ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN




KỸ THUẬT LÊN MEN
CÔNG NGHIỆP
(Bản thảo)














TS. HOÀNG VĂN QUỐC CHƯƠNG

Thành phố Hồ Chí Minh - 2011


1
MỤC LỤC

CHƯƠNG 1. KHÁI NIỆM LÊN MEN VÀ ỨNG DỤNG 3
1. Khái niệm lên men 3
2. Ứng dụng của các quá trình lên men 3
2.1. Sản xuất sinh khối vi sinh vật 3
2.2. Sản xuất enzyme vi sinh vật 4
2.3. Sản xuất các chất trao đổi vi sinh vật 4
2.4. Sản xuất các sản phẩm tái tổ hợp 5
2.5. Hỗ trợ các quá trình biến nạp 8
3. Quá trình phát triển của công nghiệp lên men 8
CHƯƠNG 2. ĐỘNG HỌC TĂNG TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT 
TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN 9

1. Phân loại phương pháp lên men 9
2. Phương pháp lên men mẻ 9
3. Phương pháp lên men liên tục 12
4. Phương pháp lên men mẻ-bổ sung (fed-batch) 14

5. Lên men mật độ cao 16
CHƯƠNG 3. SƠ ĐỒ LƯU TRÌNH HỆ THỐNG LÊN MEN CÔNG
NGHIỆP 18

1. Giới thiệu 18
2. Các công đoạn của qui trình lên men 19
3. Hệ thống thiết bị liên quan đến qui trình lên men 22
CHƯƠNG 4. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TRONG LÊN MEN CÔNG
NGHIỆP 27

1. Giới thiệu 27
2. Thiết kế môi trường lên men 27
3. Các thành phần của môi trường lên men 30
4. Đánh giá môi trường 43
5. Phương pháp đường hóa tạo dung dịch glucose từ tinh bột 43
6. Phương pháp xử lý mật rỉ đường tạo dung dịch đường phục vụ cho lên men 45
CHƯƠNG 5. KHỬ TRÙNG TRONG LÊN MEN CÔNG NGHIỆP 46
1. Mục đích khử trùng trong lên men 46
2. Yêu cầu khi khử trùng 47
3. Phương pháp khử trùng 47
4. Động học sự chết của vi sinh vật bởi nhiệt 48
5. Khử trùng môi trường 51
5.1. Khử trùng theo phương pháp liên tục 52
5.2. Khử trùng theo phương pháp mẻ 55
6. Khử trùng nồi lên men 55
7. Lọc không khí 57
CHƯƠNG 6.  KIỂM SOÁT NUÔI CẤY 58
1. Kiểm soát tăng trưởng tế bào 58
2. Kiểm soát pH 60
3. Kiểm soát nhiệt độ 61

4. Kiểm soát hàm lượng oxygen hòa tan trong môi trường lên men 64
5. Kiểm soát tốc độ bổ sung môi trường dinh dưỡng trong quá trình lên men 67
6. Phá bọt trong quá trình lên men 70
6. 1. Tạo bọt và các nhân tố gây tạo bọt 70

2
6.2. Những trở ngại gây nên bởi bọt 70

6.3. Kiểm soát bọt 70
7. Theo dõi và tính toán kết quả lên men 73
1. Nồng độ sản phẩm 73
2. Sản lượng 73
3. Hiệu suất 74
CHƯƠNG 7.  TỐI ƯU HOÁ HỆ THỐNG LÊN MEN 78
1. Cải tiến giống 78
2. Cải tiến thiết bị 79
3. Tăng cường các điều kiện thích hợp trong quá trình nuôi cấy 79
CHƯƠNG 8. NHIỄM TẠP KHUẨN VÀ NGUYÊN TẮC PHÒNG
CHỐNG TẠP NHIỄM 84

1. Hậu quả của sự nhiễm tạp khuẩn 84
2. Phát hiện tạp nhiễm 84
3. Nguyên nhân tạp nhiễm 85
4. Nguyên tắc phòng chống nhiễm trong lên men 85
5. Cách phát hiện - đánh giá nguồn gốc tạp nhiễm 86
6. Một số điểm cần lưu ý khi truy tìm nguồn gốc gây tạp nhiễm 88
CHƯƠNG 9. THU HỒI VÀ TINH CHẾ SẢN PHẨM LÊN MEN 89
1. Giới thiệu 89
2. Các phương pháp xử lý thu hồi sản phẩm lên men 92
CHƯƠNG 10. XỬ LÝ CHẤT THẢI CỦA QUI TRÌNH LÊN MEN 97

1. Giới thiệu về xử lý chất thải và các phương pháp xử lý 97
2. Tiếp cận xử lý chất thải của qui trình lên men công nghiệp 102
CHƯƠNG 11. BÀI TẬP ÁP DỤNG 104
1. Bài tập 104
2. Bài giải 106
TÀI LIỆU THAM KHẢO 110
PHẦN PHỤC LỤC 110




3
CHƯƠNG 1. KHÁI NIỆM LÊN MEN VÀ ỨNG DỤNG

1. Khái niệm lên men
Thuật ngữ “lên men” bắt nguồn từ động từ “fervere” trong tiếng Latin, có nghĩa
là làm sôi bọt (nổi bọt), nhằm mô tả hiện tượng hoạt động của nấm men trong dịch
chiết trái cây hoặc dịch chiết đại mạch. Hiện tượng sôi bọt này là do CO
2
sinh ra bởi
sự phân giải hiếu khí của các loại đường hiện diện trong dịch chiết. Tuy nhiên, đối với
các nhà sinh hoá và các nhà sinh vật học thì thuật ngữ lên men còn có ý nghĩa khác.
Về phương diện sinh hóa thì lên men có ý nghĩa liên quan đến sự sinh năng lượng bởi
quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ, trong khi đó, về phương diện vi sinh vật học
trong công nghiệp thì nghĩa của lên men rộng hơn.
Sự phân giải đường là mộ
t quá trình oxy hoá dẫn đến việc tạo thành các phân tử
pyridine nucleotides ở dạng khử và sau đó các phân tử này lại tiếp tục bị oxy hoá cho
các quá trình tiếp theo. Trong điều kiện hiếu khí, sự oxy hóa của các phân tử pyridine
nucleotides diễn ra bằng sự chuyển điện tử thông qua hệ thống cytochrome mà trong

đó oxygen đóng vai trò là chất nhận điện tử cuối cùng. Tuy nhiên, trong điều kiện kỵ
khí, sự oxy hoá các pyridine nucleotides dạng khử diễn ra cùng với s
ự khử của một
hợp chất hữu cơ mà thường là sản phẩm trung gian của một quá trình phân giải. Đối
với trường hợp về sự hoạt động của nấm men trong dịch nước trái cây hoặc dịch chiết
ngũ cốc, NADH được hình thành nhờ sự khử của acid pyruvic thành ethanol. Các
chủng vi sinh vật khác nhau có khả năng khử pyruvate thành các sản phẩm khác nhau
và rất đa dạng. Do vậy, thuật ng
ữ lên men được sử dụng đúng theo ý nghĩa sinh hóa là
một quá trình sinh năng lượng trong đó các chất hữu cơ đóng vai trò vừa là chất cho
vừa là chất nhận điện tử.
Quá trình sinh tổng hợp alcohol nhờ tác động của nấm men trong dịch chiết đại
mạch hoặc dịch chiết trái cây đã được thực hiện với qui mô lớn từ rất lâu và đã trở
thành chất trao đổi của vi sinh v
ật được sản xuất công nghiệp đầu tiên. Do vậy, các
nhà vi sinh vật học công nghiệp đã mở rộng khái niệm lên men để mô tả bất kỳ qui
trình sản xuất nào mà sản phẩm được sinh ra nhờ nuôi cấy vi sinh vật. Việc sản xuất
bia hoặc các dung môi hữu cơ được xem như là quá trình lên men theo cả nghĩa về
sinh hoá học và vi sinh vật học. Trong tài liệu này, thuật ngữ lên men được sử dụng
theo nghĩa rộng bao hàm c
ả hai
Cần phân biệt các khái niệm:

Chất cho điện tử Chất nhận điện tử cuối cùng
Lên men (sinh hoá)
Hô hấp hiếu khí
Hô hấp kỵ khí
Chất hữu cơ
Chất hữu cơ
Chất hữu cơ

Hợp chất hữu cơ
Oxygen
Hợp chất vô cơ (nitrate, sulphate)

Thuật ngữ lên men mở rộng bao gồm cả ba khái niệm trên.

2. Ứng dụng của các quá trình lên men
2.1. Sản xuất sinh khối vi sinh vật
Công nghiệp sản xuất sinh khối vi sinh vật có thể được chia thành hai qui trình chính.
(1) sản xuất nấm men dùng trong công nghiệp bánh mì, (2) sản xuất tế bào vi sinh vật
dùng trong thực phẩm cho con người và cho động vật (protein đơn bào). Nấm men

4
bánh mì được sản xuất theo qui mô công nghiệp từ những năm 1900 và nấm men được
sản xuất dùng làm thực phẩm cho con người ở Đức trong Đại thế chiến thứ I. Tuy
nhiên mãi đến những năm 1960 thì sản xuất sinh khối vi sinh vật mới được khai thác
mạnh mẽ. Và do vậy từ những năm 1970, các qui trình liên tục theo qui mô lớn đã
được thiết lập và đưa vào sản xuất sinh khối vi sinh vật phục vụ cho độ
ng vật.

2.2. Sản xuất enzyme vi sinh vật
Enzyme thương mại được sản xuất từ thực vật, động vật và vi sinh vật. Tuy nhiên,
enzyme vi sinh vật có nhiều ưu thế vượt trội là do có thể sản xuất với lượng rất lớn
bằng kỹ thuật lên men. Hơn nữa rất dễ dàng làm tăng sản lượng của hệ thống vi sinh
so với các qui trình sản xuất từ nguồn thực v
ật hay động vật. Bên cạnh đó, sự tiến bộ
của kỹ thuật DNA tái tổ hợp đã giúp có thể sản xuất các enzyme có nguồn gốc động
vật nhờ các chủng vi sinh vật. Các enzyme này được dùng chủ yếu trong công nghiệp
thực phẩm và các ngành công nghiệp có liên quan khác (Bảng 1. 1). Quá trình nuôi
cấy vi sinh vật để sản xuất enzymes được kiểm soát rất chặt chẽ. Ngày nay, người ta

sử dụng một số kỹ
thuật sinh học phân tử để tăng cường năng suất sản xuất của các
chủng như bổ sung chất cảm ứng, đột biến genes, hay kỹ thuật tái tổ hợp genes.

2.3. Sản xuất các chất trao đổi vi sinh vật
Cùng với các giai đoạn tăng trưởng, sự thay đổi trong quá trình nuôi cấy một
chủng vi sinh vật có thể được mô tả thông qua sản phẩm mà chúng sinh ra trong các
phase khác nhau của đường cong tăng tr
ưởng. Ở log phase, sản phẩm được sinh ra chủ
yếu là phục vụ cho tăng trưởng của tế bào, bao gồm các amino acids, nucleotides,
lipids, carbohydrates… Những sản phẩm này được xem là sản phẩm sơ cấp của sự
biến dưỡng, và phase này được gọi là trophophase.
Rất nhiều sản phẩm sơ cấp có giá trị kinh tế cao và ngày nay được sản xuất bằng
phương pháp lên men (Bảng 1. 2).
Sự tổng hợp các chất trao đổi sơ
cấp của các chủng vi sinh vật hoang dại chỉ đủ cho
nhu cầu trong tế bào của chúng. Do vậy nhiệm vụ của các nhà vi sinh vật học công
nghiệp là phải làm sao cải biến các chủng này và cung cấp các điều kiện nuôi cấy cần
thiết để cải thiện năng suất sinh tổng hợp các chất này.
Trong phase ổn định, một số chủng tổng hợp ra các hợp chất mà chúng không tổng
hợp đượ
c trong log phase, các chất này không có vai trò rõ ràng đối với quá trình biến
dưỡng của tế bào và chúng được xem là chất trao đổi thứ cấp, và phase này gọi là
idiophase. Vi sinh vật tăng trưởng trong môi trường tự nhiên ở tốc độ thấp, điều này
khiến người ta cho rằng, trong tự nhiên thì idophase chiếm ưu thế hơn trophophase.
Không phải toàn bộ vi sinh vật đều có biến dưỡng thứ cấp, ví dụ như đối với trường
hợp của vi khuẩ
n Enterobacteriaceae thì không tìm thấy có sản phẩm thứ cấp. Đôi khi
rất khó để phân biệt một sản phẩm là sơ cấp hay thứ cấp và động học sinh tổng hợp
của những hợp chất nhất định có thể thay đổi tùy thuộc vào các điều kiện nuôi cấy.

Vai trò sinh lý của biến dưỡng thứ cấp trong các tế bào vi sinh vật được tranh luận
nhiều, nhưng người ta quan tâm đến vai trò quan trọng của các ch
ất trao đổi trung gian
nhiều hơn. Có rất nhiều chất trao đổi thứ cấp có hoạt tính kháng khuẩn, là các enzyme
ức chế, một số chất thúc đẩy tăng trưởng và rất nhiều chất có dược tính. Do vậy, sản
phẩm của biến dưỡng thứ cấp đã hình thành nên cơ sở của nhiều qui trình lên men
khác nhau. Cũng giống như trường hợp đối với các chất trao đổi sơ cấp, các chủng vi

5
sinh vật hoang dại có khuynh hướng tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp với nồng độ
thấp và sự tổng hợp này được kiểm soát bởi sự cảm ứng, sự ức chế dị hóa và hệ thống
phản hồi.

2.4. Sản xuất các sản phẩm tái tổ hợp
Sự phát triển của công nghệ DNA tái tổ hợp đã mở rộng tiềm năng ứ
ng dụng của công
nghệ lên men, tạo ra các sản phẩm lên men khác nhau, phục vụ cho cuộc sống của con
người. Các genes của các sinh vật bậc cao có thể sẽ được đưa vào tế bào vi sinh vật và
các chủng này có khả năng tổng hợp ra các protein ngoại. Có nhiều chủng vi sinh vật
khác nhau được dùng làm tế bào chủ cho những hệ thống biểu hiện bao gồm E.coli,
Sac. cerevisiae và các nấm sợi. Các sản phẩm được sinh ra từ các chủng được biế
n đổi
di truyền như thế này gồm: interferon, insulin, albumin của huyết thanh người, các
nhân tố tăng trưởng biểu bì, chymosin của bê, và somatostatin của bò. Khi thiết kế các
hệ thống biểu hiện các sản phẩm tái tổ hợp cần chú ý đến một số vấn đề: sự tiết của
sản phẩm, giảm thiểu sự phân hủy sản phẩm và sự kiểm soát sinh tổng hợp trong toàn
bộ tiến trình lên men, cũ
ng như tối ưu hóa biểu hiện của genes ngoại.
6
Bảng 1. 1. Các ứng dụng của enzyme trong thương mại

Công nghiệp Ứng dụng Enzyme Nguồn gốc
Công nghiệp bánh mì và
xay bột

Công nghiệp bia


Công nghiệp ngũ cốc
Trong chế biến socola
Coffee
Trong xay café


Siro bắp



Chế biến sữa




Trong chiên-xào
Nước ép trái cây

Giặt ủi
Thuộc da
Thịt
Giảm độ nhớt trong quá trình nhào bột, tăng cường độ mềm
mại, và duy trì độ tươi của bột

Cải thiện cấu trúc, giảm thời gian trộn, tăng thể tích c
ủa ổ bánh
mì
Tăng cường độ nghiền nhừ
Chống lại ảnh hưởng của khí lạnh
Cải thiện độ lọc tinh
Xử lý các thực phẩm ăn nhanh
Sản xuất các dịch si-rô
Lên men hạt cà-fé
Làm chế phẩm cà-fé cô đặc
Sản xuất các lọai bánh kẹo
Sản xuất các lọai siro có hàm lượng maltose cao
Sản xuất các loại siro có chỉ số DE thấp
Sản xuất glucose từ
siro bắp
Sản xuất siro fructose
Sản xuất dịch thủy phân protein
On định sửa bay hơi
Sản xuất sữa đặc, kem, và các thức ăn tráng miệng dạng động
lạnh
Sản xuất sữa thô
Tách lọai glucose
Làm trong các loại dịch
Loại oxygen
Sử dụng làm chất tẩy
Chống mọc lông
Làm mềm mại
Amylase

Protease

Amylase
Protease
b-glucanase
Amylase
Pectinase
Pectinase
Pectinase, hemicellulase
Invertase, pectinase

Amylase
Amylase
Amyloglycosidase
Glucoseisomerase
Protease
Protease
Lactase

Protease
Glucose oxidase
Pectinase
Glucose oxidase
Protease, lipase
Protease
Protease
Nấm

Nấm/vi khuẩn
Nấm/vi khuẩn
Nấm/vi khuẩn
Nấm/vi khuẩn

Nấm
Nấm/vi khuẩn
Nấm
Nấm
Nấm/vi khuẩn

Nấm
Vi khuẩn
Nấm
Vi khuẩn
Nấm/vi khuẩn
Nấm
Nấm men

Nấm/vi khuẩn
Nấm
Nấm
Nấm
Vi khuẩn
Nấm/vi khuẩn
Nấm
7
Trong y dược


Tráng ảnh
Dịch thủy phân protein
Chế biến thức uống
Công nghiệp dệt
Rau quả

Hổ trợ tiêu hóa
Chống đông máu
Trong các thử nghiệm lâm sàng
Thu hồi bạc từ film đã sử dụng
Trong sản xuất dịch thủy phân
Tạo sự ổn định
Chống sự xắp xếp theo kích thước của các sợi
Các chế phẩm dạng soup hoặc nghiền nhừ

Amylase, protease
Steptokinase
Numerous
Protease
Proteases
Glucose oxidase, catalase
Amylase
Pectinase, amylase,
cellulase
Nấm
Vi khuẩn
Nấm/vi khuẩn
Vi khuẩn
Nấm/vi khuẩn
Nấm
Vi khuẩn
Nấm

Bảng 1. 2. Các sản phẩm sơ cấp của biến dưỡng vi sinh vật và ứng dụng trong thương mại
Chất trao đổi sơ cấp Ý ngh
ĩ

a thương mại
Ethanol
Citric acid
Glutamic acid
Lysine
Nucleotides
Phenylalanine
Polysaccharides
Vitamins
Thành phần hoạt tính trong các thức uống có cồn, sử dụng làm nhiên liệu thay thế xăng dầu.
Có nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm
Chất tăng vị
Chất hổ trợ thực phẩm
Chất tăng vị
Chất tiền thân của aspartame, chất gây ngọt
Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, tăng cường khả năng thu hồi dầu béo
Ch
ất hổ trợ thực phẩm


8
2.5. Hỗ trợ các quá trình biến nạp
Các tế bào vi sinh vật có thể được sử dụng để chuyển một hợp chất vào một cấu
trúc liên quan có giá trị hơn vì chúng có tác dụng như các chất xúc tác với tính đặc trưng
vị trí và lập thể cao. Các quá trình vi sinh vật đặc trưng hơn các quá trình hóa học và cho
phép có thể thêm, loại bỏ hoặc thay đổi từng nhóm chức năng ở những vị trí đặc trưng
nhất đị
nh trên các phân tử phức tạp mà không cần dùng đến các hoá chất. Các phản ứng
được xúc tác bởi enzyme bao gồm phản ứng khử hydrogen, phản ứng oxy hoá, phản ứng
hydroxyl hoá, phản ứng khử nước, phản ứng khử carboxyl, amin hoá, khử amin, phản

ứng chuyển vị. Các quá trình vi sinh vật còn có thêm một thuận lợi nữa là thực hiện ở
nhiệt độ và áp suất phản ứng thấp, không đòi hỏi các chất xúc tác như các kim loại n
ặng.

3. Quá trình phát triển của công nghiệp lên men
Quá trình phát triển của công nghiệp lên men diễn ra qua năm giai đoạn được mô tả
trong Bảng 1. 3. Quá trình phát triển ngành công nghiệp lên men trước giai đoạn 1900
được mô tả là giai đoạn 1, các sản phẩm trong giai đoạn này chỉ đơn thuần giới hạn ở
dạng alcolhol uống được, hoặc dấm ăn.
Bảng 1. 3. Quá trình phát triển của ngành công nghiệp lên men.


Giai đoạnSản phẩm chính Loại bồnKiểm soát quá trình Phương pháp nuôi cấy
Kiểm soát
chất lượng Các thiết bị pilot Chọn lọc giống
Alcohol
- Bằng gỗ, đạt đến 1500
barrels
- Bằng đồng thau
Sử dụng thiết bị đo
nhiệt độ, báo mực,
trao đổi nhiệt
Dạng mẻ
Hầu như không
kiểm soát
Không có
Nấm men
thuần nhất
sử dụng
ở

Carlberg
(1886)
Dấm
Bằng các thùng phuy, khay
hay trong các lớp lọc chảy
dòng
Dạng mẻ
Hầu như không
kiểm soát
Không có
Chọn lọc
chủng
lên men dấm
tốt
2. 1900-1940
Nấm men bánh mì,
glycerol, citric acid,
lactic acid,
acetone/butanol
Bồn bằng kim loại 200m3 cho
sản xuất acetone/butanol
Sử dụng hệ thống phân phối
Khuấy trộn được sử dụng
Sử dụng đầu dò
pH,
đầu dò kiểm soát
nhiệt
độ
Dạng mẻ và hệ thống
fed- batch

Hầu như không
kiểm soát
Hầu như không
có
Sử dụng giống
thuần nhất
3. 1940 đến nay
Pennicillin,
Streptomicin
các kháng sinh
khác
gibberelin,
amino acid,
nucleotides,
các chất chuyển
hoá, enzyme
Các bồn lên men có trang bị hệ
thống sục khí, vận hành trong
điều kiện vô trùng- đúng nghĩa
bồn lên men
Sử dụng đầu dò
pH,
DO có thể thanh
trùng được. Sử
dụng các thiết bị
kiểm soát mà sau
này có th
ể kiểm
soát trên máy tính
- Thông thường là

dạng mẻ và fed-batch.
- Phát triển nuôi cấy
liên tục cho lên men
bia và một vài chất
trao đổi sơ cấp
Rất quan trọng Trở nên thông dụ
n
Sử dụng các
chương
trìnhđột biến và
chọn lọc cơ
bản
4. 1964- nay
Sinh khối đơn bào,
protein,
hydrocarbon, các
chất phục vụ chăn
nuôi
Các bồn lên men chịu áp lực,
được thiết kế để giải quyết vấn
đề trao đổi khí, nhiệt độ
Sử dụng máy tính
kiểm
soát các thông số
vận hành
Nuôi cấy liên tục
với việc hồi lưu môi
trường nuôi cấ
y
Rất quan trọng Rất quan trọng

Sử dụng kỹ
thuật di truyền
5. 1979- nay
Sản xuất các
protein
khác dòng
(heterologous) bởi
vi sinh vật và tế
bào động vật, Sản
xuất kháng thể đơn
dòng bởi tế bào
động vật
Sử dụng nồi lên men được phát
triển trong giai đoạn 3, 4. Và
phát triển thêm nồi nuôi cấy tế
bào động vật
Phát triển các điều
kiện
ki
ểm soát và đầu
dò như trong giai
đoạn 3, 4
Dạng mẻ, fed-batch,
hoặc liên tục.
Phát triển nuôi cấy liên
tục dạng chảy tràn để
nuôi cấy tế bào động
vật
Rất quan trọng Rất quan trọng
Sử dụng kỹ

thuật tái tổ hợp
1. Trước 1900

9
CHƯƠNG 2. ĐỘNG HỌC TĂNG TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT
TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN

1. Phân loại phương pháp lên men

Tuỳ theo từng đặc điểm cụ thể mà việc phân loại lên men có khác nhau. Có thể phan loại
lên men như sau:
1. Theo tính chất môi trường: Lỏng; Rắn; Bán rắn
2. Theo đặc tính sử dụng oxygen của chủng vi sinh vật: Lên men hiếu khí; Lên
men kỵ khí
3. Theo trạng thái: Trạng thái tĩnh (không khuấy trộn/sục khí); Trạng thái động
(có khuấy trộn/sục khí)
4. Theo mức độ kiể
m soát của qui trình: Có kiểm soát (độ tạp nhiễm, cơ chất,
pH,…); Không kiểm soát (tự nhiên)
5. Theo qui trình lên men: Lên men theo mẻ (batch); Lên men theo dạng liên tục
(continuous); Lên men theo dạng bán liên tục (fed-batch, dạng mẻ-bổ sung)
Nhằm đánh giá diễn tiến cụ thể của một chu kỳ lên men, phương pháp lên men
theo mẽ được chọn làm kiểu mẫu để đánh giá, trên cơ sở đó sẽ mở rộng đánh giá đối với
các phương pháp lên men còn lại.

2. Ph
ương pháp lên men mẻ
Đây là một hệ thống nuôi cấy khép kín, giới hạn về dinh dưỡng, nghĩa là cơ chất
dinh dưỡng không được bổ sung trong suốt quá trình lên men, trải qua bốn phase khác
nhau.

Trong giai đoạn đầu (lag phase, (a)) của quá trình nuôi cấy, hầu như không có sự
tăng trưởng đáng kể nào xảy ra, chủ yếu là giai đoạn thích nghi của tế bào trong môi
trường mới. Trong thực tế sản xuất cần phải rút ngắn th
ời gian của phase này càng nhiều
càng tốt để đưa hệ thống lên men nhanh chóng bước vào giai đoạn tăng trưởng và sinh
tổng hợp sản phẩm quan tâm. Tiếp theo, vi sinh vật dần dần thích nghi, tăng trưởng
nhanh dần và đạt đến tốc độ tối đa - log phase (b).

Hình 2. 1. Hệ thống lên men theo phương pháp mẻ.

10
Sự tăng trưởng trong phase này có thể được biểu diễn theo phương trình tốn học
sau:
dx/dt = x (2.1)
Trong đó x sinh khối vi sinh tại thời điểm ni cấy được t giờ,  là tốc độ tăng
trưởng đặc trưng (hr
-1
), tốc độ này khác nhau tùy theo các giai đoạn trong chu kỳ tăng
trưởng. Từ phương trình trên ta có:
dx/x = dt



t
to
t
to
dtxdx

/


 (ln x
t
- ln x
0
) = (t-t
0
) (2.2)
x
0
: lượng sinh khối ban đầu (t
0
), x
t
: lượng sinh khối sau thời gian ni cấy t (giờ).


Hình 1. 1. Sơ đồ động học tăng trưởng của vi sinh vật khi ni cấy dạng mẻ. (a) lag- pha,
(b) log- pha, (c) pha ổn định, (d) pha suy vong.

Trong log phase, giàu dinh dưỡng,  sẽ đạt 
max
. Mỗi chủng vi sinh vật trong
những điều kiện tối thích nhất định sẽ có 
max
khác nhau. Tốc độ tăng trưởng phụ thuộc
rất lớn vào nguồn dinh dưỡng của mơi trường ni cấy và thành phần các sản phẩm do
chính hoạt động của vi sinh vật tạo ra trong mơi trường. Nếu vẫn duy trì việc bổ sung
dinh dưỡng vào mơi trường ni cấy thì tăng trưởng vẫn giữ ở tốc độ cao.
Bảng 2. 1. Một số giá trị


max
của một số chủng vi sinh vật trong điều kiện ni cấy đặc
trưng
Chủng vi sinh vật

max
(giờ
-1
)
Tham khảo
Vibrio natriegents
Methylomonas methanolytica
Aspergillus nidulans
Penicilium chrysogenum
Fusarium graminearum Schwabe
4,24
0,53
0,36
0,12
0,28
Eagon (1961)
Dostalek et al (1972)
Trinci (1969)
Trinci (1969)
Trinci (1992)
0
0.2
0.4
0.6

0.8
0 4 8 12162024283236
Thời gian nuôi cấy (giờ)
Ln(nồng độ tế bào)
(a) (b)
(c)
(d)

11
Ni cấy tế bào thực vật
Ni cấy tế bào động vật
0,01-0,046
0,01-0,05
Petersen & Alfermann (1993)
Lavery (1990)

Sự tăng số lượng tế bào diễn ra trong log phase theo cấp số nhân với cơ số 2 theo
phương trình:
N = N
0
.2
n
(2.3)
trong đó, N
0
và N là số lượng tế bào ban đầu và tại thời điểm khảo sát, n là số thế hệ.
 lg(N/N
0
) = n.lg2
 n = 3,32.lg(N/N

0
) (2.4)
Thời gian thế hệ t
g

t
g
= t/n (2.5)
với t là thời gian mà vi sinh vật nhân đơi qua n thế hệ. Đối với vi khuẩn t
g
thường khoảng
20-60 phút, đối với nấm men t
g
thường khoảng 1-3 giờ.
Hằng số tốc độ phân chia k là số lần phân chia sau 1 giờ ni cấy
k =1/g = n/t (2.6)
Trong giai đoạn ổn định (stationary phase, c), lượng sinh khối tạo thành có thể mơ
tả bằng phương trình:
x = Y(s
i
-s
r
) (2.7)
trong đó, x là hàm lượng sinh khối, Y là hiệu suất tổng hợp sinh khối, s
i
là hàm lượng cơ
chất ban đầu, s
r
là hàm lượng cơ chất còn lại. Tăng trưởng của vi sinh vật sẽ dừng lại khi
s

r
= 0 hoặc khi mà trong mơi trường có sự tích lũy các chất có thể gây độc hại cho chủng.
Giá trị Y nhằm giúp đánh giá hiệu suất chuyển đổi một cơ chất thành sinh khối vi sinh
vật. Do vậy có thể dùng Y để tính tốn lượng cần thiết của một cơ chất khi muốn tổng
hợp một lượng sinh khối nhất định. Hiệu suất Y khơng phải là một hằng số ổn định mà
thay đổi tùy thu
ộc vào điều kiện ni cấy như nhiệt độ, độ pH, hàm lượng oxygen hồ
tan, sự giới hạn của các cơ chất, Sự suy giảm tăng trưởng phụ thuộc vào cơ chất giới
hạn khi cạn kiệt trong mơi trường có thể được mơ tả theo phương trình (theo Monod,
1942):
 = 
max
×s
r
/(K
s
+s
r
) (2.8)
Trong đó K
s
là hằng số sử dụng cơ chất,
Hình 2. 2. Đối với một cơ chất nhất định thì mỗi chủng vi sinh vật có K
s
khác nhau
(Bảng 2. 2).
Khi s
r
= K
s

thì  = 1/2
max
. Khi  = 0, bước vào giai đoạn phase ổn định. Đây là
giai đoạn chính của việc sản xuất các chất trao đổi.






s
i
K
s
s
r
Nồng độ cơ chất giới hạn
Thời gian nuôi cấy

12
Hình 2. 2. Sơ đồ biểu thị trị số K
s
.
Bảng 2. 2. Một số giá trị K
s
của một số chủng thông thường
Chủng vi sinh vật Cơ chấ
t

K

s
(mg/d
m
3
) Tham khảo
E.coli
Sac. cerevisiae
Pseudomonas sp.
Glucose
Glucose
Methanol
6,8.10
-2

25,0
0,7
Shehata and Marr (1971)
Pirt and Kurowski (1970)
Harison (1973)

Sự thay đổi hàm lượng các chất trao đổi có thể biểu diễn:
dp/dt = x (2.9)
trong đó, p là nồng độ sản phẩm,  là tốc độ sinh tổng hợp đặc trưng. Mặt khác, sự tạo
thành sản phẩm tùy thuộc vào hoạt tính của chủng (hiệu suất trên một đơn vị tế bào):
dp/dx = Y
p/x
(2.10)
với Y
p/x
là hiệu suất tạo sản phẩm trên một đơn vị sinh khối (năng suất sản xuất).

Từ hai phương trình trên ta có:
dx/dt = x/Y
p/x

mà dx/dt = x
Do vậy ta có:  = .Y
p/x
(2.11)


Như vậy tốc độ sản xuất đặc trưng phụ thuộc vào , và đạt giá trị cao nhất khi = 
max
.

3. Phương pháp lên men liên tục
Khác với các giai đoạn trong nuôi cấy theo mẻ (gồm 4 pha riêng biệt lag phase,
log phase, phase ổn định và phase suy vong), đối với nuôi cấy liên tục, log phase được
duy trì bằng cách bổ sung nguyên liệu vào nồi lên men và quá trình này được lặp đi lặp
lại cho đến khi nồi lên men đầy. Trong nhiều trường hợp, người ta lắp đặt thêm hệ thống
thông lưu nhằm giữ mực (thể tích) của dịch lên men trong nồi luôn ở mức độ
ổn định cao
nhất, và khi đó tốc độ nạp liệu và tốc độ chiết dịch được cân bằng, nồng độ tế bào trong
nồi lên men phụ thuộc vào tốc độ nạp liệu.
Ta có:
D = F/V (2.12)
Trong đó, F: tốc độ nạp liệu (KL/hr), V là thể tích dịch lên men trong nồi (KL), D là độ
pha loãng (giờ
-1
).
Sự thay đổi mật độ tế bào trong dịch lên men có thể biểu diễn:

dx/dt = growth – output
dx/dt = x – Dx (2.13)
Trong điều kiện ổn định, nồng độ tế bào trong dịch không đổi, dx/dt = 0.
Lúc đó:  = D (2.14)
Tốc độ tăng trưởng đặc trưng phụ thuộc vào độ pha loãng và như vậy trong nuôi
cấy liên tục thì   
max
.

13


Hình 2. 3: Sơ đồ hệ thống lên men liên tục.
(A): Hệ thống lên men liên tục đơn tầng, không hồi lưu sinh khối;
(B): Hệ thống lên men liên tục đơn tầng, hồi lưu sinh khối;
(C): Hệ thống lên men liên tục đa tầng.
Trong một số trường hợp, người ta dùng D để kiểm soát . Tăng trưởng của vi
sinh vật trong nuôi cấy liên tục được điều khiển bởi các chất trong thành phần củ
a môi
trường nuôi cấy. Lên men theo cách này còn được gọi là chemostat. Theo Monod ta có:
 = 
max

s
/(K
s
+
s
) (2.15)
Ở trạng thái cân bằng, D = , nên D = 

max

s
r
/(K
s
+
s
r
),
s
r
: nồng độ cơ chất ở trạng
thái cân bằng.

s
= K
s
D/(
max
- D) (2.16)
Như vậy, nồng độ cơ chất còn lại phụ thuộc vào độ pha loãng. Trong thực tế, điều
này xảy ra do sự tăng trưởng của tế bào làm cạn kiệt nguồn dinh dưỡng khi mà nguồn
cung cấp cho tăng trưởng ngang bằng với độ pha loãng. Nếu tốc độ sử dụng cơ chất của
vi sinh vật nhỏ hơn tốc độ nạp liệu cho sự tăng tr
ưởng tế bào thì một số đặc điểm sau sẽ
xảy ra: Tốc độ tăng trưởng của tế bào nhỏ hơn tốc độ pha loãng, và do vậy tế bào sẽ bị
chiết ra khỏi nồi lên men với tốc độ cao hơn tốc độ mà chúng được sinh ra. Điều này gây

14

nên suy giảm mật độ tế bào trong nồi lên men. Nồng độ cơ chất trong nồi lên men sẽ tăng
dần vì trong nồi lên men còn ít tế bào hơn để sử dụng. Khi nồng độ cơ chất cao hơn, tốc
độ tăng trưởng của vi sinh vật tăng lên và cao hơn tốc độ pha loãng và khi đó, sinh khối
tăng dần lên và trong trường hợp này thì trạng thái ổn định mới được thiết lập.
Do vậy, ngườ
i ta còn gọi chemostat là hệ thống nuôi cấy tự cân bằng theo giới hạn
dinh dưỡng, và có thể duy trì trong một giới hạn rộng của tốc độ tăng trưởng đặc trưng
phụ (sub- 
max
).
Nồng độ tế bào trong nuôi cấy liên tục ở giai đoạn cân bằng (
x
) có thể được biểu
diễn:

x
= Y(s
i
+ s
f
- s
r
) (2.17)
Phương trình tạo sản phẩm:
Sự thay đổi nồng độ sản phẩm = (tổng sản phẩm – lượng sản phẩm đã chiết);
 dp/dt = .x - Dp (2.18)
Ở giai đoạn ổn định, dp/dt = 0. Khi đó:

p
= .

x
/D (2.19)
trong đó
p là nồng độ sản phẩm ở giai đoạn ổn định. Trong nuôi cấy liên tục, người ta
còn chia ra nhiều kiểu nuôi cấy khác nhau:
1. Nuôi cấy dạng đa hệ thống: Dịch chiết ra từ hệ thống lên men này được đưa
ngay vào một hệ thống lên men khác. Ưu điểm của phương pháp này là có thể thay đổi
được nguồn nguyên liệu ở các giai đoạn khác nhau trong quá trình lên men.
2. Phương pháp hồi lưu tế bào vi khuẩn trong quá trình lên men: D
ịch chiết ra
trong quá trình lên men ngoài sản phẩm còn chứa một lượng rất lớn tế bào vi khuẩn. Nếu
lượng tế bào này được thu hồi và tái bổ sung vào hệ thống lên men thì sẽ tăng cường
được sản lượng của hệ thống. Có thể dùng phương pháp lọc hay ly tâm tách tế bào rồi
cho hồi lưu vào hệ thống. Tuy nhiên, rất khó thực hiện việc hồi lưu toàn bộ tế bào theo
dịch chiết và vấn đề
chống tạp nhiễm đối với hệ thống theo kiểu này cũng là một trở ngại
lớn.

4. Phương pháp lên men mẻ-bổ sung (fed-batch)
Lên men mẻ-bổ sung là phương pháp nuôi cấy mà nguyên liệu được bổ sung vào
nồi lên men liên tục hoặc gián đoạn, dịch lên men có thể được chiết ra trong quá trình
nuôi cấy. Ban đầu nuôi cấy theo mẻ, sau đó nguyên liệu được nạp vào nồi lên men. Các
cơ chất khi được bổ sung vào môi trường đ
ang nuôi cấy có thể là (1) giống như thành
phần môi trường ban đầu hoặc chỉ một số cơ chất giới hạn. Đối với cơ chất giới hạn khi
bổ sung vào có thể (2) nồng độ tương đương với môi trường ban đầu, hoặc (3) cao hơn
hoặc (4) rất đậm đặc. Hệ thống mẻ-bổ sung theo cách (1), (2) gọi là mẻ-bổ sung thay đổi
thể tích; theo cách (3), (4) gọi là hệ thống m
ẻ-bổ sung cố định thể tích.



15

Hình 2. 4. Sơ đồ tệ thống lên men mẻ-bổ sung.
(A): Lên men mẻ-bổ sung giới hạn thể tích
(B): Lên men mẻ-bổ sung không giới hạn thể tích

4.1. Lên men mẻ-bổ sung thay đổi thể tích
Động học của hệ thống này được mô tả lần đầu bởi Pirt (1975), được xem xét như
hệ thống nuôi cấy mẻ nhưng bị giới hạn bởi nồng độ của một cơ chất. Sinh khố
i tại bất kỳ
thời điểm nào trong quá trình nuôi cấy được trình bày theo phương trình:
x
t
= x
o
+ Y(s
i
- s
r
) (2.20)
trong đó x
o
là nồng độ giống nạp vào hệ thống.
Khi s
r
= 0 và x
t
= x
max

; do x
0
<< x
max

 x
max
= Y.s
i
(2.21)
Nếu tại thời điểm s
r
= 0, môi trường được bổ sung vào với D < 
max
thì toàn bộ
môi trường vừa mới được bổ sung sẽ được sử dụng ngay (ds/dt = 0), và ta có:
F.s
i
= .(X/Y) (2.22) với X = x.V.
Theo cách này, tổng sinh khối sẽ tăng dần trong khi đó nồng độ tế bào hầu như
không tăng (dx/dt = 0), do vậy  = D. Đây được xem như là trạng thái cân bằng. Khi thể
tích dịch lên men trong nồi tăng, tỷ lệ pha loãng giảm xuống, và như vậy:
D = F/(V
0
+ F.t) (2.23)
Theo phương trình Monod, Khi s
r
giảm thì D sẽ giảm, do vậy sẽ x tăng lên. Tuy
nhiên trong hệ thống nuôi cấy mẻ-bổ sung thì ở bất kỳ giá trị nào của  thì s
i

>> K
s
nên
trong thực tế s
r
thay đổi rất nhỏ. Do vậy, ở trạng thái được coi như là cân bằng ổn định thì
D < 
max
và K
s
<< s
i
.
Sự thay đổi nồng độ sản phẩm trong hệ thống này tương tự như trong nuôi cấy liên
tục được biểu diễn theo cân bằng:
dp/dt = x – Dp (2.24)
Ở trạng thái cân bằng tức là lượng sản phẩm sinh ra cân bằng với độ pha loãng do
nạp dịch bổ sung vào thì nồng độ sản phẩm trong hệ thống sẽ không thay đổi, dp/dt = 0,
khi đó:

16
p = x/D (2.25)

4.2. Lên men mẻ-bổ sung không thay đổi thể tích
Theo Pirt (1979), cơ sở của hệ thống này được xem như trong trường hợp nuôi cấy
mẻ trong đó do sự tăng trưởng của chủng đã gây nên sự cạn kiệt cơ chất giới hạn đạt đến
một mức nhất định. Sau đó cơ chất này được bổ sung với nồng độ cao, không làm thay
đổi đến thể tích dị
ch lên men. Động học trong hệ thống này được mô tả như sau:
dx/dt = GY (2.26)

trong đó G là tốc độ nạp cơ chất.
Do dx/dt = x, nên:
GY = x
  = GY/x (2.27)
Nếu GY/x < 
max
thì khi bổ sung cơ chất vào chúng sẽ được sử dụng ngay, lúc đó
ds/dt = 0. Tuy nhiên do dx/dt > 0 vì x và X tăng theo thời gian nên:
x
t
= x
0
+ GYt (2.28)
Trong đó x
0
, x
t
là nồng độ tế bào khi bắt đầu và sau khi vận hành hệ thống mẻ-bổ sung
được t giờ nuôi cấy.
Khi x tăng lên,  giảm dần. Nồng độ của chất giới hạn hầu như không thay đổi,
sinh khối tăng dần và nồng độ các chất không giới hạn trong môi trường giảm dần.
Sự cân bằng sản phẩm trong hệ thống này được biểu diễn như sau:
dp/dt = x
t
(2.29)
dp/dt = (x
0
+ GYt) (2.30)

5. Lên men mật độ cao

Như đã đề cập trong phương pháp lên men mẻ, tổng lượng sinh khối sinh ra trong
quá trình lên men là từ nguồn dinh dưỡng nhất định trong môi trường chuẩn bị ban đầu.
Nồng độ các thành phần môi trường được thiết kế để bảo đảm tốc độ tăng trưởng là tốt
nhất. Do vậy, để tăng mật độ tế bào cần phải bổ sung dinh dưỡng trong quá trình nuôi cấy
và như vậy, lên men mật độ cao chỉ có thể đạt được trong trường hợp nuôi cấy mẻ-bổ
sung và thành phần bổ sung vào phải có nồng độ cao để thể tích dịch lên men hoặc không
thay đổi hoặc thay đổi ít.
Trong lên men sản xuất công nghiệp, cho dù sản phẩm sinh ra là nội bào hay ngoại
bào, với một điều kiện thích hợp thì chủng nuôi cấy sẽ có một giá trị về tốc độ sản xuất
đặc trưng () nhất định:
 = (P/X)/t (2.31)
 P = .X.t (2.32)
trong đó P là tổng lượng sản phẩm thu được sau thời gian nuôi cấy t, X là tổng lượng sinh
khối tham gia sản xuất. Từ phương trình trên ta thấy, để thu được P nhiều, cần phải tăng
X.
X = x.V (2.32)

17
với V là thể tích dịch lên men, x là nồng độ tế bào trong dịch lên men. Do thể tích dịch
lên men bị giới hạn bởi dung tích nồi lên men nên để đạt X cao cần phải tăng nồng độ tế
bào x trong quá trình lên men.
Vấn đề đặt ra là làm thế nào để tăng nồng độ tế bào và nồng độ tế bào này có thể
tăng được tới mức nào? Chúng ta sẽ đề cập vấn đề này trong những chuyên đề sau.


18
CHƯƠNG 3. SƠ ĐỒ LƯU TRÌNH HỆ THỐNG LÊN MEN CÔNG
NGHIỆP

1. Giới thiệu

Trong phần này, chúng ta tập trung phân tích qui trình lên men công nghiệp theo
phương pháp chìm, hiếu khí, có kiểm soát vì đây là qui trình bao gồm đầy đủ các thành tố
của một qui trình lên men tiêu chuẩn. Qui trình này thường bao gồm các công đoạn sau:
- Giữ giống
- Hoạt hóa giống
- Nhân giống (sơ cấp, thứ cấp)
- Lên men sản xuất
- Thu hồi sản phẩm lên men
- Xử lý các chất thải sinh ra trong quá trình sản xuấ
t sản phẩm lên men
Tùy theo chủng vi sinh vật, yêu cầu của sản phẩm mục tiêu và hệ thống công nghệ
thiết bị mà điều kiện của từng bước trong qui trình lên men có thể khác nhau. Tuy nhiên,
để đảm bảo được hiệu quả sản xuất tốt và ổn định nhất thì toàn bộ các hoạt động có liên
quan đến lên men có một đặc điểm chung là cần được thực hiện trong điều kiện có kiể
m
soát vô trùng.
Nếu không đề cập đến các yếu tố về kiểu nồi lên men, một hệ thống lên men căn
bản bao gồm sáu thành tố sau:
1. Công thức môi trường sử dụng trong qui trình nuôi cấy vi sinh vật từ giai đoạn
nhân giống cho đến giai đoạn lên men sản xuất.
2. Điều kiện vô trùng của môi trường nuôi cấy, nồi lên men và các thiết bị liên
quan trong hệ thống.
3. Bảo đả
m nhân giống đủ số lượng với độ thuần nhất và chất lượng cao trước khi
nạp vào nồi lên men chính.
4. Sự tăng trưởng của chủng vi sinh vật trong sản xuất dưới điều kiện tối ưu để
tạo thành các sản phẩm mong muốn.
5. Chiết tách, tinh sạch và kết tinh sản phẩm.
6. Xử lý chất thải của quá trình sản xuất.


Các yế
u tố này liên quan chặt chẽ với nhau theo một qui trình được mô tả trong
Hình 3. 1. Từng yếu tố độc lập có thể được nghiên cứu cải tiến phù hợp để cuối cùng
nâng cao hiệu quả sản xuất của toàn hệ thống.
Trước khi tiến hành xây dựng hệ thống lên men cần phải chọn lọc chủng giống vi
sinh vật bảo đảm sinh tổng hợp đúng sản phẩm mong muốn vớ
i hàm lượng cao. Việc
chọng lọc chủng giống thường được thực hiện bởi các phòng nghiên cứu có năng lực và
kinh nghiệm trong lĩnh vực phát triển chủng giống, đánh giá hiệu quả và tính ổn định của
chủng. Việc tuyển chọn chủng giống phục vụ sản xuất công nghiệp dựa trên một số tiêu
chí sau:
- Đặc tính dinh dưỡng của chủng (dùng cơ chất thông dụng, rẻ
tiền)

19
- Nhiệt độ tối thích của chủng (chọn chủng có nhiệt độ tối thích cao, giảm chi phí
hệ thống giải nhiệt trong lên men công nghiệp)
- Tính ổn định của chủng trong quá trình sử dụng
- Năng suất sinh tổng hợp sản phẩm cao
Dựa vào loại sản phẩm lên men và các yêu cầu về độ tinh sạch của sản phẩm, hệ
thống thu hồi chiết tách và tinh sạch sản phẩm được thiế
t kế để bảo đảm hiệu suất thu hồi
cao, đạt tiêu chuẩn như mong muốn. Trong quá trình vận hành sản xuất, cả ba yếu tố
chính: chủng giống, qui trình lên men, qui trình thu hồi cần phải được nghiên cứu cải tiến
liên tục nhằm thu nhận được nhiều sản phẩm với chất lượng cao.

2. Các công đoạn của qui trình lên men
2.1. Giữ giống
Đây là bước rất quan trọng trong hoạt động vận hành một hệ thống lên men nhằm
bảo đảm được nguồn cung cấp giống ổn định cho sản xuất. Quá trình giữ giống cần phải

bảo đảm một số yêu cầu sau:
- Duy trì hoạt tính giống trong thời gian dài (không xảy ra hiện tượng thoái hóa,
giảm khả năng tăng trưởng hoặc/và năng lực sản xuất của giống)
- Không bị tạp nhiễm
Các phương pháp giữ giống khác nhau trong công nghiệp bao gồm:
a. Giữ giống ở nhiệt độ thấp
- Giữ trên mặt thạch nghiêng –20 ~ 5
0
C, khoảng 6 tháng cấy chuyền một lần. Nếu
giống được giữ trên bề mặt thạch nghiêng có phủ một lớp dầu bảo vệ thì thời gian giữ
giống có thể kéo dài đến 1 năm.
- Giữ trong nitơ lỏng (đông sâu). Khi giữ giống ở nhiệt độ thấp (-150 ~ -190
0
C),
hoạt động biến dưỡng của vi sinh vật giảm hẳn. Đây là phương pháp giữ giống khá an
toàn cho nhiều loài vi sinh vật khác nhau (vi khuẩn, nấm mốc, nấm men, virus). Thông
thường người ta cho chủng vi sinh vật cần giữ phát triển đến phase ổn định, bổ sung chất
bảo vệ (thường là glycerol 10%), sau đó làm lạnh và giữ.
b. Giữ trong điều kiện khử nước
- Nuôi cấy khô. Phương pháp này thường được áp d
ụng đối với bào tử nấm sợi.
Các bước tiến hành bao gồm ủ đất vô trùng với bào tử nấm khoảng vài ngày cho phát
triển, làm khô ở nhiệt độ phòng khoảng 2 tuần, sau đó cất giữ ở điều kiện không khí khô
hoặc tủ lạnh.
- Phương pháp đông khô. Làm đông một dung dịch tế bào trong điều kiện chân
không, kéo theo sự thăng hoa của các phân tử nước. Dịch nuôi cấy phải
đạt đến giai đoạn
phase ổn định, sau đó tạo huyền phù tế bào trong một môi trường bảo vệ như sữa, serum,
hoặc glutamate natri. Dịch này được làm đông khô sau đó giữ trong tủ lạnh và có thể bảo
quản đến hơn 10 năm.


20
Nồi lên
sản xuất
(> 1000L)
Khí vào
M
Nồi nuôi
cấy mầm
(10-100L)
M
Nuôi cấy lắc
(200-1000mL)
Nuôi cấy
giống gốc
(5-10mL)
Nguyên liệu
Môi trường
Thanh trùng
Ly tâm/lọc
Dòch nỗiSinh khối
Xử lý nước thải
Chiết xuất sản phẩm
Tinh chế sản phẩm
Đóng gói
Dòch sau nuôi cấy
Thành phẩm

Hình 3. 1. Sơ đồ lưu trình hệ thống lên men trong cơng nghiệp.


21
2. 2. Hoạt hóa giống
Hoạt hoá giống là bước rất quan trọng thường được thực hiện bằng phương pháp
cấy chuyền nhằm mục đích khôi phục lại hoạt tính của giống sau thời gian lưu giữ. Cấy
chuyền thường được thực hiện trên môi trường thạch nghiêng trong ống nghiệm, ủ trong
tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp đến khi vi sinh vật phát triển thành một lớp trên m
ặt thạch.
Môi trường nuôi cấy trong giai đoạn này phải bảo đảm các yếu tố dinh dưỡng cần thiết,
điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, độ pH, độ thoáng khí phải đạt giá trị tối ưu cho chủng.
Các điểm cần lưu ý trong công đoạn này bao gồm:
- Bề mặt thạch cần phải đảm bảo độ ẩm nhất định, không được quá khô vì như th
ế
sẽ gây ảnh hưởng đến sự phát triển của chủng sau khi cấy ria lên mặt thạch.
- Trong quá trình cấy ria, cần phải bảo đảm ria đều (theo đường zic-zăc) trên mặt
thạch, không ria quá gần mép thạch nghiêng vì ở đây lớp thạch mỏng, khô và ít dưỡng
chất, không đủ cho sinh khối tế bào khi khuẩn lạc phát triển lớn.
- Cần phải kiểm soát tốt thời gian ủ để đạt được lượng sinh kh
ối với hoạt tính tối
ưu và ổn định. Tránh trường hợp ủ thời gian quá dài, sinh khối tế bào phát triển quá nhiều
(over growth), lớp tế bào trên cùng của khuẩn lạc không được tiếp xúc trực tiếp với dinh
dưỡng của môi trường thạch trong thời gian dài sẽ ảnh hưởng đến chất lượng của giống
sau này.

2.3. Nhân giống
Mục đích của nhân giống là tạo một lượng sinh khối đủ
lớn để đưa vào qui trình
sản xuất. Quá trình nhân giống thường dừng lại ở giai đoạn cuối của log phase, khi đó
hoạt tính của giống là mạnh nhất. Quá trình nhân giống thường chia thành hai giai đoạn:
a. Nhân giống sơ cấp
Công đoạn nhân giống sơ cấp thường được thực hiện trong phòng nhân giống

(phòng clean room) ở qui mô 100-500 ml với thiết bị sử dụng có thể là:
1. Máy lắc với bình tam giác có thể
tích phải gấp tối thiểu 4 lần thể tích dịch nuôi
cấy để bảo đảm đủ không gian để lắc trộn dịch nuôi cấy và cung cấp đủ lượng oxy cần
thiết. Tốc độ lắc là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến tăng trưởng của chủng trong
quá trình nhân giống. Nếu lắc ở tốc độ thấp sẽ không bảo đảm được độ hòa tan oxy tố
t
trong dịch lên men, chủng sẽ phát triển chậm. Nếu lắc quá nhanh, dịch nuôi cấy sẽ tiếp
xúc với phần nút bông (cotton plug) làm ẩm ướt nút bông dễ gây ra hiện tượng tạp nhiễm
và sẽ cản trở việc trao đổi không khí giữa bên trong và bên ngoài của bình tam giác. Mặt
khác, khi lắc ở tốc độ quá cao, tế bào vi sinh vật sẽ bị ảnh hưởng bởi những tác động cơ
học.
2. Nồi lên men nhân giống với kích thước nh
ỏ. Hệ thống này có đầy đủ các yếu tố
bảo đảm cho chủng phát triển tốt nhất như độ khuấy trộn, hệ thống cung cấp không khí,
hệ thống hiệu chỉnh pH, nhiệt độ…. Tuy nhiên do có nhiều hệ thống liên quan phức tạp
tác động vào trong quá trình nuôi cấy nên nguy cơ xảy ra tạp nhiễm trong trường hợp này
là rất cao.
Khi quá trình nhân giống kết thúc cần phải tiến hành kiểm tra, đánh giá các thông
số
quan trọng trước khi đưa vào sản xuất như OD (DCW- dried cell weight), hiệu suất
sinh khối, pH, … so với tiêu chuẩn. Một trong những vấn đề quan trọng của công đoạn

22
nhân giống sơ cấp là phải bảo đảm giống mầm không bị tạp nhiễm. Để đạt được điều này
cần phải bảo đảm môi trường và thiết bị sử dụng được thanh trùng triệt để, quá trình thao
tác vận hành phải được chuẩn hóa, đáp ứng được các tiêu chí vô trùng. Để kiểm tra tạp
nhiễm của giống mầm thông thường sử dụng phương pháp trải trên đĩa pettri. Trong mộ
t
số trường hợp do mật độ tạp nhiễm quá nhỏ, không thể phát hiện được, người ta thường

nuôi cấy tăng cường (enrichment culture) nhằm tăng số lượng tế bào tạp nhiễm (nếu có)
trong mẫu thử để kiểm tra. Phương pháp thực hiện như sau: dùng khoảng 10-50 ml dịch
nhân giống sau khi kết thúc nuôi cấy nạp vào bình tam giác chứa môi trường tương tự
như môi trường nhân giống và tiếp tục nuôi cấ
y cùng điều kiện trong thời gian 24 giờ.
Sau đó lấy mẫu dịch trải lên đĩa pettri để kiểm tra độ tạp nhiễm. Nếu tạp nhiễm xảy ra thì
khả năng giống mầm ban đầu bị tạp nhiễm rất lớn. Để bảo đảm kết quả đánh giá chính
xác, quá trình nuôi cấy tăng cường cần phải được thực hiện trong điều kiện tuyệt đố
i vô
trùng.
b. Nhân giống thứ cấp
Tùy theo qui trình mà hệ thống nhân giống thứ cấp được thực hiện qua một hoặc
nhiều bậc. Quá trình nhân giống thức cấp được thực hiện trong nồi nuôi cấy mầm với thể
tích nạp giống tăng dần, khoảng 5-10% cho mỗi bậc. Cần phải bảo đảm các điều kiện như
thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy, pH, nhiệt độ… t
ối ưu để chủng tăng
trưởng tốt nhất. Mục đích của nhân giống thứ cấp là tạo được lượng sinh khối lớn, hoạt
tính tốt phục vụ cho lên men sản xuất.

2.4. Lên men sản xuất
Đây là công đoạn chính của qui trình, do vậy cần phải kiểm soát chặt chẽ các điều
kiện nuôi cấy như lượng tế bào cần thiết cho sản xuất, nhi
ệt độ, pH, hàm lượng oxygen
hòa tan, nồng độ các cơ chất giới hạn nhằm đạt được hiệu quả lên men cao nhất. Trong
quá trình nuôi cấy cần phải rút ngắn lag phase, tăng cường tốc độ tăng trưởng đặc trựng 
để đạt giá trị tối đa, 
max
và trong pha ổn định phải được duy trì tốt. Một số thành phần
dinh dưỡng sẽ bị cạn kiệt theo thời gian do vậy cần phải bổ sung để bảo đảm duy trì được
hoạt tính sản xuất của chủng (mẻ- bổ sung). Theo thời gian, cần phải phân tích, đánh giá

hiệu quả lên men để xác định thời gian nuôi cấy thích hợp, mang lại hiệu quả sản xuất
cao nhất.

3. Hệ thống thiết bị liên quan đến qui trình lên men

Một hệ thống lên men hiếu khí có kiểm soát bao gồm các thiết bị liên quan như
sau (Hình 3. 2):



H
công ty
K
(
1
(
2
H
ình 3.3.
H
K
hoa học
v
1
) Bồn lên
m
2
) Tủ điều
k
hoà tan

(1)
Hình 3. 2
.
H
ệ thống th
i
v
à Kỹ thuật
m
en thể tíc
h
k
hiển: Kiể
m
(2
.
Mô hình
h
i
ết bị
l
ên
m
Vĩnh An (
V
h
50 L (2 b
ồ
m
soát các

t
)
h
ệ thống lê
n

m
en qui m
ô
V
iệt Nam).
ồ
n)
t
hông số: t
ố
(5)
n
men kiểm
ô
pilot đượ
c
ố
c độ khuấ
y
(4)
soát tự độ
n
c
thiết kế

v
y
trộn, độ p
H
(3)
n
g.

v
à gia côn
g
H
, nhiệt đ
ộ
23

g
bởi
ộ
, oxy

(
3
(
4
(
5

3.1. N
ồ

-
1000 K
L
-
nồi và t
ă
-
nhiệt là
m
nuôi cấ
y
nhiệt đ
ộ
tower).
C
(jacket)
gắn bên











-
qua nh

ữ
men, tă
n
thường
đ
men kh
i
trong dị
c
-
hiếu kh
í
thống c
y
hình th
à
lên me
n
qua dịc
h
do tác đ
ộ
đưa trở
l
3
)
M
áy làm
4
)

M
áy nén
5
) Lò hơi
đ
men và
k
ồ
i lên men
Thân nồi:
T
L
.
Hệ thống
k
ă
ng cường
đ
Thiết bị gi
m
cho nhiệ
y
thì cần p
h
ộ
thấp 5-25
C
ó 3 dạng
b
ao bên n

g
trong nồi l
ê
Hệ thống
p
ữ
ng lỗ có k
n
g diện tíc
h
đ
ược lắp đ
ặ
i
đi
t
ừ đáy
c
h nuôi cấ
y
Hệ thống t
h
í
, không k
h
y
clone đượ
c
à
nh và vì

t
ỷ
n
. Phần lớn
h
lên men,
đ
ộ
ng cơ học
l
ại nồi lên
m

l
ạnh nước
khí cung c
ấ
đ
iện nhằm
c
k
hử trùng
m
T
ùy theo q
u
k
huấy trộn
:
đ

ộ hòa tan
c
ải nhiệt: D
o
t độ của d
ị
h
ải giải nhi
o
C, được c
thiết bị gi
ả
g
oài nồi lê
n
ê
n men.
p
hân phối
í
ch thước
n
h
tiếp xúc c
ủ
ặ
t ở gần đá
y
bồn đến
m

y
.
h
oát khí và
h
í được sụ
c
c
gắn ở đỉn
h
ỷ
trọng của
bọt khí nà
y
đ
i vào hệ t
h
, phần khí
t
m
en qua đ
ư
để giải nh
i
ấ
p không k
h
c
ung cấp
h

m
ôi trường t
r
u
i mô sản
x
:
Nhằm m
ụ
c
ủa oxygen
o
quá t
r
ình
ị
ch lên me
n
ệt cho nồi
ung cấp b
ở
ả
i nhiệ
t
thư
ờ
n
men; dạn
g
khí (air sp

a
n
hỏ, tạo đi
ề
ủ
a bọt khô
n
y
bồn lên
m
m
ặt dịch là
hồi lưu dị
c
c
vào từ đ
á
h
bồn. Tro
n
bọt nhỏ nê
n
y
sẽ thoát
r
h
ống thu hồ
t
rong bọt s
ẽ

ư
ờng ống h
ồ
i
ệt sinh học
h
í cho quá
h
ơi nước n
ó
r
ước khi n
u
x
uất mà th
ể
ụ
c đích tạo
vào dịch l
ê
lên men s
i
n
tăng lên.
lên men. T
ở
i hệ thốn
g
ờ
ng được

s
g
ống vòng
a
rger): Nh
ằ
ề
u kiện ch
o
n
g khí với
d
m
en, bảo đả
m
dài nhất đ
ể
c
h bọt tan (
c
á
y nồi lên
m
n
g quá t
r
ìn
h
n
toàn bộ

b
r
a khỏi nồi
i dịch (cyc
l
ẽ
thoát ra n
g
ồ
i lưu gắn
ở
trong quá
t
r
ình lên m
ó
ng phục
v
u
ôi cấy.
ể
tích bồn l
sự đồng n
h
ê
n men.
i
nh ra năng
Để kiểm s
o

T
ác nhân gi
ả
g
máy làm
s
ử dụng ch
o
xoắn (coil
)
ằ
m phân c
h
o
không k
h
d
ịch lên m
e
m
hành trì
n
ể
tăng tính
c
yclone):
Đ
m
en, sau đ
ó

h
lên men d
o
b
ọt sẽ nổi l
ê
lên men c
ù
l
one). Ở tr
o
g
oài và ph
ầ
ở
đáy cyclo
n
t
r
ình lên m
en
v
ụ cho tha
n
ên men sẽ
h
ất của dịc
h
g
lượng sin

h
o
át nhiệt đ
ộ
ả
i nhiệt th
ư
mát nước
(
o
nồi lên
m
)
và dạng b
h
ia không
k
h
í tiếp xúc
e
n. Hệ thố
n
n
h của bọt
k
hiệu quả
h
Đ
ối với t
r

ư
ờ
ó
sẽ thoát
r
o
có
r
ất nh
i
ê
n ở bề m
ặ
ù
ng với kh
o
ng cyclon
e
ầ
n dịch (m
à
n
e.
en
n
h t
r
ùng n
ồ
khác nhau

h
lên men
t
h
học dưới
ộ
thích hợ
p
ư
ờng là nư
ớ
(
chiller, co
o
m
en: (1) dạ
n
ó ống (tub
e
k
hí sục và
o
tốt với dịc
h
n
g phân ph
ố
k
hí trong n
ồ

h
òa tan củ
a
ờ
ng hợp lê
n
r
a ngoài q
u
i
ều bọt khí
đ
ặ
t dịch tron
g
ông khí sa
u
e
, bọt sẽ bị
v
à
ng bọt) sẽ
đ
24
ồ
i
l
ên
t
ừ 1-

t
rong
dạng
p
cho
ớ
c có
o
ling
n
g áo
e
set)
o
bồn
h
lên
ố
i khí
ồ
i lên
a
oxy
n
men
u
a hệ
đ
ược
g

nồi
u
khi
v
ỡ ra
đ
ược