BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG






NGHIÊN CỨU BẢO QUẢN TINH TRÙNG CÁ TRÊ ĐEN
(Clarias fuscus) TRONG NITƠ LỎNG (-196
O
C)

Luận văn tốt nghiệp
Chuyên ngành: Nuôi Trồng Thủy sản, khóa 2003 – 2007






Sinh viên thực hiện:
VŨ THỊ LOAN
MSSV: 45DN077
Người hướng dẫn:
TS. LƯU THỊ DUNG


Nha Trang, tháng 11 năm2007

i

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp tôi đã được sự hướng dẫn tận tình của
tiến sĩ Lưu Thị Dung hoàn thành đề tài này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới sự
giúp đỡ quý báu đó.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong khoa Nuôi trồng Thuỷ Sản
– Trường Đại Học Nha Trang đã chỉ dạy cho tôi những kiến thức cơ bản trong suốt
thời gian học tập tại trường, để tôi có đủ kiến thức thực hiện đề tài này. Cảm ơn các
thầy cô ở phòng thí nghiệm khoa nuôi đã tạo mọi điều kiện cho tôi thực tập tốt nghiệp.
Qua đây tôi cũng xin bầy tỏ lòng cảm ơn tới gia đình bạn bè đã động viên giúp đỡ
tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài tốt nghiệp.
Nha Trang, ngày 25 tháng 10 năm 2007
Sinh viên thực hiện
Vũ Thị Loan
ii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC CÁC BẢNG iii
DANH MỤC CÁC HÌNH iv
MỞ ĐẦU 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1. Một số đặc điểm sinh học cá Trê Đen 3
Hệ thống phân loại: 3
Đặc điểm về hình dạng ngoài: 3
2. Đại cương về tinh trùng 4
2.1 Quá trình tạo tinh 4

2.2 Cấu tạo tinh trùng 5
2.3 Một số đặc điểm sinh học của tinh trùng 6
3. Tóm tắt tình hình nghiên cứu bảo quản tinh 8
3.1 Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trên thế giới 8
3.2 Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh ở Việt Nam 10
4. Các yếu tố ảnh hưởng tới kết quả bảo quản tinh 11
4.1 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường 11
4.2 Ảnh hưởng của kỹ thuật 12
PHẦN 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 17
2. Đối tượng nghiên cứu 17
3. .Phương pháp nghiên cứu 17
4. Phương pháp xử lý số liệu 23
PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 26
1. Một số đặc điểm sinh học cá Trê Đen 26
2. Bảo quản tinh dài hạn trong Nitơ lỏng (-196
o
C) 28
3.Kết quả tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ nở của tinh bảo quản 37
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

iii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 2.1: Thành phần hóa học các Extender sử dụng trong bảo quản
tinh cá (mg/1000mL nước cất) 20
Bảng 3.1 : Một số chỉ tiêu sinh học tinh dịch cá Trê Đen 25

Bảng 3.2 : Màu sắc tinh cá Trê Đen dùng bảo quản 26
Bảng 3.3 : Kết quả bảo quản tinh trùng cá Trê Đen trong Nitơ lỏng
sau 1 tuần giải đông 28
Bảng 3.4 : Kết quả bảo quản tinh trùng cá Trê Đen trong Nitơ lỏng
sau 2 tuần giải đông 28
Bảng 3.5 : Kết quả bảo quản tinh trùng cá Trê Đen trong Nitơ lỏng sau
3 tuần giải đông 29
Bảng 3.6 : Tỷ lệ sống (%) của tinh trùng cá Trê Đen sử dụng chất chống đông
DMSO 10% sau khi giải đông. 32
Bảng 3.7: Tỷ lệ thụ tinh của trứng dùng tinh bảo quản so với tinh tươi 35
Bảng 3.8: Tỷ lệ nở của trứng sử dụng tinh bảo quản so sánh với tinh tươi 37


iv

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1: Sơ đồ tóm tắt quá trình nghiên cứu bảo quản tinh cá 23
Hình 2.2: Sơ đồ tóm tắt thí nghiệm thụ tinh 24
Hình 3.1 : Tỷ lệ sống (%) của tinh trùng trong các Extender khác nhau sau
bảo quản 1 tuần 33
Hình3.2 : Tỷ lệ sống của tinh trùng ở các tỷ lệ pha loãng khác nhau sau
bảo quản 1 tuần 34
Hình 3.3: Tỷ lệ sống (%) của tinh trùng theo thời gian bảo quản 35
Hình 3.4 : Tỷ lệ thụ tinh (%) của tinh bảo quản so với tinh tươi 36
Hình 3.5: Tỷ lệ nở của tinh bảo quản so với tinh tươi 38


1


MỞ ĐẦU

Khi môi trường sống thay đổi, dẫn đến sự tạp giao ngẫu nhiên của sinh vật trong
tự nhiên nói chung và các đối tượng nuôi nói riêng đã làm biến đổi gen. Cá là động vật
có xương sống bậc thấp, sống ở nước. Quá trình thụ tinh diễn ra bên ngoài cơ thể nên
dễ bị biến đổi. Từ đó chất lượng con giống kém, một số loài quý hiếm có nguy cơ bị
suy thoái và diệt vong. Để hạn chế điều đó việc thu thập lưu giữ và bảo tồn vốn gen là
rất cần thiết và rất quan trọng, hơn nữa tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình sản xuất
giống nhân tạo và mở rộng chương trình chọn giống.
Bảo quản tinh là phương pháp nhằm kéo dài thời gian sử dụng của tinh dịch, giúp
cho quá trình thụ tinh nhân tạo được chủ động hơn, đơn giản trong việc vận chuyển cá
bố mẹ từ nơi này tới nơi khác phục vụ cho lai tạo giống mới.
Bảo quản tinh khắc phục được những khó khăn trong sinh sản nhân tạo do lệch
pha sinh dục giữa con đực và con cái đồng thời bảo vệ được nguồn gen quý (Young và
ctv…,1992). Hơn nữa bảo quản tinh còn có vai trò quan trọng trong việc hạn chế tối
đa lưu giữ cá đực, bảo tồn dòng thuần, ngăn cản sự suy giảm chất lượng di truyền do
lai cận huyết trong quần đàn (Rana và ctv, 1990).
Nghiên cứu bảo quản tinh của các loài động vật đã thực hiện từ những năm 1950.
Đầu tiên là trên các đối tượng vật nuôi như Cừu, Bò,…sau đó đến cá. Hiện này, những
nghiên cứu về bảo quản tinh cá đã được triển khai một cách có hiệu quả ở nhiều nước
trên thế giới. Các đối tượng như cá Trích (Blaxter, 1953), cá Hồi (Stoss và Holtz, 1983;
Lahnsteiner và ctv.1997; Brown và Mim,1999), cá Bơn (Mounib, 1978), cá Tuyết
(Bolla và ctv. 1987)…
Ở Việt Nam việc bảo quản tinh được thực hiện chủ yếu trên các đối tượng bò,
heo. Tinh cá chủ yếu được bảo quản ngắn hạn. Hình thức bảo quản thường ở trạng thái
nguyên tinh dịch hay trong các dụng cụ khô ráo ở nhiệt độ thấp trong vài giờ tới vài
ngày (Dương Tuấn, 1978).
2

Cá Trê Đen (Clarias fuscus) là đối tượng cá nước ngọt có giá trị kinh tế và thương

phẩm cao, thịt mềm ít xương, vị thơm ngon. Tuy nhiên hiện nay do quá trình di nhập
cá Trê phi từ nước ngoài dẫn tới quá trình lai tạp xảy ra nhiều làm biến đổi nguồn gen
quý này. Vì vậy việc lưu giữ và bảo tồn giống thuần phục vụ công tác lai tạo, chọn
giống là rất cần thiết. Xuất phát từ vấn đề đó, đồng thời tập làm quen với phương pháp
nghiên cứu khoa học. Trong thời gian thực tập tốt nghiệp tôi được phân công của bộ
môn cơ sở sinh học – Khoa nuôi trồng thuỷ sản – Trường đại học Nha Trang giao cho
đề tài.
“Nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá Trê Đen (Clarias fuscus) trong Nitơ lỏng”
Nội dung chính của đề tài bao gồm:
- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học cá Trê Đen.
- Nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá Trê Đen trong Nitơ lỏng : Xác định chất chống
đông và nồng độ chất chống đông thích hợp. Tìm ra Extender và tỷ lệ pha loãng thích
hợp. Xác định tỷ lệ sống, tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ nở của trứng thụ tinh với tinh sau bảo
quản.
- Đánh giá chất lượng tinh sau thời gian bảo quản thông qua tỷ lệ sống, hoạt lực, tỷ lệ
thụ tinh và tỷ lệ nở của trứng thụ tinh với tinh bảo quản.
Do thời gian có hạn, trình độ và kinh nghiệm của bản thân còn hạn chế nên báo cáo
này không tránh khỏi thiếu sót. Kính mong sự chỉ bảo và giúp đỡ của thầy cô và các
bạn để báo cáo được hoàn chỉnh hơn.


Nha Trang, ngày 25 tháng 10 năm 2007
Sinh viên thực hiện
Vũ Thị Loan
3

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1. Một số đặc điểm sinh học cá Trê Đen
Hệ thống phân loại:


Ngành động vật có xương sống: Vertabrata
Lớp cá xương: Osteichthyes
Lớp phụ - cá vây tia: Actinopterygii
Bộ cá nheo: Siluriformes
Họ cá nheo: Siluridae
Chi: Clarias
Loài: C. f uscus [8]




Đặc điểm về hình dạng ngoài:
Thân cá trần, đầu dẹp bằng thân và đuôi dẹp bên. Có 4 đôi râu dài và to, mõm tù,
miệng rộng hướng ra phía trước, hai hàm đều có răng sắc nhọn. Mắt ở hai bên đầu,
khoảng cách hai ổ mắt rộng. Vây lưng và vây hậu môn dài không có gai. Vây đuôi tròn
bé. Vây ngực có một tia vây cứng.
Cá Trê Đen là loài cá ăn tạp, chủ yếu là ăn động vật, ống tiêu hóa của cá ngắn. Cá
Trê Đen có thịt thơm ngon [11] [14].
4

2. Đại cương về tinh trùng
2.1 Quá trình tạo tinh
Tinh trùng trước khi thành thục trải qua nhiều giai đoạn phát triển khác nhau, cuối
cùng mới phân hoá cao độ hình thành tế bào sinh dục đực có khả năng thụ tinh. Toàn
bộ quá trình tạo tinh trùng diễn ra trong tinh sào (buồng sẹ), sự phát triển của tinh trùng
bắt đầu từ tế bào sinh dục nguyên thuỷ trải qua các giai đoạn sau:
 Giai đoạn tăng sinh
 Giai đoạn sinh trưởng
 Giai đoạn thành thục

2.1.1 Giai đoạn tăng sinh
Tế bào nguyên thuỷ phân chia nguyên nhiễm tạo thành nhiều tinh nguyên bào,
tinh nguyên bào có một nhân to, chất nguyên sinh trong nhân phân bố đều [2].
2.1.2 Giai đoạn sinh trưởng
Tinh nguyên bào qua nhiều lần phân chia sẽ đến thời kỳ sinh trưởng. Thời kỳ
này chất dinh dưỡng do tinh nguyên bào hấp thụ được đồng hoá và chuyển thành
nguyên sinh chất của tế bào. Do đó tế bào sinh trưởng nhanh mãnh liệt, thể tích tăng
hình thành tinh bào sơ cấp (tinh bào bậc 1). Chất nguyên sinh phân bố đều ở tinh
nguyên bào sơ cấp [2].
2.1.3 Giai đoạn thành thục
Tinh nguyên bào phân chia giảm nhiễm liên tục hai lần, lần phân bào thứ nhất
để hình thành tinh bào bậc 2 (tinh bào thứ cấp), lúc này nhiễm sắc thể trong nhân giảm
xuống một nửa (nhiễm sắc thể ở trạng thái đơn bội kép). Sau khi hoàn thành quá trình
phân chia giảm nhiễm lần thứ nhất, lần phân chia thứ hai tiếp tục bắt đầu (phân chia
nguyên nhiễm bình thường) để tạo nên tinh tử. Mỗi một nhiễm sắc thể chia đôi theo
chiều dọc số lượng nhiễm sắc thể không thay đổi, một tinh bào thứ cấp chia đôi thành
hai tinh tử có thể tích bé hơn tinh bào. Tinh tử trải qua quá trình biến đổi để hình thành
tinh trùng [2].
5


2.2 Cấu tạo tinh trùng
Tinh trùng là một tế bào đặc biệt, thích ứng với chức năng vận chuyển và thụ tinh.
Tinh trùng có kích thước vô cùng nhỏ từ 50-60 µm, được bao bọc bởi màng bọc tế bào
và các cơ quan như: nhân, ty thể, trung thể… Tinh trùng có hình thái khác nhau ở các
loài khác nhau tuy nhiên đều có cấu tạo chung liên quan tới chức năng thụ tinh. Cấu
tạo của tinh trùng gồm ba phần: phần đầu, phần cổ, phần đuôi [2].
2.2.1 Phần đầu
Đầu tinh trùng là phần có khả năng kích thích trứng và truyền đạt vật chất di
truyền. Hình thái của đầu tinh trùng khác nhau tuỳ theo loài. Ở cá Sụn

(Chondrichthyes) đầu tinh trùng lớn, hình trụ kéo dài hình chỉ thường xoắn lại. Ở cá
Xương (Ostrichthyes) đầu tinh trùng có thể hình tròn, hình tim, hoặc ô van.
Phần đầu do hai bộ phận là thể đỉnh và nhân tạo thành. Thể đỉnh là một bao kín,
dẹp lại giống như cái mũ đội lên phần nhân. Trong bao, ngay trên đỉnh của nhân
thường có hạt đỉnh. Bên trong thể đỉnh và các hạt đỉnh thường có chứa các enzyme
thuỷ phân như: phosphatase, esterase, nhiều loại protease, hyaluzonidase, các enzyme
này đóng một vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập của tinh trùng qua màng
trứng để vào trứng. Nhân tế bào của tinh trùng được bao bọc bởi màng nhân, chất chứa
trong nhân được cô lại ở trạng thái rất đậm đặc trong một thể tích rất nhỏ. Người ta
thấy rằng cấu tạo của nhân gồm một sợi mảnh, có lẽ là DNP (Dezoxyribo
nucleoprotein) xếp song song và rất chặt vào nhau làm cho cấu trúc nhân gần như cấu
trúc tinh thể. Tuy nhiên nhiễm sắc thể vẫn phân bố theo một trật tự nhất định. Nhân
tinh trùng không có ARN và prôtein phi histon. Histon được thay thế bằng loại protein
giàu prolin thuộc nhóm protamin [2] [5].
2.2.2 Phần cổ
Phần cổ nằm sát ngay sau phần đầu, rất ngắn và hơi eo lại. Trong phần cổ có hai
trung tử, một trung tử nằm ngay sát nhân, một trung tử xa ở gần với đuôi, và từ trung tử
6

xa sẽ phát ra các sợi trục của đuôi tinh trùng. Trung tử đóng vai trò quan trọng trong
quá trình phân chia trứng thụ tinh [2].
2.2.3 Phần đuôi
Đuôi tinh trùng là cơ quan vận động, thường mảnh và dài từ 25-60 µm tuỳ theo
loài. Phần đầu của đuôi tinh trùng là vòng xoắn ty thể. Ty thể là bào quan mang
enzyme oxy hoá và các enzyme photphryil hoá liên quan tới nhu cầu chuyển hoá năng
lượng của tinh trùng trong quá trình vận động. Ngoài ra phần đuôi còn có tác dụng điều
hoà áp suất thẩm thấu, giữ cho tinh trùng không bị trương nước [2].
2.3 Một số đặc điểm sinh học của tinh trùng
2.3.1 Kích thước và số lượng
Kích thước của tinh trùng thường rất bé so với tế bào trứng của cùng một loài.

Ví dụ: Bò 65µ, chuột 100µ, Gà 90 – 100 µ, Người 50 – 70 µ, Cá Rô 20 µ, Hầu
75 µ, Tôm He 10 µ.
Ngược lại với kích thước, số lượng tinh trùng vô cùng lớn. Ngựa mỗi lần phóng
tinh trùng đến 10 triệu tinh trùng. Các động vật thụ tinh ngoài số lượng của tinh trùng
mỗi lần phóng tinh vô cùng lớn.
2.3.2 Tuổi thọ và đặc điểm hoạt động
Nói chung tuổi thọ của tinh trùng rất ngắn. Đối với động vật thụ tinh ngoài, tuổi
thọ tinh trùng ngắn hơn động vật thụ tinh trong, thông thường chỉ vài phút. VD: Tinh
trùng Gà có thể sống trong ống sinh dục của con cái 20-40 ngày ở nhiệt độ 26-29
o
C,
tinh trùng Bào Ngư có thể sống và có khả năng thụ tinh sau 2h ngoài môi trường nước
[4].
Sức sống và năng lực hoạt động của tinh trùng biểu lộ bằng sự chuyển động của
chúng. Khi còn ở trong tuyến sinh dục tinh trùng không vận động nhưng khi rơi vào
môi trường nước, tinh trùng vận động mạnh. Tinh trùng lao về phía trước, sau 1-2phút
chuyển động chậm dần và sau đó chuyển sang chuyển động giao động. Độ khoảng 2-3
phút lượng tinh trùng chuyển động còn rất ít và cuối cùng toàn bộ ngừng hoạt động [4]
7

Khả năng vận động và tuổi thọ của tinh trùng phụ thuộc rất nhiều các yếu tố như sự
thành thục của tinh trùng, các yếu tố môi trường: áp suất thẩm thấu, nhiệt độ, pH, ánh
sáng…
Đối với những tinh trùng chưa thành thục hoặc quá trình thành thục khả năng vận
động đều rất kém so với tinh trùng vừa độ thành thục.
Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng rất lớn tới sức sống và khả năng vận động của tinh
trùng. Trong giới hạn nhiệt độ thích hợp khi nhiệt độ tăng thì tốc độ vận động của tinh
trùng tăng, nhưng tuổi thọ của tinh trùng giảm. Vì nhiệt độ tăng nên làm cho quá trình
oxy hoá vật chất trong tinh trùng diễn ra nhanh và sự tiêu hao năng lượng tăng lên. Do
vậy, nếu nhiệt độ tăng nhanh thì tinh trùng sẽ nhanh mất khả năng vận động và chết.

Đây là cơ sở khoa học của việc bảo quản tinh ở nhiệt độ thấp.
VD: Tinh trùng cá Chép bảo quản ở môi trường có nhiệt độ từ 0-2
o
C sống được
8 ngày vẫn có khả năng thụ tinh. Tinh trùng cá Tầm ở 1-4
o
C sống lâu nhất nếu bảo
quản nơi khô ráo có thể sống được 19 ngày.
Áp suất thẩm thấu của môi trường cũng ảnh hưởng rất lớn tới sức sống của tinh
trùng. Áp suất thẩm thấu của nguyên sinh chất hay của tinh trùng phải bằng với áp suất
thẩm thấu của môi trường thì tinh trùng mới không bị ảnh hưởng có hại của áp suất
thẩm thấu. Nếu áp suất thẩm thấu của môi trường lớn hơn hay nhỏ hơn áp suất thẩm
thấu của tinh dịch đều không tốt cho tinh trùng. Cụ thể tinh trùng có thể teo lại hay
phồng lên nếu chênh lệch áp suất thẩm thấu quá lớn, nếu chênh lệch không lớn thì làm
tinh trùng bị tiêu hao một phần năng lượng cho quá trình điều hoà áp suất thẩm thấu,
làm tinh trùng giảm tuổi thọ.
Ánh nắng cũng ảnh hưởng trực tiếp tới sức sống của tinh trùng, đó là do hiệu ứng
của tia tử ngoại và hiệu ứng nhiệt quang làm tăng sức hoạt động của tinh trùng làm tinh
trùng nhanh chết.
8

pH của môi trường cũng có liên quan đến sự vận động của tinh trùng. Thông
thường thì pH của môi trường tương đương pH của tinh dịch là tốt nhất cho tinh trùng.
Mỗi loài cá khác nhau có pH môi trường phù hợp với tinh trùng cũng khác nhau.
3. Tóm tắt tình hình nghiên cứu bảo quản tinh
3.1 Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trên thế giới
Các công trình nghiên cứu bảo quản tinh cá đã được triển khai cách đây 50 năm về
trước. Nhưng việc lưu giữ tinh ban đầu chỉ là cất giữ trong điều kiện thấp như tủ lạnh
hay đá khô. Tuy nhiên, thời gian sau đó nhiều công trình nghiên cứu bảo quản tinh đã
thành công và công bố rộng rãi như Stein và Bayrle 1978; Scott và Bayrle Stoss 1983;

Bart và ctv, 1998; Grow, 2000…Các nghiên cứu này đã được công bố dưới nhiều hình
thức khác nhau, với nhiều ngôn ngữ khác nhau: Trung Quốc, Nhật Bản, Nga, Anh, đến
nay đã có khoảng 20 công trình được công bố với nhiều phương pháp bảo quản khác
nhau. Trong đó cá nước ngọt là đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất.
Blaxter là người đầu tiên thành công trong việc nghiên cứu bảo quản tinh cá. Năm
1953, ông đã nghiên cứu bảo quản thành công tinh cá Trích (Lupea herenffus), thời
gian bảo quản 6 tháng ở -70
o
C trong dung dịch nước biển, nồng độ 0,34% và chất
chống đông là glycerol 12,5% tỷ lệ pha loãng với nước biển là 4:1 (nước biển:tinh
dịch). Kết quả thu được là 80-85% trứng thụ tinh với tinh trùng được bảo quản sau khi
giải đông và cho thụ tinh.
Đối tượng cá biển chưa được nghiên cứu nhiều lắm. Cho đến nay có khoản 30 loài
đã được nghiên cứu, nhiều nhất là cá Song (Epinephlus taurina). Theo nghiên cứu của
Withler và Lim (1982) trên cá Song có khoảng 50-75% tinh trùng có hoạt lực sau khi
giải đông. Dung dịch bảo quản gồm hai extender, một gồm 7,65 mg/L NaCl, 4,5 mg/L
NaHCO
3
, 251 mg/L buffer, một loại gồm 6,57 mg/L NaCL, 4,5 mg/L NaHCO
3
, 189
mg/L Buffer và chất chống đông DMSO 10%. Sau khi cân bằng ở 5-10
o
C, tinh dịch
9

chuyển vào trong cọng chúa có V = 1ml và làm lạnh trong hơi Nitơ lỏng. Nhiệt độ giải
đông ở 21-26
o
C trong tủ ấm.


Cho đến năm 1992, phương pháp bảo quản tinh cá Song có sự cải tiến (Chao &
ctv). Phương pháp được các ông tiến hành trên cá Song (Epinephelus malabaricus) kết
quả thụ tinh là 66-92% không khác biệt đáng kể so với đối chứng. Tinh được làm lạnh
trên hơi Nitơ lỏng cách bề mặt nitơ lỏng khoảng 2 cm, thời gian làm lạnh là 5, 10, 15
và 20 phút. Sau đó mới được chuyển vào lưu giữ trong Nitơ lỏng. Dung dịch bảo quản
tinh gồm: NaCL 135 g, KCL 0,06 g, NaHCO
3
0,02 g, CaCl
2
0,025 g, MgCl
2
0,035 g,
trong 100 mL nước cất, hai loại chất chống đông (DMSO và Glycerol) với ba nồng độ
khác nhau (5%, 10% và 15%) thời gian cân bằng không quá 10phút ở nhiệt độ 4
o
C .
Việc nghiên cứu tinh trùng nước ngọt diễn ra mạnh mẽ hơn, chủ yếu tập trung trên
các đối tượng nuôi quan trọng như cá Hồi, cá Rôphi, cá Chép, cá Tầm, cá Trắm Cỏ…
Stein và Bayrle (1978) đã bảo quản tinh các loài cá Hồi nước ngọt, theo phương
pháp bảo quản của Nagase (1964), dung dich bảo quản gồm 10% chất chống đông
DMSO và hai extender khác nhau theo tỷ lệ pha loãng 1:3 (tinh: extender) tinh bảo
quản trong nitơ lỏng thời gian 7 ngày, sau đó giải đông nhanh trong 10ml
NaHCO
3
(1%), có hơn 70% tinh trùng hoạt động sau giải đông.
Urbanyi và ctv (2000) đã mô tả chi tiết phương pháp bảo quản tinh cá Trê (Clarias
gariepilus). Tinh thu được bằng cách giết cá đực, dung dịch bảo quản gồm 6% đường
fructose và 10% chất chống đông DMSO. Độ pH được điều chỉnh bằng dung dịch đệm
NaHCO

3
(0,1N). Tinh sau khi pha loãng với dung dịch bảo quản theo tỷ lệ 1:1 được
cân bằng ở nhiệt độ 3
o
C trong 10 phút. Sau đó chuyển tinh vào cọng rạ V= 0,25ml và
làm lạnh theo chương trình chạy nhiệt áp dụng theo Steyn và Van Vuren (1987);
Magyary và ctv (1986). Phương pháp đông nhanh (trong 5 giây) ở nhiệt độ trong tủ ấm
40
o
C. Kết quả thụ tinh đạt được rất cao từ 90%-95% so với đối chứng trong khi hoạt
lực của tinh trùng sau khi giải đông 50%.
10

Chao và ctv (1986) đã công bố kết quả bảo quản tinh 6 loài cá Rôphi gồm:
Oreochromis aureus; O.mossambicus; O.niloticus; Tilapia zilli; cá lai giữa
O.nilotcus * O.mossambicus và cá Oreochromis spp. Độ pH của tinh dịch các loài cá
Rôphi trên dao động từ 6,2-8,2. Dung dịch bảo quản gồm 15% sữa và 5% methanol.
Sau khi pha loãng tinh với tỷ lệ 1:1 nhanh chóng làm lạnh nhanh xuống -35
o
C và hạ
tiếp với tốc độ 5
o
C/phút cho xuống tới -70
o
C rồi chuyển vào giữ trong nitơ lỏng. Tỷ lệ
thụ tinh của tinh trùng đã giải đông đạt được sau 22 ngày bảo quản là 72,7%, so với đối
chứng là 90%. Riêng cá Rôphi Đỏ (Oreochromis spp), sau 304 ngày bảo quản tinh cá
vẫn có khả năng thụ tinh.
Trong số các loài cá nước ngọt thì cá Chép là đối tượng được nghiên cứu rộng rãi
(Magyary, 2000). Moczarski(1976-1977) đã bảo quản thành công tinh cá Chép trong

dung dịch đệm photphat đạt tỷ lệ ra bột cao nhất là 16,2% và tỷ lệ sống sau 5,5 tháng
tuổi đạt cao nhất là 60,2%. Trong thí nghiệm tác giả đã sử dụng 12 extender và 3 loại
chất chống đông khác nhau. Chất chống đông gồm glyceryl, ethylen glycol dimethyl
sulfoxide (DMSO) với nồng độ 15% và 25%. Tỷ lệ pha loãng từ 1:1 tới 1:6, thời gian
cân bằng từ 5 tới 6 phút. Phương pháp làm lạnh được thực hiện theo 3 cách khác nhau:
thứ nhất chuyển thẳng mẫu tinh vào giữ trong Nitơ lỏng; thứ 2 là làm lạnh từ từ trong
hơi Nitơ lỏng cách bề mặt 3-5cm; thứ 3 cũng làm lạnh trong hơi Nitơ lỏng cách bề mặt
10cm. Nhiệt độ giải đông cũng được thử nghiệm trên 3 mức nhiệt độ khác nhau, một
mức ở nhiệt độ 20-26
o
C, mức hai ở O
o
C, mức ba ở 20
o
C. Sau đó cho thụ tinh với trứng,
tỷ lệ thụ tinh đạt cao nhất là 49,5%.
3.2 Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh ở Việt Nam
Việc nghiên cứu bảo quản tinh cá trong Nitơ lỏng ở Việt Nam đã được chú ý một
vài năm gần đây. Trước đó việc bảo quản tinh cũng đã được nghiên cứu song chủ yếu
là trên các đối tượng vật nuôi, gia súc và chỉ bảo quản ngắn hạn ở nhiệt độ thấp. Theo
Dương Tuấn (1978), nếu để tinh dịch ở trong dụng cụ sạch sẽ, khô ráo ở 0 ÷ 2
o
C có thể
duy trì khả năng thụ tinh của cá 1 ÷ 2 tuần.
11

Đối với một số loài cá nước ngọt như: cá Chép, cá Trắm Cỏ, cá Mrigan, cá Bỗng,
đã được Hồ Kim Điệp và ctv (2002) của Viện nghiên cứu NTTS1 nghiên cứu tìm ra
được dung dịch bảo quản và nồng độ chất chống đông thích hợp cho mỗi loài. Và bước
đầu xây dựng quy trình bảo quản tinh cho những loài trên [6].

Năm 2001 -2003 Nguyễn Minh Thành, Hoàng Quốc Trọng, Hoàng Quang Bảo,
Nguyễn Thị Hồng Vân của Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II, đã tiến hành nghiên
cứu “ Phương pháp bảo quản tinh cá Tra dài hạn trong Nitơ lỏng” [21].


Năm 2006 Đàm Bá Long thuộc trường Đại học Nha Trang đã công bố kết quả đề
tào nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá Mè Trắng (Hypophthalmichthys molitrix) trong
Nitơ lỏng (-196
o
C) [11].
Ngoài các đối tượng trên thì những đối tượng khác cũng đang được triển khai
nghiên cứu tìm ra phương pháp bảo quản thích hợp.
4. Các yếu tố ảnh hưởng tới kết quả bảo quản tinh
4.1 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường
4.1.1 Áp suất thẩm thấu
Áp suất thẩm thấu là yếu tố ảnh hưởng lớn nhất tới quá trình bảo quản tinh. Đối
với tinh trùng cá khi còn ở trong tinh sào, tinh trùng không vận động., khi vào trong
nước do oxy trong nước gây nên quá trình oxy hoá kích thích tinh trùng họat động. Mặt
khác do sống trong môi trường nước có áp suất thẩm thấu chênh lệch nên chúng phải
tiêu hao năng lượng để điều chỉnh áp suất thẩm thấu do đó tinh trùng lại càng nhanh
chết. Năng lượng cần để duy trì sự sống của tinh trùng chủ yếu dựa vào chất
glucoprotit và lipit trong chất nguyên sinh. Tinh trùng hết sức nhạy cảm với áp suất
thẩm thấu, vì thế khi tiến hành cất giữ tinh dịch, cần phải theo dõi chặt chẽ dung dịch
pha loãng với áp suất thẩm thấu bằng với áp suất thẩm thấu của tinh dịch hay không.
12

4.1.2 Độ pH
Theo nghiên cứu của Inba Densabaro nồng độ của ion hydro ảnh hưởng rất lớn đến
khả năng tồn tại của tinh trùng do đó khi xử lý tinh dịch để đưa vào lưu giữ cần phải
xem xét đến độ pH của extender sử dụng và pH của tinh dịch cá phải xấp xỉ với nhau.

4.1.3 Nhiệt độ
Nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến sức sống và khả năng vân động của
tinh trùng, tuổi thọ tinh trùng và nhiệt độ môi trường có liên quan mật thiết với nhau.
4.1.4 Ánh sáng
Ánh sáng là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp tới tuổi thọ của tinh trùng, do hiệu ứng
quang học của tia tử ngoại và hiệu ứng nhiệt quang của tia hồng ngoại. Nên khi chiếu
thẳng vào tinh trùng làm tăng khả năng vận động của tinh trùng, như vậy tinh trùng sẽ
mau chết (Dương Tuấn, 1978).
4.2 Ảnh hưởng của kỹ thuật
4.2.1 Kỹ thuật chọn cá bố mẹ
Đây là khâu đầu tiên quan trọng vì chất lượng tinh của cá đực có tốt hay không phụ
thuộc vào mức độ thành thục của nó và điều kiện đang sống. Khả năng vận động của
tinh trùng chưa thành thục hay quá thành thục đều rất kém so với vừa độ thành thục.
4.2.3 Quá trình thao tác thu mẫu
Trước khi thu mẫu dụng cụ cần được khử trùng và để nơi thoáng mát, cá bố mẹ
phải được kiểm tra lại. Khi thu mẫu phải hết sức cẩn thận, tránh không để phân cá máu
cá chày vào tinh dịch nếu không tinh trùng bị kích thích dẫn đến thời gian cất giữ ngắn.
Nên lấy tinh trùng vào buổi sáng lúc trời mát tinh sẽ không bị biến chất, không nên lấy
tinh dưới ánh sáng mặt trời để tránh tinh trùng bị sát thương. Những ống đựng tinh
dịch cần để trong chỗ mát không nên nắm trong tay bởi nhiệt độ tay cao làm giảm tuổi
thọ tinh trùng. Tinh dịch lấy xong cần chuyển nhanh về phòng thí nghiệm để kiểm tra
và xử lý mẫu.

13

4.2.4 Extender (Dung dịch pha loãng)
Extender (dung dịch pha loãng) là dung dịch có tác dụng làm tăng dung tích và duy
trì trạng thái vô hoạt cũng như thời gian sống tiềm sinh của tinh trùng. Những nghiên
cứu về Extender không những đạt được mục đích pha loãng tăng dung tích của tinh
dịch mà còn có thể nâng cao sức thụ tinh của tinh trùng, kéo dài thời gian sống cũng

như tiết kiệm nhiều tinh dịch. Lựa chọn dung dịch pha loãng cần chú ý tới các điều
kiện sau:
1. Có chất dinh dưỡng cần cho việc trao đổi chất của tinh trùng
2. Tránh được sự kích thích của nhiệt độ.
3. Áp lực thẩm thấu phải bằng áp suất thẩm thấu của tinh dịch hoặc nguyên
sinh chất của tinh trùng.
4. Độ pH cũng thích hợp với pH tinh dịch.
Chất pha loãng khác nhau theo loài và quan trọng nhất là phải có áp suất thẩm
thấu sao cho giữ được tinh trùng ở trạng thái bất động. Trước khi sử dụng phải chắc
chắn rằng dung dich pha loãng không làm tinh trùng chuyển động (Bates và ctv. Trích
qua Wayman và ctv. 2000).
4.2.5 Tỷ lệ pha loãng
Tỷ lệ pha loãng khác nhau dẫn đến nồng độ tinh trùng trong mẫu khác nhau. Theo
Smirnov(1978) mật độ tinh trùng trong tinh dịch pha loãng ảnh hưởng đến kết quả làm
đông nhanh, khi pha loãng tinh dịch có cùng tỷ lệ, tinh dịch nào có nồng độ cao thì khả
năng đông lạnh kém hơn tinh dịch có nồng độ thấp. Platanov (1978) cho rằng nồng độ
tinh trùng có ảnh hưởng đến tốc độ đông lạnh và sự phục hồi sức sống của tinh trùng
trong quá trình giải đông (trích qua Đỗ Văn Thu, 2000). Theo Chambeyron, Zohan
(1990) và Gwo và ctv. (1991) tỷ lệ pha loãng giữa tinh dịch và extender có thể tăng từ
1:1 đến 1:20, khi tỷ lệ pha loãng lớn hơn 1:20 thường cho tỷ lệ họat động của tinh bảo
quản thấp. Theo Moczaski(1978), Stein và Bayre (1978) cho rằng tỷ lệ thích hợp cho
cá chép là 1:3. Tỷ lệ pha loãng thích hợp cho cá Hồi là 1:3 (Legendre và Billard, 1980);
14

cá Rôphi là 1:5 (Harye, 1983). Tuy nhiên một số nghiên cứu cho rằng tỷ lệ pha loãng
tương đối rộng nhưng để lựa chọn được tỷ lệ pha loãng thích hợp nhằm nâng cao sức
sống của tinh trùng khi giải đông là cần thiết (Ott, 1975; Withler,1980; Trusscott và
Idler, 1969; Ott và Hortton,1971; Buyukhatipoghu và Holtz, 1978).
4.2.6 Chất chống đông (chất bảo vệ) và nồng độ chất chống đông
Chất chống đông (chất bảo vệ) là những chất được thêm vào dung dịch pha loãng

để hạn chế tối đa ảnh hưởng sốc nhiệt, giúp tinh trùng sống sót trong quá trình làm lạnh
cũng như giải đông. Một số nghiên cứu cho thấy, trong dung dịch bảo quản không có
chất chống đông, chất nguyên sinh của tinh trùng có hiện tượng kết tinh lại và tế bào bị
phá huỷ, dẫn đến tinh trùng bị chết. Tinh dịch nguyên chất và túi tinh không thể bảo vệ
tinh trùng chịu sự làm lạnh ở nhiệt độ thấp ngay cả có sử dụng extender cũng không có
khả năng bảo vệ. Chất bảo vệ có hai loại, loại thứ nhất có thể thấm và tế bào tinh trùng,
loại thứ hai thì không. DMSO, methanol và glycerol đại diện cho nhóm thứ nhất.
Nhóm thứ hai gồm các loại đường như glucose hoặc sucrose, polymer như dextran
hoặc protein từ sữa và trứng. Cho đến nay, các chất chống đông hay sử dụng nhất là
glycerol, DMSO và methanol để bảo quản tinh các loài cá xương. Tuy nhiên cả ba chất
đó đều là chất gây độc đối với tế bào song DMSO được coi là tốt nhất nhưng cũng là
chất có độc tố cao nhất. Trong nghiên cứu bảo quản tinh cá Rôphi vằn (O. niloticus)
cho thấy, DMSO là một chất có độc tố nặng hơn methanol sau khi so sánh với nồng độ
giống nhau (Rana và Mc Andrew, 1986). Thông thường nồng độ của các chất chống
đông tốt nhất cho nhiều loài cá từ 10%-15%, bao gồm cả glycerol, DMSO và
methanol.
4.2.7 Thời gian cân bằng
Sau khi thêm chất chống đông vào tinh trùng, thời gian cần thiết để chất chống
đông thẩm thấu vào tinh trùng gọi là thời gian cân bằng (Tierch và Wayman,2000).
Trong hầu hết các trường hợp, thời gian cân bằng có thể kéo dài 10-30 phút nhưng nó
có thể thay đổi phụ thuộc vào chất chống đông được sử dụng. Nếu nồng độ chất chống
15

đông cần thiết là độc cho tế bào thì thời gian cân bằng để chất chống đông thẩm thấu
vào tế bào phải nhanh, có thể rút ngắn thời gian tối thiểu cần thiết để chuyển sang làm
lạnh nhanh.
Một số tài liệu gần đây cho rằng, thời gian cân bằng là không cần thiết. Rana và ctv
(1989) cũng đã kết luận thời gian cân bằng ảnh hưởng không có ý nghĩa tới hoạt lực
tinh trùng cá Rôphi (O. niloticus) sau khi giải đông, do trước khi làm lạnh thời gian từ
khi pha loãng cho tới khi đóng cọng đưa vào làm lạnh mất khoảng 30 phút. Tuy nhiên,

chất chống đông và thời gian cân bằng có mối tương quan với nhau, khoảng thời gian
cân bằng phụ thuộc vào chất chống đông được chọn, thường vào khoảng từ 30-90 phút.
4.2.8 Tốc độ hạ nhiệt
Sau khi cân bằng xong thì tiến hành hạ nhiệt. Tốc độ hạ nhiệt ảnh hưởng rất lớn
đến sự thành công của công việc bảo quản tinh. Vấn đề cơ bản là tìm ra quy trình hạ
nhiệt phù hợp với đối tượng nghiên cứu. Khi hạ nhiệt độ tinh trùng sẽ đông lại qua hai
trạng thái. Một tinh trùng tạo thành tinh thể đá và một trạng thái tạo thành thuỷ tinh
thể. Theo nguyên tắc thì khi hạ nhiệt độ xuống tới 0
o
C thì nước bắt đầu đóng băng, sau
đó chuyển dần sang giai đoạn kết tinh rồi dạng thuỷ tinh thể (khi để tinh dịch ở nhiệt
độ lạnh sâu). Trong quá trình đông lạnh tinh dịch từ nhiệt độ thấp sang giai đoạn lạnh
sâu -196
o
C, giai đoạn đầu nếu như khoảng cách nhiệt độ lớn dễ gây ra hiện tượng sốc
nhiệt, giảm sức sống hoặc gây chết hàng loạt tinh trùng. Vì vậy giai đoạn đầu nên giảm
từ từ để tinh trùng không bị sốc nhiệt (Bart, 2000). Theo một số giả thiết trên, trong
quá trình hạ nhiệt độ tinh dịch, sự đông lại của phần nguyên sinh chất cũng ở hai dạng,
dạng tinh thể và dạng thuỷ tinh thể. Dạng thứ hai, nguyên sinh chất không bài tiết được
nước các phân tử không di động, do đó chất nguyên sinh không bị phá hoại.
4.2.9 Phương pháp giải đông
Sau quá trình bảo quản, tinh cá được giải đông theo các phương pháp khác nhau.
Do trong điều kiện bảo quản ở nhiệt độ thấp, tinh trùng đang ở trạng thái kết tinh ở
dạng thuỷ tinh nên cần áp dụng phương pháp làm tan giá bằng nước ở nhiệt độ 20
o
C
16

tương đối tốt, một mặt làm tan giá nhanh (khoảng 5 phút) đồng thời nhiệt độ nước
trong điều kiện này dễ khống chế.

17

PHẦN 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thực hành Cơ sở sinh học – khoa NTTS,
trường Đại học Nha Trang.
Thời gian nghiên cứu từ tháng 7 tới tháng 11 năm 2006.
2. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là cá Trê Đen (Clarias fuscus) được thu mua ngoài tự nhiên
rồi nuôi vỗ trong bể lót bạt.
3. .Phương pháp nghiên cứu
3.1 Chọn cá bố mẹ và thu mẫu tinh dịch
- Chọn cá bố mẹ: Chọn cá đực thành thục tốt màu sắc tươi sáng hoạt động tốt
không bị bệnh hoặc xây xước dị tật, mấu sinh dục dài màu đỏ.
Cá cái bụng lớn mềm không bị dị tật, màu sắc tươi sáng.
- Thu mẫu tinh cá:
Cá được chọn để lấy tinh và thu trứng được bắt trước một ngày và tiêm kích dục tố
để kích thích cá thành thục. Liều lượng 3µg LRHa + 3mg MutililumM/kg cá đực, cá
cái tiêm bằng 2 lần cá đực. Cá được tiêm vào buổi tối, sau khi tiêm 8-10 giờ thì thu
mẫu.
Để tránh ảnh hưởng của ánh sáng và hạn chế ảnh hưởng của nhiệt độ, tinh được thu
vào sáng sớm và trong phòng không có ánh sáng mặt trời trực tiếp. Tinh thu bằng cách
mổ cá cắt hai túi sẹ đặt trong hộp lồng, cẩn thận lấy bỏ sạch máu, nhớt và chất bẩn rồi
nghiền và hút sẹ vào trong từng xilanh.
18

3.2 Đánh giá sơ bộ chất lượng tinh dịch
Trước khi bảo quản cần đánh giá sơ bộ chất lượng tinh gồm: màu sắc tinh dịch,
hoạt lực, pH, mật độ tinh trùng.

- pH của tinh dịch:
pH của tinh dịch được kiểm tra bằng giấy quỳ tím, nhúng đầu giấy quỳ vào tinh
dịch sau đó đọc kết quả.
- Màu sắc của tinh dịch:
Màu sắc tinh dịch được quan sát bằng mắt thường dựa vào đó đánh giá sơ bộ chất
lượng tinh dịch. Màu sắc tinh dịch được chia làm ba loại: màu trắng ngà, trắng sữa,
trắng đục.
- Kiểm tra hoạt lực của tinh trùng:
Nhỏ một giọt tinh dịch lên lam kính rồi nhỏ giọt nước cất lên đậy lamen lại rồi
quan sát trên kính hiển vi có vật kính 40. Có 3 hình thức vận động: thẳng tiến, xoay
vòng và lắc lư tại chỗ. Ước lượng phần trăm tinh trùng chuyển động thẳng tiến trên
tổng số tinh trùng trong vi trường quan sát, không tính những tinh trùng chuyển động
do nước gây rung động. Chỉ trữ đông những mẫu có độ vận động lớn hơn 80%.
- Kiểm tra mật độ tinh trùng:
Mật độ tinh trùng được kiểm tra bằng buồng đếm hồng cầu trên kinh hiển vi có
vật kính 40. Tinh dịch được pha loãng trong ống pha loãng hồng cầu với bội số pha
loãng nhỏ nhất là 1:1000, pha loãng 1000 lần (hút tinh dịch đến vạch 0,1 sau đó hút
nước lên vạch 1001) lắc đều và bỏ vài giọt tinh dịch đã pha lên buồng đếm. Đếm tinh
trùng trong các ô đếm hồng cầu (đếm tổng số tinh trùng trong 4 ô đếm nhỏ ở bốn góc
của một ô lớn, mỗi ô có trung bình 16 ô nhỏ, mỗi ô nhỏ có diện tích 1/400 mm
2
và độ
sâu 1/10 mm. Đếm tinh trùng theo đầu từ hang nọ đến hang kia, những tinh trùng nằm
19

trên cạnh ô nhỏ thì chỉ đếm hai cạnh thường là cạnh trên và cạnh phải. Mật độ tinh
trùng tính theo công thức:

)/(10004000
4

16
4321
mLtbxDxx
x
EEEE
X





Trong đó:
X: Số lượng tinh trùng trong 1 ml tinh dịch.
E
1,
E
2,
E
3,
E
4
: Số lượng tinh trùng trong 4 ô đếm nhỏ.
D: Độ pha loãng.
16: Số ô vuông nhỏ trong 1 ô lớn.
4000: Số nghịch đảo của mỗi một dung tích ô vuông nhỏ
3.3 Thí nghiệm bảo quản tinh dài hạn (trong nitơ lỏng -196
o
C)
3.3.1 Pha loãng tinh dịch với dung dịch bảo quản
Sau khi chọn được dung dịch bảo quản và tỷ lệ pha loãng thích hợp tiến hành pha

loãng tinh dịch với dung dịch bảo quản và chất bảo vệ. Trong nghiên cứu sử dụng một
loại chất chống đông: DMSO (dymethyl sulfoxide), sử dụng hai nồng độ là 5% và 10%
tổng thể tích.
Dung dịch bảo quản được sử dụng trong đợt thực tập này là:Durbin A, Durbin B,
Kurokura 2, Hanks, Hanks không Ca.
20

Tinh trùng cá được pha loãng với dung dịch bảo quản – Extender theo tỷ lệ 1:3;
1:6; 1:9 (tinh : extender). Chất chống đông được sử dụng là DMSO với hai nồng độ là
5% và 10% tổng thể tích Extender và tinh trùng. Dung dịch đã đươc pha loãng đựng
trong chén thủy tinh và để trên bề mặt nước đá.