ĐẠI HỌC QUÓC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Tự NHIÊN
TÌM HIỂU BỆNH TY THẺ
ở NGƯỜI BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SINH HỌC PHÂN TỬ
MÃSÓ: QT 08-31
CHỦ TRÌ ĐÈ TÀI: CHU VĂN MẲN
Đ A' H Ọ C Q U Ố C GtA HẢ NÒ'
Th ò n g tin thư ■/ 1É
D ĩ / ‘-J 3
HÀ NỘI - 2009
Tên đề tài:
Tìm hiểu bệnh ty thể ở người bằng phưomg pháp sinh học phân tử
MÃSỐ: QT 08-31
Chủ trì đề tài: Chu văn Mẩn
Các cán bộ tham gia:
- PGS.TS. Phan Tuấn Nghĩa, ĐHKHTN, ĐHQG Hà nội
- Trịnh Lê Phương, Khoa Sinh ĐHKHTN, ĐHQG Hà nội
Báo cáo đề tài QT 08-31
Tên đề tài:
Tìm hiểu bệnh ty thể ở người bằng phương pháp sinh học phân tử
MÃ SỐ: QT 08-31
Chủ trì đề tài: Chu văn Man
Các cán bộ tham gia:
- PGS.TS. Phan Tuấn Nghĩa, ĐHKHTN, ĐHQG Hà nội
- Trịnh Lê Phương, Khoa Sinh ĐHKHTN, ĐHQG Hà nội
Mục tiêu và nội dung nghiên cứu:
+ Xác định phương pháp tách chiết ADN ty thể từ máu ngoại vi của người,
+Tìm hiểu khả năng xác định đột biển gen ty thể.
+ Giải trình tự ADN ty thể từ máu ngoại vi của người.
Các kết quả đạt được:

- Đã xác định được phương pháp tách chiết AND ty thể từ máu ngoại vi của
các bệnh nhân nghi mắc bệnh ty thể bằng việc sử dụng kit của Qiagen .
- Xây dựng phương pháp tính toán lý thuyết cho việc sử dụng enzim giới hạn
{Spe I và H ae\\\ ) và thiết kế mồi để nhân đoạn AND nghi có chứa đột biến
gen (đã phân tích đột biến TIOOIOC và A3243G).
- Sử dụng cặp mồi cải tiến đã nhân bản thành công đoạn gen ngắn (357 bp và
198 bp) trong hệ gen ty thể người, phối hợp kỹ thật PCR với việc cắt sản
phẩm PCR bằng enzyme giới hạn Spe\ cho đoạn 357bp và Hae\\\ cho đoạn
198bp, điện di sản phẩm phân cắt trên gel polyacrylamide (kỳ thuật PCR-
RFLP), đã phát hiện chính xác đột biến A3243G trong hội chứng MELAS.
- Giải trình tự các đoạn AND đã nhân bản.
- Cách cải tiến của chúng tôi là cơ sở để phát triển kỹ thuật real-time PCR cho
phép xác định hiện tưọTig heteroplasmy vốn rất đăc trựng của hệ gen ty thể.
-Tình hình kinh phí của đề tài:
Tổng kinh phí được cấp: 20 000000 đ
Mua hoá chất, dụng cụ: 9 600000 đ
Thuê khoán chuyên môn: 8 000000 đ
Thông tin liên lạc, văn phòng phẩm: 800000 đ
Quán lý hành chính và chi phí khác: 1600000 đ
Báo cáo đề tài QT 08-31
Báo cáo đề tài QT 08-31
Subject of scientific research 2008
Tile: Investigation of mitochondirial diseases by molecular methods
Coder QT 08-31
Leader of reasearch: Chu Van Man
Reasearch of cooperation:
Dr. Phan Tuan Nghia, Trinh Le Phuong.
Objective and contents of research;
- Building methods of extracting mitochondrial DNA( mt DNA) from patient
blood

- Building methods of detecting mutations in mt DNA.
- Sequencing some parts of mt DNA.
Results of research:
- Extracting mt DNA from patient blood by using Qiagen kit.
- Designing two sets of primers to amplify DNA fragments consisting
mutations: T 100IOC and A3243G. Caculating the amount of restriction
enzyme (such as Sepl, Hae III ) to be used by theoretical way.
- Amplifying two short fragments (357 bp and 198 bp) of mt DNA by PCR
with these primers.Using restriction enzyme Sep\ for the 357 bp fragment,
Hae III for 198 bp one. Separating the digested fragments by Agarose and
Polyacrylamide Gel Electrophoresis to dectect A3243G mutation.
- Sequencing two fragments
- This improment is a foundation to develop RT- PCR to examine
heteroplasmy, a characteristic feature of mt DNA mutations.
Xác nhận của BCN Khoa Sinh học
PH^ CHÚ NHIÊM KHOA
ỊViS.Tu. %iMUh Jì/ịfÁìa
Chu Văn Mần
Xác nhận của Trường
• r4Ó
Báo cáo để tài QT 08'31
MỤC LỤC
trang
LỜI Mơ ĐÀU 6
Chương 1. TÓNG QUAN 7
1.1- Đại cương về ty thể người 7
1.1.1. Cấu trúc ty thể người 7
1.1.2. Vai trò, chức năng của ty thê người 7
1.2. Đặc điểm của hệ gen ty thể người 8
1.2.1. Cấu tạo của hệ gen ty thể người 8

1.2.2. Đặc điêm di truyên của hệ gen ty thê người 9
] .2.3. Các rối loạn chức năng của hệ gen ty thể người ] 0
1.2.4. Y nghĩa việc nghiên cứu hệ gen ty thê người ] 1
1.2.5. Nghiên cứu hệ gen ty thê người Việt Nam 12
1.3. Đặc điểm của gen ND5 ty thể ] 2
1.3.1. Cấu trúc, chức năng của phức hệ I của chuỗi hô hấp ty thể 12
1.3.2. Vị trí, chức năng gen ND5 ty thê 13
1.4. Các đột biên AND ty thê quan tâm của đê tài 14
1.5. Các phương pháp thường dùng trong sinh học phân tử ] 5
1.5.1. Phương pháp phân tích ADN 15
1.5.2. Phương^pháp RPLP 16
Chương II. N G Ư \TN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ử u 18
2.1. Nguyên liệu, hoá chât và thiêt bị 1 8
2.2. Phương pháp nghiên cứu ] 9
Chương III. KET QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24
3.1- Phân tích AND ty thê của bệnh nhân Hoàng Lê Bảo Tr. 24
3.1.1. Tách chiết đoạn ADN 25
3.1.2. Nhân bản đoạn gen của ty thể bằng pp PCR 25
3.1.3. Nhân dòng đoạn gen AND sau PCR bằng vector pCR2.1 26
3.1.4. Giải trình tự đoạn AND của ty thê 26
3.2- Phân tích AND ty thể của bệnh nhân Nguyễn Hữu M, 28
3.2.1. Tách chiết đoạn ADN 29
3.2.2. Nhân bản đoạn gen của ty thể bằng pp PCR 29
3.2.3. Cắt sản phẩm PCR bằng enzim giới hạn Haelll 30
KÉT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ 3 2
TÀI LIỆU THAM KHẢO 33
PHỤ LỤC 36
Báo cáo đề tài QT 08-31
MỞ ĐẦU
Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật và công nghệ thông tin vào

những năm cuôi thê kỷ XX - đậu thê kỷ XXI, Sinh học phân tử và Công nghệ
gen đã có những bước phát triên nhảy vọt, đặc biệt là việc giải mã ra bô gen
người. Bộ gen người gôm 2 phân chính : Bộ gen nhân (23 cặp nhiêm săc thê
= 3,2 tỷ bp) và bộ gen tê bào chât (genome ty thê = 16569 bp). Việc giải mã
ra bộ gen ty thê đã góp phân rât lớn trong khoa học hình sự và pháp y và đặc
biệt trong việc chẩn đoán, điều trị các bệnh liên quan đên di truyền ty thể.
Trình tự hoàn chỉnh của hệ gen ty thê n^ười đâu tiên có kích thước
16569 bp được công bô vào năm 1981. Cho đên nay, có hàng ngàn trình tự
các đoạn gen ty thể của các dân tộc khác nhau trên thế giới được giải mã và
đâng ký trong các ngân hàng trình tự gen quôc tê : EMBL/EBI (Anh),
Genbank (Mỳ). Hệ gen ty thê là kiêu đơn di truyên hoàn toàn theo mẫu hệ, vì
vậy nó là công cụ rât hữu hiệu đê phân tích di truyên quân thê người. Hiện
nay, người ta biêt đên hàng trăm bệnh di truyên tỵ thê do đột biên ADN. Phân
tích các đột biến ẠDN ty thê có thể dùng đê chẩn đoán nhanh và chính xác
cũng như hướng điêu trị một sô bệrứi.
Ty thể là cơ quan tử sản xuất năng lượng cần thiết cho các hoạt động
sông của tê bào. Hệ gen ty thê có kích thước 16,5 kb, mã hóa cho 13 protein
và 22 RNA vận chuyển của ty thể và 2 RJMA ribosome (Reeve et al., 2008).
Cho đên nay, người ta đã phát hiện được khoảng 180 đột biên trong hệ gen ty
thê người có khả năng gây nên các bệnh khác nhau (Brandon et al, 2006). Các
bệnh này chủ yếu ve thần kinh, cơ, mắt và khó có được những chẩn đoán
chính xác nếu chỉ qua một sô xét nghiệm ì âm sàng và cận lâm sàng. Phương
pháp phát hiện chính xác là phân tích DNA (PCR-RFLP, real-time PCR, xác
định trình tự gen v.v ).
ơ Việt Nam, đã băt đâu có một vài công trinh nghiên cứu đên bệnh ty
thể ở mức độ gen và protein (Lê et al., 2004; Nguyễn et al., 2006; Trân et al.,
2007). Tuy vậy, đây cũng chỉ mới là những nghiên cứu mang tính chât khởi
đầu. Vì vậy chúng tôi chọn đề tài “Tìm hiểu bệnh ty thể ở người bằng phương
pháp sinh học phán tử" nhăm cải tiên phương pháp PCR-RFLP đê thử
nghiệm khả năng phát hiện một đột biến gen ở bệnh nhân MELAS

(mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes)
và bệnh nhân bại não nghi có đột biên gen ty thê. Đông thời, tùng bước thiết
lập các phương pháp xác định nhanh, chírứi xác các đột biên gen ty thê ở
người, nhằm phục vụ việc chẩn đoán và điều trị bệnh do đột bien gen ty thể
gây ra.
Chương I
TỐNG QUAN
1.1. Đại cương về ty thể người
1.1.1, Câu trúc của ty thê người
Ty thế là bào quan nằm trong tế bào chất của tế bào sinh vật nhân
chuân. Chúnệ có nhiều hình dạng khác nhau tùy thuộc vào lọại tế bào nhưng
phổ biến nhat vẫn !à hình oval hoặc hình hạt đậu. Ty thể có kích thước
khoảng 0,5-1 ^im và được bao bọc bởi hai lớp màng: màng ngoài và màng
trong. Màng ngoài giống màng sinh chật của tế bào, chứa phần lớn các
protein vận chuyển các chất ra, vào ty thể. Màng trong lại tạo thành những
nêp gâp hình ống gọi là mào, có tác dụng làm tăng diện tích bê mặt. Màng
trong là nơi tạo ra ATP - năng lượng thiêt yêu cho mọi hoạt động của tê bào
Các protein vận chuyên, chuôi vận chuyên điện tử và các enzym tông họfp
ATP cũng năm ở mào ty thê. Khoảng không gian bên trong màng trong là
chât nên ty thê, chứa các enzym, protein, ribosom, tARN và hệ gen ty thê [21.
Hâu hêt các protein của ty thê được mã hoá bới gen nhân và được vận chuyên
vào trong ty thể qua các kênh protein trên màng. Bộ máỵ tạo năng lượng năm
ở màng trong của ty thể và được mã hoá bởi hệ gen ty thể.
Sô lượng ty thê có trong một tê bào khoảng từ hàng trăm đên hàng triệu
ty thê, phụ thuộc vào chức năng của tê bào. Chúng thường xuât hiện nhiêu ở
những mô đòi hỏi nhiêu năng lượng như mô cơ, tim hơn là ở những mô
khác [21].
LỈ.2. Vai trò, chức năng của ty thể người
* Vai trò trong chuỗi vận chuyến điện tử
Ty thê đóng vai trò quan trọng trong con đường trao đôi chât. Chức

năng chủ yêu của chúng là tạo ra năng lượng cho các hoạt động của tê bào
thông qua quá trình hô hâp hiêu khí. Chúng cung câp năng lượng cho tê bào
thông qua quá trình phosphoryl oxy hoá, tạo ra ATP từ glucose.
Thức ăn đi vào cơ thể phải được chuyển hoá thành dạng đơn giản mà tế
bào có thê sử dụng được là glucose. Glucose sau đó được vận chuyên vào
trong tế bào bởi các chất vận chuyển nằm trên màng tế bào, Bên trong tế bào,
glucose lại tiếp tục được chuyển hoá thành ATP theo hai con đường sau;
Con đưOTg thứ nhất là đường phân, xảy ra ở màng sinh chất, bên ngoài
ty thể. Quá trình này không cần có oxy nên được gọi là trao đổi chất kị khí.
Nhờ quá trình đường phân, một phân tử glucose được chuyên hoá thành hai
phân tử pyruvat và tạo thành 4 phân tử ATP. Sau đó, pyruvat được vận
chuyển vào bên trong ty thê.
Con đường thư hai xảy ra ở bên trong ty thể và cần sự có mặt của oxy.
Đây là quá trình chủ yêu đê tạo ra ATP cho các hoạt động của tê bào. Tại đây,
pỵruvat được chuyển hoá thành Acetyl CoA, tiếp tục đi vào chu trình Krebs
đe tạo thành các điện tử giàu năng iượng (các ion hydro). Điện tử ra khỏi chu
trình Krebs được NAD^ hoặc FAD^ nhận lấy và chuyển đến chuỗi vận chuyển
điện tử nằm ở màng trong của ty thê. Điện tử được vận chuyển qua một loạt
các chất vận chuyển trung gian đến oxy, là chất nhận điện tử cuối cùng, tạo ra
Báo cáo để tài QT 08-31
nước và 10 nguyên tử hydro. Các nguyên tử hydro được vận chuyển qua
màng trong vào khoảng không gian giữa hai màng ty thê, tạo ra một gradient
điện thê. Quá trình này làm kích hoạt borm proton và tạo ra ATP. Như vậy,
chu trình Krebs tạo ra được 24-28 phân tử ATP từ một phân tử pyruvat.
ATP là chât có vai trò trun^ tâm trong trao đôi năng lượng ở tê bào và cơ thê
sống. ATP được vận chuyển ra ngoài tế bào chất và được sử dụng cho tất cả
các chức năng của tê bào như vận chuyên tích cực các chât qua màng, tông
hợp các phân tử lớn từ các chât đơn giản, quá trình vận động, quá trình phân
chia
Hô hấp hiếu khí là một quá trình diễn ra liên tục, nhờ đó ty thể có thế

tạo ra được hàng trăm nghìn phân tử ATP môi phút ở một tẻ bào. Như vậy,
có thể coi ty thể như là nhà máy năng lượng của tế bào.
* Vai trò trong sự tão hoả
Người ta cho rang các rối ỉoạn chức năng của ty thế và những biển đôi
của protein là nguyên nhân gây nên sự lão hoá. ơ một sô sinh vật, các dạnjg
oxy gây phản ứng (Reactive Oxygen Species - ROS) là yêu tô chủ yêu quyêt
định tuổi đời (tuy nhiên đó không phải là cơ chế duy nhất của sự lão hoá).
ROS là sản phâm phụ không mong muôn của quá trình hô hâp tê bào (một sô
điện tử không được chuyên qua ubiquinone mà tới khử trực tiêp oxy, tạo ra
anion superoxit). ROS là chât oxy hoá mạnh, có thê phá huỷ các phân tử khác
và cấu trúc tế bào mà chúng có mặt [21].
* Các chức năng tế bào khác
Ngoài chức năng trong chuồi hô hâp và trong sự lão hoá, tỵ thê còn giữ
vai trò trong quá trình “chết theo chưorng trình” (apoptosis) của tế bào. Đây là
quá trình quan trọng trong sự phát triên và điêu hành mô của sinh vật đa bào.
Sự sai khác chức năng ở bât cứ mức độ nào đêu làm giải phóng các yêu tô gâỵ
“chết theo chương trình” vào khoảng không gian giữa hai màng của ty thể
(gian màng), làm cho tê bào bị phá huỷ. Tuy nhiên vai trò của ty thê trong
“chết theo chương trình” rất phức tạp và chưa được biết đến đầy đủ. Có thê
quá trình tạo năng lượng của ty thê có liên quan tới “chêt theo chương trình”.
Nguyên nhân có thể do chuồi hô hấp của ty thê tạo ra sản phấm phụ là các
dạng ROS và bởi hoạt tính sửa chữa của hệ gen ty thê kém nên càng làm tăng
quá trình này [21].
Ngoài ra, ty thể còn có khả năng tích luỹ và giữ lượng ion canxi. Điều
này rất quan trọng trong việc điêu hoà trao đôi chât, tạo ATP và các quá trinh
khác, như tiết thể dịch thần kinh [22].
1.2. Đặc điểm của hệ gen ty thệ ngưòi
L2.1. Cẩu tạo của hệ gen ty thể người
Hệ gen ty thể chiếm khoảng 1 đến 5% ADN của tế bào. ADN ty thể
người là phân tử mạch kép, vòng, có từ 2 đến 10 bản sao trong mỗi tv thể.

Kích thước của chúng là 16569 bp, tuy nhiên có thê sai khác đôi chút do có
những đoạn chèn vào, hoặc mât đoạn, hoặc có những trình tự lặp lại nôi tiêp.
Khác với ADN nhân, ADN ty thê không liên kêt với protein histon, điều này
làm cho ADN ty thể giốnẸ với ADN của vi khuẩn. Người ta đã đưa ra nhiềia
giả thuyết về nguồn goc tiền hoá của hệ gen ty thể. Giả thuyết được chấp nhận
Báo cáo đề tài QT 08-31
Báo cáo đề tài QT 08-31
rộng rãi nhất là hệ gen ty thể là dấu vết còn lại của hệ gen vi khuẩn cổ, sống
cộng sinh bên trong tê bào sinh vật nhân chuân.
Toàn bộ trật tự các gen cấu trúc và chức năng cua hệ gen t) thê người
được săp xêp theo sơ đô trên hình 1.
Phân tử ADN ty thể người gồm có hai chuôi: chuôi nặng giàu guanin
và chuỗi nhẹ giàu cytósin, ma hoá cho 37 gen gồm 2 rARN (12S và 16S), 22
tARN và 13 protein. Chúng là thành phân của phức hệ hô hâp của ty thẻ,
trong đó có 7 tiêu phân của phức hệ I (NDl -> ND6 và ND4L), 1 tiêu phận
của phức hệ III (Cytb), 3 tiêu phần của phức hệ 4 (CO I -> III) và 2 tiểu phần
của phức hệ V (ATPase
6; 8) [14], Hâu hêt các gen được phiên mã từ chuôi
nặng, trừ một tiểu phân ND6 của phức hệ I vả 8 phản tư lARN là được phiên
mã từ chuôi nhẹ [21].
■|ATP&:k8K
[^Cytocluome
lCamplex 1
¡f^trmplgT 4
OtHHAs
■ iRNAs
Hình 1. Hệ gen ty thể ngưòí
ADN ty thế không có intron (ngoại trừ một sô nucleotid không mã hoá
ở giữa một vài gen) ^ à có các gen năm gôi lên nhau (o\ erlapping genes), [14 .
Vung duy nhất không mà hoá ở ADN ty thể người la \ ung điều hòa (được gọi

là đoạn D-loop), chiếm khoảng 7% chiều dài ty thẻ, eom 1121 bp, chứa
promoter cho sựj)hiên mã chuồi nặng và chuỗi nhẹ và chứa điểm khởi đầu
sao chép của chuoi nặng,
1.2.2. Đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể người
sir di truyền cua ADN ty thê là sự di truyền lế bào chất. Đối với các
gen nằm trong nhân cua tê bào sinh vật nhân chụân, chúng tuân theo các quy
luật vận động của nhiễm sắc thể trong các cơ chế phân bào. Nhưng hệ gen tý
Báo cáo đề tài QT 08-31
thể lại không tuân theo những quy luật đó mà các tính trạng do chúng xác
định có những kiêu di truyên riêng đặc trưng cho chúng.
- Di truyền theo dòng mẹ: 0 động vật có vú, 99,99% ADN ty thể được
di truyên theo dòng mẹ [15]. Sô lượng ADN ty thê ở noãn bào khoảng hơn
100.000 phân tử trong khi tinh trùng chỉ có từ 100 đên 1500 phân tử. Trong
quá trình tạọ thành hợp tử, tế bào tinh trùng chỉ đóng góp hệ gen nhân của
chúng cho tê bào trứng chứ không đóng góp hệ gen ty thê. Ty thê của tinh
trùng bị loại bỏ ngay khi vào trứng có thể do quá trình phân hủy protein phụ
thuộc ubiquitin [20], Do vậy, hệ gen ty thê của hợp tử chỉ được nhận từ mẹ.
Đôi khi cơ chê loại bỏ ADN ty thê của tinh trùng có thê bị hỏng, dân đên hiện
tượng lê bào chât của họp tử chứa ADN ty thê của cả bô và mẹ. Hiện tượng
này được gọi là hiện tượng ”dị tê bào chât” (heteroplasmy).
- Đon bội, không có sự tái tô hợp vì chủng được di truyên theo dòng.
- Tốc độ đột biển lón gấp 5-10 lan trong nhân.
ADN ty thể tự tái bản theo kiếu bán bảo toàn nhờ hệ enzym ADN
polymerase có trong chất nên ty thể và xảy ra ở gian kỳ của chu kỳ phân chia
tế bào. Quá trình sao chép bắt đầu từ điểm khởi đầu sao chép của chuỗi năng
và sử dụng đoạn ARN được phiên mã từ chuỗi nhẹ làm mồi. Quá trình tong
hợp chuồi nặng kéo dài cho đên khi điêm khởi đâu sao chép của chuỗi nhẹ ỉộ
ra. Lúc đó, sự tông hợp chuôi nhẹ mới băt đâu. Sau đó, môi được loại bỏ và 2
chuồi được nối với nhau.
Quá trình phiên mã và dịch mã của ADN tỵ thế được điều khiến bởi

gen nhân [13]. Tuy nhiên, sự phiên mã các tiêu phân của chuỗi hô hâp trong
nhân không kêt họp với sự phiên mã các tiêu phân được mã hoá bởi ADN ty
thể [12]. Cả hai chuôi nặng và nhẹ đêu được phiên mã và hâu hêt toàn bộ
chiêu dài của hai chuôi được dùng đê tông hợp nên khuôn ARN polycistronic.
Sau đó, nhờ enzym nuclease tạo ra tARN, rARN và mARN riêng của ty thê.
Điêu đặc biệt là các gen ty thê của người, cũng như các động vật có vú
khác, có một sô mã di truyên khác hăn gen nhân.
Bàng 1: Mòt số mả di truyền của ADN ty thế khác vừi ADN nhản
Mã dì truyền
Hệ gen nhân Hệ gen ty thé
TGA
Mã kêt thúc Trp
AGA, AGG
Arg Mã kêt thúc
ATA, ATT
Ile
Mã mở đâu
ĩ. 2.3. Các rồi hạn chức năng của hệ gen ty thể ngườỉ
Trong vòng 12 năm qua, người ta đã phát hiện ra hơn 50 điêm đột biên
và gần 100 rôi loạn ty thê có liên quan đên bệnh của người [14]. Vì hệ ậen ty
thể chỉ mã hoá cho một lượng rât ít protein tham gia vào quá trình hô hâp của
tế bào nên chức năng của ty thê được thực hiện nhờ chủ yêu vào các protein
do nhân quyết định. Chính vì vậy, các rối loạn ty thể hay bệnh ty thể có thể do
những đột biên ở gen nhân hoặc gen ty thê gây nên. [
2].
Cho đến nay đã biết đến trên 150 bệnh di truyền khác nhau theo mẫu hệ
do ty thể quyết định. Các bệnh này được biểu hiện rất đa dạng, có thể liên
quan đến rối loạn quá trình mã hoá protein hoặc đơn thuần chỉ là nhừng đột
biên thay đôi các nucleotid. Chúng có thê xảy ra ở bât kì ở lứa tuôi nào. cơ
quan nào nhưng cơ quan thưòng bị ảnh hưởng nhiều là não và cơ.

^ Các bệnh về ty thể phổ biến nhất được biết đến là do các đột biến ADN
ty thê gây nên. Các bệnh như “Liệt măt tăng tiên kinh niên”, “Hôi chứng
Keams-Sayre”, đái tháo đường và điếc đều do mất đoạn hoặc sắp xếp lại các
nucleotid trong gen. Các đột biến G1 1778A, T14484C, G3460A cũng làm
biến đổĩ protein, dẫn đến liệt thần kinh thị giác di truyền Leber. Đột biến
irong gen Cyt b gây bệnh không dung nạp vận động và Myoglobin niệu.
Những đột biên thay đôi các nucleotid trên tARN có thê gây khá nhiêu bệnh:
các thay đôi A3243G, T3271C, A3251G gây viêm não tuỷ nhiêm acid ỉaclic
với các triệu trứng giông đột quỵ; A8344G, T8356C gây động kinh co giật cơ;
A3243G, T4274C gây liệt mắl cơ ngoài tăng tiên kinh niên [11].
1.2.4. Ỷ nghĩa việc nghiên cửu hệ gen ty thể người
Do các đặc điêm như: di truyên theo mâu hệ, mức độ đột biên cao,
không tái tô hợp và sô lượng bản sao lớn, ADN ty thê là một công cụ hừu
hiệu dế nghiên cửu sự tiến hoá ở người. Những đột biến của ADN ty thế nếu
là trung tính sẽ không bị loại bỏ trong quá trinh chọn lọc tự nhiên và trở thành
xu thế di truyền (genetic drift). Do ADN ty thể được di truyền theo mầu hệ
nên nó tích luỳ các đột biến và phát tán theo các dòng phả hệ mẫu hệ, Chính
điều này đã tạo nên tính đa hình của ADN ty thê, đặc trưng theo quân thê, tạo
nên các nhóm kiêu đơn của ADN ty thê có quan hệ với nhau, hay còn gọi là
nhóm đơn bội (Haplogroup). Người ta đã nghiên cứu phân loại các nhóm đơn
bôi dựa vào kĩ thuậí RFLP (kĩ thuật nghiên cửu sự đa hình chiêu dài các đoạn
cắt hạn chế) và trình tự đoạn siêu biến của vùng D-loop ty thể [9], [10], Dựa
trên số liệu RFLP người ta đã phân loại ADN ty thê thành 3 nhóm đơn bôi đôi
với người Phi (Ll, L2, L3), 9 nhóm (H, I, J, K, T, u, V, w, X) đối với hầu hết
người Châu Au, Băc Phi và ngưòã da trăng vùng Tây A, 9 nhóm đơn bội khác (A,
B, c, D, E, F, G, M, N) đôi với ngưòd Châu A, Châu Đại Dương và Bãc Mỹ [2],
Việc nghiên cứu hệ gen ty thê, đọc các trình tự nucleotid của các vùng siêu
biến của đoạn D'loop cũng như các gen khác của ty thể, dẫn đến giải mã toàn
bô hệ gen ty thê của nhiêu đại diện các dân tộc khác nhau sẽ cung câp sô liệu
để phân loại các nhóm đơn bội chính xác và chi tiêt hơn [17],

Ngoài mục đích nghiên cứu các quan hệ di truyên theo mâu hệ, các
nghiên cứu hệ gen ty thê các tộc người trên thê giới được dùng đê chân đoán
và điều trị các bệnh di truyên ty thê, trong xác định cá thê và quan hệ huyêt
thống, trong giám định pháp y, điêu tra tội phạm Hiện nay, tại các nước
tiên tiến trên thê giới như Mỳ, Nhật Bản, các nước Tây Au việc tìm kiêm
người bị mất tích, các điều tra hình sự đêu dựa trên giám định gen, bao gồm
phân tích trinh tự ADN nhân và ADN íy thê. Tuy nhiên, việc phân tích trình
tự ADN ty thể tỏ ra có nhiều un thế hơn trong trường họp phân tích nhừng
mẫu sinh phâm còn sót lại sau hàng^ chục hay hàng trăm năm. ADN nhân do
có câu tníc mạch thăng nên không bên, dê bị phân huỷ, làm cho việc phân tích
gặp nhiều khó khăn. ADN ty thê mạch vòng, có kích thước nhỏ nên bền theo
thời gian trong các mô khó phân huỷ như mô xươne, răng và tóc [2].
Báo cáo đê tài QT 08'3l
1.2.5. Nghiên cứu hệ gen ty thể người Việt Nam
Cho đên nay, các nghiên cứu trong nước vê đặc điêm hệ gen ty thê
người Việt Nam còn rất ít, chủ yếu là của một số tác giả nước ngoài.
Năm 1992, Ballinger và các tác giả khác đã dùng phương pháp PCR -
RFLP và lai phân tử đê nghiên cứu ADN ty thê của người di cư thuộc chủng
tộc Mongoloid cô đại, trong đó có sử dụng các mâu ADN người Việt không rõ
nguôn gôc [7].
Bằng phương pháp tương tự, nhóm các nhà khoa học Pháp kết họp với
Vù Triệu An, Trường Đại học Y, Hà Nội, đã nghiên cứu vê sự đa hình ADN
ty thê tộc người Kinh của Việt Nam. Các tác giả này đưa ra kêt ỉuận ủng hộ
giả thuyết cho rằng người Kinh có nguồn gốc kép từ người Trung Quốc và
các nhóm quân thê Thái - Indonesia [18], Tuy nhiên, điêu này cân có thời
gian kiêm chứng thêm. Việc giải mã hệ gen ty thê của người Việt Nam chăc
chắn sẽ có đóng góp quyết định cho câu trả lời chính xác về mối quan hệ di
truyên tiên hoá.
Công trình nghiên cứu duy nhất vê đoạn HVl thuộc vùng D- loop của
hệ gen ty thể của 35 cá thế người Việt định cư tại Mỳ đã được Oota và các tác

giả khác công bổ vào năm 2002 [23], Nghiên cứu này nằm trong nghiên cứu
đánh giá vê di tiuyên quân thê của người Châu A. Tại Việt Nam, chỉ có một
vài nghiên cứu ứng dụng phân tích trình tự vùng D-Loop của hệ gen ty thê
người như: trình tự đoạn HVl được nghiên cứu ứng dụng vào việc giám định
hài côt liệt sỳ [4], được sử dụng trong nghiên cứu bệnh ung thư vú ờ các đôi
tượng Việt Nam [1], Vì thê, việc giải mã hệ gen ty thê người Việt Nam, trước
hêt là đại diện dân tộc Kinh và các dân tộc khác trong cộng đông các dân tộc
Việt Nam có ý nghĩa khoa học và thực tiên cao.
Hiện nay, nhóm nghiên cứu tại Viện Công nghệ Sinh họCj Viện khoa
học và công nghệ Việt Nam đang tiên hành đê tài câp nhà nước vê giải mã hệ
gen ty thê người Việt Nam và định hướng ứng dụng. Các tác giả của đê tài đã
công bô công trình đâu tiên vê phân tích trình tự vùng D-loop của 5 cá thê
người Việt Nam thuộc 3 dân tộc Kinh/Việt, Tày và H’Mông/Mông [3]. Các
gen chức năng và các vùng khác của ty thê cũng đang được giải mã. Trong đó
giải mã gen ND5 chính ỉà một trong những nhiệm vụ đóng góp vào việc thực
hiện đê tài nghiên cứu này.
1.3. Đặc điểm của gen ND5 ty thể
1.3.L Cẩu trúc, chưc năng của phức hệ I của chuỗi hô hấp ty thể
* Cẩu trúc
Phức hệ I là một thành phần của chuồi vận chuyển điện tử nằm ở màng
trong của ty thể. Hệ thống vận chuyến điện tử này gồm có hơn 80 chuôi
polypeptit của năm phức hệ enzym và hai phân tử vận chuyên điện tử là
coenzym Q và cytochrom c [14], Phức hệ I (NADH-ubiquinone
oxiđoreductase, NADH dehydrogenase) là phức hệ enzym lớn nhất, gồm 42
tiểu phần, trong đó có 7 tiêu phân được mã hóa bởi ADN ty thể là NDl ->
ND6 và ND4L [21]. Phức hệ có cấu trúc một phần được gắn vào màng trong
cùa ty thể còn phần kia nầm nhô vào trong chất nền [8], Chất mang điện tư
của phức hệ I là phân tư flavin mononucleotid (FMN) và 6 cụm Sắt-Lưu
Báo cáo đề tài QT 08-31
huỳnh là N-la, N-lb, N*2 -> N-5. Phức hệ I có thể chia nhỏ hơn thành 3

phân: phân flavoprotein, phần protein-sắt và phần protein kị nước [24], Phần
flavoprotein chứa vị trí liên kêt với NADH và FMN. Phân protein-săt là \ ị trí
liên kết với ubiquinon. Phần protein kị nước chứa trung tâm sat-lưu huỳnh
(đóng vai trò là chât cho điện tử tới ubiquinone), một vài tiêu phân mã hóa
bởi nhân và 5 tiêu phần đưgrc mã hóa bởi ty thê (NDl, ND2, ND3, ND4,
ND4L và ND5). Do vậy, phân găn vào màng trong của phức hệ I chứa toàn
bô các tiếu phần được mã hóa bởi ty thể, còn phân nằm trong chất nền chứa
hâu hêt các tiêu phân được mã hóa bởi nhân.
* Chức năng
Phức hệ I là bước đâu tiên trong chuồi vận chuyên điện lư cua ụ ihẻ.
Nó nhận điện tử từ NADH rồi chuyển đến ubiquinon (coenzym Ql 0).
Điện tử ra khỏi chu trình Krebs được NAD" nhận lây và tạo thành NADH.
NADH - ubiquinon oxidoreductase (phức hệ I) là một trong 3 phức hệ enzym
chuyến đối năng lượng của chuỗi hô hấp ty thế. Chúng xúc tác cho phản ứng
vận chuyên điện tử từ NADH tới FMN, rôi tới cụm Sãt-Lưu huỳnh, cuôi cùng
tới coenzym Q. Phản ứng này tái tạo lại NAD* đê quay lại chu trình Krebs,
tiếp tục vận chuyến điện tử. NADH - ubiquinon oxidoreductase xúc tác cho
sự oxy hoá NADH cùng với sự khử ubiquinon, đông thời đây proton ra khoi
màng ty thể. Quá trinh này có liên quan tới sự tạo thành ATP [8 .
Phản ứng tông hợp của quá trình này được xúc tác bởi phức hệ I như sau:
NADH + CoQ + 2H" 4 NAD" + H + C0QH2
(chất khử) (chất oxy hoá) (chất oxy hoá) (chất khử)
Năng lượng được tạo ra bởi quá trình oxy hoá NADH bởi phức hệ
NADH-ubiquinon oxidoreductase (phức hệ I) được dùng đê vận chuyên điện
tử đi ^ua màng trong của ty thê. Cùng với quá trình đó, proton cũng được đây
từ chât nên của ty thê vào khoảng không gian giữa hai màng. Ọuá trình này làm
kích hoạt ATP synthase tạo ra ATP.
1.3.2. Vị trí, chức năng gen ND5 ty thể
* Vị trí _ >
Sản phẩm của gen ND5 nằm ở phần kị nước của phức hệ 1, Protein nậy

là một trong 7 tiểu phần được mã hoá bởi ADN ty thê trong số 42 tiểu phần
của phức hệ I của chuôi hô hâp [26].
Gen ND5 là gen chức năng, có chiều dài 1812 cặp base, nằm giừa cặp
nucleotid 12377 và 14148 [5], [28], được mã hoá bởi chuôi nặng giàu guanin
của ADN ty thê. Đây là gen có trình tự mã hoá liên tục có trọng lượng phân tử
khoảng 66.6 kD.
Chuồi mARN của gen ND5 băt đâu băng mã mở đầu là AƯA-
methionin và kết thúc là mã UAA. Ngoài ra, mARN còn có một trình tự
không mã hoá ở đầu 3’, dài 521 bp, nằm ở phía trước đuôi polyadenin. Trình
tự này đối nghĩa với trình tự của gen ND6 năm ờ chuôi nhẹ [5]. Chuôi mARN
của gen ND5 được phiên mã như là một phần của sự phiên mã chuồi nặng
polycỉstronic.
* Vai trò
Báo cáo đề tài QT 08-31
Sản phẩm của gen ND5 là một thành phần của phức hệ enz^m NADH -
ubiquinon oxydoreductase (phức hệ I). Enzym này có vai trò rât quan trọng
trong các chu trình sinh tổng họp của tế bào:
• Xúc tác cho phản ứng tách H trực liêp từ cơ chât và chuyên đên
NA D\FM N , FA D\
• Xúc tác cho giai đoạn đầu của chuỗi hô hấp ,vận chuyển H", đồng
thời vận chuyển cả proton và electron.
• Chúng cũng xúc tác cho phản ứng theo chiêu ngược lại: chuyên H"
từ [NADH+H"] đến cơ chất, khử cơ chất.
• Đột biến gen NĐ5
Nhừng đột biên gen ND5 ty thê cũng đã được nghiên cứu và chỉ ra răng
có liên quan tới nhiều bệnh như Liệt thần kinh thị giác dì truyền Leber
(LHON), Hội chứng^ Leigh hoặc Hội 'chứng M E LAS
Bệnh Liệt thân kinh thị giác di truyên Leber gây ra do sự thay đôi
alen, chuyên Alanine 458 thành Threonine (A458T). Một đột biên nữa cũng
gây ra bệnh này là đột biến chuyển vị trí nucleotid 13730, dẫn đến sự thay thể

Glycin băng axit glutamic ở vị trí 465 của chuôi pol;/peptit ND5 (G465E)
[16]. Các nghiên cứu chỉ ra răng đột biên này có thẻ băt nguôn từ trong dòng
phôi của mẹ.
Hội chứng Leigh có liên quan tới sự biên đôi T -> c ở vị trí nucleotid
12706 của gen ND5, làm biên đôi trình tự axit amin Phenylalanin thành
Leucin ở vị trí 124 (F124L) [27],
Đặc điẽm của Hội chứng MELAS là rôi loạn thân kinh trung ương,
tăng CSF lactat có liên quan tới sự biên đôi A -> G ở vị trí nucleptid 12770
của gen ND5, dân đên đột biên thay axit Glutamic thành Glycin (E145G)
[19].
1.4. Các đột biến ADN ty thề quan tâm của đề tài
- Trong nhừnệ năm qua, các kết quả nghiên cứu về đột biến hệ gen ty
thê đã được công bô cho thây một vài các đột biên intDNA đơn và các đa đột
biến đã có mối ỉiẽn hệ với các đặc điêm bệnh lỷ và biêu hiên bên ngoài đặc
trưn^. Mặc dù vậy, một vài bệnh nhân có các bang chứng về bất thường của
ty the vẫn không có các chuân đoán phân tử. Trình tự gen của ty thê hiện là
một công cụ hừu hiệu đê có thê đưa ra các khăng định ờ các bệnh không hoặc
chưa được chuẩn đoán. Xử dụng phương pháp tiếp cận này, các đột bien mới
hay đã được miêu tá đêu được xác định, và thật ngạc nhiên các đột biên lạ
thường có mối liên hệ với các đãc đĩêm bệnh lý , khác hăn với các đặc điêm ở
bênh nhân được báo cáo ban đầu. Điều này một lần nữa khẳng định sự thay
đồi trong các bệnh liên quan đẽn ty thê. Việc xác đinh và nghiên cứu các đột
bién đã biêt và các đột biên lạ là rât quan trọng đê tim ra nguyên nhân gây
bệnh có liên quan đên nucleotide. Dựa vào mâu bệnh phâm do Bệnh viện Nhi
Trung ương cung cấp có biểu hiện lâm sàng liên quan đến hai đột biến điểm
là T I001 oc và A3243G, nên chúne, tôi đi sâu phân tích hai loại đôt biên này.
- Đột biên TIOOIOC được Bidooki et al (1997) miêu tả lấn đầu tiên ở
một bệnh nhân nữ với các chứng bệnh nguy hiêm.Và được báo cáo lần tiếp
theo do Nishigaki el al, 2002. Trong báo cáo của Crimi, M., Galbiati, s.,
Báo cáo đề tài QT 08-31

Sciacco, M., Bordoni, A., Natali, M. G., Raimondi, M., Bresolin, N. and
Comi, G. p. (2004). "Mitochondrial-DNA nucleotides G4298A and TIQOIOC
as pathogenic mutations: the confirmation in two new cases." Mitochondrion
3(5):279-283, đê cập tới tình trạng khảm của đột biến này ở các mô của các
bệnh nhân được nghiên cứu. Tìm đột biên TIOOIOC được thực hiện băne
phân tích RPLP của sản phẩm PCR. Theo nhóm tác giả Crimi, M et al thì
doạn ADN từ vị trí 9763 đên 10268 gôm 505 nucleootit đã được nhân lên và
sau đó sử dụng enzim giới hạn endunucleaza Rsa\ căt thành 2 tiêu phán có độ
dài là 258 và 247 nucleotit. Trường hơp có đột biên T thay băng c thi Rsa\
không nhận ra đoạn này và sẽ không căt. Tât cả mô tả trên được phát hiện khi
điện di sản phâm RFLP. Trên giá điện di nêu thây có 2 tiêu phân ứng với
thang chuân trong khoảng từ 247 đên 258 thì đó là trưòrng hợp khône có đột
biến. Ngược lại neu chỉ có một tiếu phần ở mức 505 thì trường hợp nàv có đột
biếnTlOOÌOC.
Loại đột biến T10010C trong cơ là dạng heteroplasmic, tuy nhiên
trong mô máu dạng này lại rất thấp, chỉ khoảng 5,4% (Crimi, M et al, 2004).
- Đột biên điêm A thành G tại vị trí nucleotit 3243 trên gen ty
thê được coi là đột biên gây viêm não Xuỷ nhiêm axit lactic với các tinh tiêt
giống đột quỵ (MELAS) và gây liệt cơ mắt ngoài tăng tiết kinh niên cũng như
gây bệnh liệt cơ tim (Cardiomyopathy) và gây bệnh đái đường kèm câm điêc.
Đột biên này tìm thây ở hơn 80% sô bệnh nhân MELAS. Tỉ lệ đột biên
A3243G trong các bệnh nhân tiêu đường typ II ước tính là 1 -2%.
Loại đột biên A3243G trên gen tARN'®“ ty thê đâu tiên được tìm thây ở
các bệnh nhân tiêu đường typ II do ưrata et al (1998). Các tác giả này đã nhân
xét đột biến nầy có liên quan mật thiết với các dạng khác nhau của bệnh tiều
đường. Đột biên này tạo ra điêm căt của enzim giới hạn Apơì nên nó có thê
được xác định băng cách thuỷ phân sàn phâm PCR có chứa nucleotit 3243
bănẸ Apaì. Phương pháp này có thê thực hiện nhanh chóng , chính xác trên
nhiêu bệnh nhân có triệu chứng của các bệnh nêu trên.
1.5. Các phương pháp thuòng dùng trong sinh học phân tử

1.5.1, Phương pháp phân tích ADN
Phương pháp phân tích ADN được dùng để xác định huyết thống cha -
con, mẹ - con hay cá thê chính xác cũng như các đột biên gen liên quan đên
hội chứng hoặc bệnh di truyên.
Khi nghiên cứu vê câu trúc ADN của sinh vật nhân chuân, người ta
thấy răng ADN bao gôm các trình tự mã hoá (exon) và các trình tự không mà
hoá (intron). Các trinh tự mã hoá ở sinh vật nhân chuân chìm trong một khối
ADN lón mà hiện nay còn chưa rõ tác dụng. Tuỳ mức độ hiện diện của chúng
trong nhân, các trình tự ADN được chia làm 3 loại :
- Các trình tự lặp lại nhiêu lân chiêm 10 -15 % hệ gen động vật có vú.
Đó là những trình tự ADN ngăn (10- 200 Kb) không mã hoá.
- Các trình tự có sô lân lặp lại trung bình chiêm khoảng 25 - 40% hệ gen
người, chúng có kích thước lớn honn (100 - 1000 Kb) và đa dạng hơn các trinh
tự lặp lại nhiều lần. Các trình tự này không tập trung mà phân tan trên toàn bộ
bộ gen.
Báo cáo đề tài QT 08-31
- Các trình tự duy nhất !à các gen mã hoá cho các protein có trình tự đặc
trưng cho từng gen (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 1998).
1.5.2. Phương pháp RFLP Các tiểu vệ tinh (minisateiỉiíes)
Năm 1985, tại nước Anh, Alec Jefreys và các cộng sự khi nghiên cứu
các đoạn ADN mã hoá protein trong máu người myoglobulin đã phát hiện ra
minisatellites (tiểu vệ tinh )
• Đặc điểm của các tiểu vệ tinh
Là những đoạn trình tự ADN lặp lại một sô lân có trong mọi tế bào và ơ
những vị trí khác nhau trong hệ gen người.
Mỗi đoạn lặp có chieu dài từ 9 - 24bp, tổng cộng chiều dài nàm trong
khoảng từ 0,5 Kb - 30 Kb .
Các trình tự này có số lân lặp lại khác nhau ở các alen khác nhau cua
cùng một locus.
• Phương pháp RFLP

Băng cách ứng dụng kỳ thuật xác định trình tự chiêu dài của những
đoạn ADN lặp lại này, Jefreys đã tạo ra phương pháp RFLP. Phương pháp
này xác định tính đa hình về chiều dài các đoạn ADN được lạo ra bởi các
enzym giới hạn. Các enzym giới hạn sẽ căt vùng bao quanh đoạn lặp lại với
tân sô trung bình này. Các đoạn này được phân giải băng điện di trên gel
agaroza. Các cá thê khác nhau sẽ cho các băng với kích thước dài ngăn khác
nhau. Nhưng với các băng hơn kém nhau vài nucleotit sẽ rât khó phân biệt.
Đê khăc phụ vân đê này, người ta dùng phương pháp phân tích Southern với
các mâu dò đa locus đê lìm ra các băng nôi bật được phân biệt một cách dê
dàng.
Mặc dù có ưu điêm là có độ chính xác cao nhưng phương pháp này vân
có những hạn chê :
Phương pháp này đòi hoi lượng mâu ADN lớn ( khoáng ] 00 nanogram)
và ADN phải còn nguyên vẹn, không bị phân huỶ.
Các bước tiên hành phức tạp, đòi hỏi kỹ thuật viên có trình độ cao.
Không tự động hoá được.
Với nhừng trường hợp ADN bị tách mạch, enzym giới hạn sẽ không
cẳt được
1.5.3. Định dạng các đoạn ADỈ^ lặp lại nßan (STR typing)
• Các đoạn AD Ỉ\ lặp lại đoạn ngăn (STR)
Qua “chương trình hê gen ngườị” các nhà khoa học đã phát hiện ra các
đoạn ADN lặp lại đoạn ngăn có tân sô cao (microsatellites hay short tandem
repeat). Đặc điêm của STR :
- Là các trình tự nucleotide ngắn được lặp lại nhiều lần liên tiếp nhau và có
số lần lặp lại khác nhau ở các cá thê khác nhau.
- Một đơn vị lặp lại có chiều dài từ 2 - 5 nucleotide. Với các dạng lặp lại 2
nucleotide:
+ Dạng CA / GT chiếm khoane 0,5% hệ gen.
+ Dạng CT / GA chiếm khoảne 0,2% hệ een.
Báo cáo đề tài QT 08-31

Tuy nhiên, người ta sử dụng dang lặp lại 4 nucleotide trong giám định
gen do nó có độ phân giải cao và hệ sô trùng lặp tương đôi thâp.
- Tông cộng chiêu dài < 100 bp.
• Phương pháp xác định trình tự đoạn ngăn STR ( STR typing )
Phương pháp này xác định tính đa hình của các đoạn STR nhờ phản
ứng PCR. ưu điếm nổi bật của phương pháp PCR là khả năng nhân nhanh
một đoạn ADN lên hàng triệu lân sau một thời gian ngăn . Phương pháp này
có ưu điêm :
- Phân tích các đoạn ADN ngắn nên có lính bao tồn cao.
- Đòi hỏi một lượng mẫu ADN rất nhỏ, phương pháp có thê thành công chi
với một sợi tóc hoặc 40 tinh tmng
- Thời gian phân tích ngăn.
- Có thể the tự động hoá được.
Báo cáo đề tài QT 08-31
1 QAI H Ọ C Q U Ố C * N Ô'
ĩ RUNG TAM t h ò n g TIK' '-hụ 71$ N
f)'l / 9 5 0
17
Báo cáo để tài QT 08-31
Chưong II
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ử v
2.1. Nguyên liệu, hoá chất và thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu:
- Máu ngoại vi của bệnh nhân 1 tuôi, nghi có đột biên A I00]OT (hội chứng
bại não, bệnh chuyên hoá) do Bệnh viện Nhi Trung ương cung câp (bệnh án
xem phần phụ lục).
-Máu ngoại vi cùa người bô và mẹ binh thường vê bệnh lý và người con trai
(bệnh nhân 8 tuôi) có đột biên A3243G (hội chứng MELAS) do Bệnh viện
Nhi Trung ương cung cấp (bệnh án xem phần phụ lục).
2.L2. Hoả chẩt

- Hoá chất íảch chiết ADN
Tên hoá chất
ỉ) Kit lách chiết DNA
2) Hoá chất phản ứng PCR
3) Kit linh sạch DNA từ gel
4) Enzyme giới hạn: Hae \\\,Spe I
5) Kit Top TA Cloning
6) Hoá chất pha môi trường LB
7) Hoá chât điện di Agarose
8) Hoá chât cho giải trình tự
Hãng sản xuất
Qiagen ( Hàn Quôc)
Bioneer ( Hàn Quốc)
Fermentas ( Đức)
Enzynomic (Hàn Ọuôc),
Invitrogen ( Mỹ)
Beckman Coulter ( Mỹ)
- Ký hiêu và trình tự mồi ty thể đã sử dụng như sau : Các mồi được thiết
kế từ việc phân tích đoạn ADN có chứa đột bien quan tâm và đặt mua từ hãng
Invitrogen.
Tt Tên mồi Trình tự mồi
1 5 ’-c ACC ATTTCCG ACGGC ATCTACGGC-3 ’
2 5 '-GTAATAATTATTAGTAGTA AGGCTAG-3 ’
3 MtFMl
5 '-C A AG AGA A ATA AGGCTTACTTC-3 ’
4 MtRM
5'-GGAGTAGGAGGTTAGCCATGGG-3’
2. Ị.3. Thiết bị
Các thiềt bị PTN TĐ ỈClioa Sinh học trường ĐHKHTN;
- Máy ổn nhiệt { Block heater - Anh ).

- Be Ổn nhiệt (Tempette Junior Techne)
- Máy li tâm Eppendorf centrifuge 5417R (Eppendorf- Đức)
- Máy li tâm Eppendorf 5415C (Eppendorf, CHLB Đức)
- Máy li tâm Eppendorf centrifuge 5804 (Eppendorf - Đức )
- Máy li tâm (Sorvall);
- Máy vortex - Mini Sharker (Kika Works - Malaysia)
- Bộ điện di đứng nhỏ, mini - sub cellGT (Bio - rad - Italy).
- Bộ điện di ngang
- Máy PCR Eppendorf (Singapore).
- Máy GeneAmp® PCR System 9700 (ABI, Mỹ
- Máy xác định trình tự Beckman Coulter ( Mỳ)
- Máy chụp ảnh Bio-Rad (Bio-Rad, Mỹ)
- Máy đo quang phô tự động Nanodrop.
- Và một số thiết bị khác: Tủ lạnh -20°c, -84°c (Sanyo, Nhật Bản);
Pipetman các loại (Gilson, Pháp); Cân phản tích (Mettler Toledo, Thụy
Sỹ);Máy Vortex (OSI Rotolab); Máy đo pH (Beckman - Mỹ)
2.2. Phưong pháp nghiên cứu
2.2. J DNA được tách theo kit của Qiagen
DNA được tách theo kit của Ọiagen, các bước cụ thê như sau:
Dùng pipet hút 25 Ịil Qiagen protease vào ông eppendorf 1,5 ml.
Bô sung 200 |J,1 huyêt thanh.
Bô sung 200 |il đệm AL (có chứa 28 |J.g/ml RNA carrier), đóng năp và
trộn hỗn hợp bàng vortex trong 15 giây.
ủ hỗn hợp ở 560C trong 15 phút bàng heating block, ly tâm nhẹ để tránh
hóa chât còn bám trên thành ông.
Bổ sung 250 ethanol 100%, đậy nẳp và trộn đều hồn hợp trong 15 giây,
u hỗn hơp với ethanol 5 phút ở nhiệt độ phòng.
Hút cân thận hôn hợp dịch vào cột QIAamp MinElute và ly tâm ờ 8000
vòng/phút trong 1 phút ờ nhiệt độ phòng.
Chuyển cột sang ống eppendorf 2 ml mới; rửa cột 2 lần bằng 500 \i\ đệm

AW1 và AW2 kết hợp ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 1 phút.
Chuyển cột sang ông eppendorf mới, ly tâm ở 14.000 vòng/phút trong 3
phút đê làm khô mànậ hoàn toàn.
Chuyển cột sang ong eppendorf 1,5 ml mới, bổ sung 40 Ịil đệm AVE, để
đứng cột ở nhiệt độ phòne trong 5 phút, và tiên hành ly tâm ở 14000
vòng/phút trong 1 phút đê thu DNA và RNA. Bô sung tiếp 20 |il đệm AVE,
lập lại ly tâm đê thu tiêp DNA và RNA. Mâu được bảo quản ở -80°c đên khi
sử đụng.
- PCR để nhân đoạn gen của ty thế (9763-10120) được thực hiện với các
thành phần phản ứng như sau.
DNA Khuôn: 2 Ịil
Mồi xuôi: 1 |il
Mồi ngược ] |il
Báo cáo đề tài QT 08-31
Taq DNA Pol (5u/|j,l): 0,2 |il
Đệm Taq: 2,5
dNTP ( 2,5 mM); 2,5
MgCblOmM: 2,5 ịx\
dHjO: Ỉ3,3ịi\
(Tông thê tích phản ứng là 25 jul)
- Giải trình tự đoan gen nhân dòng bang phương pháp Sanger trên hệ thống
máy tự động CEQ'"^8000 (Beckman Coulter)
2.2.2 Điều kiện tiến hành PCR
Thành phần phản ứng;
DNA Khuôn 2
Mồi xuôi 1 ^1
Mồi ngược 1 ^1
Taq ỒNA Pol (5u/ụl): 0,2 ill
ĐệmTaq 2,5 |il
dNTP( 2,5 mM) 2,5 ^1

MgCb lOmM 2,5 jil
dHsO ^ , 13,3^1
(Tông thê tích phản ứng ỉà 25 ỊẤỈ)
Chu kỳ phản ứng:
Khởi động nóng ở 94°C: 5 phút
94°c : 1 phút
56°c : 30 giây 35 chu kỳ
72°c : 40 giây
72“C ; 10 phut
4°c :oo
2.2.3 Điều kiện tiến hành phản ứng cắt enzyme giới hạn Spe I
Thành phần phản ứng:
DNA sau thôi gel: lOfil
Enzyme Spel 1 |il
BSA : 3 ịi\
Đệm : 3 |il
H2O :.13|al
Thời gian phản ứng căt là 14 tiêng.
2.2.4 Các bước để nhân dòng đoạn gen quan tâm bằng kit TOP cloning
TA.
2.2.4.1 Phản ứng gẳn đoạn gen quan tâm vào vector pCR 2.1
-Thành phần phản ứng:
Sản phẩm PCR đã được thôi gel : 1
Báo cáo đề tài QT 08-31
70
Báo cáo đề tài QT 08-31
Vector pCP 2.1
Đệm
«ÌH2O
Tổng thể tích

- Giữ phản ứng ỏ 25°c trong 30 phút
iMl
1
3^1
6ụl
2.2.4.2 Biến nạp vector tải tồ hợp trên vào tế bào khả biển DH5
Lấy tế bào khả biến từ -80 đặt lên đá trong 10 phút.
Cho 30 tế bào khả biến vào ống thí nghiệm l,5ml, Cho 3 sar phâm cua
phản ứng gắn (ligation) vào.
Đặt ông thí nghiệm trên đá trong ] 0-20 phút
Chuyển ống thí nghiệm sảng bể ổn nhiệt ở 42“ c tòng 45 giây.
Đặt lại ông thí nghiệm lên đá trong 2 phút.
Cho 300ml LB lỏng vảo ông thí nghiệm và đặt ở 37° c trong 30 phút.
Lăc ông thí nghiệm với tôc độ 180 vòng/ phút ở 37° c trong 1 0 phút.
2.2.4.3 Cấy trải vi khuẩn lên đĩa
Chuẩn bị môi trường LB đặc ở dạng lỏng có chứa kháng sinh ampicillin
với nông độ 50-100 g/ ml.
Đô môi trường LB vào đĩa petri và đê một lchoảng thời gian đê LB đông
lại.
Trải Xgal và IPTG lên mặt đĩa. Giữ đĩa một thời gian ở nhiệt độ phòng
Cấy trải vi khuẩn đã tiến hành biến nạp lẽn mặt đĩa. cất đĩa ở 37" c trong
10-14 tiếng.
2.2.4.4 Chọn dòng tế bào có chứa vector tái to hợp
- Chon khuẩn lạc trắng, khuẩn lạc xanh
- Kiểm tra sự có mặt của đoạn gen quan tâm trong các khuẩn lạc trắng bàng
kỹ thuật PCR với cặp môi của vector và cả cặp môi đặc hiệu của đoạn gen
quan tâm.
2.2.5 Giải trình tự đoạn gen quan tăm
2.2.5,1 Tách plasmid của tế bào có chứa vector tái tể hợp
Đệm P1 ; Glucose 50 mM; tris Hcl 25mM, pH 8; EDTA lOmM.

Đẹm P2 : NaOH 0.2 N; SDS lo/o
Đêm P3 : CH3COOK 5K, CH3COOH/ H20. Rnase.
Đệm TE Trí - Hcl 1 OmM, pH 8, EDTA 1 mM.
Ly tâm dịch nuôi tê bào với tôc độ 6000 vòng/ 1 phút, ở 4°c trong vòng
10 phút. Loại dịch nôi và thu kêt tủa.
Hỏa tan kết tủa bằng 100 Pl, trộn đêu băng máy, để ở nhiệt độ phòng
trong 5 phút.
Bổ sung 200 |il P2, trộn bằng các đảo ngược ống 5 lần. ủ trên đá trong 5
phút.
- Cho 150 ụl P3, trộn bằng cách đảo ngược ống 5 lần, ủ trên đá trong 5
phút.
91
Báo cáo đề tài QT 08-31
- Ly tâm với tốc độ 14000 vòng/ phút ở 4 ‘’C trong vòng 10 phút. Thu dịch
nôi chuyên sang ông thí nghiệm khác.
Bô sung_ hôn hợp Phenol, choloroform, isoanylancohol với tỷ lệ 25:24:1.
Lv tâm với tôc độ 12000 vòng/ phút ở 4°c

trong vòng 5 phút.
Thu dịch nôi và bô sung Kali acetate 3M với thê tích băng 2 lân thê tích
dịch nôi thu được ở bước trên.
Ly tâm với tốc độ 12000 vòng/ phút ở 4 "c trong vòng 20 phút.
Loại dịch nối, thu kết tủa, hoà tan trong nước thành dung dịch.
2.2.5.2 Chạy PCR lần 1
-Thành phân phản úng:
DNA plasmid 0.5
Môi xuôi pUC19 1
Ml
Mồi ngươc pUC 19
1

Taq DNA Pol (5u/^l): 0,5
^1
Đêm Taq 2,5
Ml
dNTP(2,5 mM) 2,5
Ml
MgCỈ2 10 inM
2,5
dH2Ơ
- Chu kỳ phản ứng;
Khởi động nóng ở 94"c: 5 phút
94"C : 30 giây ]
96°c : 30 giây 30 chư hỳ
72°c : 40 giây
72°c :
10
phút
4“C : oo
2.2.S.3 Chạ^ PCR lần 2
- Thành Ị)han phản ứng:
Sản phẩm PCR lần 1
Môi (xuôi hoặc ngược)
DTCS master mix
dH20
- Chu kỳ phản ứng:
Khởi động nóng ở 94‘^’C; 5 phút
96 T : 30 phút
56°C:30giây 30 chu kỷ
1 giây
phút

17,2
ụ i
1 ^1
:6 ^il
:6 ịx\
60
72T
4 T
; 00
Xử dụng sản phảm chạy PCR lần 2 đê giải trình tự tự động.
2.2.6. Phương pháp định lượng AD N bằng quang phổ kế
Nguyên tắc : Dựa vào sự hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm
của các bazơ purin và pyrimidin. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm
của các mẫu cho phép xác định nồng độ ADN trong mẫu dựa vào tương quan
sau:
Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ là :
50p,g cho một dung dịch ADN sợi đôi
40fj.g cho một dung dịch ADN sợi đon
Đê kiêm tra độ sạch của dung dịch đo thêm giá trị OD ờ 280 nm. Tại
bước sóng này các protein có mức hâp thụ cao nhât. Một dung dịch axit
nucleic được xem là sạch (không lân nhiêu protein) khi có tỉ sô OD260nm-
/OD280nm khoảng 1,8- 2,0.
2.2.7. Kv thuật điện di
- Nguyên lý
Mọi phân tử sinh học có tích điện đêu có khả năng di chuyên trong điện
trưòng. Tuỳ thuộc vào mồi loại phân tử có tích điện khác nhau mà chúng có
hướng di chuyên vê cực âm hay dương. Dựa vào tính chât này mà người ta
dùng phương pháp điện di đê phân tách các đoạn ADN có kích thước, trọng
lượng khác nhau.
Dưới tác dụng của dòng điện một chiêu, các đoạn ADN sẽ di chuyên từ

cực âm sang cực dương. Đoạn nào có trọng lượng phân tử thâp hơn, kích
thước nhỏ hơn sẽ di chuyên nhanh hơn và ngược lại.
Tính linh động của phân tử trong bản gel dưới tác dụng của một điện
trường được tính theo công thức :
Log ịi = Log ^0 - ỉ<^rC
Trong đó :
Log |J.0 : tính linh động của phân tử trong môi trường lỏng
c ; Nồng độ gel,
Kr : Hằng số làm chậm do cấu trúc gel đồng thời cũng phụ thuộc vào
khối lượng phân tử của phân tử axit nucleic.
Qua đó ta thấy được tính linh động của phân tử phụ thuộc vào hai chỉ
tiêu khoi lượng phân tử và nông độ các chât câu thành gel. Hai loại gel được
sử dụng trong nghiên cứu axit nucleic là polyacrylamide và agaroza. Việc lựa
chọn loại gel cũng như như nồng độ các chất tạo thành gel tuỳ thuộc vào kích
thước trung bình của các đoạn axit nucleic cân phân tích.
Nồng độ Acrylamide Kích thước trung bình các đoạn cân phân tích
Báo cáo đề tài QT 08-31
(%w/v)
(bp)
3,5
1000-2000
5,0
8 0 - 500
8^0
60 - 400
12,0
40-20 0
15,0
25-15 0
20,0

6 -1 0 0
- Phương pháp
- Lau sạch bản kính, lược, giá kẹp bằng cồn. Đe khô ở nhiệt độ phòng
trong 20 phút.
- Đo gel polyacr>'lamit 8% theo công thức sau ;
Acrylamit 30% : 6 ml
Glyxerol 5% : 1 ml
APS 10% ÓO^il
TEMED : 6fil
- Đơi cho gel trùng hợp hoàn toàn trong ít nhất 1 giờ.
- Lăp bản gel vào bình điện di.
- Tra mẫu, chạy điện di ở điện áp 100 - 120 vol trong 2 giờ.
Báo cáo đề tài QT 08-31
Chưong III
KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân tích ADN ty thể của bệnh nhân HOÀNG LÊ BAO TR. (sổ lưu trữ
437560, xem phần phụ lục) nghi có đột biến dạng TIOOIOC.
Trong nhŨTig năm gua, các kêt quả nghiên cứu vê đột biên hệ gen ty thê
đã được công bô cho thây một vài các đột biên mtDNA đơn và các đa đột
biến đã có mối liên hệ với các đặc điểm bệnh lỵ và biểu hiên bên ngoài đặc
trưng. Mặc dù vậy, một vài bệnh nhân có các bang chứng về bất thường của
ty thê vân không có các chuân đoán phân tử. Trình tự gen của ty thê hiện là
một công cụ hữu hiệu đê có thê đưa ra các khăng định ở các bệnh không hoặc
chưa được chuân đoán chính xác.
Việc xác định và nghiên cứu các đột biến đã biết và các đột biến lạ là
rất quan trọng để tìm ra nguyên nhân gây bệnh có liên quan đến nucleotit. Đột
biên TIOOIOC được Bidooki et al (1997) miêu tả lân đâu tiên ở một bệnh
nhân nữ với các chứng bệnh nguy hiểm.Và được báo cáo lần tiếp theo do
Nishigaki et al, 2002.
Loại đột biến TIOOIOC trong cơ là dạng heteroplasmic, tuy nhiên

trong mô máu dạng này lại rât thâp, chỉ khoảng 5,4% (Crimi, M et aỉ, 2004).
Mầu bệnh phâm - máu ngoại vi của bệnh nhân bại não do viện Nhi
Trung ương cung cấp cho chúng tôi cũng có những hôi chứng lâm sàng đã
được các tac giả khác công bố có liên quan đến đột biến T10010C hệ gen ty
thể. Do đó, đê xác định xem hội chứng này cỏ liên quan đên đột biến
TIOOIOC hay không, chúng tôi tiên hành phân tích AND ty thê của đoạn gen
có chứa điêm
10010 băng các phương pháp nghiên cứu trong sinh học phân tử
có cải tiến cho phù hợp với điêu kiện PTN của chúng tôi.
a- Xác định đoạn ADN cần tách chiết từ vị trí 9763 đến vị trí 10120 trong
hệ gen ty thể
972 1 a t t t t a c c c t c c t a c a a g c c t c a g a g t a c t t c g a g t c t c c c t t C a c c a t t tc c g a c g g c a
9 7 81 t c t a c g g c t c a a c a t t t t t t g ta g c c a c a g g c t t c c a c g g a c t t c a c g t c a t t a t t g g c t
9841 c a a c t t t c c t c a c t a t c t g c tt c a t c c g c c a a c t a a t a t t t c a c t t t a c a t c c a a a c a t c
9901 a c t t t g g c t t c g a a g c c g c c g c c t g a t a c t g g c a t t t t g t a g a t g t g g t t t g a c t a t t t c
996 1 t g t a t g t c t c c a t c t a t t g a t g a g g g t c t t a c t c t t t t a g t a t a a a t a g T a c c g t t a a c t
1 0 0 2 1 t c c a a t t a a c t a g t t t t g a c a a c a t t c a a a a a a g a g t a a t a a a c t tc g c c t t a a t t t t a a
l O O B l t a a t c a a c a c c c t c c t a g c c t t a c t a c t a a t a a t t a t t a C a t t t t g a c t a c c a c a a c t c a
T/l
Báo cáo đề tài QT 08-31
b- Kết quả phân tích
ỉ)Tách chỉêt đoạn ADN quan tâm
DNA của 2 mẫu máu bệnh nhân và mẹ bệnh nhân được tách theo kit
của Qiagen, chế phẩm DNA đươc định lượng bàng cách đo độ hấp thụ ơ bươc
sóng 260 nm (A260) và đo tỷ sô A26Ũ/A280 • Kêt quả cho ihây tỷ sô A260'^A280
của 2 mâu DNA (MI và M2) tương ứng là 1,78 và 1,74. Chê phâm ADN còn
được kiêm tra độ sạch và nguyên vẹn băng điện di trên gel agarose 1 % , kêt
quả thu được (hình ]) cho thây cả hai mâu đêu chỉ có cùng một băng, chứng
tỏ chúng tôi đã thu được DNA và chê phâm có độ sạch cao.
Hình 1: Điên di gel agarose 1% sản phẩm

tách DNA từ máu
MI; Máu của mẹ bệnh nhân
M2: Máu của bệnh nhàn
2) Nhăn bản đoạn gen của ty thế bằng PCR
Đoạn ^en ty thê mà chúng tôi quan tâm năm ở vùng 9763-10120, được
nhân bản băng PCR với chu kỳ nhiệt như sau.
Kiiởi động nóng ở 94‘’C; 5 phúl
94°c : 1 phut
56‘^C : 30 giây .35 chu kỳ
72"c : 40 giây
72T ; 10 phút
4"C :oo
Kết quả điện di sản phẩm PCR thu được (hình 2) cho thấy khi sử dụng
DNA của bệnh nhân làm khuôn cho phản ứn§, chúng tôi đã thu được băng
nhân bản với kích thước như tính toán lý thuyêt. Chứng tỏ với các điêu kiện
và thành phần phản ứng được lựa chọn chúng tôi đã nhân bản thành công
đoạn gen quan tâm của ty thê.
Hỉnh 2: Điện di trên agarose sản phẩm PCR nhân bàn đoạn
gen của ty thể
H2O: ĐC(-)
MI : PCR của MI
M2 : PCR của M2.
Thang chuẩn DNA 100 bp
H?0 MI (-12 M
Để khẳng định sản phẩm PCR thu được đúng là đoạn gen đang quan
tâm, chúng tôi sử dụng enzim giới hạn Spe I cắt sản phẩm này thành hai đoạn.
Enzim Spe 1 chi căt nhóm tô hợp A/CTAGT. Trong đoạn gen nghi có đột biên
TIOOIOC theo ỉụa chọn cua chúng tôi, chỉ có một điêm ACTAGT tại vị trí
10029 đến vị trí 10034. Theo tính toán lý thuỵêt của chúng tôi, Spe 1 cắt đoạn
DNA quan tằm thành 2 đoạn có kích thước lần lượt là 266 bp và 91 bp. Kết