ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC



LÊ HOÀNG ANH




PHƯƠNG PHÁP LY TRÍCH, THU NHẬN VÀ
LÀM GIÀU ACID DOCOSAHEXAENOIC (DHA)
TỪ MỢ CÁ BA SA Pangasius bocourti Sauvage





KHÓA LUẬN CỬ NHÂN SINH HỌC
NGÀNH SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC ĐỘNG VẬT

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN KIM PHI PHỤNG











Thành phố Hồ Chí Minh – 2006

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến

Bố Mẹ và gia đình đã chăm sóc, nuôi dưỡng và dạy dỗ để tôi có ngày hôm nay.
Cô Nguyễn Kim Phi Phụng và Thầy Phan Kim Ngọc đã tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất
để tôi hoàn thành khóa luận này.
Quý thầy cô, các anh chị khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên và quý thầy cô, các anh
chị, các bạn khoa Hóa học trường Đại họcKhoa học Tự nhiên đã quan tâm, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt
thời gian tôi thực hiện đề tài.


Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2006
Lê Hoàng Anh

MỤC LỤC


Trang
MỤC LỤC i
DANH MỤC BẢNG BIỂU iv
DANH MỤC SƠ ĐỒ iv
DANH MỤC HÌNH ẢNH v


MỞ ĐẦU 1

I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
I.1. Kiến thức tổng quát 3
I.1.1. Giới thiệu về chất béo 3
I.1.2. Giới thiệu về acid béo 4
I.2. Giới thiệu về acid docosahexaenoic (DHA) 5
I.2.1 Tính chất hóa học 5
I.2.2 Nguồn hiện diện

7

I.2.3. Các phương pháp ly trích, cô lập và tinh sạch DHA 8
I.2.3.1. Phương pháp phân đoạn bằng li tâm phân tử 8
I.2.3.2. Phương pháp sắc ký khí định lượng 8
I.2.3.3. Phương pháp sắc ký cột 8

I.2.3.4. Phương pháp CO
2
siêu tới hạn 9
I.2.3.5. Phương pháp trích bằng chất lỏng siêu tới hạn 9
I.2.3.6. Phương pháp bạc nitrate 9
I.2.4. Phương pháp nhận danh DHA 10
I.2.4.1. Phương pháp sắc ký khí, sắc ký khí/khối phổ và sắc ký khí mao dẫn 10
I.2.4.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 10
I.2.4.3. Phương pháp ái lực pha rắn với ion bạc và sắc ký lớp mỏng
có chỉnh đổi 10
I.2.4.4. Phương pháp phổ hồng ngoại chuyển dạng Fourier 11
I.2.4.5. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 11
I.2.5. Tác dụng của DHA đối với cơ thể 11
I.2.5.1.Vai trò của acid béo 11
I.2.5.2.Vai trò của DHA 12
I.2.5.2.1. Tác dụng đối với bào thai và trẻ sơ sinh 12
I.2.5.2.2. Tác dụng đối với thị giác và màng tế bào 12
I.2.5.2.3. Tác dụng đối với não 12
I.2.5.2.4. Tác dụng đối với bệnh thấp khớp 13
I.2.5.2.5. DHA và bệnh ung thư 13
I.2.5.2.6. Tác dụng đối với các bệnh tim mạch 13
I.2.5.2.7. Tác dụng đối với huyết áp và hàm lượng lipid trong huyết tương 14
I.3. Các phương pháp tiến hành trong thí nghiệm 15
I.3.1. Phương pháp thủy giải 15
I.3.2. Sắc ký lớp mỏng 16
I.3.3. Sử dụng phương pháp tủa urê để loại bỏ các acid béo bão hòa 17
I.3.3.1. Giới thiệu 17
I.3.3.2. Phương pháp tiến hành 18
I.3.4.Phương pháp sắc ký ghép khối phổ 18
I.3.4.1. Nguyên tắc hoạt động 18

I.3.4.2. Sơ đồ thiết bị GC/MS 18
I.4. Giới thiệu về cá ba sa Việt Nam (Pangasius bocourti SAUVAGE, 1880) 19
I.4.1. Các đặc điểm chính 19
I.4.2. Phân loại 20
I.4.3. Thành phần acid béo trong mỡ cá ba sa Việt Nam 20


II. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 22
II.1. Vật liệu 23
II.1.1. Đối tượng nghiên cứu 23
II.1.2. Dụng cụ - thiết bị - hóa chất 24
II.1.2.1. Dụng cụ 24
II.1.2.2. Thiết bị 24
II.1.2.3. Hoá chất 24
II.2. Phương pháp 24
II.2.1. Bố trí thí nghiệm 24
II.2.2. Chuẩn bị mẫu 25
II.2.3. Phương pháp thủy giải 25
II.2.4. Sắc ký lớp mỏng 25
II.2.5. Phương pháp tủa urê 25
II.2.6. Phương pháp sắc ký ghép khối phổ 26
II.2.6.1.Phương pháp ester hóa acid hữu cơ 26
II.2.6.2. Phương pháp sắc ký ghép khối phổ 26

III. KẾT QUẢ -THẢO LUẬN 33
III.1. Kết quả phương pháp thủy giải 34
III.1.1. Ảnh hưởng của thời gian lên phản ứng thủy giải 34
III.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol lên phản ứng thủy giải 34
III.1.3. Ảnh hưởng của dung môi hòa tan lên phản ứng thủy giải 34
III.1.4. Mô tả thí nghiệm 35

III.1.5. Nhận xét 35
III.2. Kết quả phương pháp tủa urê 36
III.2.1. Mô tả thí nghiệm 36
III.2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ urê/acid béo (w:w) lên phản ứng 36
III.2.3. Nhận xét 37
III.3 Khảo sát hàm lượng DHA có trong dầu béo A
1
37
III.4. So sánh với kết quả thu được của các tác giả khác 40
III.4.1. So sánh với các kết quả đạt được bởi các tác giả : PGS.TS.
Hoàng Đức Như, Huỳnh Kiến Thành, Nguyễn Thị Bích Liên và
Mai Thị Diệu Thảo 40
III.4.2. So sánh với kết quả đạt được của Phạm Thị Anh 41
III.4.2.1. Phương pháp thực hiện 41
III.4.2.2. Kết quả 42

IV. KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 44
IV.1. Kết luận 45
IV.2. Đề nghị 46


TÀI LIỆU THAM KHẢO 47


PHỤ LỤC










DANH MỤC BẢNG BIỂU

Trang
Bảng I.1. Các acid béo thường gặp 6
Bảng I.2. Thành phần tương đối của các acid béo có trong mỡ cá ba sa thô 21
Bảng III.1. Ảnh hưởng của thời gian lên phản ứng thủy giải 34
Bảng III.2. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol lên phản ứng thủy giải 34
Bảng III.3. Ảnh hưởng của dung môi hòa tan lên phản ứng thủy giải 35
Bảng III.4. Hiệu suất phản ứng thủy giải ở điều kiện tối ưu 35
Bảng III.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ của urê/acid béo lên phản ứng tủa urê 36
Bảng III.6. Hiệu suất phản ứng tủa urê 37
Bảng III.7. Kết quả sắc ký khí ghép khối phổ của acid béo methyl ester A
2
39
Bảng III.8. So sánh thành phần một số acid béo quan trọng có trong mẫu thí nghiệm
với thành phần acid béo thu được từ mỡ cá ba sa của
PGS.TS. Hoàng Đức Như, Huỳnh Kiến Thành, Nguyễn Thị Bích Liên
và Mai Thị Diệu Thảo 40
Bảng III.9. So sánh hàm lượng các acid béo chủ yếu trong mẫu thí nghiệm
với mẫu của Phạm Thị Anh 42
Bảng IV. So sánh thành phần một số acid béo thiết yếu trong mỡ cá ba sa có
hoặc không có xử lý 45


DANH MỤC SƠ ĐỒ


Trang
Sơ đồ I.1. Sự chuyển hóa của các acid béo omega-3 trong cơ thể 7
Sơ đồ II.1. Công nghệ tách chiết mỡ lỏng từ mỡ cá ba sa 23
Sơ đồ II.2. Các bước tiến hành phản ứng xà phòng hóa 27
Sơ đồ II.3. Các bước tiến hành để làm giàu DHA 28
Sơ đồ II.4. Các bước tiến hành ester hóa mẫu acid béo thu được sau khi tủa urê 29
Sơ đồ II.5. Các bước chuẩn bị và tiến hành sắc ký lớp mỏng 30
Sơ đồ III. So sánh các bước cơ bản của 2 tiến trình thí nghiệm 41


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Trang
Hình I.1. Cấu trúc cis- và trans- 4
Hình I.2. Acid cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic 5
Hình I.3. Cấu trúc không gian của acid cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic 5
Hình I.4. Hoạt động cấp phân tử của các acid béo omega-3 14
Hình I.5. Sự di chuyển điện tử của chất béo trong quá trình xà phòng hóa 16
Hình I.6. Mô hình máy GC/MS 18
Hình I.7. Cá ba sa (Pangasius bocourti SAUVAGE, 1880) 20
Hình II.1. Quá trình thủy giải dầu cá ba sa (đun hoàn lưu + khuấy từ) 31
Hình II.2. Đun dung dịch xà phòng trong môi trường acid để thu acid béo 31
Hình II.3. Hỗn hợp acid béo bão hòa và bất bão hòa thu được
sau khi xà phòng hóa 31
Hình II.4. Lóng để thu lớp ether dầu hỏa chứa acid béo bất bão hòa 31
Hình II.5. Acid béo bất bão hòa trong ether dầu hỏa 32
Hình II.6. Cô quay đuổi dung môi để thu acid béo bão hòa 32
Hình II.7. Acid béo bất bão hòa 32
Hình II.8. Máy GC/MS ở phòng phân tích Hóa lý-Viện Khoa học Công nghệ để
phân tích hỗn hợp acid béo bất bão hòa trong mẫu thí nghiệm 32

Hình III.1. Sắc ký lớp mỏng trong hệ dung môi giải ly benzen:chloroform (8:2) 43
Hình III.2. Sắc ký lớp mỏng trong hệ dung môi giải ly benzen:chloroform (8:2) 43







I.1. KIẾN THỨC TỔNG QUÁT
I.1.1. Giới thiệu về chất béo

Chất béo (lipid) là một trong những thành phần sinh hóa cơ bản của động thực vật. Các thành phần của
thức ăn thường được tập trung nghiên cứu là protein, lipid, glucid và một số vitamin. Trong đó lipid đóng vai
trò quan trọng như là nguồn cung cấp năng lượng (8-9 kcal/gam) và các acid béo cần thiết cho quá trình sinh
trưởng và phát triển của động vật. Lipid cũng đóng vai trò như là chất vận chuyển vitamin tan trong dầu và
sterol. Ngoài ra trong thành phần của lipid có phospholipid và sterol ester tham gia vào quá trình sinh tổng hợp
màng tế bào
Lipid là một hợp chất hữu cơ có chức năng và thành phần hóa học khác nhau được ly trích từ động và
thực vật nhờ các dung môi ether, chloroform, methanol Có nhiều kiểu phân loại lipid, về cơ sở phân loại chủ
yếu cũng dựa vào cấu tạo hóa học. Hiện nay có 2 kiểu phân loại chính :
• Kiểu 1 : chia làm 2 nhóm lớn (theo Lenindger)
[11]

Nhóm 1 gọi là lipid phức, thành phần có chứa gốc acid béo trong đó bao gồm acylglyceride,
phosphoglyceride, sphingolipid và sáp – hay còn gọi là “nhóm lipid xà phòng hóa được”.
Nhóm 2 gọi là lipid đơn, không chứa gốc acid béo trong thành phần, là “nhóm không xà phòng hóa”
gồm : terpen, steroid, prostaglandin, vitamin hòa tan trong chất béo.
• Kiểu 2 : cũng chia ra 2 nhóm lớn (theo Lê Ngọc Tú, Plenikov)
[11]


Lipid đơn giản : về cấu tạo nó chỉ là ester của rượu và acid béo, không có thành phần khác tham gia. Ví
dụ như glyceride, sáp, steride (cholesterin) là ester của acid béo và rượu đa vòng sterol.
Lipid phức tạp : cũng là một ester nhưng khi thủy phân thu được ngoài thành phần chính là rượu, acid
béo còn có các thành phần khác như base nitơ, lưu huỳnh, acid phosphoric, glucid… Thuộc về nhóm này có
một số nhóm lớn sau :
Phospholipid là ester của rượu đa chức với acid béo cao phân tử, trong thành phần còn có các gốc acid
phosphoric, base có nitơ (phosphatid)
Glycolipid là ester của rượu và acid béo bậc cao, trong cấu tạo còn có glucid (thường là galacto) hay dẫn
xuất có nitơ của glucid.
Lipoprotein : thành phần tham gia cấu tạo có acid béo, rượu và protein.
Chức năng của lipid
[11], [37], [41]

• Cung cấp năng lượng : lipid là nguồn cung cấp năng lượng tốt nhất cho cơ thể động vật. Lượng calo do lipid
cung cấp cao gấp 2 lần glucid và protid. Lipid là chất dự trữ năng lượng cho cơ thể. 1gam lipid cung cấp 9,3
calo trong khi đó 1gam glucid hay protid chỉ cho 4,1 calo.
• Hoạt hóa và cấu thành enzyme và hormone : Lipid, đặc biệt là phospholipid có khả năng hoạt hóa enzyme. Ví
dụ phosphattidyl choline có khả năng hoạt hóa enzyme glucose-6-phosphatase, Adenogentriphosphatase
(ATPase). Lipid là thành phần chính của nhiều hormone steroid. Ngoài ra một số PUFA (polyunsaturated fatty
acid – acid béo bất bão hòa đa) là tiền thân của prostaglandin ở tôm cá (prostaglandin là họ acid béo 5 mạch
vòng, số lượng rất nhỏ, hoạt động giống như hormone).
• Tham gia cấu trúc màng tế bào : Lipid phân cực hay phospholipid có một vai trò rất quan trọng trong dinh
dưỡng vì nó tham gia vào cấu trúc của tất cả các màng tế bào. Cấu trúc cơ bản của các màng tế bào này là hai
lớp của những phân tử phosphoglyceride trong đó đuôi không phân cực xếp đối diện và chồng với đuôi kỵ nước
của một phospholipids và chúng xếp ở giữa màng cơ bản, trong khi hai chiều ưa nước xếp ở mặt ngoài tạo nên
hai bề mặt trong và ngoài của màng cơ bản. Trong màng cơ bản những đại phân tử protein sắp xếp xuyên
qua màng cơ bản và liên quan đến khả năng vận chuyển những vật liệu qua màng.
• Hỗ trợ hấp thu các lipid khác : Phospholipid giữ vai trò quan trọng trong sự vận chuyển và hấp thụ lipid và
tham gia vào các quá trình biến dưỡng trung gian trong cơ thể sinh vật. Phospholipid đóng vai trò như chất nhũ

tương hóa giúp các acid béo, muối mật và các chất hòa tan trong chất béo gắn vào các hạt micelle nhỏ li ti. Nhờ
đặc tính có hai đầu phân cực: kỵ nước và hiếu nước, nên các phospholipid nằm bên ngoài các hạt micelle gắn
các sản phẩm thủy phân của lipid vào. Sự vận chuyển các hạt micelle qua màng tế bào nhờ liên kết của các hạt
micelle với hai lớp phospholipid của các màng cơ bản nên các sản phẩm thủy phân của lipid được đưa qua
màng tế bào và hấp thụ vào hệ bạch huyết. Như vậy, phospholipd có một vai trò quan trọng trong sự hấp thu
chất béo.
• Vận chuyển các vitamin và một số chất khác : Lipid là dung môi hòa tan các vitamin tan trong trong dầu như
A, D, E, K và hydrocarbon. Do đó trong khi hấp thu và vận chuyển trong cơ thể lipid cũng mang theo các chất
hòa tan trong lipid.
• Chức năng bảo vệ cơ thể : lipid giúp cơ thể chống lại các va đập cơ học, chống lạnh và bảo vệ các cơ quan
bên trong.
I.1.2. Giới thiệu về acid béo
[11], [20]

Acid béo là thành phần chính của hầu hết các lipid trong cơ thể cũng như lipid trong thực phẩm. Acid
béo là một mạch dài các nguyên tử carbon liên kết với nhau và được bao quanh bởi các nguyên tử hydro. Một

phân tử acid bao gồm 2 đầu, đầu alpha là một nhóm carboxyl –COOH, đầu còn lại là đầu omega, là một nhóm
methyl –CH
3
.
Acid béo được phân loại căn cứ vào những chuỗi mắc nối và mức độ bão hòa với phân tử hydro. Chuỗi
mắc nối tùy thuộc vào số lượng carbon trong mỗi chuỗi, thường là số chẵn, thí dụ như C12, C16, C18. Mức độ
bão hòa tùy thuộc số lượng nối đôi giữa các phân tử carbon với nhau. Các phân tử carbon nối với nhau bằng nối
đơn và carbon được bao bởi hydro thì được gọi là acid béo bão hòa hay acid béo no. Nếu các nguyên tử hydro
trong mạch bị thiếu nghĩa là có sự hiện diện của một hay nhiều nối đôi C=C thì acid béo được gọi là acid béo
chưa bão hòa hay chưa no. Nếu acid béo có 1 nối đôi giữa các carbon, nó được gọi là bất bão hòa đơn
(monounsaturated). Nếu có 2 hay nhiều nối đôi trong phân tử acid béo thì đó là acid béo bất bão hòa đa
(polyunsaturated).
Với các acid béo chưa no, mỗi liên kết đôi tồn tại hai đồng phân lập thể, dạng cis và trans. Trong tự

nhiên, acid béo dạng cis là phổ biến hơn nhưng dạng trans thì lại bền hơn dạng cis cho nên biến đổi dạng cis
thành dạng trans dễ dàng hơn từ trans thành cis.
C
C
CH
2
H
2
C
H
H
C
C
CH
2
H
H
H
2
C

Hình I.1. Cấu trúc cis- và trans-
Vị trí của các nối đôi trong chuỗi carbon của acid béo bất bão hòa đa tạo nên sự khác biệt lớn trong việc
cơ thể con người chuyển hóa chúng. Chúng ta có thể kể ra một số dạng chính như sau: nếu nối đôi đầu tiên nằm
cách 3 carbon so với đầu omega (methyl) của acid béo thì đó là acid béo omega-3 (Ω-3), tương tự với cách quy
ước như thế ta có acid béo Ω-6 và acid béo Ω-9.
Các tế bào của cơ thể của con người chỉ có thể tạo nối đôi C=C trong acid béo kể từ carbon thứ 9 trở đi.
Điều này có nghĩa là cơ thể con người không thể tự tổng hợp được acid béo Ω-3 và Ω-6. Do đó 2 loại acid béo
này chỉ có thể được lấy qua chế độ ăn hàng ngày.
Các phân tử acid béo bão hòa có mạch thẳng, thường dễ gắn chặt với nhau. Ngược lại các phân tử acid

béo bất bão hòa có cấu tạo lệch do đó chỉ gắn với nhau một cách lỏng lẻo và dễ bị phá vỡ bởi nhiệt hơn các acid
béo bão hòa. Vì vậy các chất béo giàu acid béo bão hòa có nhiệt độ tan chảy thấp hơn các chất béo giàu acid
béo bão hòa (đặc biệt là các acid béo có chuỗi carbon dài hơn 12 carbon). Hầu hết các chất béo chứa nhiều
acid béo bão hòa, như mỡ động vật, tồn tại dưới dạng rắn ở nhiệt độ thường, trong khi các chất béo chứa nhiều
acid béo bất bão hòa hơn thì tồn tại ở dạng bán rắn hoặc dạng lỏng tùy theo hàm lượng của acid béo bất bão
hòa trong chất béo.
Các loại acid béo thường gặp được trình bày ở bảng I.1.
I.2. GIỚI THIỆU VỀ ACID DOCOSAHEXAENOIC (DHA)
I.2.1 Tính chất hóa học
[35]

Acid docosahexaenoic (DHA) là một acid béo bất bão hòa đa thuộc nhóm Ω-3. DHA chứa 22 nguyên tử
carbon và 6 nối đôi, có công thức tổng quát là :
CH
3
(CH
2
-CH=CH)
6
(CH
2
)
2
COOH
Trọng lượng phân tử của DHA là 328,6 và điểm nóng chảy là -44
0
C. DHA còn được kí hiệu là
22:6n-3 và trong tự nhiên có dạng acid cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic.

Hình I.2. Acid cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic

[48]

Hình I.3. Cấu trúc không gian của acid cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic
[29]


Bảng I.1. Các acid béo thường gặp
[42]
Những acid béo có nguồn gốc từ động thực vật quen thuộc
Danh pháp hệ thống Danh pháp thông dụng Số carbon
Acid béo bão hòa
ethanoic acetic 2:0
butanoic butyric 4:0
hexanoic caproic 6:0
octanoic caprylic 8:0
decanoic capric 10:0
dodecanoic lauric 12:0
tetradecanoic myristic 14:0
hexadecanoic palmitic 16:0
octadecanoic stearic 18:0
eicosanoic arachidic 20:0
docosanoic behenic 22:0
Acid béo bất bão hòa đơn
cis-9-hexadecenoic palmitoleic 16:1(n-7)
cis-6-octadecenoic petroselinic 18:1(n-12)
cis-9-octadecenoic oleic 18:1(n-9)
cis-11-octadecenoic cis-vaccenic 18:1(n-7)
cis-13-docosenoic erucic 22:1(n-9)
cis-15-tetracosenoic nervonic 24:1(n-9)
Acid béo bất bão hòa đa*

9,12-octadecadienoic linoleic 18:2(n-6)
6,9,12-octadecatrienoic γ-linolenic 18:3(n-6)
9,12,15-octadecatrienoic α-linolenic 18:3(n-3)
5,8,11,14-eicosatetraenoic arachidonic 20:4(n-6)
5,8,11,14,17-eicosapentaenoic EPA 20:5(n-3)
4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic DHA 22:6(n-3)

Ghi chú:
• Trong cách viết ký hiệu của acid béo, số thứ nhất biểu thị số carbon, số thứ hai biểu thị số nối đôi và n- chỉ
nhóm của acid béo bất bão hòa.
• * Tất cả liên kết đôi đều ở dạng cis-


Sơ đồ I.1. Sự chuyển hóa của các acid béo omega-3 trong cơ thể
[53]

I.2.2 Nguồn hiện diện
[47]

DHA được tìm thấy nhiều ở cá, đặc biệt là các loại cá béo, chứa nhiều mỡ và dầu như cá trích, cá thu, cá
mòi, cá hồi, cá ngừ, cá tuyết và các loại cá da trơn. Vài loại thực vật nhất định bao gồm dầu đậu nành và dầu cải
cũng chứa tiền chất của DHA là α-linolenic acid
[36]
. Ngoài ra, DHA cũng là một trong những acid béo chính
trong thành phần acid béo của một số loài vi nấm sống ở biển như Tharaustochytrium roseum, T. aureum và
Schizochytrium aggeratum.
[14]

Hiện nay, dầu cá là nguồn thu nhận DHA chủ yếu, nhưng DHA cũng có thể được sản xuất bằng cách sử
dụng vi sinh vật. Các vi sinh vật biển có thể chứa một lượng lớn DHA và được xem như là nguồn thu nhận hiệu

quả của acid béo quan trọng này. Vài loài trong đó có thể tăng trưởng theo lối dị dưỡng trên những chất nền
hữu cơ ở điều kiện không có ánh sáng (như vi tảo Crypthecodinium cohnii). Gần đây đã có nhiều tiến bộ
trong việc sản xuất DHA trong công nghệ sinh học từ các vi sinh vật biển.
I.2.3. Các phương pháp ly trích, cô lập và tinh sạch DHA
I.2.3.1. Phương pháp tách phân đoạn bằng li tâm phân tử (molecular centrifugal)
[25]

Acid béo của dầu cá mòi (10% DHA) được phân chia thành những phân đoạn bằng ly tâm phân tử cho
đến khi được những phân đoạn chứa 5, 11, 20, 21 và 30%. Phân đoạn cuối cùng được khuấy với urê trong
MeOH ở 45
0
C, làm lạnh trong 18 giờ ở 16
0
C, lọc, nước lọc cho tiếp xúc với nhiều urê hơn, làm lạnh ở 13
0
C qua
α- linolenic acid
(ALA, C18:3)
Stearidonic acid
(C18:4)
∆-6-desaturase
8,11,14,17-eicosatetraenoic acid
(C20:4)
5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid
(EPA, C20:5)
7,10,13,16,19-docosapentaenoic acid
(DPA, C22:5)
4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic acid
(DHA, C22:6)
elongase

∆-5-desaturase
∆-4-desaturase
lipoxygenase
cycloxygenase
leukotrienes
prostaglandins
thromboxanes
elongase

đêm, lọc, nước lọc được cô đặc và tái xử lý với urê. Nước lọc cuối cùng được rót vào nước, dung dịch nước này
được trích ly với ether, , làm khan dung dịch eter với Na
2
SO
4
và dung môi được loại bỏ. Sản phẩm bây giờ chứa
88% DHA, và được làm tinh khiết hơn bằng cách chuyển thành methyl ester, đi qua silica gel, giải li bằng dung
môi ether dầu hỏa, và loại bỏ những tạp chất còn dư bởi sự chưng cất phân tử.
I.2.3.2. Phương pháp sắc ký khí định lượng (preparative scale gas chromatography)
[23]

Dầu gan cá tuyết chứa 3 loại acid béo không bão hòa cần thiết (C18:4, C20:5, C22:6) được xà phòng
hóa, và acid được tìm thấy có giá trị iode là 205. Phổ UV cho thấy sự hiện diện của 0,11% nối đôi liên hợp và
0,07% nối ba liên hợp, những đồng phân khác không hiện diện. Từ 200g dầu, polyenoic ester được cô đặc bằng
phương pháp urê – MeOH và hydro hóa để cho 36,5g các acid có giá trị iode 401. Hỗn hợp này được ester hóa
với MeOH-H
2
SO
4
và hỗn hợp ester qua sắc kí cho thấy có chứa 11% C18:4; 32,6% C20:5 và 49,7% C22:6
trong khi phổ UV cho thấy 1,5% nối đôi tiếp cách. Sắc ký định lượng được tiến hành trên cột cao 5 feet được

nhồi bằng 5% Apiezon trên Chromosorb G. Dòng khí N là 150ml/phút. Nhiệt độ cột và ống góp (collector) là
225
0
C. Phân đoạn thu được có thể được làm tinh sạch hơn bằng sắc ký cột.
I.2.3.3. Phương pháp sắc ký cột (column chromatography)
[52]

Các acid béo bất bão hòa (C ≥ 16) và những dẫn xuất của chúng được tách bởi sắc ký cột sử dụng CO
2

siêu tới hạn hoặc CO
2
lỏng như là pha động và oxide nhôm đã xử lý với kiềm như là pha tĩnh.
Phosphate kim loại cũng được sử dụng như là tác nhân tách chiết các acid béo bất bão hòa và các chất
tương đồng của chúng. Các tác nhân tách chiết bao gồm các muối phosphoric acid với Ag (và các kim loại
khác). Hỗn hợp chứa ethyl eicosapentaenoate và ethyl docosahexaenoate được đưa lên sắc ký cột silica gel phủ
Ag phosphate và cột được giải li với hỗn hợp n-hexane và n-hexane-isopropanol để thu nhận lượng ester.
Phương pháp sắc ký cột ion bạc cũng được dùng để thay thế cho việc trích pha rắn để tách các acid béo
methyl ester. Cột trích pha rắn loại Bond Elut SCX (0.5g propylbenzene sulphonic acid) được cân bằng bởi 5ml
NaOH 1M, 10ml nước, 5ml HCl 4M, nước cho đến khi đạt pH trung tính và tiếp tục với acetonitrile-nước
(10:1). Cột được bọc lại trong cuộn nhôm để tránh ánh sáng.
Cột được chuyển sang dạng ion bạc bằng cách cho ngấm kiệt từ từ 1ml dung dịch AgNO
3
(40mg AgNO
3

trong 1ml acetonitrile-nước 10:1). Sau đó cột được giải ly lần lượt với 5ml acetonitrile, 5ml acetone và 10ml
dichloromethane.
0,1ml dichloromethane chứa không quá 1mg acid béo methyl ester. Các (hệ) dung môi dùng để giải ly có
độ phân cực tăng dần (từ dichloromethane đến acetone-acetonitrile) theo số liên kết đôi của acid béo (từ acid

béo bão hòa đến acid béo 6 nối đôi). Sự giải ly tiến hành ở áp suất khí quyển (vận tốc dòng chảy 0,5ml/phút).
I.2.3.4. Phương pháp CO
2
siêu tới hạn (supercritical carbon dioxide)
[27]

CO
2
siêu tới hạn (SC-CO
2
) là một chất thích hợp để trích ly các chất không phân cực (triacylglycerol).
Hiệu quả trong việc sử dụng SC-CO
2
và hỗn hợp ethanol để trích ly và phân đoạn các phospholipid từ trứng cá
hồi đã được khảo sát. Sự trích ly được thực hiện ở nhiệt độ 33
0
C và áp suất thấp 17,7MPa để tránh sự oxide hóa
các acid béo bất bão hòa đa. Các phospholipid đươc trích ly hiệu quả với 10, 15 hay 20% ethanol trong SC-CO
2
.
Lượng phospholipid được trích ly tăng cùng với sự bổ sung ethanol (với hỗn hợp 20% ethanol, có 80% các
phospholipid được thu nhận).
I.2.3.5. Phương pháp trích bằng chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid extraction – SFE)
[22]

Các acid béo được trích ly từ cá bằng cách sử dụng một máy đặc biệt gọi là “máy trích CO
2
lỏng siêu tới
hạn” (Supercritical Fluid CO
2

Extraction Machine). 3 mức áp suất khác nhau (200, 240 và 280 bar), 3 mức
nhiệt độ khác nhau (35, 40 và 45
0
C) và 5 khoảng thời gian khác nhau (60, 120, 180, 240 và 300 phút) được
chọn. Điều kiện lý tưởng nhất cho sự trích ly acid béo bất bão hòa đa được xác định là áp suất 280 bar ở nhiệt
độ 40
0
C và 300 phút.
I.2.3.6 Phương pháp bạc nitrate (silver nitrate method)
[21]

DHA và các dẫn xuất của nó được cô lập từ hỗn hợp các acid béo bất bão hòa đa từ nguồn tự nhiên bằng
phương pháp bạc nitrate. Phương pháp bao gồm sự tính toán lượng bạc nitrate cần để tạo phức với các acid bất
bão hòa đa dựa trên số mol nối đôi có trong acid béo bất bão hòa.
DHA được tách chiết và tinh sạch từ dầu cá ngừ bằng phương pháp tách chiết nhiệt độ thấp kết hợp với
phương pháp kết tinh sắc ký cột Ag
+
/silica gel hoặc phương pháp riêng lẻ với sắc kí cột Ag
+
/silica gel. Dung
môi giải ly cột là hỗn hợp của aceton (hoặc diethyl ether)-hexane.
Một phương pháp khác được sử dụng để tinh sạch hỗn hợp các acid béo methyl ester từ dầu cá hoặc dầu
thực vật là phương pháp sắc ký lớp mỏng ion bạc. Các bản mỏng silica gel được nhúng trong 1 phút vào dung
dịch bạc nitrate 4% trong methanol-nước (9:1). Sau đó bản mỏng được sấy khô 2 phút dưới ánh sáng mờ trong
tủ sấy thông gió và tiếp tục trong 20 phút ở 100
0
C. Chúng được giữ trong 1 hộp được đậy kín ở trong tối.
Dung môi giải ly có thể là hexane-diethyl ether (9:1) để tách các acid béo bão hòa, acid béo có 1 nối đôi
và acid béo có 2 nối đôi, hoặc là toluen-ethyl acetate (9:1) để tách tất cả các loại acid béo theo độ bất bão hòa.


Tỷ lệ dung môi có thể thay đổi 1 ít theo điều kiện thí nghiệm (loại bản mỏng, độ ẩm, nhiệt độ, hình dạng
của bình giải ly …) để nâng cao hiệu quả của việc phân tách. Việc thêm 1% acid acetic theo thể tích vào pha
động cho phép các vết acid béo đạt độ phân giải tốt.
Bảng mỏng được sấy trong tủ sấy thông gió, nhúng vào dung dịch nước đã bão hòa sodium thiosulphate
trong 1 phút và rửa dưới dòng nước chảy trong 1 phút. Sau đó tiếp tục sấy khô và phun xịt với primuline để phát
hiện các vết acid béo phát huỳnh quang dưới đèn UV.
I.2.4. Phương pháp nhận danh DHA
I.2.4.1. Phương pháp sắc ký khí (gas chromatography – GC), sắc ký khí ghép khối phổ (gas
chromatography/mass spectrometry – GC/MS) và sắc ký khí mao dẫn (capillary gas chromatography).
[4], [7],

[8]

Các acid béo tự do và acid béo trong triglyceride trong dầu cá biển sâu được biến đổi thành acid béo
methyl ester bằng cách sử dụng tetramethylammonium hydroxide methanoal (N(CH
3
)
4
OH-CH
3
OH). Sau đó,
các acid béo methyl ester này được phân tích bằng GC và GC/MS. 41 thành phần được xác định, và thành phần
chủ yếu là cis-5,8,11,14,17-EPA và cis-4,7,10,13,16,19-DHA được định lượng.
Kỹ thuật sắc ký khí mao dẫn được áp dụng trong việc định danh các acid béo bão hòa chuỗi dài và acid
béo bất bão hòa trong lòng đỏ trứng và gan gà. Mẫu trước tiên được làm đồng nhất và trích ly bằng cách sử
dụng chloroform-methanol (CHCl
3
-MeOH) hay methylene chloride-methanol (CH
2
Cl

2
-MeOH) 2:1, những acid
béo trong chất trích được methyl hóa với KOH-MeOH. Acid béo methyl ester được phân tích bằng sắc ký khí
mao dẫn. Các Ω-3 LC PUFAs có hoạt tính sinh học dễ bị oxde hóa như EPA, DPA (docosapentaenoic acid,
22:5n-3) và DHA có thể được xác định bởi phương pháp này.
I.2.4.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (proton nuclear magnetic resonance
spactroscopy –
1
H NMR)
[24]

Bằng cách sử dụng phổ kế
1
H NMR 500MHz, các tác giả đã phát triển một phương pháp định lượng cho
việc xác định thành phần của DHA trong dầu cá (mg/g), tỷ lệ mol (mol %) của DHA so với toàn bộ các acid béo
khác trong dầu cá, và tỷ lệ mol của toàn bộ các acid béo n-3 so với toàn bộ các acid béo không phải n-3 trong
dầu cá. Với ethylene glycol dimethyl ether được sử dụng làm chất nội chuẩn (internal standard)và thời gian
xung lặp lại (pulse repetition time) là 30 giây, thời gian phân tích đạt được dưới 10 phút. Việc sử dụng chất nội
chuẩn còn cho phép định lượng DHA theo khối lượng (mg/g). Sự chuẩn bị mẫu trước khi đo phổ chỉ yêu cầu hai
bước: cân mẫu và chuẩn bị dung dịch nội chuẩn. Phương pháp này hứa hẹn sẽ thay thế phương pháp sắc ký khí
trong việc định lượng DHA nói riêng và acid béo n-3 nói chung.
I.2.4.3. Phương pháp ái lực pha rắn với ion bạc và sắc ký lớp mỏng có chỉnh đổi (affinity solid-
phase purification with argentous ions and modified thin layer chromatography)
[16]

Đây là phương pháp đơn giản để nhận danh DHA trong sữa bò. Phương pháp bao gồm ba bước : (1) sự
methyl hóa DHA một lần trong sữa bò mà không cần phải loại béo trước, (2) sự cô đặc methyl ester bằng sắc ký
cột silica gel có chỉnh đổi với AgNO
3
, (3) sự phát hiện DHA methyl ester bằng cách sử dụng sắc ký lớp mỏng

hiệu năng cao-tập trung vết (spot focusing-high performance thin layer chromatography). DHA được methyl
hóa trực tiếp trong sữa bò và được cô đặc một cách có chọn lọc nhờ vào ái lực của nó với các ion bạc. Phương
pháp này không cần sự trích ly lipid tốn hao lượng lớn dung môi hữu cơ và không cần hệ thống sắc ký khí.
I.2.4.4. Phương pháp phổ hồng ngoại chuyển dạng Fourier (Fourier transform infrared spectroscopy
– FT-IR)
[5]

Những co giãn của nối =C-H alkene của các acid béo bất bão hòa trong dầu sẽ hấp thu ở bước sóng
3010cm
-1
với những cướng độ khác nhau. Nguyên tắc hoạt động của phương pháp này : nguồn sáng phát ra một
chùm bức xạ đến gương cầu lõm, tại gương cầu lõm sẽ cho chùm tia phản xạ song song đập vào gương phẳng.
Ánh sáng phản xạ từ gương phẳng sẽ đi vào giao thoa kế michelson rồi đi qua mẫu đến detector. Tín hiệu quang
sau đó sẽ được biến đổi thành tín hiệu điện, qua bộ khuếch đại rồi và bộ máy tính lắp ghép với máy phổ. Máy
tính sẽ xử lý tín hiệu và in ra phổ. Sự đo bằng FT-IR trên thực tế có thể dự đoán được thành phần của mỗi loại
PUFA trong mẫu dầu được kiểm tra.
I.2.4.5. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (high performance liquid chromatography – HPLC)
hay còn gọi là sắc ký lỏng cao áp (high pressure liquid chromatography)
[7], [8]

Phương pháp HPLC thuộc loại sắc ký cột có pha động là chất lỏng. Khác với các loại sắc ký lỏng khác,
hiệu quả phân tích của HPLC rất cao là do vật liệu nhồi cột có kích thước hạt rất bé (5-10 µm) và độ đồng nhất
cao cùng với việc sử dụng nhiều đầu dò khác nhau.
HPLC tỏ ra ưu việt hơn so với sắc ký khí khi phân tích thành phần của dầu cá do dầu cá không cần phải
methyl ester hóa trước khi phân tích. Dầu cá khi phân tích sẽ được hòa tan vào dung môi thích hợp và được
phân tích ở nhiệt độ phòng. Trong sắc ký phân bố, thông thường người ta sử dụng pha tĩnh phân cực hơn so vớ

pha động và gọi là sắc ký thuận (normal phase). Nhưng trong kỹ thuật HPLC ngược lại người ta thường dùng
pha tĩnh kém phân cực hơn và gọi đó là sắc ký pha đảo (inversed phase) (RP-HPLC). Dung môi sử dụng ở
phương pháp này là dung môi phân cực, thường ít độc hại, rẻ tiền và không gây ô nhiễm môi trường (thường

dùng nước có bổ sung methanol, ethanol hoặc acetonitrile).
I.2.5. Tác dụng của DHA đối với cơ thể
I.2.5.1.Vai trò của acid béo
[32]

Một cách tổng quát, vai trò và chức năng của các acid béo nói chung bao gồm :
- Thành phần cơ bản của lipid và chất béo.
- Thành phần quan trọng trong cấu trúc màng tế bào.
- Giúp cho sự vận chuyển các chất dinh dưỡng hòa tan trong chất béo (trong đó có các vitamin như
vitamin A và vitamin D) ngang qua màng tế bào cũng như trong máu.
- Quan trọng cho sự phát triển của não.
- Quan trọng cho sự tăng trưởng.
- Quan trọng cho sự sản sinh năng lượng, duy trì thân nhiệt.
- Quan trọng trong việc duy trì một làn da khỏe mạnh.
- Hoạt động như những tiền chất của một số hợp chất có hoạt tính sinh học bao gồm prostaglandin,
prostacyclin và leukotriene.

I.2.5.2.Vai trò của DHA
I.2.5.2.1. Tác dụng đối với bào thai và trẻ sơ sinh
[33]

Sự phụ thuộc vào DHA nhiều nhất là ở bào thai trong suốt 3 tháng cuối thai kỳ và trẻ sơ sinh trong suốt
ba tháng đầu sau khi sinh. Trong suốt giai đoạn này khớp thần kinh của não hình thành một cách nhanh nhất và
nhu cầu về DHA của trẻ sơ sinh vượt quá sức chứa của enzyme tổng hợp ra nó. Những đòi hỏi dược bổ sung lúc
này hoàn toàn từ nhau thai của mẹ.
Sau khi sinh, trẻ cần bú sữa mẹ vì trong sữa mẹ chứa : 12% acid linoleic, 0.5% acid alpha linolenic, 0.6%
acid arachidonic (ARA), 0.3% DHA trong tổng số trọng lượng acid béo. Vì vậy chế độ ăn của mẹ cần đủ các
acid béo .
Theo các nhà khoa học Mỹ việc ăn nhiều cá trong 3 tháng giữa của thai kỳ sẽ giúp bộ não của thai nhi
phát triển hoàn thiện. Tiến sĩ Emily Oken và cộng sự, Đại học Harvard, đã tìm hiểu tác dụng của cá trên 135 bà

mẹ cùng đứa con. Kết quả cho thấy những người ăn nhiều cá trong 3 tháng giữa của thời kỳ mang thai có con
thực hiện bài test về trí nhớ và thị giác rất ấn tượng khi mới 6 tháng tuổi. Nguyên nhân là nhờ cá rất giàu axit
béo omega-3, thành phần hỗ trợ phát triển trí não tích cực nhất . Trong suốt ba tháng cuối thai kỳ , lượng lớn
DHA và ARA, đặc biệt là DHA , được đưa vào não và võng mạc của thai nhi. Sau đó tiếp tục tăng trong vài
tháng sau khi sinh, nó có vai trò vô cùng quan trọng cho sự phát triển thần kinh và thị giác bình thường của bào
thai và trẻ em. Một nghiên cứu cho thấy ở độ tuổi khoảng 8, trẻ em được bú sữa mẹ có chỉ số thông minh cao
hơn khoảng 8,3 so với trẻ em chỉ sử dụng sữa bột.
I.2.5.2.2. Tác dụng đối với thị giác và màng tế bào
[14] ,[26]

Sự thiếu acid béo omega-3 trong chế độ ăn dẫn đến sự cạn kiệt DHA trong phospholipid ở tế bào thần
kinh, cho dù có những cơ chế bảo toàn cục bộ và hệ thống. Sự cạn kiệt DHA ảnh hưởng đến các thụ thể nằm
trên màng mà ở đây là rhodopsin và làm thay đổi chức năng của nó. Sự thiếu DHA làm giảm hoạt động thần
kinh của võng mạc, làm giảm độ nhạy của thị giác, làm thay đổi những phản ứng hành vi và gây ra những cơn
khát bất thường, và cả những phản ứng bất thường về thính giác và khứu giác. Những sự bất thường này có thể
được gây ra do những receptor bề mặt bị ảnh hưởng do thiếu DHA.
Khi được ester hóa vào trong những phospholipid màng, DHA được chứng minh là đã làm thay đổi một
cách đáng kể nhiều tính chất cơ bản của màng tế bào bao gồm trật tự chuỗi acyl, độ lỏng, cách hoạt động của
pha, độ nén đàn hồi, tính thấm, sự hợp nhất và hoạt động của protein. Sự tương tác của DHA với những lipid
khác trên màng, đặc biệt là cholesterol, có thể đóng một vai trò nổi bật trong việc điều hòa cấu trúc và chức
năng cục bộ của màng.
I.2.5.2.3. Tác dụng đối với não
[30] , [45]

Khoảng 2/3 não bộ được tạo nên từ những acid béo. Chúng là thành phần cơ bản của màng tế bào, qua
màng này sẽ diễn ra sự giao lưu, liên lạc với mọi tế bào thần kinh trong các vùng của não và cơ thể. Nếu ăn quá
nhiều chất béo bão hòa (như bơ, mỡ động vật - thường đông ở nhiệt độ môi trường), các tế bào não sẽ như đông
đặc lại; còn nếu ăn nhiều chất béo không bão hòa (vẫn lỏng ở nhiệt độ môi trường) thì màng tế bào não mềm
mại, uyển chuyển hơn và sự liên lạc giữa các tế bào não cũng ổn định hơn. Điều này càng rõ khi chất béo đó là
omega-3.


Các nhà khoa học cho rằng, loại axit béo có nhiều trong thủy hải sản là một trong những yếu tố giúp tổ
tiên loài người trở thành Homo sapiens (người khôn ngoan). Họ cho rằng thức ăn của loài người sơ khai hoàn
toàn cân đối về omega-3 và omega-6 theo tỷ lệ 1/1. Tỷ lệ lý tưởng này đã cung cấp cho cơ thể nguồn nguyên
liệu thích hợp để sản sinh ra các tế bào thần kinh có chất lượng tốt nhất, giúp con người sáng tạo ra công cụ sản
xuất, ngôn ngữ và ý thức. Như vậy omega-3 đã góp phần tạo nên trí thông minh của chủ nhân Trái đất.
I.2.5.2.4. Tác dụng đối với bệnh thấp khớp
[50]

DHA có khả năng ngăn chặn phản ứng của hệ miễn dịch gây ra chứng viêm khớp, khiến khớp bớt cứng
và sưng, làm thuyên giảm các triệu chứng của bệnh này. Một số công trình nghiên cứu khi cho bệnh nhân dùng
những liều dầu cá từ 2-4g, thậm chí 5g/ngày, đã cho một số kết quả khá hứa hẹn: khớp bớt cứng và ít đau hơn.
Bác sĩ chuyên khoa Joel M.Kremer ở đại học Y Khoa Albany, New York theo dõi một nhóm 33 người có
bệnh nhức khớp xương uống 15 viên mỡ cá mỗi ngày và một nhóm dùng giả dược (placebo). Sau 14 tuần lễ,
nhóm uống mỡ cá ít bị nhức khớp xương và ít bị mệt mỏi hơn nhóm uống giả dược. Ngoài ra nghiên cứu ở động
vật cho thấy dùng omega-3 của cá có thể giảm nguy cơ loét bao tử của thuốc chống viêm không có steroid.
I.2.5.2.5. DHA và bệnh ung thư
[50]

Tiến sĩ Rasida A Karmali của viện đại học Rutgers và trung tâm nghiên cứu ung thư Memorial Sloan-
kettering đã nghiên cứu tác dụng của dầu mỡ cá đối với ung thư vú và nhiếp hộ tuyến của chuột . Kết quả là dầu
mỡ cá chận đứng sự nảy nở của nhọt ung thư.Theo kết quả nghiên cứu của Michigan State University cho hay là
dầu mỡ cá làm ngưng sự tăng trưởng tế bào ung thư vú lấy của người rồi cấy vào chuột trong phòng thí
nghiệm.
Các cuộc nghiên cứu tương tự ở trường thuốc của Viện Đại Học Rochester và Cornell đều cùng có kết
quả như trên. Tiến sĩ Karmali kết luận : “Kết quả nghiên cứu cho thấy là mỡ omega-3 có những đặc tính đáng
được nghiên cứu và phát huy để nó có thể trở thành loại thuốc ngừa và chống vài loại ung thư ”.
I.2.5.2.6. Tác dụng đối với các bệnh tim mạch
[31] ,[37] ,[46] ,[50]


DHA có tác dụng ngăn ngừa tiểu huyết cầu dính với nhau,và còn có tác dụng ngăn các mảng vụn bám
vào vách mạch máu do đó giúp mạch máu khỏi bị nghẽn, tránh được nguy cơ nhồi máu cơ tim.
DHA tinh khiết còn làm giảm độ nhớt của máu. Bằng chứng là DHA làm tăng độ lỏng của màng tế bào
hồng cầu, bằng cách đó nó biến dạng để di chuyển xuyên qua mao mạch dễ dàng hơn và do đó độ nhớt và huyết
áp thấp hơn.
Nghiên cứu về bữa ăn của người Eskimos - một dân tộc ở cực Bắc Á Cầu, người ta thấy rằng dù ăn rất
nhiều mỡ, rất ít người Eskimos bị bệnh tim, nhiều người có huyết áp bình thường, máu it bị đóng cục. Ngoài ra
họ còn tránh được một số bệnh như tiểu đường, viêm bao tử, đau nhức khớp xương, hen xuyễn, bệnh vẩy nến
(psoriasis). Trong máu của họ, cholesterol xấu LDL (low density lipoprotein) rất thấp mà cholesterol lành HDL
(high density protein) lại cao, máu cũng loãng hơn. Sở dĩ sức khoẻ được như vậy, vì ngoài mỡ, dân tộc này còn
ăn rất nhiều cá.
Ngoài ra theo Karen Schneider, DHA không làm thay đổi hàm lượng cholesterol mà lại giúp cơ thể
chống lại những rối loạn nhịp tim tiềm tàng có thể gây tử vong. DHA và EPA (acid eicosapentaenoic) trong
màng tế bào tim được phóng thích khi có sự thiếu hụt của dòng máu đi đến một phần của tim. Hai loại acid này
bảo vệ những tế bào tim khỏi việc tham gia vào hoạt động nhanh của tim, liên quan đến sự gia tăng nguy cơ đột
tử.
I.2.5.2.7. Tác dụng đối với huyết áp và hàm lượng lipid trong huyết tương
[17]

DHA hạ thấp lượng triglyceride trong máu qua việc làm giảm tốc độ tổng hợp acid béo ở gan và giảm sự
phóng thích các lipoprotein có trọng lượng phân tử thấp giàu triglycerid vào máu, làm tăng độ lỏng của màng tế
bào hồng cầu, từ đó làm tăng độ biến dạng cũng như khả năng linh hoạt của chúng để chúng có thể di chuyển dễ
dàng qua các mao mạch, dẫn đến việc giảm độ nhớt của máu và giảm huyết áp. DHA làm giảm huyết áp bằng
cách giảm hàm lượng cortisol trong máu.
Cơ chế hoạt động của DHA thông qua các yếu tố phiên mã. Sự gắn của một acid omega-3 vào một yếu tố
phiên mã làm biến đổi cấu trúc và chức năng của yếu tố đó để hoạt hóa hay ức chế gene mục tiêu. Cho đến nay
có 2 yếu tố phiên mã được biết đến là có tương tác với các chuỗi của acid béo bất bão hòa đa là thụ thể PPAR
và SREBP. PPAR là thụ thể được hoạt hóa bởi yếu tố sản sinh peroxisome (peroxisome proliferator activated
receptor), liên quan đến việc hoạt hóa cho sự oxide hóa acid béo. SREBP là protein gắn với yếu tố điều hòa
hàm lượng sterol (sterol regulatory element binding protein) liên quan tới sự ức chế các con đường tổng hợp

triglyceride.



Hình I.4. Hoạt động cấp phân tử của các acid béo omega-3
I.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH TRONG THÍ NGHIỆM
I.3.1. Phương pháp thủy giải (lipid hydrolysis)
[9], [10]

Chất béo tồn tại chủ yếu ở dạng ester, ở khuôn khổ bài luận văn này, chúng tôi tiến hành thủy giải chất
béo ra thành các acid béo tự do để tiện cho việc nghiên cứu. Chất béo có thể được thủy giải theo 3 cách sau :
• Sử dụng enzyme lipase để thủy giải, đây là một phương pháp tiến tiến, hiện đại. Phản ứng xảy ra
điều kiện nhiệt độ bình thường không phải đun nóng. Một ví dụ cho phản ứng thủy phân chất béo bằng lipase :
2ml dung dịch đệm 0,2M Tris maleate-NaOH (pH 8,2), 1ml CaCl
2
0,03M, 5ml nước cất, 1ml dầu olive và 1ml
dịch enzyme. Để dung dịch này ở 30
0
C trong 60 phút. Khi phản ứng hoàn thành thì thêm vào 20ml ethanol :
aceton (1:1) để kết thúc phản ứng. Sử dụng enzyme lipase để thủy giải thì tiện lợi nhanh chóng, tuy nhiên các
hóa chất sử dụng thì khá đắt tiền và không kinh tế.
OCCH
2
R
O
OCCH R
O
OCCH
2
R

O
+
OH
2
3
CH
2
OH
CH
2
OH
CHOH
+
R
R
R
COOH
COOH
COOH

• Thủy giải chất béo trong môi trường acid : chất béo được đun hoàn lưu với một acid vô cơ loãng như
acid HCl hoặc H
2
SO
4
. Phản ứng này là phản ứng ngược lại phản ứng ester hóa. Acid HCl hay H
2
SO
4
được dùng

như là một chất xúc tác và đồng thời cung cấp nước cho phản ứng xảy ra. Chúng ta cần cung cấp một lượng
thừa nước để ngăn phản ứng xảy ra theo chiều ngược lại là phản ứng ester hóa. Phản ứng này xảy ra với một
hiệu suất không cao.


CCH
3
O CH
2
CH
3
+
OH
2
CCH
3
OH
+
CH
2
CH
3
OH
O
O


• Thủy giải chất béo trong môi trường kiềm hay còn gọi là phản ứng xà phòng hóa (saponification).
Đây là một phương pháp đơn giản, dễ tiến hành và hiệu suất phản ứng rất cao. Chất béo được đun hoàn lưu với
một baz loãng như KOH hoặc NaOH. Phản ứng này có hai điều tiện lợi hơn so với phản ứng thủy giải chất béo

trong môi trường acid: đây là phản ứng một chiều trong khi phản ứng thủy giải trong môi trường acid là phản
ứng thuận nghịch và sản phẩm của quá trình này dễ dàng tách ra khỏi dung dịch.
Acid loãng
lipase

Sản phẩm của quá trình trên là xà phòng. Cho xà phòng tác dụng với một acid đậm đặc như H
2
SO
4
thì sẽ
thu được acid béo.
OCCH
2
R
O
OCCH R
O
OCCH
2
R
O
+
NaOH
3
CH
2
OH
CH
2
OH

CHOH
+
R
R
R
COONa
COONa
COONa







Hình I.5. Sự di chuyển điện tử của chất béo trong quá trình xà phòng hóa
I.3.2. Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography – TLC)
[1]

Sắc ký lớp mỏng hay còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatogaphy), là kỹ thuật phân bố rắn - lỏng,
trong đó pha động là chất lỏng được cho đi ngang qua một lớp chất hấp thu trơ (ví dụ như : silica gel hoặc oxid
alumin) chất hấp thu này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm
nhôm hoặc tấm plastic. Do chất hấp thu này được tráng thành một lớp mỏng nên được phương pháp này được
gọi là sắc ký lớp mỏng. Trong đề tài này, loại bản mỏng được sử dụng là bản nhôm tráng silica gel có trộn thêm
chất phát huỳnh quang (Merck)
Muốn thực hiện việc sắc ký, người ta cho mẫu cần phân tích (có thể chứa nhiều hợp chất khác nhau) hòa
tan vào một dung môi dễ bay hơi, dùng vi quản để chấm một ít dung dịch mẫu chất này thành một vết nhỏ gọn
lên tấm lớp mỏng nói trên, vết chấm ở vị trí cách cạnh đáy 1 – 1,5cm. Sấy nhẹ để đuổi bay đi phần dung môi
hòa tan mẫu, như thế mẫu chất chỉ còn là dạng bột khô ở trên tấm lớp mỏng. Đặt tấm lớp mỏng này theo chiều
thẳng đứng vào trong một bình có chứa sẵn dung môi phù hợp (chiều dày của lớp dung môi trong bình không

quá 1cm). Trước khi đặt bản vào bình, bình được bão hòa dung môi để có một bầu khí quyển đồng nhất bằng
cách phủ bề mặt trong của bình bằng một tờ giấy lọc có tẩm ướt dung môi dùng để giải ly. Dung môi sẽ bị lực
mao quản hút di chuyển lên cao trong tấm bảng, quá trình như thế sẽ phân chia hỗn hợp mẫu chất ban đầu thành
những vết riêng biệt . Khi dung môi lên gần hết tấm bảng (còn cách khoảng 0,5cm), lấy bảng ra khỏi bình và
sấy khô bảng. Các vết mẫu sẽ được xác định bằng phương pháp vật lý (nhìn trực tiếp bằng mắt thường, soi tấm
bảng bằng đèn phát huỳnh quang…) hoặc bằng phương pháp hóa học (phun xịt lên tấm bảng bởi một loại dung
dịch thuốc thử phù hợp). Ở đây, chúng tôi đã sử dụng phương pháp hóa học với thuốc thử là dung dịch H
2
SO
4

đậm đặc để xác định vết mẫu. Bản mỏng sau đó được lưu trữ trong bao plastic hoặc chụp hình và scan lại cho
việc nghiên cứu về sau.
Một hợp chất tinh khiết sau khi sắc ký lớp mỏng sẽ cho một vết, với giá trị Rf không đổi, trong một hệ
dung môi xác định, bởi bảng sắc ký của một lô sản xuất nhất định. Rf được tính theo công thức sau :

khoảng đường di chuyển của hợp chất
Rf =
khoảng đường di chuyển của dung môi
Giá trị Rf không bao giờ > 1 và thay đổi tùy theo : loại chất hấp thu dùng để tráng bảng mỏng, bảng
mỏng tráng sẵn dù của cùng một hãng sản xuất cũng khác nhau từ lô này đến lô kia, hoạt độ của bảng lúc sử
dụng, việc tồn trữ bảng , độ dày của bảng, thành phần của dung môi giải ly (chỉ cần thay đổi một ít cũng làm
ảnh hưởng kết quả), độ bão hòa của dung môi trong bình giải ly của 2 lần giải ly khác nhau cũng khác nhau, kỹ
thuật giải ly (dung môi đi lên hay đi xuống cũng cho kết quả khác nhau).

Dung môi giải ly phù hợp là dung môi có thể là cho hỗn hợp các chất ban đầu tách thành nhiều vết khác
nhau, các vết này sắc nét, rõ ràng và có vị trí nằm trong khoảng từ 1/3 đến 2/3 chiều dài bản sắc ký (các vết
chính có Rf khoảng từ 0,3 đến 0,7)
Sắc ký lớp mỏng có các ưu điểm sau :
• Mẫu để phân tích chỉ cần một lượng rất ít.

• Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng một điều kiện phân tích.
• Việc triển khai sắc ký nhanh nên trong một thời gian ngắn có thể biết kết quả mẫu cần phân tích.
• Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc ký lớp mỏng.
Sau quá trình giải ly, dung môi sẽ được loại bỏ khỏi tấm bảng mỏng trước khi dùng kỹ thuật vật lý hoặc
hóa học để phát hiện sự hiện diện chất nên không phải lo đến vấn đề hậu sắc ký như ở sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC).
I.3.3. Sử dụng phương pháp tủa urê (urea complexation) để loại bỏ các acid béo bão hòa
[19], [48]

I.3.3.1. Giới thiệu
Theo những nghiên cứu gần đây, mỡ cá có vai trò rất quan trọng đối với con người bởi vì nó có chứa
nhiều PUFA (polyunsaturated fatty acid – acid béo bất bão hòa đa), đặc biệt là DHA và EPA (acid
eiscosapentaenoic). Tuy nhiên, lượng DHA và EPA này (đặc biệt là DHA) chiếm tỷ lệ rất thấp trong mỡ cá. Do
đó đã có nhiều nghiên cứu về cách làm giàu PUFA trong mỡ cá để đưa vào sử dụng.
Các PUFA có thể được làm giàu lên bằng nhiều phương pháp khác nhau như tạo tinh thể ở nhiệt độ thấp,
tủa urê, lọc phân tử, tạo kết tủa với ion bạc hoặc bằng cách sử dụng lipase. Tuy nhiên, phương pháp đơn giản và
hiệu quả nhất để thu nhận những PUFA được làm giàu dưới dạng những acid béo tự do từ mỡ cá là phương
pháp tủa urê. Đây là một phương pháp sử dụng urê để tạo tủa với các acid béo bão hòa, loại bỏ bớt các acid này
ra khỏi hỗn hợp acid acid béo ban đầu. Phương pháp này dựa trên hiện tượng urê sẽ tạo thành tinh thể (kết tủa)
ở nhiệt độ thấp và các acid béo bão hòa sẽ liên kết với những tinh thể urê. Bằng cách loại bỏ những kết tủa này
có thể loại bỏ được những acid béo bão hòa trong hỗn hợp. Phương pháp này đã được áp dụng trên dầu gan cá
tuyết và kết quả thu được là rất khả quan, hàm lượng DHA và EPA trong hỗn hợp tăng lên đến 60-85% .
I.3.3.2. Phương pháp tiến hành
Mỡ cá đem đi thủy giải để thu được những acid béo tự do. Acid béo tự do thu được sau đó sẽ được trộn
lẫn với urê (10%, w/v) trong ethanol 95%. Hỗn hợp này được đun nóng kết hợp với khuấy kĩ ở 60 – 70
0
C đến
khi thành một dung dịch đồng nhất. Tỷ lệ của urê với lượng acid béo tự do theo nghiên cứu tốt nhất là 1 : 15
theo số mol. Dung dịch này sau đó được cho vào tủ đông -5
0

C trong 22 giờ. Loại bỏ kết tủa tạo thành bằng
phương pháp lọc. Nước lọc sau đó được pha loãng với một lượng nước cất và được acid hóa bởi acid H
2
SO
4

6M sao cho pH= 2-3. Thêm vào dung dịch nước lọc một lượng hexan (hoặc ether dầu hỏa) và lắc kỹ. Dung dịch
nước lọc sau đó sẽ tách làm hai lớp : lớp nước chứa urê nằm phía dưới và lớp hexan (ether dầu hỏa) chứa acid
béo nằm phía trên. Thu lấy lớp hexan (ether dầu hỏa), làm khan nước, đem cô quay đuổi dung môi thu được
acid béo tự do chứa chủ yếu là các acid béo bất bão hòa.
I.3.4.Phương pháp sắc ký ghép khối phổ (gas chromatograph /mass spectrometry – GC/MS)
[3], [4], [7]

I.3.4.1. Nguyên tắc hoạt động
Vào những năm đầu của thập kỷ 70, kỹ thuật liên hợp giữa hệ thống sắc ký khí và phổ khối lượng được
ra đời. Trong trường hợp này các cấu tử sau khi tách khỏi cột sắc ký sẽ lần lượt được đưa vào buồng ion hóa
của máy khối phổ. Tại đó chúng được phân mảnh và tách theo khối lượng nhờ một từ trường rồi đi vào bộ nhân
quang để chuyển hóa thành tín hiệu điện ứng với mỗi peak trên sắc ký đồ mà ta sẽ nhận được một khối phổ
riêng biệt và hoàn chỉnh.
I.3.4.2. Sơ đồ thiết bị GC/MS


Hình I.6. Mô hình máy GC/MS
[49]
So sánh giữa phương pháp sắc ký và phương pháp khối phổ thấy có những đặc tính chung sau :
• Mẫu được nghiên cứu trong trạng thái khí.
• Cả hai phương pháp đều có độ nhạy cao.
• Tốc độ phân tích của cả hai phương pháp tương tự nhau.
Sự khác biệt duy nhất giữa hai phương pháp này là trong cột sắc ký luôn tồn tại một áp suất lớn hơn áp
suất môi trường, trong khi đó buồng ion của máy khối phổ lại hoạt động ở một chân không cao (khoảng 10

-
6
mmHg). Để có thể ghép nối giữa cột sắc ký và buồng ion, giữa hai thiết bị này có một bộ phận dùng để tách
khí mang (thường là helium) trước khi vào buồng ion hóa. Nhờ đó mà độ chân không của nguồn ion không bị
ảnh hưởng. Toàn bộ hệ thống GC/MS được nối với máy tính để điều khiển tự động, xử lý số liệu, lưu trữ và ghi
phổ. Phổ MS ghi được sẽ được so sánh với các phổ MS chuẩn chứa trong thư viện máy tính, nhờ đó mà xác
định được các chất có trong mẫu. Thư viện phổ cần phải có nhiều phổ chuẩn để tăng độ chính xác cho sự
dò tìm và so sánh.
Những ưu điểm của phương pháp GC/MS :
• Lượng mẫu cần phân tích nhỏ.
• Nghiên cứu được các hợp chất không bền.
• Tiến hành tốt việc tách và nhận biết đồng thời hỗn hợp nhiều cấu tử.
Nhược điểm của phương pháp này là không phân tách được các chất có trọng lượng phân tử cao, có nhiệt
độ bay hơi cao. Chính vì vậy mẫu chất acid béo muốn phân tách được thành phần thì phải được ester hóa để
giảm nhiệt độ bay hơi thuận tiện cho kiểm tra bằng GC/MS.
I.4. GIỚI THIỆU VỀ CÁ BA SA VIỆT NAM (Pangasius bocourti SAUVAGE, 1880)
I.4.1. Các đặc điểm chính
[42]

Cá ba sa phân bố ở lưu vực sông Mê kông, có mặt ở cả 4 nước Lào, Việt Nam, Campuchia và Thái Lan.
Ở Việt Nam, cá ba sa phân bố ở sông Tiền và sông Hậu. Cá trưởng thành chỉ thấy trong ao nuôi, rất ít gặp
trong tự nhiên ở địa phận Việt Nam, do cá có tập tính di cư ngược dòng sông Mê Kông để sinh sống và tìm nơi
sinh sản tự nhiên.
Cá ba sa (còn gọi là cá bụng) là cá da trơn, có thân dài, chiều dài chuẩn bằng 2,5 lần chiều cao thân. Đầu
cá ba sa ngắn, hơi tròn, dẹp bằng, trán to, miệng hẹp và nằm hơi lệch dưới mõm, có hai đôi râu, mắt to, bụng
to, lá mỡ rất lớn, phần sau thân dẹp bên, lưng và đầu màu xám xanh, bụng trắng bạc.
Cá ba sa không có cơ quan hô hấp phụ, ngưỡng oxy cao hơn cá tra, nên chịu đựng kém trong nước có
hàm lượng oxy hòa tan thấp. Cá ba sa sống chủ yếu ở nước ngọt, chịu được nước lợ nhẹ, nồng độ muối 12,
chịu đựng được ở nơi nước phèn có pH > 5,5. Ngưỡng nhiệt độ của cá ba sa là từ 18-40
0

C, ngưỡng oxy tối thiểu
là 1,1mg/lít.
Khu vực ương nuôi cá giống tập trung chủ yếu ở các địa phương như Tân Châu, Châu Đốc (An Giang)
và Hồng Ngự (Đồng Tháp). Ở các vùng này, cá được nuôi thương phẩm chủ yếu trong bè trên sông nước chảy.


I.4.2. Phân loại
[2]

Cá ba sa là một trong số 11 loài thuộc họ cá tra (Pangasiidae) đã được xác định ở sông Cửu Long.

Hình I.7. Cá ba sa (Pangasius bocourti SAUVAGE, 1880)
[42]

Hệ thống phân loại cá ba sa từ giới đến bộ tham khảo từ tác giả Trần Thanh Tòng như sau đây :
- Giới động vật Animalia
- Ngành có dây sống hoàn chỉnh Chordata
- Ngành phụ có xương sống Vertebrata
- Nhóm có hàm Gnathostomata
- Tổng lớp cá Pisces
- Lớp cá xương Osteichthyes
- Lớp phụ cá vây tia Actinopterygii
- Tổng bộ cá toàn xương Teleostei
- Bộ cá nheo Siluriformes
- Họ cá tra Pangasiidae
- Giống Pangasius
- Loài Pangasius bocourti (Sauvage, 1880)
I.4.3. Thành phần acid béo trong mỡ cá ba sa Việt Nam
[28]


Thành phần acid béo trong mỡ cá ba sa thô được khảo sát trong đề tài nghiên cứu cấp thành phố
mang tên “Nghiên cứu hoàn thiện thiết bị sản xuất thực nghiệm chế biến mỡ cá ba sa thành dầu thực phẩm
quy mô 50kg/ngày để ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và thức ăn giàu dinh dưỡng cho trẻ em”,
do phó Chủ tịch Hội Dinh dưỡng Thành phố Hồ Chí Minh Hoàng Đức Như làm chủ nhiệm, được sở Khoa
học Công nghệ Môi trường Thành phố Hồ Chí Minh nghiệm thu thanh lý ngày 18-06-1999 và được phân tích
bởi Trung tâm Dịch vụ Phân tích và Thí nghiệm Kiểm định.

Bảng I.2. Thành phần tương đối của các acid béo có trong mỡ cá ba sa thô
Tên acid Ký hiệu Hàm lượng (%)
Myristic 14:0 1,21
Palmitic 16:0 28,66
Stearic 18:0 6,49
Oleic 18:1n-9 33,60
Linoleic 18:2n-6 12,63
Linolenic 18:3n-3 1,48
Arachidic 20:0 0,34
Gadoleic 20:1 0,60
Cetoleic 22:1n-11 0,83
Docosahexaenoic 22:6n-3 0,59










II.1. VẬT LIỆU

II.1.1. Đối tượng nghiên cứu
[12]
Đối tượng nghiên cứu là mỡ cá ba sa thô được cung cấp bởi công ty thủy hải sản An Giang.




Sơ đồ II.1. Công nghệ tách chiết mỡ lỏng từ mỡ cá ba sa.
Mỡ cá ba sa thu được từ quá trình trên có các đặc tính sau :
• Tỷ trọng ở 30
0
C 0,917
• Chỉ số chiết quang ở 40
0
C 1,460
• Chỉ số acid 0,22 mg KOH/g
• Chỉ số peroxide 4ml Na
2
SO
3

• Chỉ số xà phòng hóa 196,96 mg KOH
Mỡ cá
( mỡ phần hay mỡ bụng )
Rửa và làm sạch trong nước lạnh, xay nhỏ 3-5mm
Gia nhiệt gián tiếp
( hơi nước 1kg/cm
2
, 90-95
0

C )
Ép cơ học
Mỡ cá lỏng
Rửa bằng dung dịch nước muối 10%
Lắng tách nước
Mỡ lỏng sạch
Bảo quản

• Chỉ số iode 78,72
Mỡ cá ba sa thô được tách làm hai phần :
• Phần đặc chiếm 10% (có thể gọi là mỡ cá ba sa)
• Phần lỏng chiếm 90% (có thể gọi là dầu cá ba sa).
Ở đây, chúng tôi tiến hành thí nghiệm với dầu cá ba sa do hàm lượng của DHA trong dầu cá ba sa cao
hơn so với trong mỡ cá ba sa (0,34% so với 0,11%).
II.1.2. Dụng cụ - thiết bị - hóa chất
II.1.2.1. Dụng cụ
- Bình cầu 150ml
- Becher 100ml, 250ml
- Erlen 250ml, 500ml
- Ống đong 10ml
- Pipette 1ml
- Lọ thủy tinh 10ml, 100ml
- Ống nghiệm
- Phễu thủy tinh
- Bình lóng 250ml
- Giấy lọc
- Ống vi quản
- Đèn cồn
- Bản mỏng Silica gel 20x20cm (Merck)
- Bình giải ly

- Đá bọt
II.1.2.2. Thiết bị
- Máy cô quay chân không
- Máy đun cách thủy
- Máy khuấy từ
- Cân điện tử
- Máy sắc ký ghép khối phổ
- Tủ đông
II.1.2.3. Hoá chất
- Ether dầu hỏa (Trung Quốc)
- Benzene (Trung Quốc)
- Chloroform (Trung Quốc)
- Ethyl acetate (Trung Quốc)
- Ethanol (Trung Quốc)
- Methanol (Trung Quốc)
- Aceton
- Dung dịch H
2
SO
4
98.08%
- NaOH (Trung Quốc)
- Na
2
SO
4
khan (Trung Quốc)
II.2. PHƯƠNG PHÁP
II.2.1. Bố trí thí nghiệm
- Bước 1: Chuẩn bị mẫu, dụng cụ và hóa chất.

- Bước 2: Thủy giải mỡ cá ba sa trong môi trường kiềm.
- Bước 3: Tiến hành tủa urê để làm giàu DHA.
- Bước 4: Khảo sát bằng sắc ký bảng mỏng đặc tính của sản phẩm thu được từ bước 3.
- Bước 5: Ester hóa sản phẩm thu được từ bước 3.
- Bước 6: Khảo sát sâu hơn đặc tính của của sản phẩm từ bước 3 bằng GC/MS.
- Bước 7 : Phân tích, đánh giá các dữ liệu thu được.
II.2.2 Chuẩn bị mẫu
Mỡ cá ba sa thô có thể được bảo quản ở điều kiện bình thường và lấy ra sử dụng khi cần. Phần lỏng của
mỡ cá ba sa thô có màu vàng nhạt, có mùi cá nhẹ, đây là đối tượng chính trong suốt tiến trình thí nghiệm.
II.2.3. Phương pháp thủy giải (lipid hydrolysis)
Ở đây chúng tôi đã quyết định tiến hành thủy giải dầu cá ba sa trong môi trường kiềm bởi vì
đây là phương pháp dễ làm ở quy mô phòng thí nghiệm và cho năng suất cao.
Cho 5g dầu cá ba sa vào bình cầu, thêm vào 100ml NaOH 0,5M trong ethanol 70
0
. Tiến hành
đun hoàn lưu kết hợp với khuấy từ để dầu tan hoàn toàn vào dung môi.
Khi dầu tan hoàn toàn vào dung môi thì ta đun thêm khoảng 30 phút nữa là phản ứng hoàn tất.

Sau khi đun xong, đổ dung dịch vào 1 becher 250ml và đun cách thủy đến khi cạn khô ta thu được sản
phẩm là xà phòng.
Sau đó cho tiếp 100ml nước cất vào, thêm vào H
2
SO
4
6M sao cho pH = 1-2, dung dịch trở nên đục.
Đun hỗn hợp đến khi sôi thì acid béo nổi lên. Nhắc becher ra khỏi bếp, để nguội thì acid béo đông lại (có
thể cho becher vào tủ lạnh để acid béo mau đông hơn nhằm giảm thời gian tiến hành).

Tách lấy riêng acid béo ra cho vào lọ thủy tinh 10ml để dùng nghiên cứu tiếp về sau.
Acid béo thu được được gọi là chất A.

Sơ đồ phương pháp thủy giải được trình bày ở sơ đồ II.2.
II.2.4. Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography – TLC)
Các mục đích khảo sát khi dùng sắc ký lớp mỏng :
• Khảo sát đặc điểm của mỡ cá ba sa.
• Theo dõi diễn biến của quá trình thủy giải.
• Theo dõi quá trình methyl ester hóa acid béo.
• So sánh acid béo thu được sau khi thủy giải và sau khi làm giàu bằng phương pháp tủa urê.
Sơ đồ các bước tiến hành sắc ký lớp mỏng được trình bày ở sơ đồ II.5.
II.2.5. Phương pháp tủa urê (urea complexation)

Cho 10g acid béo thu được từ quá trình thủy giải ở trên vào 1 erlen 500ml. Sau đó cho tiếp vào 40g urê
và 400ml ethanol 95
0
. Đây là tỷ lệ tương đối thích hợp nhất cho quá trình tủa urê.
Đun erlen ở khoảng 60-70
0
C và khuấy kỹ để urê có thể tan hết vào dung dịch.
Khi dung dịch đã trở nên đồng nhất, cho erlen vào tủ đông ở -5
0
C trong 22 giờ để urê có thể tạo kết tinh
với các acid béo bão hòa.
Sau khoảng thời gian tạo tủa trên, lấy erlen ra và lọc loại bỏ tủa. Thu lấy dịch lọc (200ml) và bổ sung vào
100ml nước cất.
Thêm vào dịch lọc H
2
SO
4
6M sao cho pH của dịch lọc là 2 đến 3.
Bổ sung thêm vào dung dịch 300ml ether dầu hỏa và lắc kỹ. Để yên một lát, dung dịch sẽ tách làm hai
pha : pha ether chứa acid béo nằm phía trên và pha nước chứa urê, ethanol và H

2
SO
4
nằm phía dưới.
Thu lấy pha ether, làm khan với Na
2
SO
4
, đem cô quay đuổi dung môi.
Cuối cùng thu được acid béo đã được làm giàu DHA.
Ta đặt đây là chất A
1
.
Sơ đồ các bước tiến hành để làm giàu DHA được trình bày ở sơ đồ II.3.
II.2.6. Phương pháp sắc ký ghép khối phổ (gas chromatography / mass spectrometry – GC/MS)
II.2.6.1.Phương pháp ester hóa acid hữu cơ
Vì acid béo khó bay hơi nên thường phải được ester hóa để trở thành dạng methyl hoặc ethyl ester là
dạng dễ bay hơi để có thể phân tích bằng sắc ký khí ghép khối phổ.
Acid béo thu được sau quá trình tủa urê (1,5g) được chứa trong bình cầu 150ml. Cho thêm vào 50ml
methanol, sau đó cho vào H
2
SO
4
đậm đặc.
Lắc nhẹ, dùng giấy pH để kiểm tra độ pH của dung dịch trong lọ (pH 1-2), sau đó đun hoàn lưu kết
hợp với khuấy từ .
Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng sau mỗi 1 giờ. Sản phẩm của phản ứng ester hóa sẽ cho vết có
Rf lớn hơn vết của acid béo trong cùng hệ dung môi. Phản ứng kết thúc khi quan sát sắc ký lớp mỏng ta chỉ còn
thấy các vết của sản phẩm ester.
Thông thường khi các giọt dầu hòa tan hết vào dung môi, ta đun thêm khoảng 30 phút nữa là phản ứng

hoàn tất (khoảng 1 giờ 30 phút)
Sau khi phản ứng kết thúc, trong lọ còn chứa H
2
SO
4
. Loại bỏ H
2
SO
4
bằng cách cho thêm khoảng 20ml
nước cất vào trong lọ, nước cất sẽ hòa tan H
2
SO
4
nhưng không hòa tan mẫu. Sau đó cho thêm vào 50ml ether
dầu hỏa để hòa tan mẫu chất. Nước và ether dầu hỏa sẽ phân thành hai pha riêng biệt : pha ether dầu hỏa chứa
ester tạo thành nằm phía trên, còn nước hòa tan H
2
SO
4
nằm phía dưới. Thu lấy pha ether dầu hỏa.
Kiểm tra xem dung dịch ether dầu hỏa có còn H
2
SO
4
không bằng giấy pH. Làm khan dung dịch bằng
Na
2
SO
4

. Đuổi dung môi thu được acid béo methyl ester. Đặt đây là chất A
2
.
Khảo sát bằng GC/MS.
Sơ đồ các bước tiến hành ester hóa acid béo được trình bày ở sơ đồ II.4.
II.2.6.2. Phương pháp sắc ký ghép khối phổ
Mẫu acid béo thu được sau quá trình ester hóa được gửi đi phân tích ở Phòng phân tích Hóa Lý, Viện
Khoa học Công nghệ Thành phố Hồ chí Minh, số 1 Mạc Đĩnh Chi, Quận 3.









Sơ đồ II.2. Các bước tiến hành phản ứng xà phòng hóa









Mỗi phản ứng gồm 5g dầu cá ba sa + 100ml NaOH 0.5M trong ethanol 70
0


Đun hoàn lưu kết hợp với khuấy từ trong 2 giờ 30 phút
Chuyển dung dịch ra becher 250ml và đun đến khi cạn khô
Æ thu được xà phòng
Thêm 100ml nước cất và H
2
SO
4
6M
Kiểm tra pH 1-2 Æ dung dịch trở nên đục
Đun đến khi sôi thì acid béo nổi lên
Cho becher vào tủ lạnh để acid béo đông lại
Thu lấy acid béo tự do và kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng


Sơ đồ II.3. Các bước tiến hành để làm giàu DHA


Trong erlen 500ml, cho vào 10g acid béo tự do + 40g urê + 400ml ethanol 95
0

Đun + khuấy ở 60-70
0
C để thành dung dịch đồng nhất (15 phút)
Để yên erlen vào tủ đông -5
0
C trong 22 giờ
Lấy erlen ra và lọc bỏ kết tủa, thu lấy dịch lọc
Thêm vào 100ml nước cất
Acid hóa dịch lọc bằng H
2

SO
4
6M (pH = 2-3)
Thêm vào 300ml ether dầu hỏa, lắc kỹ
Dịch lọc tách làm 2 pha : pha nước chứa urê + ethanol + H
2
SO
4
, pha ether dầu hỏa
chứa acid béo
Lọc lấy pha ether dầu hỏa, làm khan với Na
2
SO
4
, đuổi
dung môi
Acid béo giàu DHA (A
1
)


Sơ đồ II.4. Các bước tiến hành ester hóa mẫu acid béo thu được sau khi tủa urê



Cho mẫu (1,5g A
1
) + 50ml methanol + H
2
SO

4
đậm đặc
Lắc đều
Kiểm tra pH của hỗn hợp (pH 1-2)
Đun hoàn lưu kết hợp với khuấy từ
Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng
Phản ứng kết thúc khi acid béo chuyển hết sang dạng methyl ester

Thêm nước và ether dầu hỏa để tách làm 2 pha : pha nước chứa H
2
SO
4
,
pha ether chứa ester

Lọc lấy pha ether, làm khan với Na
2
SO
4
,
đuổi dung môi
Acid béo methyl ester (A
2
)
Khảo sát bằng GC/MS




Sơ đồ II.5. Các bước chuẩn bị và tiến hành sắc ký lớp mỏng



Chuẩn bị mẫu
Chuẩn bị tấm lớp mỏng, vi quản, dung môi giải ly
Chấm mẫu lên tấm lớp mỏng
Khai triển giải ly để dung môi di chuyển lên
Sấy khô tấm lớp mỏng
Hiện hình các vết trên bảng mỏng bằng H
2
SO
4
đậm
đặc