Các tính chất sinh vật hóa học
của vi khuẩn
NỘI DUNG
Mỗi loại vi khuẩn đều có một quá trình chuyển hoá riêng. Để xếp loại vi khuẩn, chúng
ta phải xác định tính chất sinh vật hoá học của chúng.
1.Chuyển hoá Glucid
1.1. Chuyển hoá đường
Đường là một chất vừa cung cấp năng lượng vừa cung cấp nguyên liệu để cấu tạo tế
bào vi khuẩn. Chuyển hoá đường tuân theo một quá trình phức tạp, từ polyozid đến
ozid qua glucose rồi đến pyruvat. Trong đó pyruvat đóng vai trò trung tâm trong các
quá trình chuyển hoá đường.
1.1.1. Chuyển hoá theo con đường oxy hoá:
Sản phẩm của quá trình này thường chủ yếu là CO[sub]2[/sub] và H[sub]2[/sub]O, chỉ
có một phần nhỏ là chất khác mà không phải là acid hoặc nếu là acid thì acid này rất
yếu. Do vậy mà những vi khuẩn sử dụng đường bằng cách oxy hoá thì nó không làm
cho môi trường nuôi cấy trở thành acid hơn hoặc chỉ thay đổi pH rất nhỏ.
1.1.2. Chuyển hoá theo con đường lên men:
Thực chất của quá trình này là vi khuẩn sử dụng đường trong tình trạng yếm khí
(không có O[sub]2[/sub]). Do vậy sản phẩm của quá trình là hỗn hợp các loại acid
khác nhau và có thể thêm một số ít các chất chuyển hoá trung gian khác. Cho nên khi
ta nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường có đường thì sản phẩm của quá trình lên men sẽ
làm cho môi trường trở nên acid. Để xác định xem vi khuẩn sử dụng đường theo cách
nào thì chúng ta có thể dựa vào các môi trường sau:
− Môi trường Basiekow: Môi trường Basiekow có chất chỉ thị màu là xanh
bromthymol. Để xác định xem vi khuẩn có khả năng lên men một loại đường nào đó
hay không thì người ta sẽ cho loại đường cần xác định (glucose, lactose, arabinose…)
vào môi trường này. Sau đó cấy vi khuẩn vào môi trường, để ở nhiệt độ
37[sup]0[/sup]C trong 24h. Nếu vi khuẩn lên men đường sẽ sinh ra acid và làm cho
pH của môi trường thay đổi, chỉ thị màu chuyển từ màu xanh sang màu vàng. Nếu
môi trường không thay đổi màu sau khi nuôi cấy vi khuẩn trong 24h thì vi khuẩn đó
có thể là không có khả năng sử dụng đường hoặc sử dụng theo con đường oxy hoá.

− Môi trường KIA ( Kligler Iron Agar): Đây là môi trường tổng hợp gồm có 2 loại
đường là lactose và glucose, trong đó tỷ lệ giữa lactose và glucose là 10/1. Ngoài ra,
chất chỉ thị pH là đỏ phenol cũng được đưa vào trong môi trường. Nuôi cấy vi khuẩn
vào môi trường, để nhiệt độ 37[sup]0[/sup]C trong 24h. Nếu vi khuẩn có khả năng lên
men đường glucose mà không lên men đường lactose thì phần chân ống thạch ( Môi
trường KIA đổ ống thạch nghiêng) chuyển từ màu đỏ sang màu vàng, còn nếu vi
khuần có khả năng lên men đường lactose thì toàn bộ môi trường chuyển sang màu
vàng.
1.2. Các tính chất khác trong quá trình lên men đường
Pyruvat là chất đóng vai trò trung tâm trong các quá trình chuyển hoá đường. Một số
vi khuẩn lên men đường có khả năng biến đổi pyruvat theo nhiều con đường khác
nhau, trong đó có hai con đường cần lưu ý và được thể hiện bởi các phản ứng sau:
[/font]
− Phản ứng Red Methyl (RM):
Một số loài vi khuẩn có khả năng sản sinh ra các acid mạnh (lactic, acetic, formic…)
từ glucose qua con đường lên men. Điển hình là vi khuẩn đường ruột với một số loài
có thể sản xuất ra đủ một lượng acid mạnh làm cho môi trường nuôi cấy luôn giữ ở
pH ≤ 4,4. Để phát hiện khả năng này của vi khuẩn ta chỉ cần nhỏ đỏ Methyl (Red
Methyl) vào môi trường nuôi cấy của vi khuẩn sau 48-72h (thường là môi trường
Clark-lubs), nếu phản ứng dương tính thì môi trường sẽ có màu đỏ, còn âm tính thì
môi trường có màu vàng (sơ đồ trên).
− Phản ứng Voges-Proskauer (VP): Một số vi khuẩn trong qúa trình lên men đường
có khả năng tạo ra một chất trung gian là Acethyl- Methyl- Carbinol (Acetoin). Có thể
phát hiện chất này dựa trên sự biến đổi của acetoin thành diacetyl qua tác dụng của
KOH và O[sub]2[/sub] trong không khí. Sau đó diacethyl bị biến đổi thành một phức
hợp màu đỏ dưới sự xúc tác của α -naphthol và creatin (sơ đồ trang 89) Để phát hiện
khả năng này thì ta nuôi vi khuẩn vào trong môi trường Clark-lubs 24h rồi nhỏ dung
dịch thử VP gồm có hai dung dịch Avà B sau:
+ Dung dịch A: α -naphthol 6% trong cồn 90[sup]0[/sup], để tủ lạnh trước khi dùng
+ Dung dịch B: NaOH 16% trong nước Nếu phản ứng dương tính thì môi trường có

màu đỏ, phản ứng âm tính sẽ có màu vàng nhạt.
1.3. Thử nghiệm Orthonitrophenyl Galactosid (ONPG)
ONPG có cấu trúc tương tự như lactose, ngoại trừ là orthonitrophenol đã được thay
thế cho glucose. Người ta dùng thử nghiệm này để phát hiện enzym β- galactosidase
của vi khuẩn một cách nhanh chóng hơn xét nghiệm tìm khả năng lên men đường
lactose và có ích trong việc phát hiện những vi khuẩn lên men lactose chậm do thiếu
hụt enzym Lactose- Permease (cần thiết cho việc đưa lactose xâm nhập vào tế bào vi
khuẩn ). ONPG ngấm vào trong tế bào vi khuẩn nhanh hơn lactose rất nhiều, do đó
dưới tác dụng của β- galactosidase thủy phân ONPG thành galactose và
orthonitrophenol
β
- Galactosidase
Orthonitrophenyl Galatosid > Galactose + Orthonitrophenol
Trong đó, orthonitrophenol là một phân tử có màu vàng nhạt cho nên để xác định khả
năng này của vi khuẩn người ta thả miếng giấy có thấm ONPG vào nhũ dịch nước
muối có hoà vi khuẩn. Nếu thử nghiệm dương tính ( vi khuẩn có β- galactosidase) thì
nhũ dịch có màu vàng nhạt, còn thử nghiệm âm tính thì nhũ dịch vẫn là màu trong.
2. Chuyển hoá Protein và Acid amin Một số loài vi sinh vật có khả năng chuyển hoá
các protein và acid amin đặc trưng. Dựa vào sự chuyển hoá đặc biệt đó mà người ta có
thể phân loại được vi khuẩn. Trong thực tế thì các tính chất sau thường được quan
tâm:
2.1. Làm lỏng gelatin Một số loài vi khuẩn có chứa enzym gelatinase thì có khả năng
làm lỏng gelatin. Để xác định tính chất này, người ta dùng gelatin được tráng lên lớp
nhựa mỏng (thường dùng phim ảnh chưa chụp) cho vào ống nghiệm có vi khuẩn được
hoà bằng nước muối. Nếu vi khuẩn có gelatinase thì màu phim ảnh bị tan hết, còn nếu
không có gelatinase thì màu phim ảnh vẫn tồn tại.
2.2. Khả năng khử Carboxyl (Decarboxylase)
Một số loài vi khuẩn có khả năng sản xuất enzym decarboxylase với tác dụng khử các
acid amin thành amin (R – NH[sub]2[/sub]) và CO[sub]2[/sub]:
Decarboxylase

Acid amin > Amin (R − NH[sub]2[/sub]) +
CO[sub]2[/sub]
Lysin, ornithin và arginin là 3 acid amin thường xuyên dùng để xác định khả năng này
của vi khuẩn (thường là vi khuẩn đường ruột). Môi trường Moeller Decarboxylase là
môi trường cơ bản có cho thêm các acid amin cần xác định khả năng khử carboxyl của
vi khuẩn. Để tìm khả năng này của vi khuẩn người ta nuôi cấy vào 2 ống môi trường
khác nhau, một ống gồm môi trường cơ bản có chứa các acid amin cần thiết, còn một
ống chỉ có môi trường cơ bản. Trong suốt thời kỳ nuôi cấy cả 2 ống sẽ làm chất chỉ thị
tím bromcresol sang màu vàng do vi khuẩn lên đã men một phần nhỏ glucose trong
môi trường, nếu như acid amin bị khử carboxyl thành amin thì môi trường bị kiềm
hoá trở lại và quay về màu tím ban đầu.
2.3. Khả năng khử amin (Phenylalanin Deaminase)
Phenylalanin là một acid amin, khi bị khử amine thì nó ở dạng ceto- acid
(phenylpyruvic). Thử nghiệm Phenylalanin dựa trên việc phát hiện acid phenylpyruvic
trong môi trường (thạch phenylalanin). Sau khi nuôi cấy vi khuẩn 18-24h bằng cách
nhỏ vài (IV-V) giọt dung dịch FeCl[sub]3[/sub] (Ferric chloride) 10% vào thì có kết
quả. Nếu trong môi trường có acid phenylpyruvic (thử nghiệm dương tính) thì thấy
xuất hiện màu xanh của sắt (III) phenylpyruvat
3. Khử Nitrat thành Nitrit
Tìm khả năng khử nitrat thành nitrit của vi khuẩn rất quan trọng trong việc xác định
và phân biệt các nhóm vi sinh vật. Tất cả các vi khuẩn đường ruột (ngoại
trừ Enterobacter agglomerans và Erwinia) đều có khả năng khử nitrat thành nitrit như
sau:
NO[sup]-[/sup][sub]3[/sub]-2e + 2H −−−−−−> NO[sub]2[/sub] + H[sub]2[/sub]O
Để phát hiện khả năng này của vi khuẩn người ta nuôi cấy vi khuẩn vào môi trường có
NO[sub]3[/sub][sup]-[/sup] (KNO[sub]3[/sub]), sự xuất hiện của nitrit trong môi
trường nuôi cấy được phát hiện bởi cho vào chất thử là α- naphthylamin và acid
sulfanilic với sự tạo thành màu đỏ diazo (p- sulfobenzeneazo- α naphthylamin)
4. Khả năng sử dụng Citrat
Natri citrat là một muối của acid citric, một hợp chất hữu cơ. Để phát hiện khả năng

sử dụng citrat của vi khuẩn người ta nuôi cấy vi khuẩn vào trong môi trường Simmons
có natri citrat, đây là phân tử có chứa một anion, cũng là một nguồn carbon duy nhất
và trong môi trường còn có (NH[sub]4[/sub]) H[sub]2[/sub]PO[sub]4[/sub] chứa một
nguồn nitro duy nhất. Nếu vi khuẩn có khả năng sử dụng citrat từ natri citrat thì sẽ kéo
theo sự khử được nitro từ muối amoni với sản phẩm tạo thành aminoni hydroxyd
(NH[sub]4[/sub]OH) làm kiềm hoá môi trường, do đó sẽ làm cho chất chỉ thị xanh
bromthymol trong môi trường (thường là môi trường Simmons) chuyển sang màu
xanh nước biển.
5. Xác định men Urease
Urease là một enzym có ở một số loài vi khuẩn, nó có khả năng thuỷ phân urê
(NH[sub]2[/sub]-CO - NH[sub]2[/sub]) theo phản ứng:
Urease
H[sub]2[/sub]N – CO – NH[sub]2[/sub] + 2 HOH > NH[sub]3[/sub] +
CO[sub]2[/sub] + H[sub]2[/sub]O > (NH[sub]4[/sub])
[sub]2[/sub]CO[sub]3[/sub]
Để phát hiện khả năng này của vi khuẩn người ta thường nuôi cấy chúng vào môi
trường có urê (thường là môi trường lỏng Urê- indol hoặc môi trường Christensen).
Nếu vi khuẩn có enzym urease thì sẽ xuất hiện sản phẩm NH[sub]3[/sub] trong môi
trường, những NH[sub]3[/sub] này phản ứng với dung dịch tạo thành amoni carbonat
[(NH[sub]4[/sub])[sub]2[/sub]CO[sub]3[/sub]] làm cho môi trường bị kiềm hoá. Do
vậy làm màu đỏ phenol của môi trường chuyển sang màu đỏ cánh sen.
6. Xác định men Catalase Đây là một enzym thuỷ phân hydro peroxyd
(H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub])
Catalase
H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub] > H[sub]2[/sub]O + 1/2
O[sub]2[/sub]
Ngoại trừ Streptococci, phần lớn vi khuẩn hiếu kỵ khí tùy tiện và kỵ khí có chứa
enzym catalase. Thử nghiệm tìm enzym này có thể thực hiện trên phiến kính hoặc
trong ống nghiệm bằng cách nhỏ một giọt oxy già (H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]) lên
phiến kính hoặc ống nghiệm. Nếu vi khuẩn có catalase thì thử nghiệm dương tính với

hiện tượng nổi các bọt khí khi ta nghiền một khuẩn lạc vi khuẩn vào đó. Nếu âm tính
thì không có hiện tượng gì xẩy ra.
7. Khả năng sinh indol Một số vi khuẩn có chứa enzym tryptophanase, enzym này
có khả năng phân huỷ tryptophan tạo ra các sản phẩm là indol, acid pyruvic và hợp
chất amoni. Để xác định khả năng này người ta nuôi cấy vi khuẩn vào môi trường có
tryptophan (thường là môi trường Urê - Indol), nếu vi khuẩn có enzym tryptophanase
thì trong môi trường sẽ xuất hiện indol và nó được phát hiện khi nhỏ thuốc thử Kovac
hoặc Erhlich. Nếu phản ứng dương tính, indol tan trong cồn isoamylic sẽ bắt màu đỏ
thẫm nổi lên thành một vòng tròn trên bề mặt môi trường).
8. Khả năng sinh H[sub]2[/sub]S Một số loài vi khuẩn có khả năng giải phóng
sulfua từ các acid amin hoặc hợp chất khác chứa lưu huỳnh ở dạng H[sub]2[/sub]S.
Để xác định tính chất này của vi khuẩn thì ta sẽ nuôi cấy chúng vào môi trường phải
thoả mãn hai điều kiện. − Có dẫn xuất của S (thường là acid amin cystein hoặc
methionin). − Có chất phát hiện như : Ion Fe[sup]2+[/sup] (môi trường KIA), ion
Pb[sup]2+[/sup] (môi trường thạch chì). Nếu có H[sub]2[/sub]S sinh ra thì trong môi
trường sẽ xuất hiện màu đen do sự tạo thành các muối sulfua (FeS hoặc PbS).
9. Khả năng thuỷ phân Hippurat Liên cầu B có chứa enzym hippuricase, nó có khả
năng thuỷ phân acid hippuric. Do vậy người ta thường chẩn đoán liên cầu B bằng cách
nuôi cấy vào môi trường có natrihippurat (môi trường lỏng natrihippurat) khoảng 20-
24h thì sẽ xẩy ra:
Hippuricase
Natrihippurat > Natribenzoat + Glycin
Vì vậy, nếu vi khuẩn có khả năng thuỷ phân hippurat (tức là có hippuricase) thì sau
nuôi cấy 20-24h trong môi trường sẽ xuất hiện natribenzoat và chất này được phát
hiện bằng cách nhỏ dư dung dịch FeCl[sub]3[/sub] có chứa một lượng nhỏ HCl thì
thấy có kết lắng xuống đáy (sắt III hippurat).
10. Thử nghiệm Bile- Esculin Một số vi khuẩn (đặc biệt là liên cầu D) có khả năng
phát triển trong môi trường có muối mật và thuỷ phân được esculin (dạng hợp chất
glycosid) thành glucose và aglyconeasculetin. Để xác định khả năng này ta nuôi cấy
vi khuẩn vào môi trường có 1-4% muối mật, bile- esculin và muối sắt (III) citrat. Nếu

vi khuẩn có tính chất trên thì sau 18-24h nuôi cấy thì esculetin xuất hiện sẽ tác dụng
với muối sắt (III) và làm cho môi trường có màu nâu đen hoặc màu đen.
11. Oxydase Các vi khuẩn kỵ khí không có oxydase, còn các vi khuẩn hiếu khí tuyệt
đối thì luôn có. Tuy nhiên các vi khuẩn hiếu kỵ khí tuỳ tiện thì thường không có
oxydase. Để phát hiện tính chất này ta sẽ nhỏ một giọt dung dịch dimetylparaphenylen
diamin lên một miếng giấy lọc rồi lấy một khuẩn lạc của vi khuẩn để lên miếng giấy
ẩm này. Nếu vi khuẩn có oxydase thì miếng giấy có màu hồng tím, còn không có
oxydase thì miếng giấy không đổi màu.
12. Khả năng di động Đó là những vi khuẩn có lông, chúng có thể được phát hiện
bằng cách nuôi cấy vào môi trường thạch mềm khi chọc que cấy có vi khuẩn thành
một vạch thẳng giữa ống. Nếu di động, vi khuẩn mọc lan xung quanh đường cấy và có
thể lan cả trên mặt môi trường.
13. Khả năng làm tan máu Một số vi khuẩn có các yếu tố gây tan máu. Khi nuôi cấy
chúng trên môi trường thạch máu thì có thể gặp các hình thái tan máu sau:
− Tan máu (β): vòng tan máu trong suốt, hồng cầu bị phá huỷ hoàn toàn.
− Tan máu (α):vòng tan máu không hoàn toàn, xung quanh khuẩn lạc có vòng tan máu
màu xanh, thường gặp ở liên cầu Viridans và phế cầu.
− Tan máu (γ): xung quanh khuẩn lạc không nhìn thấy vòng tan máu, hồng cầu trong
thạch vẫn giữ màu hồng nhạt và thường gặp ở liên cầu D.