,9; 3,7; và 1,3.10
9
cfu/ml tại pH theo thứ
tự là 5.5, 6.0, 6.5 và 7.0 (Reilly và Gilliland, 1999)
Việc bổ sung vào môi trường MRS với whey permeate cho thấy sự gia tăng
tốc độ phát triển bifidobacteria trong quá trình lên men theo mẻ có kiểm soát pH

(Doleyres và cộng sự, 2002b). Whey permeate là phụ phẩm giá trị thấp của ngành
công nghiệp bơ, chủ yếu chứa lactose (80 – 85%), khoáng (2.5%) và các hợp
chấtchứa nitrogen (2%) trên cơ sở ẩm tự do. Sản lượng rất cao B. bifidum đạt được
trong 12h lên men trong môi trường MRS-whey permeate-cysteine, đạt đến 9,0;
17,3; 15,0; và 6,3.10
9
cfu/ml tại pH tuần tự là 5.0; 5.5; 6.0 và 6.5, so với 8,7.10
9

cfu/ml trong môi trường cysteine sau 12h lên men ở pH 5.5 (Doleyres và cộng sự,
2002b)
Để sản xuất thực phẩm bổ sung probiotic cho người ăn kiêng trong môi
trường chi phí thấp, dịch chiết thịt chứa nước cốt thịt MRS thay thế thành công
cho môi trường dựa trên peptone đậu nành, glucose và dịch chiết nấm men cho
quá trình nhân giống bifidobacteria, mà không ảnh hưởng đến tổng số tế bào tối
đa và thời gian ủ (Heenan, Adams, Hosken & Fleet, 2002). Một môi trường rau có
chứa 6% nước ép cà rốt, 12% nước ép cải bắp và 3% nước ép hành tây thích hợp
cho việc nhân giống B. breve và B. bifidum (Savard, Gardner và Champagne, 2003).
Tuy nhiên, việc thất thoát lượng lớn tế bào xảy ra trong suốt quá trình dự trữ của
nước ép rau củ đã lên men ở 4
o
C trong 30 – 60 ngày, do thể tích dịch đệm của môi
trường thấp gây hại cho việc acid hóa về sau.
Nghiên cứu về số lượng chỉ ra rằng sữa đậu nành hỗ trợ sự phát triển của
bifidobacteria nhưng ở mức độ thấp hơn nhiều so với sữa bò hay MRS (Kamaly,
1997; Chou & Hou, 2000; Wang và công sự, 2002). Chẳng hạn, tổng số tế bào B.
longum và B. bifidum sau 24h lên men trong sữa đậu nành không kiểm soát pH đạt
được tuần tự 5,0.10
7
và 1,3.10

8
cfu/ml, trong khi nồng độ cao hơn 3 – 10 lần trong
Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria .
- -
25

sữa hoàn nguyên và MRS (Kamaly, 1997). Tương tự nồng độ tối đa đạt được
trong sữa đậu nành sau 48h phát triển của những chủng khác B. infantis và B.
longum đạt đến 3,2.10
8
và 1,3.10
7
cfu/ml theo thứ tự (Chou & Hou, 2000). Tuy
nhiên, Garro, de Valdez và de Giori (2004) cho kết quả rằng nồng độ cao 1,5.10
9

cfu/ml của B. longum đạt được trong sữa đậu nành sau 8h ủ ở 37
o
C, chỉ ra những
ảnh hưởng chính của việc lựa chọn chủng và thành phần sữa đậu nành.
Trong một nghiên cứu để so sánh việc sử dụng đường trong các canh
trường B. longum, lên men tế bào tự do theo mẻ và liên tục được thực hiện trong
môi trường MRS chứa lactose hoặc glucose như là nguồn carbon (Kim, Song,
Kang và Oh, 2003). Nồng độ tế bào cuối sau 22h lên men theo mẻ trên lactose và
glucose lần lượt là 4,37 và 3,42 g tế bào khô/l, trong khi nồng độ tế bào B. longum
thấp hơn trong quá trình lên men liên tục, trung bình khoảng 2.5 – 3.0 g/l cho tỉ lệ
pha loãng (D) phổ rộng từ 0,07 đến 0,33 h
–1
. Tuy nhiên, tính theo hiệu suất, lên
men liên tục cho phép sản lượng là 0,75 – 0,90 gl

–1
h
–1
với D = 0,33 h
–1
, so với chỉ
0,15 – 0,20 gl
–1
h
–1
trong suốt 22h lên men theo mẻ. Việc gia tăng D lên đến 0,4 h
–1
,
gần với tỉ lệ phát triển đặc hiệu cao nhất của B. longum, kết quả là làm giảm khối
lượng tế bào khô xuống khoảng 1,8 g/l, mà vẫn tương đương hiệu suất 0,7 gl
–1
h
–1

(Kim và cộng sự, 2003)

2.2.3 Ảnh hưởng của những tính chất công nghệ đến đặc tính của tế bào
Khả năng của vi sinh vật đường ruột phát triển và tồn tại phụ thuộc nhiều
vào khả năng thích ứng với sự thay đổi môi trường của nó. Sự thích nghi với môi
trường không có lợi thường xuyên kết hợp với sự cảm ứng của số lượng chủng,
sự tổng hợp của protein cảm ứng với stress (stress – response) và sự phát triển của
hiện tượng đề kháng chéo (cross – resistance) to various stress. Hiện nay các kỹ
thuật chủ yếu dựa trên sự nuôi cấy của tế bào tự do trong tình trạng bỏ đói hoặc
các điều kiện gây stress khác, ví dụ như nhiệt, nồng độ cao của muối, muối mật,
H

2
O
2
hoặc pH thấp. Nó cũng được biết đến như tế bào trong pha tĩnh có khả năng
chịu đựng hơn trong môi trường so với tế bào phát triển theo hàm mũ.
Tuy nhiên, một nghiên cứu nhỏ đã được biết đến trên khả năng thích nghi
stress của bifidobacteria. Sự phản ứng của những chủng bifidobacteria khác nhau
với việc tăng nhiệt độ gây chết, muối hoặc xứ lý muối mật bằng cách tổng hợp các
protein có tính bảo vệ đặc hiệu chống stress kết quả là khả năng chịu đựng được
cải thiện. Ví dụ, gia nhiệt tế bào B. adolescentis tới 47
o
C trong khoảng thời gian 15
phút trước khi sốc nhiệt lần lượt trong khoảng 10s và 20s. Hơn thế nữa, sự bảo vệ
chéo (cross- protection) được chứng minh trong nghiên cứu này sau khi xử lý muối
(salt treatment) là kết quả của sự tăng khả năng chịu đựng sau giai đoạn rã đông
(frezze – thawing cycles) (14-fold khả năng tồn tại cao hơn với các tế bào khi xứ lý
thô với 2% NaCl trong 1h – 14 – fold khả năng sống sót của tế bào cao hơn trước
xử lý là 2% ) hoặc stress bằng nhiệt độ gây chết (lethal heat stress) (15-fold khả
năng tồn tại cao hơn tại 55
o
C đã đạt được bằng xứ lý thô với 1.5% NaCl trong 1h).
Một số nhà nghiên cứu đã quan sát khả năng thích nghi acid tại pH 5.2 trong 2h