BÁO CÁO
PP PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI
HPLC
TRONG AN TOÀN
THỰC PHẨM
Phần dành cho đơn vị
Nhóm 2:
Bùi Thy Anh 2051778
Nguyễn Thị Thanh Loan 2051820
Đặng Minh Nhựt 2051838
Phạm Hoàng Ánh Phương 2051846

PHÂN TÍCH NITROFURAN
BẰNG HPLC MS/MS
1.Giới thiệu chung:
Nitrofuran la chất kháng sinh được dùng
trong chăn nuôi và thủy sản. Hiện nay
Nitrofuran bị cấm sử dụng do dư lượng
của chúng có thể gây ung thư đối với
người tiêu dùng.
Nitrofuran có 4 chất chính :
Furazolidone,Furaltadone, nitrofurazone,
nitrofurantoin.
Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp
của Viện Kiểm soát Chất lượng sản phẩm nông nghiệp
Hà lan (RIKILT).
Dư lượng liên kết với mô của các chất chuyển hoá nhóm
nitrofuran trong sản phẩm thuỷ sản được thuỷ phân
bằng axit clohyđric loãng để thu được mạch nhánh của
các chất nhóm nitrofuran. Các mạch nhánh này được
dẫn xuất hoá bằng 2-nitrobenzalđehyt. Ðịnh tính và

định lượng các chất dẫn xuất bằng LC/MS/MS bằng
cách sử dụng các đồng vị đơtơri như chất chuẩn nội.
Giới hạn phát hiện 1mg/kg
2. Nguyên tắc

3.Thiết bị, dụng cụ
1 Cân phân tích, độ chính xác 0,01 mg.
2 Cân phân tích, độ chính xác 0,01 g.
3 Máy nghiền
4 Máy ly tâm
5 Tủ ấm (có thể điều chỉnh được ở khoảng nhiệt độ 37oC 2oC)
6 Hệ thống cô bằng khí Nitơ
7 Máy lắc Vortex.
8 Màng lọc PTFE, 13mm, 0,45mm.
9 Giấy thử pH
10 Pipet 100ml
11 Hệ thống LC/MS/MS:
- Hệ thống sắc kí lỏng: Water Alliance 2690 hoặc tương đương gồm bơm và hệ
thống tiêm mẫu; - Cột bảo vệ pha đảo C18 (Symmetry Sentry Guard hoặc
tương đương), kích thước 20 x 3,9mm; - Cột C18 (Symmetry hoặc tương
đương) kích thước150 x 3,0 mm, 5mm, - Ðầu dò khối phổ dạng bốn cực với
giao diện ESI (Triple quadrupole Micromass Quattro Ultima hoặc tương
đương).
12 ống ly tâm 14ml, polypropylen hoặc thuỷ tinh, có nắp đậy
13 Máy lắc ống nghiệm
14 Lọ đựng mẫu cho HPLC
15 Bình định mức 10ml, 20ml, 100ml
16 Dụng cụ thủy tinh thông thường.
17 Máy lắc đảo đầu (Heidolf REAX2) hoặc tương đương


Hóa chất và Chất chuẩn
Hóa chất
•
Hoá chất phải là loại tinh khiết được sử dụng để phân tích gồm:
•
1 Metanol
•
2 Axit clohydric (HCl) 32%.
•
3 2-nitrobenzalđehyt (C7H5NO3) viết tắt làNBA.
•
4 Natri phosphat ngậm nước Na3PO4.12H2O.
•
5 Natri hyđroxyt khan (NaOH).
•
6 Etyl axetat (CH3COOC2H5).
•
7 Axit axetic (CH3 COOH).
•
8 Axetonitril (CH3CN).
•
9 Metanol -d, 99,5% D. 5.2.10 Nước
Chất chuẩn
•
1 3-amino-2-oxazolidinon (AOZ).
•
2 5-metylmorfolino-3-amino-2-oxazolidinon (AMOZ).
•
3 1-amino-hyđantoin hyđroclorit (AHD).
•

4 Semicarbazit (SEM) hyđroclorit.
•
5 3-amino-2- oxazolidinon-d4 hyđroclorit (AOZ-d4).
•
6 5-metylmorfolino-3-amino-2-oxazolidinon-d5 (AMOZ-d5).
•
7 1-amino-hyđantoin hyđroclorit-d2 (AHD-d2).
•
8 3-((2-nitrophenyl)metylen)-amino-2-oxazolidinon (NPAOZ).
•
9 5-metylmorfolino-3-((2-nitrophenyl)metylen)-3-amino-2-oxazolidinon
(NPAMOZ).
•
10 1-((2-nitrophenyl)metylen)-amino-hyđantoin (NPAHD).
•
11 (2-nitrophenyl) metylen-semicarbazit (NPSEM).

CÁCH TIẾN HÀNH
Chuẩn bị
các dung dich và mẫu
Xử lý mẫu Chạy máy sắc ký Xử lý kết quả

Chuẩn bị các dung dịch
•
Axit clohyđric 0,2M
•
2-nitrobenzalđehyt (NBA) 100mM trong metanol nồng
độ 0,1M
•
Natri phosphat 0,3M

•
Dung môi hoà tan mẫu: trộn 50ml axetonitril (5.2.8),
450 ml nước (5.2.10) và 0,5 ml axit axetic
•
Pha động A: trộn 1ml axit axetic đã chuẩn bị với
1000ml nước lọc qua màng lọc 0,45mm.
•
Pha động B: trộn 900ml axetonitril với 100ml nước và
1ml axit axetic lọc qua màng lọc 0,45mm

Chuẩn bị các dd chuẩn
Phương pháp tiến hành
Chuẩn bị mẫu
•
Mẫu thử nghiệm.
•
Mẫu kiểm soát chất lượng
•
Mẫu kiểm soát âm tính: mẫu trắng không chứa AOZ,
AMOZ, AHD và SEM
•
Mẫu kiểm soát dương tính: mẫu trắng được bổ sung
AOZ, AMOZ, AHD và SEM
Xử lý mẫu: Vì các chất dẫn xuất nitrophenyl rất nhậy với ánh sáng nên toàn
bộ qui trình xử lý mẫu phải được tiến hành dưới ánh sáng yếu (ánh
sáng vàng).
1 Thuỷ phân và dẫn xuất hoá mẫu:5 ml axit clohyđric 0,2M + 50ml dung
dịch 2-NBA trong metanol giữ qua đêm hiệt độ 372oC.
2. Trung hoà :500 ml dung dịch Na3PO4 0,3M vào mẫu. Lắc mẫu bằng tay.
Ðiều chỉnh pH về 7+-0,5 bằng dd NaOH 2M.

3. Chiết Thêm 4ml etyl axetat vào mẫu đã điều chỉnh pH
4. Chuẩn bị mẫu phân tích :Hoà tan cặn khô bằng 500ml dung môi hoà tan
mẫu
5. Phân tích trên LC/MS/MS
6. a. Tốc độ: 0,4 ml/phút; b. Thể tích mẫu tiêm: 50 ml; c. Nhiệt độ cột:
40oC; d. Toàn bộ thời gian phân tích: 22 phút; đ. Pha động: chế độ
gradien theo Bảng 2

Thời gian (phút) Pha động A Pha động B
0 90 10
1 90 10
14 55 45
16 10 90
18 10 90
19 90 10

Điều kiện đầu dò MS và MS/MS
6.2.5.2 Ðiều kiện của đầu dò MS
•
a. Tỉ số chia: xấp xỉ 1 : 2
•
b. Kiểu ion hoá: ESI, dương
•
c. Ðiện thế mao quản: 2,7 kv
•
d. Ðiện thế khối nón: 30 v
•
đ. Nhiệt độ nguồn: 120oC
•
e. Nhiệt độ khử dung môi: 300oC

•
g. Tốc độ dòng khí khử dung môi: 500 l/h
•
h. Tốc độ khí qua khối nón: 200 l/h
•
i. Khí gây phân ly bằng va chạm: Argon, p = 3,2.10-3 bar.
6.2.5.3 Ðiều kiện phân ly MS/MS NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD và
NPSEM bị phân ly thành các ion thứ cấp liên quan đến cấu trúc.
Các chất đồng vị đánh dấu được sử dụng làm chất chuẩn nội
cũng có cách phân ly tương tự (Bảng 3).

•
6.2.6 Kiểm tra hiệu năng của hệ thống LC/MS/MS
Tiêm dung dịch chuẩn làm việc 1mg/l (5.5.4). Xác định
tỷ lệ tín hiệu/nhiễu (S/N) đối với bước chuyển có
cường độ thấp nhất. Tỷ lệ S/N phải lớn hơn 6. Lặp lại
bước tiêm để kiểm tra sự lặp lại của thời gian lưu, diện
tích pic và tỉ lệ các ion.
•
6.2.7 Trình tự tiêm mẫu Các mẫu sẽ được phân tích
theo trình tự sau:
•
a. Dung môi trắng;
•
b. Mẫu kiểm soát âm tính ;
•
c. Mẫu kiểm soát dương tính
•
d. Mẫu kiểm soát độ thu hồi
•

đ. Dung môi trắng;
•
e. Mẫu cần kiểm nghiệm
•
g. Dung môi trắng;
•
h. Mẫu kiểm soát âm tính
•
i. Mẫu kiểm soát dương tính

TÍNH TOÁN KẾT QUẢ
•
Tính lượng chất cần phân tích có mặt trong mẫu kiểm theo
công thức sau:
RF – b
X =
a

- X là lượng chất cần phân tích có trong mẫu kiểm (mg/kg). (*)
- RF là hệ số tín hiệu (công thức 5).
- b là độ dựng của đường chuẩn tính theo phương pháp hồi qui
tuyến tính.
- a là độ dốc của đường chuẩn tính theo phương pháp hồi qui tuyến
tính. (**)

Phương pháp định lượng aflatoxin bằng
sắc ký lỏng hiệu năng cao
1. Đặt vấn đề

Aflatoxin là những chất chuyển

hóa có độc tính cao của nấm
Aspergillus flavus và Aspergillus
paraciticus. Các loài nấm này rất dễ
sinh sản trên các nguyên liệu giàu
tinh bột hay những hạt có dầu nên
Aflatoxin có thể tìm thấy trên rất
nhiều loại thực phẩm như : Đậu
phộng, càfe, sữa, tương , chao bắp
và các loại ngũ cốc khác



Dựa trên đặc tính lý hóa và tính độc khác nhau các
Aflatoxin được chia thành nhiều nhóm : B ( B1 , B2); G
(G1, G2); M (M1, M2); P1 và Q1

Aflatoxin được xem như là một trong các tác nhân gây
ung thư gan ở người và gây ra dị tật thai ở phụ nữ mang
thai và còn có nhiều tác hại nguy hiểm khác
2. Nguyên tắc
Aflatoxin có trong mẫu thực phẩm bao gồm các nhóm
B1, B2, G1 và G2 được chiết tách ra bằng clorofom. Dịch
chiết đựơc làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn
(SPE) trên silicagel. Hàm lượng aflatoxin có trong dịch
chiết được xác định trên hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh
quang theo phương pháp ngoại chuẩn. Giới hạn phát hiện
của phương pháp là 1,5 µg/kg.


Hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang.


Cột sắc ký pha đảo LC18 kích thước L x ID là 25 cm x
4,6 mm, đường kính hạt từ 5-10 µm

Nước cất, Metanol, Clorofom, Axetonitril, n-hexan Ete
etylic tinh khiết loại dùng cho HPLC

Silicagel đã được hoạt hóa: cân 50,0 g silicagel tinh khiết
để vào tủ sấy trong 2 giờ ở nhiệt độ 110oC. Sau đó để nguội
về nhiệt độ của phòng trong bình hút ẩm và ngâm trong
clorofom 15 phút trước khi nhồi cột

Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp aflatoxin trong
metanol từ các ống chuẩn. Tùy theo nồng độ các aflatoxin
có trong ống chuẩn, dùng bình định mức và lượng metanol
thích hợp
3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, chất chuẩn và dung dịch thử


Dung dịch chuẩn trung gian có nồng độ là B1 (10,0 µg/l),
B2 (2,0 µg/l), G1 (10,0 µg/l) và G2 (2,0 µg/l): hút chính xác 1,0
ml dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp vào bình định mức 10 ml rồi
định mức tới vạch bằng methanol

Dung dịch chuẩn: hút chính xác lần lượt 0,0 ml, 1,0 ml, 2,0
ml, 4,0 ml, 8,0 ml và 10,0 ml dung dịch chuẩn trung gian vào
các bình định mức 10 ml rồi định mức tới vạch bằng metanol
4. Phương pháp tiến hành
4.1 Chuẩn bị mẫu thử
- Dùng cân phân tích cân chính xác 50,0 g mẫu (m) đã được

băm nhuyễn cho vào ống ly tâm thuỷ tinh dung tích 250 ml
- Thêm 100,0 ml clorofom vào ống rồi trộn đều trong khoảng 2
phút bằng máy nghiền đồng thể Sau đó, ly tâm ống bằng máy ly
tâm trong khoảng 5 phút ở tốc độ 5 000 vòng/phút. Tiến hành
lọc dịch chiết và rửa phần bã bằng clorofom rồi cho tất cả dịch
thu được vào bình cầu thuỷ tinh dung tích 250 ml

- Thêm 2,0 ml dung dịch chuẩn 3 vào 10,0 g mẫu trắng.
Tiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị với mẫu thử
theo qui định tại Ðiều 5.1.
4.2 Chuẩn bị mẫu trắng
4.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi
4.4 Làm sạch dịch chiết
Làm sạch dịch chiết :Cô dịch chiết thu được trên hệ thống cô
quay chân không còn khoảng 5,0 ml ở nhiệt độ 40 oC. Dùng
pipet chuyển dung dịch từ bình cầu vào cột làm sạch đã chuẩn
bị và tráng rửa bình cầu bằng clorofom. Ðiều chỉnh khoá để tốc
độ chảy của dung dịch ra khỏi cột khoảng từ 1,0 đến 1,5
ml/phút. Trong giai đoạn này, aflatoxin sẽ hấp phụ lên các hạt
silicagel.


Ðiều kiện phân tích
a. Cột sắc ký : RP-LC 18, kích thước L x ID là 25 cm x 4,6
mm, đường kính hạt 5-10 µm
b. Nhiệt độ cột : 35C.
c. Pha động : Hỗn hợp gồm: axetonitril, metanol và nước
cất d. Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.
4.5 Tiến hành phân tích trên HPLC
Tiến hành làm sạch mẫu trắng (5.2) và mẫu để xác định

độ thu hồi (5.3) giống như với mẫu thử (5.1) theo qui định
đ. Bước sóng cài đặt cho đầu dò huỳnh quang là:
(kích hoạt) E x 365 nm, (phát xạ) Em 455 nm.
e. Thể tích tiêm : 20 µl.


Tiêm các dung dịch chuẩn (4.3.4) vào máy HPLC theo
thứ tự nồng độ từ thấp đến cao. Mỗi dung dịch tiêm 2 lần,
tính diện tích pic trung bình. Dựng đường chuẩn biểu thị
mối quan hệ giữa các diện tích pic thu được và nồng độ
từng loại aflatoxin theo quan hệ tuyến tính bậc 1 (phương
trình y = ax + b).

Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng và dung
dịch xác định độ thu hồi vào hệ thống HPLC. Mỗi dung dịch
mẫu tiêm 2 lần. Tính giá trị trung bình.
4.6 Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích

Ðộ lặp lại của 2 lần tiêm

Ðộ lệch chuẩn (CVs) tính theo diện tích pic sắc ký của 2
lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %.

Ðộ thu hồi (R)


Ðộ thu hồi được xác định bằng cách sử dụng 10 mẫu
trắng đã cho vào một lượng dung dịch aflatoxin chuẩn đã
biết hàm lượng chính xác (5.3). Ðộ thu hồi tính được phải
nằm trong khoảng từ 85 % đến 115 %, độ thu hồi trung bình

phải lớn hơn 90 %

Ðường chuẩn phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương
quan quy hồi tuyến tính (R2) phải lớn hơn hoặc bằng 0,99.
Hàm lượng các aflatoxin có trong mẫu được tính trên cơ sở
đường chuẩn thu được. Với đường chuẩn ở dạng y = ax +b,
hàm lượng các aflatoxin có trong mẫu được tính theo công
thức sau:
5. Tính kết quả
Hàm lượng các aflatoxin có trong mẫu được tính trên cơ
sở đường chuẩn thu được. Với đường chuẩn ở dạng y = ax
+b, hàm lượng các aflatoxin được tính theo công thức sau

(Y - b)
C (µg/kg) = xF
a
Trong đó:
- C là nồng độ aflatoxin có trong mẫu, tính theo µg/kg
- Y là hiệu số giữa diện tích pic của dịch chiết và diện tích pic
có trong mẫu trắng tiêm vào HPLC, tính theo đơn vị diện tích
- a, b là các thông số của đường chuẩn y = ax + b- F là hệ số
pha loãng mẫu và có giá trị bằng tỉ số giữa thể tích dịch chiết
thu được sau khi làm sạch V và khối lượng mẫu m sử dụng.

PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
CHLORAMPHENICOL TRONG SỮA
BẰNG SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP – PHỔ
KHỐI LƯỢNG (HPLC/MS-MS)

NỘI DUNG

•
GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC
•
TRÌNH BÀY PHƯƠNG
PHÁP
•
KẾT LUẬN

GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC
•
Chloramphenicol là một loại kháng sinh phổ rộng,
nó được sử dụng thường xuyên cho quá trình chế
biến thực phẩm có nguồn gốc động vật nhờ có các
đặc tính kháng khuẩn và dược động học tuyệt vời
của nó.
•
Tuy nhiên, trong cơ thể người nó lại có thể gây ra
những độc tính huyết học, cụ thể là thiếu máu biến
dạng với một hàm lượng nào đó chưa được xác định
rõ.