SỞ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH


Báo cáo nghiệm thu đề tài:
XÂY DỰNG VÀ ỨNG DỤNG
KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ ĐỂ XÁC ĐỊNH
KIỂU GENE VIRÚT VIÊM GAN SIÊU VI C




Chủ nhiệm đề tài: TS. BS. Phạm Hùng Vân
PGS. TS. Nguyễn Thanh Bảo
Cộng tác viên: CN. Võ Đức Xuyên An
CN. Trần Quốc Việt
BS. Hoàng Hiếu Ngọc
ThS. Lê Thuý Quyên


( Bảng báo cáo đã được chỉnh sửa theo ý kiến của hội đồng nghiệm thu
Ngày 11 tháng 08 năm 2008 )

TP. HCM 04/2008

1
TÓM TẮT ĐỀ TÀI
Tên đề tài:
XÂY DỰNG VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH
TỰ ĐỂ XÁC ĐỊNH KIỂU GENE VIRÚT VIÊM GAN
SIÊU VI C
Chủ nhiệm đề tài:

TS. BS. PHẠM HÙNG VÂN
PGS. TS. NGUYỄN THANH BẢO
Cơ quan chủ trì:
ĐẠI HỌC Y DƯC TP. HỒ CHÍ MINH
Cơ quản quản lý:
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ MÔI TRƯỜNG
Thời gian thực hiện:
07/2006 – 07/2007
Tổng kinh phí được duyệt:
190.000.000 VNĐ
Kinh phí đã cấp:

Lần 1:
120.000.000 VNĐ
Lần 2:

MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
1. Xây dựng kỹ thuật RT-PCR để khuếch đại được đoạn gen nằm trên vùng không
mã hoá 5’ NC mà trình tự của chúng có liên quan mật thiết đến kiểu gen của HCV
2. Xây dựng được kỹ thuật giải trình tự để giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR
khuếch đại từ đoạn gen trên
3. Xây dựng được phương pháp so sánh với ngân hàng gen HCV để từ đó xác đònh
kiểu gen của HCV (qua blast search trên internet hay trên ngân hàng dữ liệu thu
thập được)
4. Phân tích tần số kiểu gen HCV trên các bệnh nhân nhiễm HCV đã và đang được
điều trò đặc hiệu


2
NỘI DUNG ĐỀ TÀI

¤ Nội dung 1: Xây dựng kỹ thuật RT-PCR phát hiện HCV dựa trên vùng 5’-NC
có những trình tự đặc hiệu cho kiểu gene tương tự như trình tự mà Trugene và
LIPA đã nghiên cứu.
¤ Nội dung 2: Xây dưng kỹ thuật giải trình tự sản phẩm PCR của nội dung 1 trên
máy giải trình tự CEQ 8000 hiện nay đang được trang bò tại công ty Nam Khoa
¤ Nội dung 3: Xây dựng thư viện các trình tự của các kiểu gene HCV từ gene
bank
¤ Nội dung 4: Đònh kiểu gene các trình tự đã giải bằng các xác đònh phần trăm
tương đồng với các trình tự của các kiểu gene lưu trong thư viện. So sánh kết
quả đònh kiểu gene bằng thư viện đã xây dựng với kết quả đònh kiểu gene khi
blast search trên thư viện HCV kiểu gene của NCBI
¤ Nội dung 5: So sánh kết quả ghi nhận được với với kết quả đònh kiểu gene
HCV bằng kỹ thuật HCV-LIPA và/hay kỹ thuật giải trình tự TRUGENE của
Bayer.
¤ Nội dung 6: Workshop hay seminar để phổ biến kết quả nghiên cứu và khi có
yêu cầu, đưa vào áp dụng một phần tại các phòng thí nghiệm có máy PCR và
áp dụng toàn diện tại các phòng thí nghiệm có máy PCR và máy sequencer

TIẾN ĐỘ DỰ KIẾN THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
Nội dung 1
Nội dung: Xây dựng kỹ thuật RT-PCR phát hiện HCV dựa trên vùng 5’-NC có những trình
tự đặc hiệu cho kiểu gene tương tự như trình tự mà Trugene và LIPA đã nghiên
cứu.
Sản phẩm: Là kit RT-PCR phát hiện HCV dựa trên vùng 5’NC dùng cho giải trình tự HCV.
Thực hiện tại phòng nghiên cứu và phát triển công ty Nam Khoa phối hợp với
Bộ Môn Vi Sinh, Khoa Y, ĐHYD TP. HCM
Thời gian: Giai đoạn này dự kiến thực hiện trong 1 tháng (tháng 7/2006 đến 8/2006)
Nội dung 2
Nội dung: Xây dưng kỹ thuật giải trình tự sản phẩm PCR của nội dung 1 trên máy giải
trình tự CEQ 8000 hiện nay đang được trang bò tại công ty Nam Khoa

Sản phẩm: Là mồi đặc hiệu cho phản ứng giải trình tự và qui trình giải trình tự. Thực hiện
tại phòng nghiên cứu và phát triển công ty Nam Khoa, nơi có máy giải trình tự
CEQ 8000
Thời gian: Giai đoạn này thực hiện trong 1 tháng (tháng 8/2006 đến 9/2006)

3
Nội dung 3

Nội dung: Xây dựng thư viện các trình tự của các kiểu gene HCV từ gene bank
Sản phẩm: là thư viện cơ bản và sau đó là hoàn chỉnh HCV kiểu gene. Thực hiện tại
phòng nghiên cứu và phát triển công ty Nam Khoa và Bộ Môn Vi Sinh Khoa Y,
Đại Học Y Dược TP. HCM.
Thời gian: Giai đoạn này thực hiện trong 2 tuần để có dữ liệu cơ bản, sau đó liên tục nhập
dữ liệu mới trong suốt thời gian nghiên cứu (2 tuần cuối tháng 10/2006)
Nội dung 4
Nội dung: Đònh kiểu gene các trình tự đã giải bằng cách xác đònh phần trăm tương đồng
với các trình tự của các kiểu gene lưu trong thư viện. So sánh kết quả đònh kiểu
gene bằng thư viện đã xây dựng với kết quả đònh kiểu gene khi blast search
trên thư viện HCV kiểu gene của NCBI
Sản phẩm: Sản phẩm chính là dữ liệu hoàn chỉnh cho thư viện kiểu gene HCV. Thực hiện
tại phòng nghiên cứu và phát triển công ty Nam Khoa và Bộ Môn Vi Sinh Khoa
Y, Đại Học Y Dược TP. HCM.
Thời gian: Giai đoạn này thực hiện liên tực trong ít nhất 10 tháng (từ tháng 11/2006 tháng
8/2007) với ít nhất 200 mẫu
Nội dung 5
Nội dung: So sánh kết quả ghi nhận được với với kết quả đònh kiểu gene HCV bằng kỹ
thuật HCV-LIPA và/hay kỹ thuật giải trình tự TRUGENE của Bayer.
Sản phẩm: Sản phẩm chính là qui trình hoàn chỉnh đònh kiểu gene HCV băng kỹ thuật giải
trình tự. Thực hiện tại phòng nghiên cứu và phát triển công ty Nam Khoa
Thời gian: Giai đoạn này được thực hiện rải rác trong suốt thời gian nghiên cứu

Nội dung 6
Nội dung: Workshop hay seminar để phổ biến kết quả nghiên cứu và khi có yêu cầu, đưa
vào áp dụng một phần tại các phòng thí nghiệm có máy PCR và áp dụng toàn
diện tại các phòng thí nghiệm có máy PCR và máy sequencer
Sản phẩm: Sản phẩm chính là phổ biến và chuyển giao. Thực hiện tại sở Khoa Hoc công
Nghệ TP. HCM
Thời gian: Nội dung này dự kiến thực hiện vào tháng 6 năm 2007 trước khi kết thúc đề tài

4
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
Xây dựng và áp dụng kỹ thuật giải trình tự
để xác đònh kiểu gene virút viêm gan C
Đặt vấn đề
Xác đònh kiểu gene virút viêm gan C (HCV) là một chỉ đònh rất cần thiết trước khi bác só
điều trò tiến hành cho chỉ đònh điều trò đặc hiệu viêm gan C vì thời gian điều trò kéo dài bao
lâu là tuỳ thuộc vào type virút viêm gan C mà bệnh nhân đang nhiễm
[1]
.
Hiện nay, trên thế giới có 2 phương pháp xác đònh kiểu gene viêm gan C dựa vào phân
tích một vùng đặc trưng trên vùng 5’NC của bộ gen HCV đã được nhiều nhà nghiên cứu cũng
như lâm sàng chấp nhận và được thực hiện tại các phòng thí nghiệm lâm sàng, đó là phương
pháp lai trên vạch dò đặc hiệu kiểu gene C (HCV-InoLIPA)
[2]
và phương pháp giải trình tự
trên máy Trugene
[3]
. Tuy nhiên vì hai phương pháp này phải dựa trên các hệ thống thiết bò và
thuốc thử phụ thuộc hoàn toàn vào các nhà sản xuất (chúng ta thường gọi là hệ thống kín)
nên có giá thành khó có thể được chỉ đònh sử dụng rộng rãi dù tại Việt Nam tỷ lệ lưu hành
HCV là khá cao trên thế giới (5-8% người bình thường có nhiễm HCV)

[4,5]
và dó nhiên đi kèm
theo đó là số lượng bệnh nhân bò viêm gan mạn tính cần phải được điều trò và theo dõi điều
trò khá cao do nhiễm HCV có thể dẫn đến một tỷ lệ khá cao bò xơ gan và ung thư gan (4%)
[6]
.
Để có thể giúp các nhà lâm sàng có thể cho chỉ đònh xác đònh kiểu gene HCV dễ dàng hơn,
việc tìm kiếm một kỹ thuật xác đònh kiểu gene HCV mà không phải sử dụng kỹ thuật giải
trình tự của Trugene và kỹ thuật InoLIPA với giá thành thấp hơn mà vẫn đạt độ chính xác và
nhạy cảm cao là một việc làm rất cần thiết và đây cũng mục tiêu chính của đề tài nghiên cứu
này của chúng tôi.
Tổng quan
Virút viêm gan C (HCV) là một loại virút RNA
sợi đơn, dương, có kích thước 50nm (hình 1), thuộc
gia đình Flaviviridae, giống Hepacivirút. Về cấu
trúc, virút có dạng hình cầu, có vỏ bọc là lipid chèn
trên đó hai loại glycoprotein là E1 và E2
[7]
(hình 2).
Bộ gene của virút là một RNA sợi đơn dài khoảng
9600bp
[8]
. Hai đầu 5’ và 3’ của sơi đơn RNA của
virút không mã hoá thông tin di truyền và được gọi
là vùng UTR (un-translated region) hay NC (non
coding). Giữa hai đầu không mang thông tin di
truyền này là vùng mang các gene mã hoá các
protein cấu trúc C cho proteine tạo nucleocapsid
của cirút, E1 và E2 cho glycoproteine của vỏ bọc;
và các protein không cấu trúc NS1 và NS2 cho các

proteine xuyên màng, NS3 cho các protease và
Hình 1: Hình chụp qua KHV điện t
virút viêm gan C
ử

5
RNA helicase, NS4A và NS4B cho các protein đồng yếu tố, NS5A cho các protein kháng
interferon, và NS5B cho RNA polymerase (hình 3).
Hình 3: Cấu trúc bộ gene của virút viêm gan C
Hình 2: Hình vẽ mô tả cấu trúc của
HCV
Virút viêm gan C xâm nhập vào cơ
thể người bệnh qua đường máu, tình dục.
Sau khi xâm nhập và cơ thể, HCV sẽ
bám vào các thụ thể CD81 và SR-BI
(scavenger receptor class B1) trên tế bào
để xâm nhập vào tế bào gan (hình 4).
Sau khi xâm nhập, virút sẽ bắt đầu quá
trình nhân bản bằng cách trước tiên sẽ
dòch mã từ bộ gene của nó để tổng hợp
một protein đầu tiên 3011AA, rồi
proteine sẽ được các protease của tế bào
chủ và của virút phân cắt thành 3 loại
proteine cấu trúc (C và E) và 7 loại
proteine không cấu trúc (NS). Sau đó
virút hoàn chỉnh sẽ được thành lập từ các thành phần đã được tổng hợp và quá trình hoàn
chỉnh virút được xãy ra trong lưới nội sinh chất và bộ golgi của tế bào để cuối cùng các virút
hoàn chỉnh được liên tục phóng thích khỏi tế bào nhiễm virút để tiếp túc xâm nhập và các tế
bào gan mới
[9]

. Virút một khi đã xâm nhập vào cơ thể thì sẽ có khả năng nhân bản khá cao,
có thể đến 3 tỷ được nhân bản trong mỗi ngày.
Hình 4: Hình mô tả quá trình xâm nhập và
nhân bản tron
g
tế bào
g
an
Dựa trên sự khác biệt về di truyền, virút viêm gan C được phân biệt thành 6 kiểu gene với
nhiều subtype cho mỗi kiểu gene
[10]
. Ngoài ra, đối với từng subtype HCV lại có thể được
phân thành các quasi-species do sự đa dạng về di truyền của trình tự gene của virút do sự
nhân bản của virút không có cơ chế sửa sai (proof reading) trên men RNA polymerase của
virút. Chính điều này đã giúp virút trốn thoát được các cơ chể miễn dòch loại trừ của cơ thể.

6
Nhiễm virút viêm gan C là một
vấn đề rất cần được quan tâm hiện
nay, đặc biệt tại Việt Nam. Theo
ghi nhận về tình hình nhiễm viêm
gan C thì tỷ lệ người bình thường ở
Việt Nam nhiễm virút viêm gan C
là khoảng 5-10%
[11]
, xem như là
thuộc nhóm các quốc gia có tỷ lệ
nhiễm virút viêm gan C cao thứ
nhì trên thế giới. Khác với nhiễm
viêm gan B với đa số các trường

hợp người nhiễm tạo được kháng
thể bảo vệ loại trừ được virút hay
là một số ít hơn trở thành người
lành mang trùng; có đến 85%
người nhiễm viêm gan virút C bò
diễn tiến đến viêm gan mạn tính
rồi đến xơ gan với 20% trong số đó có nguy cơ diễn tiến đến ung thư gan
[12]
. Do vậy mà dù tỷ
lệ người nhiễm viêm gan C tại Việt Nam thấp hơn nhiễm viêm gan B nhưng tình trạng bệnh
tật do nhiễm virút viêm gan C mang lại là khá cao, không thua mà thậm chí còn hơn viêm
gan B. Nguy hiểm như vậy nhưng bệnh viêm gan C mạn tính lại là một bệnh mà dưới ánh
sáng của y học hiện đại lại là một bệnh có thể chữa khỏi được hoàn toàn với xác suất thành
công có thể đến 60%. Tuy nhiên, để có thể cho được chỉ đònh điều trò đặc hiệu viêm gan C
mạn tính, theo hội nghò đồng thuận của các nhà chuyên môn vào năm 2002 (biểu đồ 1), bác só
cần phải xác đònh là bệnh nhân đang mang virút viêm gan C trong máu bằng xét nghiệm
đònh tính HCV-RNA
[1,13]
vì xét nghiệm anti-HCV chỉ là xét nghiệm sàng lọc trong cho và
truyền máu chứ không phải là xét nghiệm trong chẩn đoán lâm sàng, hơn nữa một người có
kếtquả anti-HCV [+] vẫn có thể không mang virút viêm gan C mà chỉ là kết quả của tình
trạng nhiễm mầm bệnh trước đó và nay đã khỏi. Sau khi xác đònh được người bệnh dương
tính HCV-RNA, trước khi cho chỉ đònh điều trò bác só cần phải làm thêm hai xét nghiệm nữa
là đònh lượng HCV-RNA
[1,13]
và đònh genotype của virút
[1,13]
. Lý do là vì bác só cần phải đánh
giá hiệu quả điều trò mà mình đã cho trên bệnh nhân sau 3 tháng điều trò và phương pháp
đánh giá là đònh lượng lại HCV-RNA. Nếu kết quả đònh lượng cho thấy lượng virút giảm trên

100 lần (trên hay bằng 2 log) thì điều trò đã cho là hiệu quả và có thể tiếp tục. Nếu lượng
virút không giảm quá 2 log thì có thể phương pháp điều trò đã cho trên bệnh nhân là không
hiệu quả và cần phải cân nhắc để điều chỉnh (dùng loại interferon α khác có dược động và
dược lực tốt hơn, bắt buộc bệnh nhân phải tuân thủ hơn ). Để quyết đònh thời gian điều trò là
bao lâu thì bác só cần phải biết genotype của HCV trên bệnh nhân
[1,13]
, nếu là genotype 1 thì
cần phải duy trì thời gian điều trò là 48 tuần hay hơn, còn nếu thuộc genotype khác thì thời
gian điều trò có thể ngắn hơn là 24 tuần. Sau khi hoàn tất thời gian cần phải điều trò trên bệnh
nhân, trước khi quyết đònh ngưng điều trò, bác só cần phải xác đònh xem bệnh nhân đã sạch
HCV-RNA chưa bằng xét nghiệm đònh tính HCV-RNA và chỉ ngưng điều trò khi HCV-RNA
hoàn toàn âm tính. Sau khi đã ngưng điều trò, vì bệnh nhân đã sạch virút, bác só vẫn phải
khuyến cáo bệnh nhân làm xét nghiệm đònh đính HCV-RNA mỗi 3 tháng một lần để theo dõi
xem bệnh nhân có bò tái phát không. Bất cứ lúc nào HCV-RNA dương tính lại thì đó là dấu
Biểu đồ 1: Biểu đồ hướng dẫn chỉ đònh và theo dõi
hiệu quả điều trò đặc hiệu bệnh nhân viêm
g
an virút C mạn tính

7
hiệu tái phát và khi ấy có thể bác só phải xem xét điều trò lại cho bệnh nhân và cũng phải
theo thực hiện lại qui trình xét nghiệm như trên.
Như vậy, chúng ta thấy rằng hai xét nghiệm đònh lượng và đònh kiểu gene HCV là hai xét
nghiệm rất cần thiết phải được bác só chỉ đònh trên bệnh nhân nhiễm HCV trước khi quyết
đònh điều trò đặc hiệu. Để đònh lượng HCV-RNA, hiện nay có rất nhiều kit xét nghiệm đã
được thương mại hoá dựa trên kỹ thuật PCR (Roche Amplicor)
[14]
, hay real-time PCR (Cobas
taqman của Roche)
[15]

, bDNA (của Bayer)
[16]
. Đối với kỹ thuật real-time PCR, nhờ là hệ
thống mở nên đã có nhiều nhà khoa học trong nước (Đại Học Y Dược, Công ty Nam Khoa,
Đại Học Khoa Học Tự Nhiên ) phát triển được kỹ thuật này áp dụng trong phát hiện và đònh
lượng HCV-RNA, và chính nhờ vậy mà xét nghiệm đònh lượng HCV-RNA hiện đang được
triển khai sử dụng rộng rãi tại nhiều phòng thí nghiệm trong nước có trang bò real-time PCR
(Meid, Hoàn Mỹ, Đại Học Y Dược, BV. Bạch Mai, Bệnh viện 108, Học viện quân y 103,
phòng thí nghiệm NK-Biotek ). Đối với xét nghiệm đònh kiểu gene HCV, hiện nay chỉ có
hai kit được thương mại hoá là kit InoLIPA dựa trên kỹ thuật lai trên vạch tẫm các mẫu dò
đặc hiệu
[2]
và kit Trugene dựa trên kỹ thuật giải trình tự một đoạn đặc hiệu trên vùng 5’NC
của bộ gene virút
[3]
. Ngoài ra cũng có những phương pháp tiếp cận khác được các nhà khoa
học thử nghiệm như phương pháp giải trình tự vùng NS5B
[17]
, phương pháp real-time PCR
[18]
,
hay phương pháp PCR với mồi đặc hiệu. Tuy nhiên các phương pháp này chỉ trong phạm vi
nghiên cứu và chỉ giới hạn trong giá trò học thuật chứ chưa được ứng dụng rộng rãi vì có
những hạn chế nhất đònh, đặc biệt là độ nhạy.
Tại Việt Nam hiện nay, cả hai phương pháp giải trình tự và InoLIPA đều đã được triển
khai thực hiện tại một số rất ít các phòng thí nghiệm để đáp ứng với yêu cầu xét nghiệm xác
đònh kiểu gene của HCV. Tuy nhiên do giá thành của các xét nghiệm này khá đắt nên các
bác só cũng rất hạn chế sử dụng. Nguyên do gía thành đắt là vì các xét nghiệm này phải được
thực hiện trên các bộ thử nghiệm thương mại khá đắt tiền. Do vậy phương án để có thể triển
khai xét nghiệm đònh kiểu gene HCV phục vụ cho nhu cầu lâm sàng hiện nay tại Việt Nam

là phải áp dụng một hệ thống mở, và giải trình tự vùng 5’-NC tương tự hệ thống Trugene
nhưng không thực hiện trên máy giải trình tự với chương trình và thuốc thử kín của Trugene
mà thực hiện trên hệ thống PCR mở và máy giải trình tự mở là một tiếp cận mà chúng ta
hoàn toàn có thể làm được.
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện với nhiều giai đoạn, chúng tôi xin trình bày lần lượt các vật
liệu và phương pháp ngiên cứu được dùng trong các giai đoạn này:
Giai đoạn 1
(1) Thiết kế cho được một cặp mồi đặc hiệu được một trình tự trên vùng 5’-NC của HCV
để từ đó xây dựng kỹ thuật RT-PCR cho được sản phẩm PCR tương thích với phản ứng giải
trình tự CLIP của qui trình giải trình tự xác đònh kiểu gene HCV của hệ thống Trugene
Để thực hiện được các nội dung của bước này, trước hết chúng tôi tham khảo một số trình
tự HCV đã được giải bởi Trugene, và đồng thời tải về một số trình tự vùng 5’-NC của các
kiểu gene HCV tham chiếu rồi dùng phần mềm ClustalX để so chuỗi các trình tự này với
nhau từ đó làm cơ sở để thiết kế một cặp mồi phù hợp có nhiệt độ bắt cặp đích tối ưu là 58oC
khuếch đại được đoạn sản phẩm PCR tương thích với mồi giải trình tự của phản ứng CLIP

8
thực hiện với kit của Trugene. Lý do chúng tôi muốn mồi có nhiệt độ bắt cặp đích là 58oC là
để sau này dễ dàng cho việc xây dựng qui trình real-time PCR dùng taqman probe. Từ cặp
mồi thiết kế được này, chúng tôi nghiên cứu xây dựng kỹ thuật RT-PCR phát hiện HCV dựa
trên vùng 5’-NC có những trình tự đặc hiệu cho kiểu gene tương tự như trình tự mà Trugene
đã nghiên cứu. Kỹ thuật RT-PCR này bao gồm các bước sau: (1) Tách chiết RNA toàn bộ từ
các mẫu thử là huyết thanh hay huyết tương người bệnh bò nhiễm HCV. Phương pháp tách
chiết là sử dụng bộ thuốc thử tách chiết RNA tên là RNAPREP do công ty Nam Khoa sản
xuất. Bộ thuốc thử này hoạt động dựa trên nguyên tắc dùng guanidine 14M và urea, phối hợp
với phenol và các chất tẩy khác để làm các chất gây biến tính các protein, kết quả là các
protein bò vón lại, DNA tan trong phenol, còn RNA thì nằm lại trong phase nước và sẽ được
tách ra khỏi phase phenol nhờ thêm vào chloroform và quay ly tâm lắng tách. RNA trong
phase nước sau đó sẽ được kết tủa nhờ isopropanol với sự hổ trợ của tRNA và glycogen. (2)

Thực hiện phiên mã ngược để tổng hợp toàn bộ các RNA tách chiết được thành cDNA.
Phương pháp RT là sử dụng bộ thuốc thử tổng hợp cDNA do công ty Nam Khoa sản xuất. Bộ
thuốc thử này hoạt động theo nguyên tắc sử dụng mồi ngẫu nhiên 6 nucleotides (Random
hexaner primers) mà không cần dùng mồi đặc hiệu để tổng hợp toàn bộ RNA từ mẫu thử
thành cDNA từ RNA nhờ men Reverse Transcriptase, sau đó cắt bỏ RNA bò bắt cặp vào
cDNA sau khi phiên mã ngược thành cDNA bằng men RNAse H. (3) Thực hiện phản ứng
PCR với cặp mồiđã thiết kế. Phương pháp là cho 5ul cDNA vào HCV-PCR mix được pha
trong PCR master mix 1.5mM Mg
++
có dUTP và UNG do công ty Nam Khoa sản xuất bổ
sung thêm hai mồi trên với hàm lượng 50pm/thể tích phản ứng 50ul. Sau đó chạy chương
trình PCR như sau: 40
o
C/10’, 95
o
C/5’, 40 chu kỳ 94
o
C/15”-60
o
C/30”-72
o
C/1’, và cuối cùng là
72
o
C/7’. Kết quả sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di trên thạch 2%. Để đánh giá qui
trình này có khuếch đại trình tự vùng 5’NC của HCV-RNA như thiết kế mồi hay không,
chúng tôi sẽ thử qui trình trên một mẫu huyết thanh HCV-RNA dương tính đã được xác đònh
và lưu trữ ở điều kiện -70oC có trong phòng thí nghiệm của chúng tôi. Nếu kết qủa có sản
phẩm khuếch đại đúng như thiết kế thì qui trình này có thể được xem là thành công trong
khuếch đại trình tự ở vùng 5’-NC như thiết kế mồi. Để đánh giá qui trình này có cho được

sản phẩm PCR tương thích với phản ứng giải trình tự CLIP của qui trình giải trình tự xác đònh
kiểu gene HCV của hệ thống Trugene hay không, chúng tôi sẽ thử sản phẩm PCR của qui
trình này có thể đưa vào thực hiện phản ứng giải trình tự CLIP của hệ thống Trugene hay
không? Nếu được thì chứng tỏ qui trình được thiết lập không chỉ tương thích với phản ứng
CLIP của Trugene mà còn có thể dùng để tạo ra sản phẩm PCR để từ đó có thể xác đònh
được kiểu gene của HCV nhờ giải trình tự trực tiếp sản phẩm này và so sánh trình tự giải
được với thư viện trình tự các kiểu gene HCV có sẵn. Qui trình RT-PCR sau khi nghiên cứu
thành công sẽ được cung cấp cho phòng thí nghiệm DNA của Trung Tâm MEDIC sử dụng để
xác đònh kiểu gene HCV trên hệ thống Trugene mà không cần phải sử dụng kit Amplicor của
Roche. Kết quả sử dụng qui trình trên hệ thống Trugene để xác đònh kiểu gene HCV từ
Trung Tâm Medic sẽ được ghi nhận.
(2) Sau khi nghiên cứu thành công qui trình RT-PCR trên, chúng tôi sẽ nghiên cứu tiếp
xem thử qui trình này có thể áp dụng cho kit InoLIPA đònh kiểu gene HCV
Để có thể thực hiện được nghiên cứu này, chúng tôi sẽ gắn biotin vào mồi ngược (R) để
tạo được sản phẩm PCR đánh dấu biotin rồi tiến hành lai sản phẩm này với các vạch dò đặc
hiệu gắn trên que inoLIPA. Chúng tôi sẽ thử trên một số mẫu huyết thanh bệnh nhân [+]
HCV-RNA đã được lưu trử ở -70oC tại phòng thí nghiệm. Kết quả lai trên các vạch dò của

9
InoLIPA xác đònh kiểu gene HCV sẽ được ghi nhận. Nếu kết quả cho được các kiểu vạch lai
dương tính giúp xác đònh được kiểu gene mà không có kiểu vạch lai nào không xác đònh được
kiểu gene HCV thì chứng tỏ qui trình nghiên cứu thành công được khi áp dụng trên kit
InoLIPA xác đònh kiểu gene HCV.
(3) Từ qui trình RT-PCR đã nghiên cứu được, nghiên cứu xây dựng qui trình RT real-time
PCR dùng taqman probe
Mục tiêu của nghiên cứu này là sử dụng đúng mồi đã thiết kế và sẽ thiết kế một taqman
probe (HCV-probe) để nhờ đó biến RT-PCR đònh tính thành RT real-time PCR đònh lượng
HCV-RNA. Probe sẽ được thiết kế có đầu 5’ gắn FAM và đầu 3’ gắn TAMRA bắt cặp rất
gần mồi xuôi và cách đầu 3’ của mồi xuôi không quá 10bases. Probe này sẽ có chiều dài
không quá 28bp và có nhiệt độ bắt cặp tối hảo ở 60oC. Cách thiết kế taqman probe này cũng

là so chuỗi các trình tự của các kiểu gene tham chiếu để tìm trình tự bảo tồn đáp ứng được
các tiêu chí đề ra ở trên. Ngoài ra, bằng một qui trình đặc biệt, chúng tôi cũng sẽ thiết kế và
tạo dòng trong plasmid pGEMT-easy một chứng nội tại dùng chung mồi (IC-HCV) nhưng cho
sản phẩm khuếch đại có chiều dài 40-50bps khác biệt với sản phẩm PCR đích và đã có sẵn
taqman probe đặc hiệu chứng nội tại này (IC-probe) khác biệt hoàn toàn với taqman probe
đích. Ngoài ra chúng tôi cũng sẽ tạo chứng nội tại là RNA (IC-HCVRNA) bằng cách phiên
mã từ IC-HCV nhằm mục đích cho chứng nội tại RNA này vào với mẫu chứng [-] là huyết
thanh được xác đònh [-] HCV-RNA để được tách chiết RNA, tổng hợp cDNA và khuếch đại
real-time cùng với các mẫu huyết thanh thử nghiệm nhờ vậy chứng minh được toàn bộ qui
trình không có bò ngoại nhiễm nếu trong chứng [-] này chỉ có tín hiệu khuếch đại của chứng
nội tại, và đồng thời kiểm soát được độ nhạy các quá trình tách chiết-tổng hợp cDNA và
khuếch đại real-time. Taqman probe cho chứng nội tại này đã có sẵn với đầu 5’ gắn màu
huỳnh quang HEX và đầu 3’ gắn BHQ1 với các tiêu chí thích hợp cho taqman probe đã nói ở
trên. Qui trình thực hiện RT-realtime PCR do chúng tôi xây dựng này cũng sẽ bao gồm các
bước tách chiết RNA, tổng hợp cDNA như qui trình RT-PCR đã trình bày ở trên. Nhưng khi
thực hiện real-time PCR thì sau khi cho 5ul cDNA vào HCV-realtime PCR mix (được pha như
HCV-PCR mix ở trên, nhưng bổ sung thêm HCV-probe với hàm lượng 3pm và IC-probe với
hàm lượng 2pm và thêm Mg++ để đạt 6mM), cho thêm 5ul chứng nôi tại (IC-HCV được pha
loãng đến nồng độ LOD). Sau đó chạy chương trình realtime PCR như sau: 40oC/10’,
95oC/5’, 40 chu kỳ 94oC/15”-60oC/30” trong đó lấy tín hiệu realtime ở giai đoạn 60oC với
hai kênh màu FAM và HEX. Trong kỹ thuật này, chúng tôi cũng đã xây dựng được chuẩn là
sản phẩm PCR đích được dòng hoá vào plasmid và được đònh lượng số copies sau khi đã tách
chiết.
Để đánh giá qui trình real-time có thành công như mong muốn hay không, chúng tôi sẽ thử
nghiệm trên một số mẫu huyết thanh [+] HCV-RNA và [-] HCV-RNA được lưu trữ ở -70oC
có trong phòng thí nghiệm. Tiêu chí xác đònh qui trình thành công là đường chuẩn xây dựng
với 5 nồng độ chuẩn đạt R>0.990 và E nằm trong khoảng 90-105%. Ngoài ra mẫu [+] phải
cho biểu diễn khuếch đại với kênh màu FAM, còn mẫu [-] không có biểu diễn khuếch đại
với kênh màu FAM nhưng phải cho biểu diễn khuếch đại với kênh màu HEX.
Giai đoạn 2

Xây dựng kỹ thuật giải trình tự sản phẩm RT real-time PCR trên máy giải trình tự CEQ
8000 hiện nay đang được trang bò tại công ty Nam Khoa để xác đònh kiểu gene HCV

10
Mục tiêu của bước nghiên cứu này là kết hợp xét nghiệm đònh lượng HCV với xét nghiệm
đònh kiểu gene HCV vì đây là hai xét nghiệm mà bác só phải chỉ đònh trước khi quyết đònh
điều trò đặc hiệu trên bệnh nhân nhiễm HCV. Mấu chốt của bước nghiên cứu này là thiết kế
được mồi giải trình tự mà không dùng mồi PCR vì sản phẩm khuếch đại của qui trình RT
real-time PCR có thể chứa cả sản phẩm khuếch đại của chứng nội tại mà sản phẩm này lại
chung mồi PCR với sản phẩm đích. Để thiết kế mồi giải trình tự, chúng tôi cũng dùng phương
pháp so chuỗi nhưng lúc này chúng tôi chọn mồi giải trình tự gần với mồi ngược hay có thể
có một phần nhưng không hoàn toàn trùng lắp với mồi ngược, cho nhiệt độ bắt cặp tối ưu là
50oC tương thích nhiệt độ bắt cặp của phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình tự DTCS (Dye
Terminator Cycle Sequencing) của Becman Coulter. Qui trình giải trình tự và xác đònh kiểu
gene HCV sẽ được thực hiện gồm các bước sau:
(1) Tinh sạch sản phẩm PCR: Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ thuốc thử Wizard SV
Gel and PCR Clean-Up System của Promega. Kit này hoạt động trên nguyên tắc sử dụng
màng lọc Silica để tóm bắt DNA trong dung dòch có chất chaotropic. Sau khi tinh sạch, sản
phẩm PCR được kiểm tra độ tinh sạch bằng đònh lượng DNA trên máy GenQuant của
promega đồng thời được điện di trên thạch 2%.
(2) Thực hiện phản ứng chu kỳ nhiệt: Thực hiện phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình tự với
thuốc thử DTCS của Becman Coulter. Chuẩn bò phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình tự trong một
tube PCR 0.2 với các thành phần như bảng 1 sau đây:
Thành phần Thể tích
Nước khử ion 0 – 9.5µl
DNA cần giải trình tự đã tinh sạch* 0.5 – 10.0µl
Mồi giải trình tự** 2.0µl
DTCS Quick Start Master Mix*** 8µl
Tổng cộng 20µl
*Thể tích DNA tinh sạch được cho vào là tuỳ thuộc vào nồng độ DNA. Thể tích được lấy thế nào để lượng DNA cho vào phản ứng giải trình

tự là 50-100fm cho dsDNA và 25-50fm cho ssDNA. Kinh nghiệm của chúng tôi cho thấy là nếu kết quả diện di sau tinh sạch cho hình ảnh
vạch điện di đậm dày và rõ nét thì thể tích DNA cho vào là 1µl, nếu vạch điện di đậm mãnh và rõ nét thì thể tích DNA cho vào là 2 hay
3µl, nếu vạch điện di nhạt hơn thì có thể phải đến 5µl (nhưng không bao giờ quá 5µl). **Lượng primer cho vào so với lượng DNA là phải
gấp trên 40 lần (tỷ lệ primer/DNA phải ≥40:1). Thường chúng tôi pha primer đạt 5pm/µl và thể tích primer cho vào là 1µl. ***Lượng DTCS
master mix cho vào theo kinh nghiệm của chúng tôi là 3µl nếu giải trình tự sản phẩm PCR có chiều dài khoảng 400-500bp. Nếu chiều dài
khoảng 200bp thì chỉ cần 2µl DTCS. Nếu là plasmid thi chi cần 4µl DTCS.
Vì thể tích cho vào khá nhỏ, do vậy nên đặt thể tích dung dòch trong đầu pipette lên thành
tube để chắn chắn dung dòch được cho vào tube. Sau khi cho đủ các thành phần vào tube,
quay ly tâm 13000rpm thời gian vài giây để lắng toàn bộ xuống đáy tube, búng nhẹ đáy tube
để trộn đều. Cho tube vào lại máy ly tâm rồi ly tâm 13000rpm một lần nữa trong thời gian
vài giây. Đặt tube phản ứng vào máy PCR rồi chạy chương trình giải trình tự 30 chu kỳ gồm
ba bước nhiệt độ: 96
o
C/20 giây, 50
o
C/20 giây, 60
o
C/04 phút; sau đó giữ 4
o
C. Đây là chương
trình luân nhiệt được nhà sản xuất nghiên cứu tối ưu cho DTCS, do vậy chúng ta không nên
thay đổi.
(3) Tủa sản phẩm của chu kỳ nhiệt giải trình tự: Sản phẩm của chu kỳ nhiệt giải trình tự
được tủa bằng ethanol để loại sạch các ddNTP gắn màu huỳnh quang còn thừa lại trong phản
ứng. Thực hiện như sau: Đối với mỗi mẫu, đánh dấu một tube Eppendorf tinh sạch. Chuẩn bò
dung dòch dừng phản ứng (stop solution) có glycogen như sau: 2µl Sodium Acetate 3M
(pH5.2), 2µl Na
2
-EDTA (pH8), 1µl glycogen (20mg/ml). Cho toàn bộ sản phẩm chu kỳ nhiệt
giải trình tự vào tube Eppendorf có pha dung dòch dừng phản ứng có glycogen như trên. Trộn


11
đều bằng cách pipette lên/xuống vài lần. Cho vào tube 60µl ethanol 95% lạnh (lấy từ tủ đông
-20
o
C) và trộn đều cũng bằng pipette lên/xuống. Ngay lập tức cho vào máy ly tâm
14000rpm/4
o
C trong 15 phút. Dùng pipette hút bỏ dòch nổi một cách cẩn thận không chạm
vào kết tủa thường thấy được ở đáy tube. Lưu ý là luôn cho ethanol lạnh ngay trước khi ly
tâm và ly tâm lập tức ngay sau khi trộn đều, thời gian thực hiện thao tác càng nhanh càng tốt,
và máy ly tâm lạnh phải được bật lean trước đó ít nhất 30 phút để rotor đạt được 4
o
C trước
khi sử dụng). Rửa cặn (không được trộn) 2 lần với ethanol 70% lạnh (lấy từ tủ đông -20
o
C).
Mỗi lần rửa, ly tâm lập tức 14000rpm/4
o
C trong chỉ 2 phút. Sau mỗi lần rửa dùng pipette hút
bỏ dòch nổi một cách cẩn thận không chạm vào kết tủa. Cho tube mở nắp vào bình làm khô,
hút chân không trong vòng 10 đến 15 phút để làm khô hoàn toàn cặn. Cho 40µl đã được làm
rã đông vào mỗi mẫu tủa đã làm khô. Trộn đều bằng pipette lean xuống nhiều lần. Tránh có
bọt.
(4) Chạy điện di giải trình tự: Cho 20µl mẫu đã pha trong SLS vào khay mẫu của máy điện
di mao quản Becman Counter 8000 (phần còn lại giữ để chạy điện di lần 2 nếu cần thiết).
Nhõ vào giếng một giọt dầu khoáng (mineral oil). Cho dung dòch đệm vào các giếng trong
khay chứa đệm. Lưu ý là mỗi lần chạy diện di, chúng ta phải chạy cùng lúc 8 mao quản
tương ứng với một cột của khay mẫu, do vậy với các giếng không có mẫu chúng ta vẫn phải
cho vào giếng 40µl SLS chứ không được để trống vì nếu để trống, mao quản tương ứng sẽ bò

hư do không hút được dòch SLS vào và sẽ tạo ra các khoảng trống trong mao quản sau này.
Tương tự như vậy trong khay chứa đệm. Chạy điện di theo chương trình thích hợp cho sản
phẩm PCR đoạn ngắn và với chế độ phân tích là giải trình tự.
(5) Đònh kiểu gene HCV trình tự giải được: Để có được một trình tự chuẩn nhất, trình tự giải
được từ máy sẽ được phân tích bằng cách chọn chế độ phân tích đoạn PCR kích thước
≤200bp và triming 2 đầu. Kết quả được xuất qua chế độ report để từ đó dễ dàng copy sang
đònh dạng MS. Trình tự được copy sẽ được blast search trên thư viện kiểu gene HCV của
NCBI. Kết quả blast search sẽ cho biết kiểu gene nào có trình tự tương đồng nhất và đó
chính là kết quả kiểu gene HCV của trình tự giải được.
Để đánh giá xem qui trình RT real-time PCR cho sản phẩm PCR có thể đưa vào giải trình
tự để đònh được kiểu gene HCV hay không, chúng tôi sẽ thực hiện qui trình này trên 10 mẫu
huyết thanh [+] HCV-RNA đã xác đònh được kiểu gene trên hệ thống Trugene và cho giải
trình tự trực tiếp tất cả sản phẩm PCR của 10 mẫu trên bằng qui trình giải trình tự với mồi
giải trình tự đã thiết kế. Sau khi có trình tự của 10 mẫu sản phẩm PCR, chúng tôi sẽ làm blast
search trên thư viện kiểu gene HCV để xác đònh kiểu gene HCV của các mẫu thử. Kết quả
được xem là đạt khi kiểu gene HCV thu nhận được từ blast search trùng khớp với kiểu gene
HCV đã xác đònh được nhờ hệ thống Trugene.
Giai đoạn 3
Xây dựng thư viện các trình tự của các kiểu gene HCV từ gene bank
Để thực hiện nội dung này, chúng tôi vào genebank để load trình tự của phần 5’NC của
HCV genome tham chiếu rồi đưa vào thư viện local blast của phần mềm Bioedit. Thư viện
nay sẽ liên tục được cập nhật với các trình tự mà chúng tôi giải được và đònh kiểu gene đươc.
Giai đoạn 4
Thử độ chính xác của việc sử dụng thư viện các kiểu gene HCV đã thành lập

12
Trong giai đoạn này, chúng tôi thực hiện thử nghiệm RT real-time PCR phát hiện và đònh
lượng HCV trên ít nhất 200 mẫu huyết thanh (được xét nghiệm thường qui với yêu cầu phát
hiện và đònh lượng HCV-RNA tại phòng thí nghiệm của mình và có kết quả xác đònh HCV-
RNA [+]) rồi giải trình tự trực tiếp sản phẩm khuếch đại để đònh kiểu gene các trình tự đã

giải bằng local blast search trên thư viện các kiểu gene đã thành lập, đồng thời blast search
trên thư viện HCV kiểu gene của NCBI. So sánh kết quả của hai phương pháp blast search
để xem có sự khác biệt không.
Giai đoạn 5
So sánh phương pháp xác đònh kiểu gene HCV bằng giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR
của RT real-time PCR với phương pháp đònh kiểu gene HCV bằng kỹ thuật HCV-LIPA
và/hay kỹ thuật giải trình tự TRUGENE của Bayer (nay là Siemen)
Cũng trên 200 mẫu thử được thử nghiệm trên giai đoạn 4, song song với xác đònh kiểu
gene bằng kỹ thuật giải trình tự mà chúng tôi đã xây dựng, thực hiện đònh kiểu gene bằng kỹ
thuật lai trên vạch của Siemen (InoLIPA) để xem có sự khác biệt về kết quả hay không. Qui
trình thực hiện lai chúng tôi theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất
Áp dụng phương pháp xác đònh kiểu gene HCV bằng giải trình tự trực tiếp sản phẩm RT
real-time PCR phát hiện và đònh lượng HCV trên một lượng lớn mẫu để tìm hiểu sự phân bố
các kiểu gene HCV trên các bệnh nhân Việt Nam nhiễm HCV được bác só chỉ đònh xét
nghiệm để được điều trò đặc hiệu.
Sau khi đã đạt các kết quả thành công trong các giai đoạn trên, chúng tôi sẽ áp dụng
phương pháp này thành thường qui tại phòng xét nghiệm NK-BIOTEK trên các mẫu huyết
thanh lấy từ bệnh nhân Việt Nam nhiễm HCV được Bác Só lâm sàng cho chỉ đònh xét nghiệm
để được điều trò đặc hiệu. Tổng kết các kết quả để biết tỷ lệ phân bố các kiểu gene HCV
trên các bệnh nhân này.

Kết quả nghiên cứu
Giai đoạn 1
(1) Đã thiết kế được một cặp mồi đặc hiệu được một trình tự trên vùng 5’-NC của HCV để
từ đó xây dựng kỹ thuật RT-PCR cho được sản phẩm PCR tương thích với phản ứng giải
trình tự CLIP của qui trình giải trình tự xác đònh kiểu gene HCV của hệ thống Trugene
Với các trình tự tham chiếu được sử dụng là 004102 (1a), M62321 (1a), D84262 (6b),
D37841 (6b), D00944 (2a), NC009823 (2a), EU155332 (1b), EU155375 (1b), DQ480522 (6a),
DQ480521 (6a), và D28917 (3a); Chúng tôi đã sử dụng chương trình ClustalX để so sánh
chuỗi tìm các trình tự bảo tồn (hình 5), đồng thời tham chiếu với một số trình tự vùng 5’NC

của một số kiểu gene HCV do hệ thống Trugene giải trình tự, cũng như nhờ sử dùng phần
mềm Primer Premier chúng tôi đã thiết kế được một cặp mồi được xem là phù hợp nhất để
khuếch đại được đoạn sản phẩm PCR tương thích với mồi giải trình tự của phản ứng CLIP
thực hiện với kit của Trugene. Cặp mồi này có nhiệt độ bắt cặp tối ưu của cặp mồi là 60
o
C,
cho sản phẩm khuếch đại #240bps, và có trình tự như sau:
Mồi xuôi HCV-59F 5’-TGT CTT CAC GCA GAA AGC GTC TAG C-3’
Mồi ngược HCV-302R 5’-ACC CTA TCA GGC AGT ACC ACA AGG C-3’


13







Hình 5: Kết quả so chuỗi các trình tự tham chiếu để từ đó chọn được mồi HCV-59F
và HCV-302R
Từ cặp mồi thiết kế được, chúng tôi đã xây dựng được kỹ thuật RT-PCR phát hiện HCV
dựa trên vùng 5’-NC. Hình 6 dưới đây trình bày kết quả điện di sản phẩm PCR khi chúng tôi
thử qui trình RT-PCR phát hiện HCV do chúng tôi xây dựng với cặp mồi HCV-59F và HCV-
302R trên một mẫu huyết thanh HCV-RNA dương tính đã được xác đònh và lưu trữ ở điều
kiện -70oC có trong phòng thí nghiệm của chúng tôi. Kết qủa cho thấy sản phẩm khuếch đại
tạo thành vạch rất rõ trên thạch diện di với kích thước #240bp như thiết kế.











Sản phẩm PCR này đã được chúng tôi gửi chạy thử phản ứng CLIP của hệ thống Trugene
và được giải trình tự. Kết quả cho thấy sản phẩm PCR hoàn toàn tương thích với phản ứng
CLIP với các tín hiệu giải trình tự rất rõ (hình 7). Điều này chứng tỏ cặp mồi mà chúng tôi
thiết kế hoàn toàn thích hợp với giai đoạn PCR trước khi thực hiện phản ứng chu kỳ giải trình
tự CLIP của Trugene. Và đây cũng chính là cơ sở để Trung Tâm MEDIC không cần thiết
phải sử dụng kit HCV Amplicor của Roche để cho giai đoạn PCR trước khi xác đònh kiểu
gene HCV bằng kỹ thuật giải trình tự trên hệ thống Trugene.








14
Hình 6: Kết quả điện di sản
phẩm khuếch đại #240bp
của qui trình RT-PCR phát
hiện HCV-RNA dựa trên
vùng 5’NC với hai mồi
HCV-59F và HCV-302R
#240bp

Hình 7: Kết quả tín hiệu giải
trình tự trên máy Trugene
sản phẩm PCR của qui
trình RT-PCR mà chúng
tôi gửi đến thử tại
MEDIC



Nhờ kết quả này, Trung tâm MEDIC đã sử dụng qui trình RT-PCR phát hiện HCV do
chúng tôi cung cấp để thực hiện xét nghiệm đònh kiểu gene HCV bằng kỹ thuật giải trình tự
trực tiếp sản phẩm PCR trên hệ thống Trugene. Dưới đây là một biểu đồ 2 tổng kết các kết
quả xét nghiệm kiểu gene HCV trên hệ thống Trugene với giai đoạn PCR sử dụng qui trình
RT-PCR phát hiện HCV của chúng tôi cung cấp.









3
3
24
2 2
12
0
5

10
15
20
25


1 1a 1b 2 2a 6a

Biểu đồ 2: Kết quả 46 trường hợp xác đònh kiểu gene bằng pp Trugene
(Nguyễn Bảo Toàn, tài liệu của MEDIC)

(2) Qui trình RT-PCR phát hiện HCV-RNA với cặp mồi HCV-59F và HCV-302R cũng
tương thích với kit InoLIPA đònh kiểu gene HCV

15
Trong thử nghiệm đònh kiểu gene HCV bằng kit InoLIPA, kit cung cấp kèm theo hai cặp
mồi gồm một cặp vòng ngoài và một cặp vòng trong. Để làm được thử nghiệm thì người làm
thử nghiệm phải tách chiết RNA của mẫu thử và thực hiện tổng hợp cDNA bằng các kit thích
hợp nhưng không đi kèm. Sau đó khuếch đại một trình tự đặc hiệu trên cDNA bằng chạy
PCR với mồi vòng ngoài, rồi dùng sản phẩm PCR mồi vòng ngoài để làm bản đích chạy PCR
mồi vòng trong tạo ra sản phẩm PCR có gắn biotin nhờ một mồi vòng trong có gắn biotin.
Sản phẩm khuếch đại mồi vòng trong sẽ được lai trên các vạch có gắn sẵn các probe đặc
hiệu và sản phẩm lai sẽ được phát hiện nhờ công hợp streptavidine-PA. Như vậy không phải
người sử dụng mua được kit HCV InoLIPA là có thể đònh được kiểu gene HCV mà phải tìm
được kit thích hợp để thực hiện tách chiết RNA của mẫu thử và làm được tổng hợp cDNA.
Theo thông tin của kit HCV InoLIPA thì các dò đặc hiệu được gắn trên các vạch của thanh
InoLIPA là dựa trên các trình tự đặc hiệu kiểu gene HCV trên vùng 5’NC. Do vậy chúng tôi
nghó rằng có lẽ các dò đặc hiệu này sẽ tương thích với sản phẩm khuếch đại của qui trình
RT-PCR dùng hai mồi HCV-59F và HCV-302R mà chúng tôi đã thiết kế. Trên suy nghó như
vậy nên chúng tôi đã áp dụng qui trình RT-PCR phát hiện HCV-RNA với cặp mồi HCV-59F

và HCV-302R nhưng dùng mồi HCV-302R có gắn biotin ở đầu 5’ để có được sản phẩm PCR
đánh dấu biotin, nhờ vậy mà có thể phát hiện và đònh type được khi thực hiện lai trên các
vạch gắn các probe đặc hiệu trên que InoLIPA. Chúng tôi đã chọn 5 mẫu huyết thanh [+]
HCV-RNA biết rõ được các kiểu gene HCV khác nhau nhờ thử nghiệm InoLIPA để thử
nghiệm lại qui trình của chúng tôi (RT-PCR với mồi HCV-302R gắn Biotin). Các kết quả
trình bày trong hình 8 cho thấy sản phẩm PCR gắn biotin của qui trình RT-PCR của chúng tôi
hoàn toàn tương thích với que InoLIPA để có thể xác đònh được kiểu gene HCV vì cách kiểu
Hình 8: Các kết quả lai
sản phẩm PCR của qui
trình RT-PCR của
chúng tôi cho phép
đònh được các kiểu
gene của HCV

16
vạch lai [+] hoàn toàn rõ ràng để xác đònh được các kiểu gene HCV trên các mẫu thử và
trùng khớp với các kết quả InoLIPA trước đó.
Các kết quả (1) và (2) đã cho phép chúng tôi nhận đònh là chúng tôi đã xây dựng được qui
trình RT-PCR khuếch đại được vùng đặc hiệu kiểu gene của HCV, và vùng này có thể rất
trùng lặp với vùng đặc hiệu kiểu gene HCV mà dựa vào đó Trugene đã phát triển kit giải
trình tự và InoLIPA phát triển các que lai trên vạch để làm xét nghiệm đònh kiểu gene HCV.
(3) Từ qui trình RT-PCR đã nghiên cứu được, đã xây dựng thành công qui trình RT real-
time PCR dùng taqman probe
Chúng tôi cũng đã xây dựng được kỹ thuật RT-realtime PCR dùng taqman probe để phát
hiện và đònh lượng HCV. Trình tự của taqman probe này (HCV-probe) như sau:
HCV-86F: 5’-FAM-TGG CGT TAG TAT GAG TGT CGT GCA GC-TAMRA-3’.
Chúng tôi cũng đã xây dựng và tạo dòng được một chứng nội tại dùng chung mồi HCV-
59F và HCV-302R (IC-HCV) nhưng cho sản phẩm khuếch đại #190bps và chứng nội tại này
đã có taqman probe tương ứng (IC-probe) khác biệt hoàn toàn với taqman probe HCV-86F.
IC-probe cho chứng nội tại này có đầu 5’ gắn màu huỳnh quang HEX và đầu 3’ gắn BHQ1.

Ngoài ra chúng tôi còn tạo được chứng nội tại là RNA (IC-HCVRNA) phiên mã từ IC-HCV.
Các chứng nội tại IC-HCV, chứng nội tại IC-HCVRNA cũng đã được dò tìm nồng độ tối
thiểu để cho vào PCR mix (IC-HCV) và cho vào mẫu huyết thanh chứng [-] (IC-HCVRNA)
khi thực hiện qui trình RT real-time PCR phát hiện và đònh lượng HCV-RNA trong các mẫu
thử. Ngoài ra chúng tôi cũng đã xây dựng được dãy chuẩn là sản phẩm PCR đích được dòng
hoá vào plasmid và được đònh lượng số copies sau khi đã tách chiết. Qua thử nghiệm trên
một số mẫu huyết thanh [+] và [-] HCV và trên dãy chuẩn chúng tôi đã đánh giá qui trình RT
hoạ một kết quả đường chuẩn được xây dựng trên 5 nồng độ chuẩn là đạt các điều kiện lý
tưởng: R (độ tương quan) đạt >0.990, E (hiệu quả PCR) đạt trong khoảng 90-105%. Hình 10
minh hoạ một kết quả HCV [+] với số lượng 17.000 copies/ml cho thấy đường biểu diễn
real-time PCR với các mồi và taqman probe thiết kế là hoàn toàn thanh công. Hình 9 minh
Hình
9
: Biểu đồ biểu diễn tín hiệu huỳnh quang xuất hiện trong các giếng chuẩn theo
các chu kỳ nhiệt đọc bởi kênh màu “Fam”. Biểu đồ dưới cho biết mối quan hệ
tuyến tính giữa nồng độ copie ban đầu của mẫu chuẩn có trong thể tích phản ứng
với chu kỳ ngưỡng (Ct). Đường biểu diễn chuẩn lý tưởng khi hệ số tương quan
≥0.99, PCR efficiency từ 90% đến 105%, và độ dốc từ -3.2 đến -3.6

17
khuếch đại của màu FAM. Hình 11 minh hoạ một kết quả được cho phép kết luận là HCV [-]
nhờ không có biểu diển khuếch đại FAM nhưng có biểu diễn khuếch đại mà HEX của chứng
nội tại.






Ct: 23.33

SQ:
17 000
Hình 10: Kết quả mẫu thử dương tính biểu hiện bằng đường khuếch đại tính hiệu huỳnh
quang đọc bởi kênh màu “Fam” so với đường khuếch đại tín hiệu huỳnh quang
các mẫu chuẩn. Kết quả tính tóan từ biểu đồ chuẩn cho thấy mẫu thử có Ct =
23.33, và lượng HCVcDNA ban đầu có trong mẫu thử là 17.000 copies.

ình 11: Kết quả mẫu thử có số copies dưới ngưỡng phát hiện, biểu hiện bằng đường

iai đoạn 2







HEX
FAM
H
khuếch đại tính hiệu huỳnh quang đọc bởi kênh màu “Fam” là âm tính, nhưng
đường biểu diễn khuếch đại tín hiệu huỳnh quang đọc bởi kênh màu ”HEX” là
dương tính.
G
ïc kỹ thuật giải trình tự sản phẩm RT real-time PCR trên máy giải trình tự
CE
phẩm
PC
A GGC CTT TCG CGA-3’.
Xây dựng đươ

Q 8000 hiện đang được trang bò tại công ty Nam Khoa để xác đònh kiểu gene HCV
Thành công quyết đònh của giai đoạn này chính là tìm được mồi giải trình tự sản
R mà không dùng chính mồi của PCR vì trong sản phẩm PCR của qui trình RT real-time
PCR có thể có cả sản phẩm khuếch đại từ chứng nội tại mà các sản phẩm này cũng được
khuếch đại từ các mồi của sản phẩm đích. Có nhiều mồi được đề nghò từ kết quả dò tìm bằng
phần mềm Primer Premier. Tuy nhiên chúng tôi đã chọn mồi 292R vì đây là mồi đáp ứng
được tiêu chuẩn cao nhất của mồi giải trình tự là không tự bắt cặp với nhau (dimer) và cũng
không có các vò trí bắt cặp nhầm (false priming).
Trình tự của mồi này là: 5’-GCA GTA CCA CA

18
Sau khi đặt được mồi giải trình tự, chúng tôi đã tiến hành giải trình tự 10 mẫu huyết thanh
[+] HCV-RNA đã xác đònh được kiểu gene trên hệ thống Trugene. Bảng 2 dưới đây trình bày
cho thấy kết quả đònh kiểu gene HCV của Trugene trên 10 mẫu này hoàn toàn trùng khớp
với kết quả đònh kiểu gene mà chúng tôi có được nhờ blast search các trình tự mà chúng tôi
đã giải trình tự với mồi giải trình tự 292R mà chúng tôi đã thiết kế. Hình 12 minh họa một
kết quả giải trình tự với trình tự A-T-C-G tương ứng với các tín hiệu huỳnh quang ghi nhận từ
máy và kết quả kiểu gene sau khi blast search trên thư viện HCV kiểu gene.
Bảng 2: Kết quả đònh kiểu gene HCV của Trugene và kết quả đònh kiểu gene blast
search các trình tự đã giải với mồi giải trình tự 292R
Mẫu Kiểu gene
(Trugene)
KQ giải trình tự với mồi 192R Kiểu gene
(blast search)
1 2a
gctagcagtcttgcgggggcacgcccaaatggccgggcatagagtgggtttatccaagaaaggacccag
tcttcccggcaattccggtgtactcaccggttccgcagaccactatggctctcccgggaggggggggcctg
gaggctgtacgacactcatactaacgccatggctagacgctt
2a
2 2a

ctactcggctagcagtcttgcgggggcacgcccaaatggccgggcatagagtgggtttatccaagaaagg
acccagtcttcccggcaattccggtgtactcaccggttccgcagaccactatggctctcccgggagggggg
ggcctggaggctgtacgacactcatactaacgccatggctagac
2a
3 1b
actactcggctagcagtctcgcgggggcacgcccaaatctccaggcattgagcgggttgatccaagaaag
gacccggtcgtcctggcaattccggtgtactcaccggttccgcagaccactatggctctcccgggaggggg
ggtcctggaggctgcacgacactcatactaacgccatggctagacgctt
1b
4 1b
tcgcgctagcagtctcgcgggggcacgcccaaatctccaggcattgagcgggttgatccaagaaaggac
ccggtcgtcctggcaattccggtgtactcaccggttccgcagaccactatggctctccggagggggggtcct
ggaggctgcacgacactcatactaacgccatggctagacgctttctgca
1b
5 1c
actactcggctagcagtcttgcgggggcacgcccaaatctccagagcattgagcgggtgaatccaagaaa
ggacccggtcgtcctggcaattccggtgtactcaccggttccgcagaccactatggctctcccgggagggg
gggtcctggaggctgcacgacactcatactaacgccatggctagacgctt
1c
6 6a
tcggctagcagtcttgcgggggcacgcccaaatctccaggcatgtgagcgggtttgatccaatggaaagg
acccggtcatcctggcaattccggtgtactcaccggttccgcagaaccactatggctctcccgggaggggg
gggcctggaggctgtacgacactcatactaacgccatggctaaacgcttt
6a
7 6a
gctactcggctagcagtctgcgggggcacgcccaaatctccaggcattgagcgggtttgatccaatggaa
aggacccggtcatcctggcaattccggtgtactcaccggttccgcagaccactatggctctcccgggaggg
gggggcctggaggcgtgtacgacactcatactaactccatggctagacgcttt
6a
8 1a

tctcgcgggggcacgcccaaatctccaggcatgtgagcgggtgtttatccaagaaaggacccggtcgtcct
ggcaattccggtgtactcaccggttccgcagaccactatggctctcccgggagggggggtcctggaggct
gcacgacactcatactaacgccatggcta
1a
9 2b
cgggggcacgcccaaatgaccggaacattagagtgggtttatccaagaaaggacccagtctttccggcaa
ttccggtgtactcaccggttccgcagaccactatggctctcccgggaggggggggcctggaggctgtacg
acactcatactaacgccatggctagacgct
2b
10 3a
ctcggctagtgatctcgcgggggcacgcccaaatttctgggtattgagcgggttgttccaagaaaggaccc
ggtcaccccagcgattccggtgtactcaccggttccgcagaccactatggctctcccgggagggggggtc
ctggaggctgcacgacactcgtactaacgccatggctagacgct
3a









19































Hình 12: Minh họa một kết quả giải trình tự với trình tự A-T-C-G tương ứng với các tín
hiệu huỳnh quang ghi nhận từ máy và kết quả kiểu gene sau khi blast search trên
thư viện kiểu gene HCV

20
Trên 10 mẫu này, khi điện di sau khi tinh sạch sản phẩm RT real-time PCR, chúng tôi vẫn

thấy có vài mẫu có kèm sản phẩm khuếch đại từ chứng nội tại (hình 13), nhưng kết quả giải
trình tự vẫn tốt. Hơn nữa chúng tôi cũng song song thực hiện RT-PCR với qui trình được thiết
kế ban đầu (không phải RT real-time PCR, và không có chứng nội tại) có chứng nội tại với
kết quả giải trình tự trực tiếp sản phẩm RT-PCR ở trên. Kết quả giải trình tự của cả loại sản
phẩm PCR (RT-realtime PCR và RT-PCR) từ mỗi mẫu là hoàn toàn giống hệt nhau. Điều
này chứ ng tỏ với mồi giải trình tự được thiết kế, chúng tôi hoàn toàn có thể sử dụng để giải
trình tự sản phẩm RT-realtime PCR mà chúng tôi đã thiết kế dù có sử dụng chứng nội tại.





Hình 13: Kết quả điện di sản phẩm RT-realtime PCR sau khi được tinh sạch của 10 mẫu
huyết thanh thử nghiệm trong nội dung 2. Dù có sự hiện diện của sản phẩm
chứng nội tại nhưng vẫn không ảnh hưởng đến giải trình tự sản phẩm PCR vì mồi
giải trình tự hoàn toàn khác biệt với mồi khuếch đại.

Giai đoạn 3
Đã xây dựng được thư viện các trình tự của các kiểu gene HCV từ gene bank
Chúng tôi đã vào genebank để load trình tự của phần 5’NC của các bộ gen HCV tham
chiếu để xây dưng được một thư viện gồm có 137 trình tự các kiểu gene có thể gặp được tại
Việt Nam, đó là: 1a (19), 1b (56), 1c (2), 2a (17), 2b (5), 3a (5), 3b (4), 3 (19), 4a (1), 5a (1),
6a (4), 6b (1), 6e (3). Thư viện các trình tự này được đònh dạng txt và đưa vào thư viện local
blast của BioEdit (hình 14). Thư viện hiện nay cũng đang được liên tục được cập nhật với các
trình tự mà chúng tôi giải được và đònh kiểu gene đươc nếu gặp những kiểu gene khác biệt
với các kiểu gene thường gặp trên.
Giai đoạn 4










Thư viện kiêu gen HCV trong
thu mu
ï
c Database của Bioedit
Hình 14: Thư viện các kiểu
gene HCV trong thư mục
database của Bioedit

21
Đã chứng minh độ chính xác của việc sử dụng thư viện các kiểu gene HCV đã thành lập
là hoàn toàn không khác biệt với sử dụng HCV genotype blast search của NCBI
Với 234 mẫu huyết thanh HCV-RNA [+], chúng tôi đã thực hiện thử nghiệm RT real-time
PCR phát hiện và đònh lượng HCV rồi giải trình tự trực tiếp sản phẩm khuếch đại để đònh
kiểu gene các trình tự đã giải bằng local blast search trên thư viện các kiểu gene đã thành
lập, đồng thời blast search trên thư viện HCV genotype của NCBI. Kết quả trình bày trong
bảng 3 theo sau đây cho thấy không hề có sự khác biệt giữa hai phương pháp blast search.
Bảng 3: Kết quả đònh kiểu gene HCV của 234 trình tự bằng cách blast search trên thư
viện kiểu gene HCV được lập ở Bioedit (NCBI local blast search) và trên thư
viện kiểu gene HCV của NCBI genbank (NCBI blast search).
KQ đònh lượng HCV (copies/ml) Số mẫu Kết quả kiểu gene (số mẫu)
NCBI local blast search /NCBI blast search
100 – 999 1 1b(1)/
1b(1)
1.000 – 9.999 14 1a(1), 1b(10), 2a(2), 6a(1)/

1a(1), 1b(10), 2a(2), 6a(1)
10.000 – 99.999 57 1a(3), 1b(32), 2a(9), 2c(2), 6a(11)/
1a(3), 1b(32), 2a(9), 2c(2), 6a(11)
100.000 – 999.999 123 1a(8), 1b(65), 2a(15), 2b(5), 6a(30)/
1a(8), 1b(65), 2a(15), 2b(5), 6a(30)
1.000.000 – 9.999.999 37 1a(1), 1b(27), 2a(5), 6a(4)/
1a(1), 1b(27), 2a(5), 6a(4)
10.000.000 – 99.999.999 2 1b(2)/
1b(2)
Tổng cộng 234 1a(13), 1b(137), 2a(31), 2b(5), 2c(2), 6a(46)/
1a(13), 1b(137), 2a(31), 2b(5), 2c(2), 6a(46)












Hình 15: Một màn hình blast search trên thư viện HCV genotype của NCBI genbank đã
được nhập trình tự đã giải được.

22

















Hình 16: Minh hoạ một màn hình local blast search trên thư viện kiểu gene HCV do
chúng tôi thiết lập và nhập vào cơ sở dữ liệu của BioEdit.













Hình 17: Minh hoạ phần một màn hình cho thấy kết quả bảng điểm của các kiểu gene
tương đồng sau khi blast search cùng một trình tự trên thư viện HCV genotype

của NCBI genbank và trên thư viện của chúng tôi thiết lập.

23
Hình 15 và 16 minh họa các màn hình blast search trên thư viện HCV genotype của NCBI
genbank và local blast search trên thư viện kiểu gene HCV do chúng tôi thiết lập sau khi đã
nhập một trình tự đã giải. Để thực hiện được các blast search này, người làm xét nghiệm phải
copy trình tự đã giải vào khung nhập chuỗi rồi làm tiếp các bước tiếp theo như hướng dẫn
trên màn hình để có kết quả bảng điểm các kiểu gene tương đồng như trình bày ở hình 17.

Giai đoạn 5

(1) Đã so sánh phương pháp xác đònh kiểu gene HCV bằng giải trình tự trực tiếp sản
phẩm PCR của RT real-time PCR với phương pháp đònh kiểu gene HCV bằng kỹ thuật HCV
genotype của InoLIPA
Cũng trên 234 mẫu thử được thử nghiệm xác đònh kiểu gene bằng kỹ thuật giải trình tự
trực tiếp sản phẩm PCR của qui trình RT real-time PCR mà chúng tôi đã xây dựng, chúng tôi
đã thực hiện đònh kiểu gene bằng kỹ thuật lai trên vạch của Siemen (InoLIPA). Kết quả được
tổng kết và trình bày trong bảng 4 dưới đây cho thấy hai kết quả gần như tương đương, chỉ có
môt số mẫu kết quả của InoLIPA không phân biệt được kiểu gene như 2a/2c, 1a/1b
Bảng 4: Kết quả đònh kiểu gene HCV của hai phương pháp InoLIPA (I) và phương pháp
giải trình tự của chúng tôi (II) so với kết quả đònh lượng
KQ đònh lượng
copies/ml
Số
mẫu
P. pháp Kiểu gene (số mẫu)
100 – 999 1 I 1b(1)
II 1b(1)
1.000 – 9.999 14 I 1a(1), 1b(10), 2a(1), 2a/2c(1), 6a(1)
II 1a(1), 1b(10), 2a(2), 6a(1)

10.000 – 99.999 57 I 1(3), 1a(3), 1b(28), 1a/1b(1), 2(4), 2a(4), 2c(2), 2a/2c(1),
6a(11)
II 1a(3), 1b(32), 2a(9), 2c(2), 6a(11)
100.000 – 999.999 123 I 1(1), 1a(8), 1b(63), 1a/1b(1), 2(12), 2a(7), 2b(1), 6a(30)
II 1a(8), 1b(65), 2a(15), 2b(5), 6a(30)
1.000.000 – 9.999.999 37 I 1a(1), 1b(27), 2a(5), 6a(4)
II 1a(1), 1b(27), 2a(5), 6a(4)
10.000.000 – 99.999.999 2 I 1(1), 1b(1)
II 1b(2)
Tổng cộng 234 I 1(5), 1a(13), 1b(130), 1a/1b(2), 2(21), 2a(12), 2b(1), 2c(2),
2a/2c(2), 6a(46)
II 1a(13), 1b(137), 2a(31), 2b(5), 2c(2), 6a(46)
(2) Đã áp dụng phương pháp xác đònh kiểu gene HCV bằng giải trình tự trực tiếp sản
phẩm RT real-time PCR phát hiện và đònh lượng HCV trên một lượng lớn mẫu để tìm hiểu
sự phân bố các kiểu gene HCV trên các bệnh nhân Việt Nam nhiễm HCV được bác só chỉ
đònh xét nghiệm để được điều trò đặc hiệu.
Trong thời gian từ 21 tháng 9 năm 2006 đến 29 tháng 12 năm 2007, chúng tôi đã thực hiện
xét nghiệm đònh kiểu gene HCV của 918 mẫu huyết thanh HCV-RNA [+] được các bác só
cho xét nghiệm xác đònh kiểu gene HCV. Kết quả được tổng kết trong biểu đồ 3 trình bày
theo sau đây. Phân tích kết quả kiểu gene với lượng lớn này cho phép chúng tôi nhận đònh đa
số bệnh nhân nhiễm HCV của Việt Nam là nhiễm kiểu gene 1, đặc biệt 1b (57%) là kiểu
gene đòi hỏi thời gian điều trò lâu dài. Rất ít các trường hợp nhiễm kiểu gene 3 hay 4.

24


1b
56.96%
2c
0.22%

1c
0.76%
2a
10.98%
2b
1.09%
3a
0.22%
4a
0.11%
6a
21.63%
6h
0.22%
6b
0.11%
1a
7.70%














Biểu đồ 3: Phân bố các kiểu gene HCV trên 918 mẫu huyết thanh HCV-RNA [+] được bác
só cho chỉ đònh xét nghiệm để được quyết đònh điều trò đặc hiệu
Bàn luận
Đònh kiểu gene HCV bằng kỹ thuật giải trình tự của Trugene hay kỹ thuật InoLIPA lai trên
vạch của Bayer đều dựa trên một đọan nucleotide đặc hiệu trên vùng 5’NC. Đây là cả hai
phương pháp được nhiều nhà y học chấp nhận để dùng trong các phòng thí nghiệm lâm sàng.
Phương pháp InoLIPA tuy kém hơn phương pháp giải trình tự vì có thể có nhiều trường hợp
không thể phân biệt được các subtype, nhưng InoLIPA có lợi điểm là không cần thiết phải có
thiết bò giải trình tự vốn được xem là khá đắt tiền và tương đối khó về mặt kỹ thuật, do vậy
InoLIPA có thể triển khai thực hiện được tại bất kỳ các phòng thí nghiệm lâm sàng nào có
trang bò phương tiện cho kỹ thuật PCR. Tuy nhiên, vì InoLIPA phải thực hiện trên sản phẩm
PCR là kết quả của phản ứng nested PCR nên khả năng bò ngọai nhiễm là khá cao và đây
chính là lí do giải thích được tại sao có khá nhiều trường hợp InoLIPA có kết quả không thể
xác đònh được kiểu gene
[19,20]
.
Trong phương pháp giải trình tự của Trugene, các nhà sản xuất khuyến cáo nên thực hiện
trên sản phẩm PCR của Roche Amplicor, và đây chính là một trở ngại khá lớn vì giá thành
của Roche Amplicor dành cho HCV rất đắt (trên 120 USD/mẫu thử). Ngòai giá thành của
Roche Amplicor, các vật liệu tiêu hao khác đi kèm với thử nghiệm giải trình tự cũng phải
đến trên 60USD nữa, do vậy giá thành của một thử nghiệm kiểu gene HCV bằng giải trình tự
của Trugene tại Việt Nam khó có thể thấp dưới 180USD.
Với công trình này, chúng tôi đã nghiên cứu thành công một bộ thử nghiệm RT-PCR với
PCR mix dùng cặp mồi hòan tòan tương thích với hệ thống Trugene nhờ vậy mà phòng thí
nghiệm không nhất thiết phải sử dụng Roche Amplicor làm RT-PCR
[20,21]
. Chính nhờ áp dụng

25