ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ










BÁO CÁO NGHIỆM THU
(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu)

(NGHIÊN CỨU BỆNH TAY CHÂN MIỆNG Ở TRẺ EM
BẰNG ÁP DỤNG KỸ THUẬT REAL TIME RT-PCR)






CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI
(Ký tên)

CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ
(Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận)













THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 7/ 2010




ii
MỤC LỤC
Trang


Mục lục
i

Danh sách các chữ viết tắt
ii

Danh sách các bảng
iii

Danh sách các hình
iv

Tóm tắt nội dung nghiên cứu (gồm phần tiếng Việt và tiếng Anh)
v


PHẦN MỞ ĐẦU

1


CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3
1.1
Tình hình nghiên cứu ngoài nước
3
1.2
Tình hình nghiên cứu trong nước
3



CHƢƠNG II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

6
2.1.
Nội dung 1
6
2.2.
Nội dung 2 – 6
10


CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
13
3.1.
Nội dung 1: Xác định tác nhân gây BTCM do EV71 bằng kỹ thuật
Real-time RT-PCR
13
3.2
Nội dung 2: Đặc điểm dân số học và biểu hiện lâm sàng của BTCM
ở trẻ em
17
3.2.1.
Đặc điểm dân số học
17
3.2.2.
Triệu chứng lâm sàng
19
3.2.3

Tỷ lệ biến chứng và các loại biến chứng
23
3.3.
Nội dung 3: Yếu tố tiên lượng lâm sàng – cận lâm sàng về khả năng
gây biến chứng
24
3.3.1.
Mối tương quan giữa các đặc điểm dân số học với sự xuất hiện biến
chứng trong BTCM
24
3.3.2.
Mối tương quan giữa các triệu chứng lâm sàng với sự xuất hiện biến
chứng trong BTCM
24
3.3.3
Mối tương quan giữa các dấu hiệu cận lâm sàng với sự xuất hiện
biến chứng trong BTCM
28
3.4.
Nội dung 4: Thực hiện xét nghiệm PCR trên các mẫu bệnh phẩm
29
3.5
Nội dung 5: Phân tích tỉ lệ bệnh nhân dương tính với EV71 theo thời
gian
30
3.6
Nội dung 6: Phân tích nồng độ vi rút trong bệnh phẩm
31

CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

32

PHỤ LỤC: Các hình và biểu đồ
25

TÀI LIỆU THAM KHẢO
39

PHIẾU THU THẬP DỮ LIỆU NGHIÊN CỨU


DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU



iii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

VIẾT TẮT
THUẬT NGỮ TIẾNG VIỆT
BVNĐ1
Bệnh Viện Nhi Đồng 1
BTCM
Bệnh tay chân miệng
CA16
Cosxakie A16
CSF
Ceberalspino fluid (Dịch não tủy)
Ct
Threshold Cycle (Chu kỳ ngưỡng)

CV
Coefficient of Variation (Hệ số biến thiên)
DNT
Dịch não tủy
EV
Enterovirus (vi rút đường ruột)
EV71
Enterovirus 71
EV non-71
Enterovirus khác 71
NĐVR
Nồng độ vi rút
NHRI
National Health Research Institute (Viện Nghiên cứu Sức khỏe
Quốc gia Đài Loan - Trung Quốc)
PBN
Phết bóng nước
PCR
Polymerase Chain Reation (Phản ứng khuếch đại chuỗi gen)
PH
Phết họng
PTT
Phết trực tràng
Real-time RT-
PCR
Phản ứng khuếch đại chuỗi gen với men sao chép ngược thời gian
thực
RT-PCR
Reverse Transcriptae Polymerase Chain Reation (Phản ứng khuếch
đại chuỗi gen với men sao chép ngược)

TPHCM
Thành phố Hồ Chí Minh



iv
DANH SÁCH CÁC BẢNG SỐ LIỆU

Bảng số
Tên bảng số liệu
trang
1
Độ lập lại của chu kỳ ngưỡng (Ct) ứng với các nồng độ
chuẩn trong 3 lần chạy liên tiếp của phản ứng Realtime-PCR
Taqman Probes phát hiện và định lượng EV71
14
2
Dữ liệu của đường cong chuẩn với FAM-490 (Ct)
14
3
Sự biến thiên trong một lần phản ứng của phản ứng
Realtime-PCR Taqman Probes phát hiện và định lượng
EV71
14
4
Sự biến thiên giữa các lần khác nhau của phản ứng Real-
Time PCR Taqman phát hiện và định lượng EV71
14
5
Phân bố BTCM theo địa phương

18
6
Triệu chứng khởi phát trong BTCM
19
7
Triệu chứng được quan tâm của gia đình đưa trẻ vào viện
21
8
Đặc điểm lâm sàng BTCM do EV71 và EV non-71
22
9
Biến chứng của BTCM
23
10
Mối tương quan giữa các đặc điểm dân số học và biến chứng
24
11
Các yếu tố nguy cơ biến chứng chung
25
12
Các yếu tố nguy cơ biến chứng nặng
26
13
Phân tích liên quan tình trạng dinh dưỡng trẻ và biến chứng
26
14
Các yếu tố nguy cơ tử vong
27
15
Kết quả xét nghiệm EV, EV71 của các mẫu bệnh phẩm

29
16
So sánh nồng độ vi rút giữa nhóm có biến chứng và không
biến chứng
31




v
DANH SÁCH CÁC HÌNH ẢNH

Hình số
Tên hình ảnh
trang
1
Chu kỳ ngưỡng của hệ thống mẫu chuẩn pha loãng có nồng độ
từ 10
2
copies cho tới 10
5
copies/ml trong phản ứng Realtime-
PCR với Taqman probes trong định
13
2
Đường cong chuẩn của Real-Time PCR với Taqman Probes
định lượng EV-RNA
13
3
Độ lập lại của 4 lần chạy của cùng một mẫu trong cùng một đĩa

15
4
Hình ảnh khuếch đại của EV71-RNA trong các mẫu thử khi
thực hiện Realtime-PCR Taqman Probes
15
5
Đường cong chuẩn của Realtime-PCR Taqman Probe định
lượng EV71-RNA
15
6
Phân bố tuổi theo tháng
17
7
Ngày khởi phát của các triệu chứng sốt, thở nhanh và biến
chứng viêm màng não, viêm não
20
8
Phân bố ngày đến khám đầu tiên
21
9
Tương quan giữa tỷ lệ EV71 và BTCM, biến chứng theo thời
gian
30


vi
TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Đặt vấn đề: Với tình hình diễn tiến phức tạp của Bệnh tay chân miệng (BTCM) trong
những năm gần đây cả về mặt dịch tễ cũng như lâm sàng, nhu cầu áp dụng một kỹ

thuật giúp chẩn đoán xác định tác nhân gây bệnh nhanh hơn, giúp xử trí sớm hơn,
đồng thời dự báo sớm khuynh hướng của dịch BTCM nhằm có biện pháp khống chế
thích hợp là rất cấp thiết. Do đó, nhóm nghiên cứu đã áp dụng kỹ thuật Real-time RT-
PCR để nghiên cứu sâu về BTCM ở trẻ em.
Mục tiêu nghiên cứu:
Mục tiêu tổng quát: Xác định tác nhân gây bệnh (Enterovius 71 và Enterovirus
non-71) bằng kỹ thuật Real-time RT-PCR, tiên lượng độ nặng và ứng dụng để dự
báo dịch trong BTCM ở trẻ em.
Mục tiêu chuyên biệt:
1. Xác định tác nhân gây bệnh tay chân miệng do Enterovirus 71 và Enterovirus
non-71 bằng kỹ thuật Real-time RT-PCR;
2. Mô tả đặc điểm dân số học và biểu hiện lâm sàng BTCM do enterovirus;
3. Xác định yếu tố tiên lượng biến chứng (lâm sàng, cận lâm sàng)
Phƣơng pháp nghiên cứu: áp dụng thiết kế mô tả tiến cứu, chọn mẫu ngẫu nhiên hệ
thống với đối tượng nghiên cứu là tất cả các bệnh nhi đến khám hay nhập viện tại
Bệnh Viện Nhi Đồng 1 có chẩn đoán BTCM trên lâm sàng. Quy trình thực hiện xét
nghiệm 3 bước kết hợp kỹ thuật RT- PCR và Realtime RT- PCR được áp dụng để định
danh tác nhân gây BTCM và định lượng nồng độ vi rút trong các bệnh phẩm phết
họng, phết trực tràng, dịch não tủy và bóng nước. Các đặc điểm dân số, triệu chứng
lâm sàng và đặc điểm cận lâm sàng, kết quả phân tích sinh học phân tử được thu thập
để tìm hiểu đặc điểm lâm sàng của BTCM và các yếu tố tiên lượng biến chứng.
Kết quả: Từ 449 bệnh nhi BTCM đưa vào nhóm nghiên cứu chúng tôi có được 419
(93,3%) trường hợp chẩn đoán dương tính với EV qua thử nghiệm PCR. Trong đó,
mẫu bệnh phẩm phết họng cho kết quả dương tính cao nhất với 84,5% các trường hợp.
BTCM là một bệnh lưu hành ở khu vực phía Nam, thường gặp ở trẻ dưới 36 tháng.
Đây là một bệnh cấp tính; biểu hiện lâm sàng điển hình với các triệu chứng sốt, phát
ban dạng sẩn hay bóng nước ở các vị trí đặc hiệu, loét miệng và giật mình; giúp chẩn
đoán chính xác trên 90%. Biến chứng có thể xuất hiện rất sớm ngay từ ngày đầu tiên,



vii
mức độ biến chứng thay đổi từ nhẹ đến rất nặng nhưng tỉ lệ biến chứng rất cao đến
47,7%. Những biến chứng thường gặp là viêm màng não vô trùng (36,8%), viêm não
(9,1%), yếu liệt chi (8,4%), co giật (6%). Các trường hợp biến chứng nặng như viêm
não, phù phổi, viêm cơ tim chiếm 10%. Tử vong chung chiếm 1,4% trong toàn lô
nghiên cứu; 3% trong các ca có biến chứng và 10,9 % trong các ca có biến chứng
nặng.
Dựa trên các đặc điểm dân số học, các trẻ tử vong đều dưới 24 tháng. Tuổi của trẻ
tử vong nhỏ hơn trẻ mắc bệnh có biến chứng chung. Các yếu tố: sốt, sốt ≥ 38
o
5C, phát
ban ít, giật mình, nôn ói, thở nhanh, nhịp tim nhanh > 150 lần/phút, bạch cầu tăng >
13.000/mm
3
, neutrophile > 7.000/mm
3
, nhiễm EV71 có liên quan có ý nghĩa thống kê
với sự xuất hiện biến chứng. Các yếu tố như sốt trên 38
o
5C, phát ban ít, thở nhanh,
nhịp tim nhanh > 150 lần / phút, bạch cầu tăng > 16.000 /mm
3
có giá trị trong tiên
lượng biến chứng nặng (viêm não, phù phổi cấp, viêm cơ tim). Các yếu tố: nhịp tim
nhanh > 150 lần / phút, lactate trong DNT > 2,5 mmol/L, hôn mê, sốc, phù phổi hoặc
biến chứng viêm não có giá trị trong tiên lượng tử vong. Phân tích về sinh học phân tử,
nồng độ vi rút trong mẫu bệnh phẩm phết họng, phết trực tràng, DNT được lấy ở từ
ngày 2-4 của bệnh chưa thấy có mối tương quan rõ ràng với khả năng gây biến chứng
của EV71. Sự gia tăng tỉ lệ EV71/EV theo thời gian tương ứng với những cao điểm
của BTCM, nhưng chưa thấy tương quan rõ rệt với biến chứng.

Kết luận: Nghiên cứu cho thấy kỹ thuật định lượng EV71 bằng phương pháp
Realtime-PCR Taqman Probes trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm có có tính đồng nhất, ổn
định cao. Dựa vào kết quả vi sinh được xác định bằng phương pháp RT-PCR và
Realtime RT-PCR, nhóm nghiên cứu đã nhận định được đặc điểm lâm sàng – cận lâm
sàng của các bệnh nhi BTCM do EV71 và do nhóm EV khác EV71. Nhóm nghiên cứu
cũng đã đưa ra được những yếu tố tiên lượng về dân số học, lâm sàng và cận lâm sàng
trong BTCM ở trẻ em.




viii
SUMMARY OF RESEARCH CONTENT
Background: Because of the complicated progress of the epidemic of hand foot
mouth disease (HFMD) in recent years, in both clinical and epidemiological area, it is
vital to find a technology which can help identify accurately the etiology of the disease
and based on that the patients may have timing effective treatment as well as the
potential outbreak may be detected and controlled at the early stage. For this reason,
the study group has focused on applying Real-time RT-PCR to study in-depth the hand
foot mouth disease in children.
Research objectives:
Overall objective: Identify the etiology of the disease (Enterovius 71 versus
Enterovirus non-71) with the application of Real-time RT-PCR; study risk factors
of the disease for prognosis purposes; and learn the factors which can anticipate the
outbreak of the disease.
Specific objectives:
1. Identify the etiology of the disease (Enterovius 71 versus Enterovirus non-71)
with the application of Real-time RT-PCR;
2. Describe the demographic characters and clinical manifestations of HFMD
induced by enterovirus;

3. Study the risk factors for prognosis of complications.
Study methods: the study applied prospective case-series design and systematically
random sampling method upon the study objects including all children clinically
diagnosed with HFMD in both outpatient and inpatient of Children’s Hospital 1. Three
– step RT-PCR process, including both conventional PCR and real-time PCR, was
employed to identify the presence of EV, EV71 and its viral concentration in collected
specimens such as throat swab, rectal swab, cerebrospinal fluid (CSF), and vesicles.
Demographic characters, clinical signs and symptoms, investigational signs, and
molecular analysis results were collected to learn the complications in HFMD in
children.
Results: Among 449 children will HFMD enrolled in the study, 419 (93.3%) were
positive on RT-PCR with EV presence in at least one specimen (throat swab, rectal
swab, CSF, or vesicle). Among them, throat swab was most sensitive (84.5%). HFMD


ix
is endemic in the South of Vietnam, mostly among children less than 36 months of
age. It is an acute disease, typically manifesting with fever, site-specific rashes, mouth
ulcers, sleep disturbance and myoclonic jerks. These typical signs and symptoms help
diagnose accurately HFMD in 90% of the cases. Complications may appear very early
since the first day of the disease course. Complications vary from mild to very severe
with the overall prevalence of 47.7%. Common complications include aseptic
meningitis (36.8%), encephalitis (9.1%), acute paralysis (8.4%) and convulsion (6%).
Severe complications such as encephalitis, pulmonary edema and myocarditis are
present in 10% of the cases. The overall mortality rate is 1.4% in total, 3% among the
cases with complications and 10.9 % among the cases with severe complications.
In the study, all deaths were under 24 months of age. The average age among
deaths is less than that among children with complications. The factors such as fever,
fever ≥ 38
o

5C, myoclonic jerks, a few rashs, vomiting, tachycardia, tachypnea, white
blood count above 13,000 per cubic milimetre, neutrophile above 7,000 per cubic
milimetre, EV71 infection are significantly associated with the presence of
complications; factors such as fever ≥ 38
o
5C, a few rashes, myoclonic jerk,
tachycardia, tachypnea, white blood count above 16,000 per cubic milimetre among
the cases with severe complications such as encephalitis, pulmonary edema and
myocarditis; while factors including coma, shock, tachycardia, tachypnea,
encephalitis, acute pulmonary oedema and lactate in CSF above 2.5 mmol/l are
significantly associated with death. In biomolecular analysis, there is no evidence that
show the association between the viral concentration in study specimens such as throat
swab, rectal swab, CSF and vesicle, which were collected from day 2 to day 4 of the
disease course, and EV71-induced complications. The rate of EV71/EV was increased
in accordance with the peak of the diseases during the years but not significantly
associated with the increase of complication rate.
Conclusion: The study had shown the application of Realtime-PCR Taqman Probes
directly on collecyed specimens to indentify EV71 and quantify its concentration was
sensitive and stable. Based on the microbiological analysis from RT-PCR and
Realtime RT-PCR, the study had determined the clinical manifestations of EV71 and
non-EV71 – induced HFMD in children. The study had also indentified the potential
risk factors asssocitaed with the presence of complications in HFMD in children.


1
PHẦN MỞ ĐẦU

1. Tên đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu bệnh tay chân miệng ở trẻ em bằng áp
dụng kỹ thuật Real-time RT-PCR”
Chủ nhiệm đề tài: Ths BS Tăng Chí Thượng

Cơ quan chủ trì: Bệnh viện Nhi Đồng 1
Thời gian thực hiện: từ tháng 10/2007 đến tháng 4/2009 (đã được chấp thuận gia
hạn đến tháng 12/2009)
Kinh phí được duyệt: 450.000.000 đồng
Kinh phí đã cấp: 280 triệu theo TB 158/TB-SKHCN ngày 25/9/2007 và 125 triệu
theo TB 182/TB-SKHCN ngày 12/10/2009

2. Mục tiêu nghiên cứu:
Mục tiêu tổng quát: Xác định tác nhân gây bệnh (Enterovius 71 và Enterovirus
non-71) bằng kỹ thuật Real-time RT-PCR, tiên lượng độ nặng và ứng dụng để dự
báo dịch trong BTCM ở trẻ em.
Mục tiêu chuyên biệt:
Xác định tác nhân gây BTCM do Enterovirus 71 và Enterovirus non-71 bằng
kỹ thuật Real-time RT-PCR;
Mô tả đặc điểm dân số học và biểu hiện lâm sàng BTCM do enterovirus;
Xác định yếu tố tiên lượng biến chứng (lâm sàng, cận lâm sàng)

3. Nội dung nghiên cứu:
Chẩn đoán xác định nhiễm Enterovirus bằng qui trình kỹ thuật PCR qua 3
bước: Xác định Enterovirus, xác định EV71 (bằng RT-PCR), định lượng nồng
độ siêu vi EV71 bằng Real-time RT-PCR với đoạn mồi (primer) EV.
Mô tả đặc điểm dân số học và biểu hiện lâm sàng của BTCM ở trẻ em.
So sánh giữa nhóm có và không có biến chứng để tìm yếu tố tiên lượng lâm
sàng – cận lâm sàng về khả năng gây biến chứng, nhờ đó có thể chẩn đoán và
điều trị đặc hiệu sớm.
Phân tích tỉ lệ dương tính đối với từng loại mẫu bệnh phẩm nhằm đưa ra các
khuyến cáo phục vụ công tác chẩn đoán bệnh và điều trị.


2

Phân tích tỉ lệ bệnh nhân dương tính với EV71 theo thời gian để xác định tỉ lệ
này có liên quan đến cao điểm dịch bệnh hay không.
Phân tích nồng độ siêu vi trong bệnh phẩm để tìm mối liên quan giữa nồng độ
siêu vi và biến chứng của bệnh.

4. Sản phẩm của đề tài:
Báo cáo tổng kết (toàn văn và tóm tắt).
Quy trình chẩn đoán nhiễm Enterovirus bằng quy trình kỹ thuật PCR.
Báo cáo chuyên đề: Mô tả đặc điểm dân số học và biểu hiện lâm sàng BTCM
do enterovirus.
Báo cáo chuyên đề: Giá trị các mẫu bệnh phẩm và mật độ vi rút trong chẩn
đoán và tiên lượng BTCM.
Báo cáo chuyên đề: Yếu tố tiên lượng BTCM do Enterovirus.



3
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc:
Bệnh tay chân miệng do vi rút đường ruột (Enterovirus) gây ra, bệnh có khả năng
lây lan rất cao qua đường tiêu hóa. Enteroviruses (EVs), một giống thuộc họ
Picornaviridae, là những vi rút có một chuỗi đơn RNA chia thành 71 nhóm huyết
thanh, gồm các nhóm echoviruses, coxsackie virus, polioviruses và các enterovirus
(EV). Riêng EV bao gồm các nhóm huyết thanh 68 đến 71. Trong đó coxsackie A16
(CA16) và enterovirus 71 (EV71) là hai tác nhân chính gây bệnh tay chân miệng
(BTCM) ở trẻ em. [20]
Bệnh có biểu hiện bằng loét miệng, phát ban dạng sẩn hoặc bóng nước vùng lòng
bàn tay, bàn chân, mông, gối. Hai tác nhân quan trọng là CA16 và EV71 có thể gây
thành dịch. EV71 còn gây ra những biến chứng nguy hiểm như viêm não, viêm cơ tim,

phù phổi cấp gây tử vong cao và rất nhanh. Trên thế giới từ năm 1974 BTCM do tác
nhân EV71 đã xuất hiện ở hầu hết các nước, và gây ra khoảng 13 trận dịch lớn nhỏ.
Trong đó đáng lưu ý là các trận dịch năm 1973 và năm 1978 tại Nhật Bản, tại Bungary
và Hungary vào những năm cuối của thập kỷ 70 với 4 trận dịch gây nhiều ca tử vong
do biến chứng viêm thân não, tại Malaysia và Đài Loan (Trung Quốc) năm 1997 -
1998. Trong thời gian xảy ra dịch tại Đài Loan (Trung Quốc) năm 1998 đã có trên
100.000 ca mắc bệnh và 78 ca tử vong. [15], [16], [20], [24], [28], [29]
Hiện nay bệnh còn xuất hiện thường xuyên theo mùa trong năm tại các nước Đông
nam Á và Đài Loan (Trung Quốc). Tại Đài Loan (Trung Quốc) đã có chiến lược kiểm
soát bệnh bằng cách xác định tác nhân gây bệnh từ đầu năm nhằm dự đoán có xảy ra
dịch hay không để có kế hoạch phòng ngừa. Các nghiên cứu cho thấy khi số ca BTCM
tăng, nếu tác nhân là EV71 thì số ca viêm não và biến chứng nặng cũng sẽ tăng theo.
Tại Đài Loan (Trung Quốc) và Singapore đã thiết lập hệ thống giám sát cảnh báo dịch
BTCM ở cấp quốc gia trong nhiều năm qua. [12], [29]

1.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
BTCM hiện nay đã trở thành một trong những bệnh phổ biến trong nhi khoa ở phía
Nam. Theo số liệu thống kê tại Bệnh viện Nhi Đồng 1 (BVNĐ1), tổng số lượt khám và
nhập viện do BTCM hàng năm tương đương với sốt xuất huyết Dengue. Bệnh lây qua


4
đường tiêu hóa và có nguy cơ phát triển thành dịch, đặc biệt là trong các môi trường
trẻ sống tập trung như nhà trẻ, mẫu giáo.
Từ năm 2002 – 2003, tại BVNĐ1 đã xuất hiện nhiều ca viêm não tối cấp, gây tử
vong rất nhanh ở trẻ nhỏ hơn 3 tuổi [11], [27]. Trong đó, một số trẻ có biểu hiện lâm
sàng điển hình của BTCM. Qua nghiên cứu tại BVNĐ1 phối hợp với Viện Pasteur
Thành phố Hồ Chí Minh (TPHCM), lần đầu tiên đã phân lập được EV71 trong phân
trẻ BTCM có biến chứng viêm não tại Việt nam vào ngày 04 tháng 8 năm 2003 [11].
Từ đó đến nay, số ca mắc BTCM gia tăng nhanh hàng năm. Năm 2006 đã có trên 2000

trường hợp mắc mới được chẩn đoán với trên 400 ca có biến chứng thần kinh, trong đó
63% trẻ bệnh thuộc địa bàn TPHCM. Nghiên cứu về tác nhân BTCM phối hợp giữa
BVNĐ1 và Viện Pasteur TP.HCM năm 2005 bằng phương pháp nuôi cấy đã xác định
được 2 tác nhân chính là CA16 và EV71, trong đó EV71 chiếm tỉ lệ 46% [22]
Trong những năm qua, nhờ công tác chủng ngừa, số trường hợp viêm não Nhật
Bản nhập viện đã giảm đáng kể so với những năm 90 của thế kỷ trước. Từ khi phát
hiện và chẩn đoán xác định BTCM, tỉ lệ viêm não liên quan đến BTCM gia tăng và
đến nay đã chiếm trên 50% tổng số trường hợp viêm não nhập viện tại BVNĐ1.
Những cải tiến về qui trình sàng lọc phát hiện ca bệnh nặng và xử trí tích cực, bước
đầu đã giúp giảm tỉ lệ tử vong từ 3,27% (năm 2005) xuống còn 1,23% (năm 2006).
Việc điều trị bằng gamma globuline cần phải thực hiện ở giai đoạn sớm khi chưa diễn
tiến đến giai đoạn cuối thì mới đảm bảo hiệu quả điều trị. Tuy nhiên, phương pháp
chẩn đoán cổ điển BTCM bằng phân lập vi rút là một phương pháp tốn kém, thời gian
có kết quả chậm nên ít có giá trị trong công tác điều trị do bệnh diễn tiến rất cấp tính
và tử vong từ 1-7 ngày.
Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy khả năng chẩn đoán với độ chính xác cao của
phương pháp khuếch đại chuỗi gen (Polymerase Chain Reation - PCR) trực tiếp từ
mẫu bệnh phẩm khi so sánh với phương pháp nuôi cấy. [17], [21], [25] Hơn nữa RT-
PCR được thực hiện trực tiếp từ bệnh phẩm nên tránh được trường hợp khó xác định
nhóm huyết thanh do dễ phản ứng chéo.
Sự phát triển của kỹ thuật Real-time RT-PCR có thể rút ngắn thời gian trả kết quả
nhanh hơn nữa so với RT-PCR cổ điển (2 giờ so với 10 giờ). Các nghiên cứu tại Đài
loan và Singapore [12], [17] cho thấy Real-time RT-PCR có độ nhạy cảm và đặc hiệu


5
cao hơn rất nhiều so với RT-PCR nên đáp ứng cả nhu cầu điều trị và nghiên cứu khi so
sánh với phân lập siêu vi và định danh bằng phản ứng trung hòa.
Trên cơ sở đó, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này với mong muốn bằng kỷ thuật
Real-time RT-PCR sẽ giúp chẩn đoán xác định tác nhân gây BTCM sớm, giúp xử trí

bệnh sớm hơn, đồng thời dự báo dịch sớm để có biện pháp khống chế dịch bệnh kịp
thời.
Nghiên cứu này nhằm giải đáp 2 giả thuyết chính :
- Sự gia tăng tỉ lệ bệnh nhân dương tính với EV71 có liên quan với cao điểm dịch
BTCM, nhờ đó có thể ứng dụng tỉ lệ này để dự báo dịch và can thiệp sớm.
- Nồng độ vi rút EV71 từ bệnh phẩm có liên quan đến mức độ biến chứng của
BTCM, nhờ đó có thể tiên lượng bệnh và điều trị sớm nhằm giảm biến chứng
và tử vong, đồng thời việc điều trị có chọn lọc cũng làm giảm đáng kể chi phí
điều trị do chi phí điều trị bằng gamma globuline rất cao.




6
CHƢƠNG II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung 1:
Bệnh phẩm: Các mẫu bệnh phẩm dịch não tủy (DNT), phết họng, phết trực tràng
được tách chiết theo qui trình, lưu giữ ở nhiệt độ âm 70
o
C cho tới khi thực hiện phản
ứng.
Hệ thống chuẩn và chứng dƣơng: Hệ thống chuẩn dựa vào chuẩn gốc do Viện
Nghiên Cứu Sức Khỏe Quốc Gia Đài Loan-Trung Quốc (National Health Research
Institute: NHRI) cung cấp là RNA của EV71 dưới dạng dung dịch có nồng độ 10
10

copies/ml. Dùng chuẩn này pha loãng thành các nồng độ chuẩn cho phép định lượng
EVs-RNA và làm chứng dương cho phản ứng Revere transcriptase PCR (RT-PCR)
định tính. Để có mẫu chuẩn, chúng tôi dùng bệnh phẩm có phản ứng PCR dương tính

mạnh với EV (băng điện di sáng và rõ nét) trộn lẫn với nhau (khoảng 5ml) và bảo quản
ở -70
o
C. Sau đó ly trích RNA-EV trong bệnh phẩm theo phương pháp Boom
(QIAmpMinElute Virus Kit), phân chia RNA đã ly trích được thành nhiều ống thử 30
l, lưu giữ ở -70
o
C. Lấy một ống thử chạy RealTime-PCR với chứng gốc pha loãng và
tìm được nồng độ của mẫu chuẩn. Pha loãng các mẫu chuẩn và chọn các độ pha loãng
có nồng độ tương ứng từ 10
2
đến 10
7
copies/ml làm các nồng độ chuẩn, để thực hiện
gam chuẩn và chứng dương cho phản ứng Realtime-PCR.
Ly trích EVs-RNA: Dựa trên nguyên tắc trong điều kiện biến tính cao khi nhiệt độ
được nâng lên, dưới tác động của QIAGEN Protease và dung dịch đệm AL cùng với
sự bất hoạt của men RNAse sẽ làm màng tế bào vi rút bị phá vỡ để phóng thích RNA.
Các RNA sẽ gắn kết tối đa vào màng silica khi cho thêm ethanol vào phản ứng. Các
protein và các chất khác (làm ức chế các phản ứng men trong chuỗi phản ứng PCR)
không bám được trên màng silica và sẽ bị loại bỏ sau khi rửa và ly tâm hai lần. Cuối
cùng RNA tinh sạch sẽ được thu giữ bằng dung dịch đệm thích hợp.
Cách thực hiện: Cho vào 1 ống thử Eppendorf nắp khóa 1,5ml: 200 l bệnh phẩm, 25
l Protease, 200 l dung dịch đệm AL (chứa RNA carrier). Vortex kỹ trong 15 giây,
sau đó ủ ở 56
o
C trong 15 phút. Ly tâm nhẹ, cho thêm vào 250 l ethanol nồng độ từ
96-100%. Vortex kỹ trong 15 giây, sau đó ủ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 5 phút.
Ly tâm nhẹ, chuyển tất cả dung dịch vào MinElute Column (QIAgen), ly tâm 8.000



7
vòng trong 1 phút. Chuyển qua ống thử thứ 2, cho thêm vào 500 l AW1, ly tâm 8.000
vòng trong 1 phút. Chuyển qua ống thử thứ 3, cho thêm vào 500 l AW2, ly tâm 8.000
vòng trong 1 phút. Chuyển qua ống thử thứ 4, cho thêm vào 500 l ethanol (96-100%),
ly tâm 8.000 vòng trong 1 phút. Chuyển qua ống thử thứ 5, ly tâm 14.000 vòng / phút
trong 3 phút. Sau đó chuyển MinElute Column qua một ống thử Eppendorf 1.5ml mới,
mở nắp và ủ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 5 phút. Thêm 30 l AE (nước cất
không có RNAse), ủ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 10 phút. Sau đó ly tâm 14.000
vòng trong 1 phút, cẩn thận hút 30 l vào ống thử Eppendorf 1.5ml mới. Dùng 10 l
dung dịch nổi này cho phản ứng Realtime-PCR.
Chứng âm: sử dụng môi trường vận chuyển làm chứng âm ly trích và dung dịch
TE1X làm chứng âm cho phản ứng Realtime-PCR.
Thực hiện chẩn đoán bằng phản ứng khuếch đại chuỗi gien có sao chép ngƣợc:
Đối với mỗi mẫu bệnh phẩm, để xác định chẩn đoán chúng tôi áp dụng Qui trình chẩn
đoán 3 bước do Viện Nghiên Cứu Sức Khỏe Quốc Gia Đài Loan chuyên giao (đính
kèm qui trình thực hiện), gồm 3 bước: xác định EV bằng RT-PCR với đoạn mồi EV
(bước 1), nếu dương tính sẽ thực hiện tiếp bước 2 bằng phản ứng RT-PCR với đoạn
mồi EV71, trường hợp bước 2 có phản ứng dương tính sẽ thực hiện phản ứng Real-
time RT-PCR với đoạn mồi EV để xác định nồng độ vi rút trong mẫu bệnh phẩm.
Định tính EV-RNA và EV71-RNA bằng kỹ thuật RT-PCR: Hai cặp mồi đặc hiệu
cho EV (EV-F và EV-R) và EV71 (F-primer1705 và R-primer 2036) được thiết kế
nằm trong vùng VP1 của EV và EV71 genome cho sản phẩm khuếch đại theo thứ tự
lần lượt là 148bp và 331bp do NHRI cung cấp. Trình tự các đoạn mồi sử dụng trong
các phản ứng PCR như sau:
EV-F: 5'-CCCCTGAATGCGGCTAATC-3'
EV-R: 5'-GATTGTCACCATAAGCAGC-3'
F-primer1705: 5'-GTGGCAGATGTGATTGAGAG-3'
R-primer 2036: 5'-GTTATGTCTATGTCCCAGTT-3'
Sử dụng cặp mồi EV-F và EV-R trong phản ứng RT-PCR đầu tiên bằng bộ thuốc

thử One-Step RT-PCT (Qiagen, USA). Phương pháp khuếch đại định tính EV được
thực hiện trong những ống thử PCR 0.2ml với thể tích dung dịch 25µl chứa 5µl
MgCl
2
, 1µl EV-R, 1µl EV-F, 1µl enzymes, 5µl RNA ly trích. Phản ứng RT-PCR sẽ


8
được thực hiện trên máy luân nhiệt Genius (Techne, England) với trình tự các bước
như sau 50
o
C / 30 giây trong một chu kỳ, 95
o
C / 5 phút trong một chu kỳ; tiếp theo là
40 chu kỳ với 94
o
C / 30 giây, 58
o
C / 30 giây, 72
o
C / 01 phút; và cuối cùng là 72
o
C / 10
phút trong một chu kỳ. Sản phẩm khuếch đại PCR sẽ được quan sát dưới ánh sáng UV
sau khi điện di trên thạch 1,5% được chuẩn bị với dung dịch đệm 0.5X TBE. Các mẫu
dương tính sẽ được thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR với cặp mồi F-primer 1705 và R-
primer 2036 trên máy luân nhiệt Genius (Techne, England) với trình tự các bước như
sau 50
o
C / 30 giây trong một chu kỳ, 95

o
C / 5phút trong một chu kỳ; tiếp theo là 40
chu kỳ với 94
o
C / 30 giây, 50
o
C / 30 giây, 72
o
C / 01 phút; và cuối cùng là 72
o
C / 10
phút trong một chu kỳ. Tương tự như trên, sản phẩm khuếch đại PCR sẽ được quan sát
dưới ánh sáng UV sau khi điện di trên thạch 1,5% được chuẩn bị với dung dịch đệm
0.5X TBE. Mỗi lần thực hiện phản ứng RT-PCR đều chạy kèm theo một chứng dương
và hai chứng âm (một chứng âm ly trích và một chứng âm phản ứng PCR).
Định lƣợng EV71-RNA bằng kỹ thuật REAL-TIME PCR với đoạn dò
TAQMAN:
Thử nghiệm Realtime-PCR được phân tích trên máy LightCyler (Roche
Diagnostics). Bộ thuốc thử LightCycler RNA Amplification Kit Hybprobe (Roche
Diagnostics) đã được sử dụng trong phản ứng này. Đây là bộ thuốc thử cho phép sử
dụng một bước Realtime-PCR trên ống mao quản 10µl có chứa 0.4µl MgCl
2
, 0.5µl
EV-F, 0.5µl EV-R, 0.1µl TaqMan Hybprobe, 0.2 µl enzymes, 2 µl RNA ly trích. Phản
ứng Realtime-PCR được thực hiện với các bước sau: 55
o
C / 20 phút trong một chu kỳ,
95
o
C / 30 giây trong một chu kỳ; tiếp theo là 45 chu kỳ với 95

o
C / 5 giây, 57
o
C / 15
giây, 72
o
C / 6 giây; và cuối cùng là 40
o
C / 30 giây trong một chu kỳ. Để tiêu chuẩn
hóa phản ứng, mỗi lần thực hiện Realtime-PCR EV71 đều kèm theo bốn nồng độ
chuẩn có nồng độ từ 10
2
đến 10
5
cùng một chứng âm là TBX. Phân tích dữ liệu nhờ
vào phần mềm của hệ thống máy LightCycler 1.5 (Roche Diagnostics). Dữ liệu được
thu nhận ở giai đoạn bắt cặp và kéo dài (57
o
C) của mỗi chu kỳ; và chu kỳ ngưỡng
(threshold cycle: Ct) của các mẫu thử được xác định tại điểm mà ánh sáng huỳnh
quang phát ra vượt quá giới hạn nền. Đường cong chuẩn được vẽ tự động dựa vào các
giá trị Ct của mỗi một nồng độ chuẩn đã biết. Hệ số tương quan của mỗi lần chạy
Realtime-PCR phải đạt trên 0.98 và hiệu suất PCR từ 90 đến 100%. Số bản copies của
RNA trong mẫu thử được tính dựa vào phép nội suy từ đường cong chuẩn.


9
Tóm tắt qui trình thực hiện xét nghiệm PCR:
- Bệnh phẩm: phết họng, phết trực tràng, phết bóng nước, dịch não tủy
- Môi trường chuyên chở: Môi trường EMEM-Earle + Gelatin + Antibiotics +

Amphotericin B
- Xử lý bệnh phẩm và ly trích RNA từ bệnh phẩm: Sử dụng QIAamp MinElute
Virus Spin kit (QIAGEN 57704) để ly trích RNA từ bệnh phẩm theo qui trình
chuẩn của NHRI (Đài Loan - Trung Quốc).
- Qui trình thử nghiệm One-Step RT-PCR đối với Enterovirus (NHRI, Đài Loan -
Trung Quốc)
o Thuốc thử : QIAGEN One-Step RT-PCT kit (57704)
o Máy PCR : Genius (Techne, England)
o Đoạn mồi (Primer) : EV-F, EV-R, 148bp
o Chương trình :
50
o
C 30 phút 1 chu kỳ
95
o
C 05 phút 1 chu kỳ
94
o
C 30 giây }
58
o
C 30 giây } 40 chu kỳ
72
o
C 01 phút }
72
o
C 10 phút 1 chu kỳ
04
o

C forever
- Qui trình thử nghiệm One-Step RT-PCR đối với EV71 (NHRI, Đài Loan -
Trung Quốc)
o Thuốc thử : QIAGEN One-Step RT-PCT kit (57704)
o Máy PCR : Genius (Techne, England)
o Đoạn mồi (Primer) : F-primer 1705, R-primer 2036, 331bp
o Chương trình :
50
o
C 30 phút 1 chu kỳ
95
o
C 05 phút 1 chu kỳ
94
o
C 30 giây }
50
o
C 30 giây } 40 chu kỳ
72
o
C 01 phút }
72
o
C 10 phút 1 chu kỳ
04
o
C forever



10
- Qui trình thử nghiệm One-Step TaqMan probe for Real-time RT-PCR đối với
EV (NHRI, Đài Loan - Trung Quốc)
o Thuốc thử: LC RNA Amplification Kit Hybprobe (Roche Diagnostics)
o Máy RealTime PCR : Light Cycler 1.5 (Roche Diagnostics)
o Đoạn mồi (Primer) : EV-F, EV-R, Amplicon size: 148bp
o Chương trình :
RT (sao chép ngược): 55
o
C 20phút 01 chu kỳ
Denaturation (tháo xoắn): 95
o
C 30giây 01 chu kỳ
Amplification (khuếch đại):95
o
C 05 giây
57
o
C 15 giây 45 chu kỳ định lượng
72
o
C 06 giây
Cooling (làm lạnh): 40
o
C 30 giây 01 chu kỳ

2.2 Nội dung thứ 2 đến nội dung 6:
Đối tƣợng nghiên cứu:
- Tất cả bệnh đến khám hay nhập viện tại bệnh viện nhi đồng 1 có chẩn đoán lâm
sàng BTCM.

Định nghĩa ca bệnh:
- BTCM: có một trong các dấu hiệu sau
o Sang thương điển hình ở miệng: vết loét đỏ hay bóng nước đường kính
2-3 mm ở vòm khẩu cái, niêm mạc má, nướu, lưỡi.
o Bóng nước có kích thước 2-10 mm ở lòng bàn tay, bàn chân, gối, mông
có tính chất: hình bầu dục, nổi cộm hay ẩn dưới da, trên nền hồng ban,
không đau, khi bóng nước khô để lại vết thâm, không loét.
- BTCM có biến chứng: đủ tiêu chuẩn chẩn đoán BTCM kèm theo một trong các
biểu hiện sau:
o Run chi hay giật mình
o Yếu liệt chi hay liệt thần kinh sọ
o Co giật hoặc hôn mê
o Phù phổi hoặc trụy mạch
o Dịch não tủy có số lượng tế bào bạch cầu > 5 tế bào/mm3


11
- BTCM có biến chứng nặng: đủ tiêu chuẩn chẩn đoán BTCM kèm theo một
trong các biểu hiện sau:
o Viêm cơ tim
o Viêm não
o Phù phổi cấp
- Tiêu chuẩn loại trừ:
o Gia đình bệnh nhi không đồng ý tham gia nghiên cứu
o Tổn thương da do vi trùng
Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu mô tả tiến cứu
Điểm nghiên cứu: tại BVNĐ1 - TP. HCM
Thời gian chọn ca bệnh vào nhóm nghiên cứu: tháng 4/2007 đến tháng 3/2008
Ƣớc tính cỡ mẫu:
- Dựa trên kết quả nghiên cứu thử nghiệm tại BVNĐ1, tỉ lệ phát hiện EV bằng

RT-PCR là 67%.
- Kết quả nghiên cứu hợp tác giữa BVNĐ1 và Viện Pasteur TPHCM, tỉ lệ
EV71/EV là 50%.
- Tổng số bệnh nhân tay chân miệng đến khám trong năm 2006 tại BVNĐ1 là
2225 bệnh nhân.
- Ước tính cỡ mẫu nghiên cứu mô tả dựa vào chương trình Epi Info 2002:
Ước tính tổng số ca nhiễm EV71 được phát hiện: 740 = 67% x 50% x 2225
Tỉ lệ biến chứng của BTCM do EV71: 50%
Sai số xa nhất chấp nhận được: 5% (10% x 50%)
Alpha: 95%
Đưa tất cả thông số trên vào chương trình tính cỡ mẫu trong EPI INFO 2002:
n (EV71) = 125 x n (bệnh tay chân miệng) = 400
Các bệnh phẩm đƣợc thu thập trong nghiên cứu để thực hiện xét nghiệm PCR:
- Phết trực tràng : bằng 1-2 que và cho ngay vào môi trường chuyên chở vi rút
- Phết họng : 1- 2 que rồi cho vào môi trường chuyên chở vi rút
- Phết bóng nước còn tươi và cho vào môi trường chuyên chở vi rút.
- DNT: 1-2 ml DNT được cho vào môi trường chuyên chở vi rút.


12
Tất cả bệnh nhân được lấy mẫu phết họng, phết trực tràng và phết bóng nước
(nếu bóng nước chưa khô). Bệnh nhân nghi ngờ có biến chứng thần kinh sẽ được
chọc dò tủy sống để lấy bệnh phẩm dịch não tủy.
Bệnh phẩm thực hiện xét nghiệm PCR được cho ngay vào môi trường chuyên
chở: EMEM-Earle + Gelatin + Antibiotics + Amphotericin B.
Thực hiện xét nghiệm chẩn đoán và điều trị:
- Thực hiện tất cả các xét nghiệm chẩn đoán theo phân loại độ nặng và điều trị
theo phác đồ điều trị BTCM tại bệnh viện hiện nay.
- Trường hợp có biểu hiện thần kinh, thực hiện xét nghiệm ion đồ, đường huyết,
xét nghiệm sinh hoá - tế bào dịch não tuỷ, nuôi cấy dịch não tuỷ và cấy máu.

- Trường hợp có suy hô hấp hay biến chứng tim mạch thực hiện thêm xét nghiệm
Xquang phổi, ECG, siêu âm tim.
- Xét nghiệm PCR được thực hiện theo qui trình sau :
o Thực hiện RT-PCR chẩn đoán Enterovirus cho tất cả các mẫu bệnh
phẩm (đoạn mồi EV).
o Nếu RT-PCR dương tính với Enterovirus : thực hiện RT-PCR chẩn đoán
EV71 (đoạn mồi EV71).
o Nếu RT-PCR dương tính với EV71 : thực hiện Real-time RT-PCR (sử
dụng đoạn mồi Enterovirus chung, không sử dụng đoạn mồi đặc hiệu EV
71 để có độ nhạy cảm cao hơn).



13
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Nội dung 1: Xác định tác nhân gây BTCM do EV71 bằng kỹ thuật Real-
time RT-PCR
Định chuẩn xét nghiệm Real-time RT-PCR
Qui trình chẩn đoán EV71 ba bước gồm 2 phản ứng RT-PCR kết hợp với 1 phản
ứng Real-time PCR đã được nghiên cứu chứng minh về độ nhạy cảm và độ đặc hiệu.
Chúng tôi chỉ áp dụng qui trình được chuyển gia từ NHRI nên không cần thiết lập lại
các bước xác định độ nhạy cảm và độ đặc hiệu của phản ứng, mà chỉ thực hiện chuẩn
hóa xét nghiệm trong điều kiện cụ thể của phòng xét nghiệm BVNĐ1 thông qua việc
xác định độ lập lại của kết quả xét nghiệm và mức độ biến thiên.
Xây dựng đường cong chuẩn: Với hệ thống mẫu chuẩn được thiết kế dựa trên
chuẩn gốc, chúng tôi thực hiện phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes với hệ thống
mẫu chuẩn này pha loãng có nồng độ EV-RNA từ 10
2
copies cho tới 10

5
copies/ml.













Từ kết quả phản ứng Real-time PCR dựa trên chuẩn gốc, chúng tôi thiết lập đường
cong chuẩn cho phản ứng. Kết quả (hình 2) cho thấy đường cong chuẩn của phản ứng
có tương quan tuyến tính khi nồng độ EV71-RNA của mẫu chuẩn nằm trong giới hạn
từ 10
2
đến 10
5
copies/ml.
Để đánh giá mức độ tin cậy của phản ứng Real-time PCR thực hiện tại phòng thí
nghiệm BVNĐ1, chúng tôi nghiên cứu về độ lập lại của kết quả phản ứng cho một
mẫu chuẩn được thực hiện phản ứng trên nhiều ống nghiệm khác nhau trong cùng một
lần chạy phản ứng, cũng như những lần thực hiện phản ứng khác nhau.
Hình 1: Chu kỳ ngưỡng của hệ thống mẫu
chuẩn pha loãng có nồng độ từ 10
2

copies cho
tới 10
5
copies/phản ứng trong phản ứng
Realtime-PCR với Taqman probes trong định
lượng EV-RNA


Hình 2: Đường cong chuẩn của Real-Time
PCR với Taqman Probes định lượng EV-RNA


14
Bảng 1 và 2 trình bày độ lập lại của kết quả xét nghiệm trên gam chuẩn có nồng độ
vi rút thay đổi từ 10
2
đến 10
5
copies/ml.




Nồng độ
Lần 1
Lần 2
Lần 3

Nồng độ
Trung

bình
Độ
lệch
chuẩn
CV
(%)
10
5

26,24
26,50
26,79

10
5

26,5
0,22
1
10
4

30,02
30,26
30,16

10
4

30,15

0,10
0,5
10
3

33,39
33,66
33,76

10
3

33,60
0,16
0,47
10
2

37,73
37,97
37,16

10
2

37,62
0,39
1,04
(Ct: Threshold Cycle – Chu kỳ ngưỡng) (CV = coefficient of variation - hệ số biến thiên)


Độ lập lại của phản ứng là khả năng lập lại kết quả xét nghiệm của cùng một mẫu
thử, khi phản ứng được thực hiện nhiều lần khác nhau.
Để khảo sát độ lập lại của các mẫu thử lâm sàng, chúng tôi sử dụng 3 mẫu ly trích
có phản ứng RT-PCR dương tính với EV71 trên xét nghiệm PCR định tính, mỗi mẫu
lập lại 4 lần trong cùng một lần chạy phản ứng real-time PCR, và chạy như vậy trong 3
lần khác nhau. Kết quả trong bảng 3 và 4 cho các giá trị về nồng độ của mẫu mỗi lần
lập lại trong một lần phản ứng và trong các lần chạy phản ứng khác nhau.




Mẫu
số
EV71-RNA
(Copies/ml)
Trung
bình
Độ
lệch
chuẩn
CV
(%)

Mẫu
số
EV71-RNA
(copies/ml)
/ngày
Trung
bình

Độ
lệch
chuẩn
CV
(%)
1
Ống 1: 2,4 x
10
5


2,42
x 10
5


0,11

4,5

1
Lần 1: 2,42
x 10
5

2,64
x 10
5

0,16

6,1
Ống 2: 2,4 x
10
5

Lần 2: 2,7 x
10
5

Ống 3: 2,6 x
10
5

Lần 3: 2,8 x
10
5

Ống 4: 2,3 x
10
5


2
Ống 1: 8,9 x
10
3

8,77
x 10
3


0,22
2,5

2
Lần 1: 8,77
x 10
3

8,39
x 10
3

0,28
3,34
Ống 2: 8,9 x
10
3

Lần 2: 8,3 x
10
3

Ống 3: 8,9 x
10
3

Lần 3: 8, 1
x 10
3


Ống 4: 8,4 x
10
3


Bảng 1: Độ lập lại của chu kỳ ngưỡng (Ct) ứng
với các nồng độ chuẩn trong 3 lần chạy liên tiếp
của phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes phát
hiện và định lượng EV71

Bảng 2: Dữ liệu của đường cong chuẩn
với FAM-490 (Ct)
Bảng 3: Sự biến thiên trong một lần phản
ứng của phản ứng Realtime-PCR Taqman
Probes phát hiện và định lượng EV71
Bảng 4: Sự biến thiên giữa các lần khác
nhau của phản ứng Real-Time PCR Taqman
phát hiện và định lượng EV71


15
Hình 3: Độ lập lại của 4 lần chạy của
cùng một mẫu trong cùng một đĩa

Mẫu
số
EV71-RNA
(Copies/ml)
Trung

bình
Độ
lệch
chuẩn
CV
(%)

Mẫu
số
EV71-RNA
(copies/ml)
/ngày
Trung
bình
Độ
lệch
chuẩn
CV
(%)
3
Ống 1: 7,4 x
10
7

7,77
x 10
7


0,41


5,2

3
Lần 1: 7,77
x 10
7

7,79
x 10
7

0,25
3,1
Ống 2: 7,9 x
10
7

Lần 2: 8,1 x
10
7

Ống 3: 7,4 x
10
7

Lần 3: 7,5 x
10
7


Ống 4: 8,4 x
10
7



Phản ứng Real-time RT-PCR được xem là
chính xác khi có sự tương đồng với kết quả của
phản ứng RT-PCR định tính đối với EV71. Phản
ứng Real-time RT-PCR sử dụng đoạn mồi EV có
độ chính xác tốt bắt buột phải dương tính nếu
phản ứng RT-PCR trên mẫu thử trước đó dương
tính với EV71 và ngược lại. Để nghiên cứu độ
chính xác của phản ứng Realtime-PCR Taqman
Probes phát hiện EV71, chúng tôi thực hiện phản ứng định lượng này trên 100 mẫu
bệnh phẩm phết họng gồm 90 mẫu dương tính và 10 mẫu âm tính với EV/EV71 bằng
phương pháp RT-PCR. Có 10 mẫu lập lại với 5 mẫu dương và 5 mẫu âm tính. Kết quả
của phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes định lượng EV71 phù hợp với phản ứng
RT-PCR. Các mẫu dương lặp lại đều có chu kỳ ngưỡng gần giống nhau với hệ số biến
thiên < 5% và mẫu âm thì đường biểu diễn nằm dưới ngưỡng phát hiện.

Hình 4: Hình ảnh khuếch đại của EV71-RNA
trong các mẫu thử khi thực hiện Realtime-
PCR Taqman Probes

Hình 5: Đường cong chuẩn của Realtime-PCR
Taqman Probe định lượng EV71-RNA


16

Kết quả của các mẫu lâm sàng cũng có tương quan tuyến tính với hệ số góc tương
tự với mẫu chuẩn (hai đường cong chuẩn trùng khớp nhau) (hình 5).
Kỹ thuật định lượng EV71 bằng phương pháp Realtime-PCR Taqman Probes với
ưu điểm sử dụng các mồi đặc hiệu và đoạn dò đặc hiệu giúp tạo ra các sản phẩm đặc
hiệu sẽ làm tăng tính đặc hiệu của phản ứng. Chu kỳ ngưỡng được ghi nhận khi mà tín
hiệu huỳnh quang của mẫu phát ra cao hơn tín hiệu nền. Dựa trên chu kỳ ngưỡng của
các chất chuẩn và số bản sao của các chuẩn đã biết mà từ đó người ta có thể định
lượng được số bản sao RNA có trong mẫu bệnh phẩm.
Hệ thống mẫu chuẩn được chúng tôi sử dụng dựa trên chuẩn gốc do NHRI cung
cấp, từ đó chúng tôi có gam chuẩn với nồng độ từ 10
2
copies cho tới 10
7
copies/ml.
Khi thực hiện Realtime-PCR Taqman Probes, chúng tôi có kết quả phản ứng với hệ số
tương quan là 1, độ cong là -3,478, hiệu suất PCR là 93, 9 và phương trình Y= -
3,478X + 44,151. Các giá trị chu kỳ nguỡng Ct của các chuẩn này ổn định trong các
lần chạy định lượng khác nhau (CV< 10%) (bảng 1), cho thấy mức độ ổn định của
định lượng EV71 bằng Taqman Probes. Ngoài ra với 4 nồng độ này cách nhau 10 độ
pha loãng thì chu kỳ ngưỡng của chúng đi từ chuẩn có nồng độ cao nhất cho đến nồng
độ kế tiếp cách nhau 3, 3 cho đến 3,7. Điều này nói lên tính chất tuyến tính của phản
ứng.
Về độ lập lại của phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes, kết quả các số liệu
trong bảng 2 cho thấy các giá trị số lượng bản sao của các mẫu mỗi lần lặp lại trong
một lần phản ứng và trong các lần chạy phản ứng khác nhau có hệ số biến thiên
CV<10%, chứng tỏ không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê trong một lần chạy và
giữa các lần chạy khác nhau, điều đó cho thấy phản ứng Realtime-PCR Taqman
Probes định lượng EV71-RNA có tính đồng nhất, không thay đổi trong các ống thử
phản ứng khác nhau có cùng nồng độ mẫu thử.
Về độ chính xác của phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes, khi tiến hành thử

nghiệm trên 90 mẫu phết họng dương tính và 10 mẫu phết họng âm tính với EV/EV71
bằng phương pháp RT-PCR, chúng tôi thu được các kết quả của những lần chạy
Realtime-PCR này với hệ số tương quan và hiệu quả cũng như các Ct của các nồng độ
chuẩn tương đối ổn định so với nghiên cứu ban đầu. Các mẫu phết họng dương tính có
Ct chạy từ 20 đến 40, với các mẫu có Ct xuất hiện sớm (trước chu kỳ 15), chúng tôi sẽ
tiến hành pha loãng mẫu EV-RNA đã được ly trích, sau đó kết quả sẽ nhân với hệ số