ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN




LÂM ĐỨC LẬP




NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH SẢN XUẤT BUTANOL
TỪ RƠM RẠ


Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC





NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS.HOÀNG QUỐC KHÁNH

TP. HỒ CHÍ MINH, 2011


ii

LỜI CẢM ƠN

Con xin ghi khắc công ơn của Cha Mẹ.

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Hoàng Quốc Khánh người đã
tận tình chỉ bảo và cho em những lời khuyên quý báu, tạo điều kiện cho em
thực hiện đề tài này.

Em xin cám ơn Ban lãnh đạo Viện Sinh học nhiệt đới đã cho phép em làm
việc tại viện.

Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến các Thầy, Cô trong khoa Sinh học, Trường
Đại học Khoa học Tự nhiên đ
ã cho em những kiến thức quý báu trong thời
gian em học tập tại trường.

Em cũng xin cám ơn chị Đào Thị Thu Hiền và các cán bộ khác của Viện
Sinh học nhiệt đới đã nhiệt tình giúp đỡ em trong suốt thời gian làm luận
văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn cùng làm việc tại phòng thí nghiệm Vi

Sinh , viện Sinh học nhiệt đới đã giúp đỡ trong thời gian tôi làm luận văn.


TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 5 năm 2011

Lâm Đức L
ập


iii
MỤC LỤC
Lời cảm ơn ii
Muc lục iii
Danh sách các từ viết tắt v
Danh mục bảng vi
Danh mục hình vii
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 SƠ LƯỢC VỀ BIOFUEL 3
1.2 BUTANOL 4
1.2.1 Butanol 4
1.2.2 Butanol sinh học 7
1.3 CÁC NGUỒN BIOMASS CHÍNH Ở VIỆT NAM 7
1.4 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA RƠM RẠ 8
1.5 CÁC ENZYM TRONG QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN RƠM RẠ 9
1.5.1 Giới thiệu sơ lược enzym. 9
1.5.2 Bộ Biomass Kit 10
1.5.3 Enzyme sử dụng trong quá trình thủy phân rơm rạ 11
1.5.3.1 Cellulase 11

1.5.3.2 β-glucanase. 12
1.5.3.3 Hemicellulase 13
1.5.3.4 Xylanase 14
1.6 QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BUTANOL TỪ RƠM RẠ 14
1.6.1 Tiền xử lý rơm rạ 15
1.6.1.1 Mục đích nguyên tắc và tầm quan trọng của việc tiền x
ử lý 15
1.6.1.2 Các phương pháp tiền xử lý 15
1.6.2 Thủy phân 18
1.6.3 Lên men Acetone- Butanol 19
1.6.3.1 Khái niệm chung 19

1.6.3.2 Các quá trình chuyển hóa trong sự lên men 20
1.6.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men 25
1.7 CLOSTRIDIUM SACCHAROBUTYLICUM 30
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 31
2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 32

2.2 NGUYÊN LIỆU DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT SỬ DỤNG 32
2.2.1 Nguyên liệu 32
2.2.2 Các thiết bị sử dụng 32
2.2.3 Hóa chất sử dụng 33
2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG 33
2.3.1 Tiền xử lý rơm rạ 33
2.3.2 Xử lý enzym 34
2.3.3 Xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp DNS 34

iv
2.3.4 Phương pháp đo nồng độ Glucose, ABE 34
2.3.5 Phương pháp hoạt hóa vi khuẩn và lên men 35

2.3.5.1 Cấy và bảo quản vi khuẩn 35
2.3.5.2 Phương pháp nhân giống 36
2.3.5.3 Phương pháp đếm vi khuẩn 36
2.3.5.4 Phương pháp lên men 37
2.3.5.5 Phương pháp lấy mẫu 38
2.3.5.6 Phương pháp nhuộm đơn 39
2.4 CÁC BƯỚC THÍ NGHIỆM 39
2.4.1 Sơ đồ nghiên cứu 39
2.4.2 Giai đoạn tiền xử lý rơm rạ 40
2.4.2.1 Tiền xử lý bằng tác nhân vật lý 40
2.4.2.2 Tiền xử lý bằng tác nhân hóa học 40
2.4.3 Thủy phân bằng enzym: 42
2.4.3.1 Tối ưu hóa tổ hợp enzym 42
2.4.3.2 Tối ưu hóa nhiệt độ của tổ hợp enzym 43
2.4.3.3 Tối ưu pH của tổ hợp enzym: 44
2.4.3.4 Thủy phân rơm rạ đã xử lý cồn bằng Biomass Kit 45
2.4.3.5 Thủy phân rơm rạ đã xử lý acetone bằng Biomass Kit 46
2.4.4. Lên men 47
2.4.4.1 Chuẩn bị dịch lên men: 47
2.4.4.2 Lên men đối chứng 48
2.4.4.3 Khảo sát các điều kiện tối ưu cho quá trình lên men 48
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ
VÀ THẢO LUẬN 52
3.1 TIỀN XỬ LÝ RƠM RẠ BẰNG DUNG MÔI HỮU CƠ: 53
3.2 THỦY PHÂN RƠM RẠ BẰNG BIOMASS KIT 56
3.2.1 Tối ưu hóa tổ hợp enzym. 56
3.2.2 Tối ưu hóa nhiệt độ của tổ hợp enzym. 57
3.2.3 Tối ưu pH của tổ hợp enzym. 59
3.2.4 Thủy phân rơm rạ đã xử lý cồn bằng Biomass Kit 60
3.2.5 Thủy phân rơm rạ đã xử lý acetone bằng Biomass Kit. 61

3.2.6 Tổng kết giai đoạn th
ủy phân bằng enzym 63
3.3 KẾT QUẢ GIAI ĐOẠN LÊN MEN. 64
3.3.1 Phản ứng với lượng lớn để thu dịch lên men: 64
3.3.2 Lên men đối chứng 66
3.3.3 Khảo sát các điều kiện tối ưu cho quá trình lên men. 67
3.4 TÍNH TOÁN HIỆU SUẤT. 70
3.5 THẢO LUẬN 71
CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 74
4.1 KẾT LUẬN 75
4.2 ĐỀ NGHỊ. 76
TÀI LIỆU THAM KHẢO 77
PHỤ LỤC 81

vi
Danh mục bảng
Bảng 1.1 Tính chất của Butanol 5
Bảng 1.2 Các nguồn biomass chính ở Việt Nam năm 2000 8
Bảng 1.3 Thành phần của các nguyên liệu lignocellulose 9
Bảng 1.4 Vi khuẩn được sử dụng trong lên men acetone- butanol 28
Bảng 2.1 Xử lý hóa học bằng tác nhân cồn. 41
Bảng 2.2 Xử lý hóa học bằng tác acetone 41
Bảng 2.3 Tối ưu hóa tổ hợp enzym. 42
Bảng 2.4 Tối ưu hóa nhiệt độ của tổ hợp enzym. 44
Bảng 2.5 Tối ưu hóa pH của tổ hợp enzym. 45
Bảng 2.6 Thủy phân rơm rạ đã xử lý cồn bằng Biomass Kit 46
Bảng 2.7 Thủy phân rơm rạ đã xử lý acetone bằng Biomass Kit 47
Bảng 3.1 Kết quả các mẫu xử lý cồn theo thời gian. 53
Bảng 3.2 Kết quả các mẫu xử lý acetone theo thời gian. 54
Bảng 3.3 Lượng đường khử được tạo ra bởi các tổ hợp enzym khác nhau. 56

Bảng 3.4 Kết quả định lượng đường khử của các mẫu trong thí nghiệm 4. 58
Bảng 3.5 Kết quả định lượng đường khử của các mẫu trong thí nghiệm 5. 59
Bảng 3.6 Kết quả định lượng đường khử sau thủy phân các mẫu ngâm cồn. 60
Bảng 3.7 Lượng đường khử sau thủy phân các mẫu đã xử lý acetone 62
Bảng 3.8 Tổng kết giai đoạn thủy phân 63
Bảng 3.9a Kết quả xác định lượng rơm thu hồi. 65
Bảng 3.9b Kết quả định lượng đường khử của dịch thủy phân rơm rạ. 65
Bảng 3.10 Khảo sát khả năng lên men của giống 66
Bảng 3.11 Ảnh hưởng của pH lên quá trình lên men 67
Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình lên men 68
Bảng 3.13 Ảnh hưởng của hàm lượng giống lên quá trình lên men 69
Bảng 3.14 Tổng hợp các hiệu suất của quá trình: 71
Bảng 3.15 So sánh pH tại thời điểm tạo ra nhiều butanol 73



vii
Danh mục hình
Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của butanol 5
Hình 1.2 Tác dụng của từng enzyme trong cellulase 11
Hình 1.3 Hoạt động thủy phân của glucannase 12
Hình 1.4 Hoạt động của hemicellulase 13
Hình 1.5 Hoạt động của xylanase 14
Hình 1.6. Sơ đồ sản xuất butanol từ rơm rạ 15
Hình 1.7 Sự biến đổi lignocellulose qua tiền xử lý 15
Hình 1. 8 Sự tấn công của các enzyme lên cấu trúc cellulose 19
Hình 1.9 Các giai đoạn chuyển hóa của quá trình đường phân 20
Hình 1.10 Sơ đồ hình thành acid và dung môi 22
Hình 1.11 Sơ đồ hình thành butyrate 23
Hình 1.12 Sơ đồ hình thành ethanol 23

Hình 1.13 Sơ
đồ hình thành acetone 24
Hình 1.14 Sơ đồ hình thành Butanol 24
Hình 2.1 Bình lên men 100ml 37
Hình 2.2 Ảnh hưởng pH lên sự lên men 49
Hình 2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ lên sự lên men 50
Hình 2.4 Ảnh hưởng mật độ tế bào giống lên quá trình lên men 51
Hình 3.1 Khối lượng rơm sau khi tiền xử lý cồn 53
Hình 3.2 Khối lượng rơm sau khi tiền xử lý acetone 55
Hình 3.3 Lọc và thu hồi dung môi sau khi xử lý. 55
Hình 3.4 Lượng đường khử được tạo ra bởi các tổ hợp enzym khác nhau. 57
Hình 3.5 Lượng đường khử được tạo ra do hoạt
động của tổ hợp enzym với những
nhiệt độ khác nhau. 58
Hình 3.6 Lượng đường khử được tạo ra do hoạt động của tổ hợp enzym với
những pH khác nhau 59
Hình 3.7 Lượng đường khử sau thủy phân các mẫu đã xử lý cồn 60
Hình 3.8 Lượng đường khử sau thủy phân các mẫu đã xử lý acetone 62
Hình 3.9 Bình xử lý acetone sau 0 ngày( A) và sau 3 ngày (B) 64
MỞ ĐẦU
Xã hội loài người ngày càng đi lên, thời đại công nghệ ngày càng mở rộng.Vì
được sử dụng với nhu cầu quá lớn, các nguồn nhiên liệu cơ bản như than đá, dầu
mỏ ngày càng cạn kiệt.Việc sử dụng những nguồn nhiên liệu cơ bản đó cũng gây ô
nhiễm môi trường ngày càng lớn.
Trước tình hình đó, việc kiếm ra các nguồn nhiên liệu sạch thay thế cho các
nguồn nhiên liệu cơ b
ản là điều cấp bách.
Trên thế giới nhu cầu nhiên liệu ethanol , butanol đang phát triển nhanh chóng ở
các nước lớn như Hoa Kỳ, Trung Quốc, Ấn Độ, Braxin và Châu Âu nhằm mục tiêu
giảm sự tiêu thụ dầu mỏ và tăng sử dụng nhiên liệu sinh học.

Ở Việt Nam vấn đề sản xuất nhiên liệu sinh học ngày càng được chú trọng.
Nhiều nhà máy sản xuất cồn và bioethanol đang được đầu tư xây dự
ng và sản xuất
ethanol, butanol.
Mặt khác Việt Nam là quốc gia với truyền thống trồng lúa nước lâu năm. Hàng
năm sản lượng phụ phẩm nông nghiệp hay nói cách khác là rơm rạ được thải ra
nhiều, một phần nhỏ được sử dụng làm thức ăn cho gia súc hoặc làm phân bón
nhưng lượng sử dụng đó chỉ là một phần so với lượng thải ra. Trong khi đó rơm rạ
là một nguồn nguyên li
ệu giàu lignoxenlulose và hemixenlulose có khả năng
chuyển đổi thành đường pentose và hexose.
Thêm vào đó, các nghiên cứu về quy trình tạo butanol từ nguồn nguyên liệu
biomass ở Việt Nam chưa có nhiều.Từ những vấn đề nêu trên, chúng tôi thực hiện
đề tài
“Nghiên cứu qui trình sản xuất butanol từ rơm rạ ”





LÂM ĐỨC LẬP


LUẬN VĂN THẠC SĨ

2









CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

LÂM ĐỨC LẬP

LUẬN VĂN THẠC SĨ

3
1.1 SƠ LƯỢC VỀ BIOFUEL
Nhiên liệu sinh học (còn được gọi là nhiên liệu từ nông nghiệp – Agofuel) theo
định nghĩa rộng là những nhiên liệu rắn, lỏng hay khí được chuyển hóa từ sinh khối.
Tuy nhiên, phần này chỉ đề cập chính đến nhiên liệu sinh học dạng lỏng được sản xuất
từ sinh khối.
Nói chung nhiên liệu sinh học mang lại những lợi ích sau:
- Giảm khí thải nhà kính
- Giảm gánh nặng lên nhiên liệ
u hóa thạch
- Tăng sự an toàn về năng lượng quốc gia
- Góp phần phát triển nông thôn
- Là nguồn năng lượng bền vững trong tương lai
Ngược lại, nhiên liệu sinh học cũng có một số hạn chế:
- Nguồn nguyên liệu phải được tái tạo nhanh
- Công nghệ sản xuất phải được thiết kế và tiến hành sao cho cung cấp nhiên
liệu lớn nhất vớ
i giá thấp nhất và mang lại mang lại lợi ích về môi trường
nhất.

Nhiên liệu sinh học là dạng nhiên liệu tái tạo nhắm đến tính chất trung tính về
carbon. Điều này có nghĩa là carbon được thải ra trong quá trình đốt cháy nhiên
liệu để cung cấp năng lượng vận chuyển hay sinh điện năng được hấp thụ và cân
bằng với lượng carbon hấp thụ bởi cây cối. Những cây này sau đó lại được thu
hoạch để tiếp tục sản xuất nhiên liệu, những nhiên liệu trung tính về carbon
không gây ra sự tăng carbon trong khí quyển, vì thế không góp phần vào hiệu
ứng trái đất nóng lên. [3]
Sau đây là một số loại nhiên liệu sinh học thế hệ đầu tiên theo phân loại của từ
điển bách khoa toàn thư trực tuyến Wikipedia.org:

LÂM ĐỨC LẬP

LUẬN VĂN THẠC SĨ

4
- Dầu thực vật: dầu thực vật có thể dùng làm nhiên liệu sử dụng cho rất nhiều
loại động cơ diesel đời cũ, và chỉ ở điều kiện khí hậu ấm áp.Trong đa số
trường hợp, dầu thực vật được sử dụng để sản xuất biodiesel.
- Biodiesel: được sản xuất từ dầu hoặc chất béo qua quá trình
Transesterification và là một chất lỏng giống như diesel từ dầu mỏ.
- Bioalcohols: là những rượu được sản xuất từ quá trình lên men sinh học.
Bioalcohols phổ biến là ethanol, rồi đến propanol và butanol.
- Biogas: được sinh ra từ quá trình tiêu hủy kỵ khí các chất hữu cơ bởi các vi
sinh vật kỵ khí. Sản phẩm phụ dạng rắn từ quá trình này có thể được sử
dụng làm nhiên liệu hoặc phân bón. Biogas chứa chủ yếu là methane.
- Nhiên liệu sinh học dạ
ng rắn: như gỗ, than hoặc phân khô.
Để đảm bảo an ninh năng lượng và bảo vệ môi trường bền vững, nhiều quốc gia
và các tổ chức quốc tế trong vài thập kỷ qua đã tập trung nghiên cứu sử dụng nhiên
liệu sinh học thay thế một phần nhiên liệu hóa thạch, tiến tới xây dựng ngành “nhiên

liệu sạch” cho quốc gia mình. Các nước đã nghiên cứu thành công mà sử dụng nhiên
liệu sinh học là Brazil, Mỹ
, Canada, Mexico, Châu Âu có Anh, Pháp, Đức, Tây Ban
Nha, Bỉ, Áo,… Châu Á có Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Nhật. Sở dĩ nhiều quốc gia
đẩy nhanh chương trình nghiên cứu và sử dụng nhiên liệu sinh học vì đã cam kết thực
hiện nghị định Kyoto về cắt giảm khí thải nhà kính và để đảm bảo an ninh năng lượng
khi nguồn dầu mỏ trở nên đắt đỏ và sẽ cạn dần vào cuối thế kỷ này.
1.2 BUTANOL
1.2.1 Butanol
Định nghĩa : n-Butanol hay n-butyl alcohol là một rượu bậc nhất với cấu trúc 4
carbon và cấu trúc phân tử C
4
H
10
O. Đây là một trong những loại rượu đặc biệt, với
hơn 2 nguyên tử carbon nhưng có thể hòa tan trong nước.

LÂM ĐỨC LẬP

LUẬN VĂN THẠC SĨ

5
Nguồn gốc : n-Butanol xuất hiện trong tự nhiên dưới dạng một sản phẩm phụ
của quá trình lên men đường và các hydrocarbon khác, có mặt trong nhiều loại thực
phẩm và đồ uống. n-butanol được sử dụng làm hương liệu nhân tạo tại Mỹ, trong bơ,
kem, trái cây, rượu rum, bánh, kẹo,… Nó cũng được sử dụng nhiều trong các sản
phẩm tiêu dùng.




Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của butanol




Bảng 1.1 Tính chất của Butanol
Tính chất
Công thức phân tử C
4
H
10
O
Khối lượng phân tử 74.122 g/mol
Nhận dạng Lỏng, không màu
Khối lượng riêng
0.8098 g/cm
3
(20 °C
Nhiệt độ đông đặc
-89.5 °C, 184 K, -129 °F
Nhiệt độ sôi
117.2 °C, 390 K, 243 °F
Khả năng hòa tan trong nước
7.7 g/100ml (20 °C)

LÂM ĐỨC LẬP

LUẬN VĂN THẠC SĨ

6

Hệ số khúc xạ
1.399 (20 °C)
Độ nhớt
3 cP (25 °C)
Moment lưỡng cực 1.52 D
Nhiệt hóa học
Enthalpy tạo thành Δ
f
H
o
298
−328±4 kJ/mol
Enthalpy đốt cháy Δ
c
H
o
298
−2670±20 kJ/mol
Entropy S
o
298
225.7 JK
−1/
mol
−1


n-Butanol được sản xuất trong công nghiệp từ nguyên liệu của hóa dầu
propylene. Propylene qua quá trình Hydroformylation sẽ chuyển hóa thành
butyraldehyde. Sau đó butyraldehyde được hydro hóa để thành n-butanol.

Ứng dụng của butanol:
Trong công nghiệp, n-butanol là nguyên liệu để sản xuất butyl acrylate, dibutyl
phthalate, dibutyl sebacate, và các loại esters, ete. Ngoài ra n-butanol còn được sử
dụng trong lĩnh vực dược phẩm, polymer, plastic,…
n-Butanol được sử dụng làm nguyên liệu tạo ra dầu bôi trơn và làm dung môi
để trích ly tinh dầu. n-Butanol cũng được sử dụng trong quá trình trích ly thuốc kháng
sinh, hoocmone, và vitamin; làm dung môi hòa tan sơn, lớp phủ, nh
ựa thiên nhiên,
nhựa tổng hợp, thuốc nhuộm, long não,… n-butanol còn được sử dụng như một chất
pha tạp trong lịnh vực dệt sợi, dầu thắng, chất tẩy rửa, tẩy nhờn, chống thấm, chất ổn
định, xử lý gỗ.
n-butanol đang có triển vọng sẽ thay thế nguyên liệu xăng dầu truyền thống
trong tương lai. Tiêu chuẩn cho việc pha trộn ethanol hay methanol vào xăng đã hiện
hành trên nhi
ều quốc gia, gồm có EU, Mỹ, Brazil. Ethanol pha trộn thông thường đang
thay thế cho xăng khoảng 5% đến 10%. Butanol có thể làm tốt việc này hơn ethanol
60%, tức thay thế cho xăng từ 8% tới 16%. Việc sử dụng butanol làm nhiên liệu sẽ

LÂM ĐỨC LẬP

LUẬN VĂN THẠC SĨ

7
giải quyết được khoảng 10% vấn đề năng lượng toàn cầu. Nhưng hiệu quả của butanol
vẫn chưa được định rõ bởi một nghiên cứu nào.
Một số ứng dụng khác của n-butanol: da nhân tạo, butyl este, kẹo cao su, tinh
dầu quả, sơn, phim chiếu bóng, phim chụp ảnh, áo mưa, tơ nhân tạo, kính an toàn,
vecni sơn mài, quần áo chống thấm.
1.2.2 Butanol sinh học
n-Butanol là một sản phẩm phụ của một s

ố quá trình lên men, trong đó giống
Clostridium cho ra n-butanol nhiều nhất, và các nghiên cứu hiện tại đang trên đường
làm tăng tối đa lượng n-butanol từ biomass. Butanol được sản xuất từ quá trình lên
men gọi là biobutanol. Quá trình này thường sử dụng các chủng vi khuẩn thuộc họ
Clostridium, thông thường nhất là Clostridium acetobutylicum, và Clostridium
Beijirinskii. Sản phẩm phụ của quá trình này gồm có: acetic, lactic, propionic acids,
acetone, isopropanpol và ethanol. [6] [27]
1.3 CÁC NGUỒN BIOMASS CHÍNH Ở VIỆT NAM
Ở Việt Nam cây lúa luôn giữ vị trí trung tâm trong nông nghiệp và kinh tế Vi
ệt Nam.
Rơm rạ chiếm một phần rất lớn trong các nguồn biomass ở Việt Nam.
Bảng 1.2 cho thấy vị trí và tiềm năng rất lớn của rơm trong viêc sử dụng làm nguồn
nguyên liệu. Rơm chiếm 62,6% trong tổng khối lượng biomass ở Việt Nam năm
2000 với lượng năng lượng chứa đựng là 866.600 GJ. Rơm hứa hẹn là một nguồn
năng lượng lớn cho nước ta.
Mặc dù rơm rạ là một nguồn năng lượng lớn, rơm rạ nói riêng và từ biomass nói
chung không được sử dụng một cách hiệu quả ở Việt Nam. Phần lớn rơm rạ được
bón trở lại ruộng sau khi thu hoạch, sử dụng làm chất đốt cho các hộ nhà nông, làm
thức ăn cho gia súc … hiệu suất sử dụng năng lượng của quá trình này chỉ được 10%.





LÂM ĐỨC LẬP

LUẬN VĂN THẠC SĨ

8
Bảng 1.2 Các nguồn biomass chính ở Việt Nam năm 2000 [4]

STT Biomass Lượng (triệu tấn
)

N
ăng lượng chứa
đựng (GJ)
Phần
trăm(%)

1 Gỗ từ nhà máy cưa 3,1 35,960 2,6
2 Gỗ đốt 12,4 186,000 13,4
3 Rác thải rắn 0,015 57 0
4
Rơm 61,9 866,600 62,6
5 T
r
ấu 5,6 63,840 4,6
6 Vỏ
b
ắp 4,8 60,000 1,3
7 Bã khoai
m
ì 0,6 7,500 0,5
8 Phế
p
hẩm cây
m
ía 1,5 18,750 1,4
9 Bã
m

ía 5,0 36,050 2,6
10 Vỏ đậu 0,1 1,250 0,1
11 Xơ và lá
d
ừa 5,8 104,400 7,5
12 Vỏ hạt cafe 0,3 4,670 0,3
Tổng 101,1 1,385,077

100


1.4 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA RƠM RẠ
Theo nghiên cứu của Howard R.L.1*, Abotsi E2., Jansen van Rensburg E.L.1 và
Howard S.3 thành phần rơm rạ bao gồm các thành phần chính được biểu diễn theo
bảng 1.3.Tuy nhiên thành phần hóa học của rơm rạ thay đổi tùy thuộc vào vùng miền,
khu vực và điều kiện nuôi cấy. Do đó theo nghiên cứu khác cho ta thấy trong rơm rạ
chứa các thành phần chủ yếu cũng bị thay đổi.









LÂM ĐỨC LẬP

LUẬN VĂN THẠC SĨ


9
Bảng 1.3 Thành phần của các nguyên liệu lignocellulose

(Nguồn Howard)
Ngoài ra, trong rơm rạ có nhiều đường pentose, thành phần chủ yếu của đường
pentose là xylose tiếp theo là arabinose và hexose.
Glucose 41-43.4%, Xylose 14.8-20.2%
Arabinose 2.7-4.5%, Mannose 1.8%
Galactose 0.4%
(Maiorella, 1985; Roberto et al.,2003).
Qua đó cho ta thấy nguyên liệu rơm rạ là một nguồn nguyên liệu tiềm năng với lượng
cao cellulose, hemicellulose hay nói cách khác nguyên liệu rơm rạ là nguồn nguyên
liệu lignocellulose có giá trị. [4]
1.5 CÁC ENZYM TRONG QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN RƠM RẠ[4]
1.5.1 Giới thiệu sơ lược enzyme

Enzyme là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học với mức
độ đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ tương đối thấp. Enzyme có trong tất cả các tế bào
sinh vật sống, là chất xúc tác sinh học.
Từ nhiều thập kỉ trước enzyme được sử dụng mang tính chất kinh nghiệm thuần
túy. Công nghệ enzyme ra đời mang lại một bước ngoặt mới trong sự phát triển về
nghiên cứu và ứng dụ
ng các enzyme.



LÂM ĐỨC LẬP

LUẬN VĂN THẠC SĨ


10

1.5.2 Bộ Biomass Kit
Các enzyme chính được sử dụng thủy phân nguyên liệu lignocellulose là NS50013
(cellulase) có thể bổ sung NS50010 (β-glucosidase). NS50013 sẽ bẻ gãy cellulose
trong nguyên liệu tiền xử lý thành cello-oligomer và cellobiose, trong khi NS50010 sẽ
chuyển đổi cellobiose thành glucose.

Phụ thuộc vào thuộc tính của nguyên liệu và phương pháp tiền xử lý, người ta sẽ
có sự kết hợp của NS50013 (cellulase), NS50010 (β-glucosidase), NS22036
(xylanase), NS22002 (hemicellulase), và NS50012 (multi-component complex) một
cách tươn ứng.
Để thu được sản lượng lớn nhất từ sự thủy phân enzyme. Sự trộn lẫn enzyme tốt
nhất phụ thuộc trên thành phần của các nhánh khác nhau (cellulose, hemicellulose,
lignin) trong cơ chất sinh khối.
• NS50013 (cellulast) là hỗn hợp các enzyme cellulase thực hiên vai trò xúc
tác bẻ gãy nguyên liệu cellulose thành glucose, cellobiose, và các đường đa khác.
Chúng có thể được sử dụng để giảm độ nhớt hoặc tăng sản lượng khai thác của các sản
phẩm khác nhau có nguồn gốc thực vật.

•
NS50010 (Novozyme) thành phần là enzym β-Glucosidase hay còn gọi là
cellobiase thủy phân cellobiose tạo thành glucose. NS50010 có thể được dùng để bổ
sung vào NS50013 để tăng năng suất của các loại đường lên men.
• NS50012 là hỗn hợp enzym bao gồm arabinase, β-glucanase, cellulase,
hemicellulase, pectinase, và xylanase. Thực hiện vai trò bẻ gãy vách tế bào ly trích
những thành phần có ích từ mô thực vật.
Enzym được sản xuất từ giống Asp. aculeatus.
• NS22036 là enzyme endo-xylanase tinh khiết sử dụng để thủy phân sinh
khối hemicellulose thành đường pentose.


LÂM ĐỨC LẬP

LUẬN VĂN THẠC SĨ

11
• NS22002 có hai enzyme chính β-Glucanase, xylanase, nhưng chúng cũng có
hoạt động của các enzyme khác là cellulase, hemicellulase, và pentosanase. Enzym
được sản xuất bởi sự lên men chìm của giống Humicolainsolen.


1.5.3 Enzyme sử dụng trong quá trình thủy phân rơm rạ
1.5.3.1 Cellulase
Cellulase là một loại enzyme, có thể được sản xuất từ nấm mốc, vi khuẩn hoặc
sinh vật đơn bào; có khả năng thủy phân cellulose và cả hemicellulose. Ký hiệu là EC
3.2.1.4.
Nhóm enzyme cellulase
Quá trình thủy phân cellulose tạo thành glucose được thực hiện nhờ sự tác dụng
hiệp đồng của 3 enzyme khác nhau
• “Endo-1,4-β-glucanases” (EG) hay 1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolases (EC
3.2.1.4), enzyme này sẽ tấn công ngẫu nhiên vào các cơ chất 1,4-β-glucan cả
tan và không tan.
• “Exo -1,4-β
-D-glucanases”
Bao gồm 1,4-β-D-glucan
glucohydrolase
(EC3.2.1.74), enzyme này có
tác dụng giải phóng D-glucose
từ 1,4-β-D-glucan và thủy phân
chậm D-cellobiose;



Hình 1.2 Tác dụng của từng enzyme trong cellulase[30]
Ngoài ra còn có enzyme 1,4-β-D-glucancellobiohydrolase (EC3.2.1.91) (CBH),
enzyme này sẽ giải phóng cellobiose từ 1,4-β-glucan.

LÂM ĐỨC LẬP

LUẬN VĂN THẠC SĨ

12
• “β-D-glucosidase” hay còn gọi là β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) có
tác dụng tạo thành D-glucose từ celobiose là cellodextrin, cũng như các olygomer của
glucose.

Nhóm enzyme endo và exo thường được gọi chung là enzyme cellulase, còn
β- glucosidase do có cấu trúc khác và cơ chế khác nên tách thành nhóm riêng.
Các nguồn sản xuất cellulase
Nấm mốc là một trong vi sinh vật chính sản xuất cellulase, mặc dầu một vài vi
khuẩn và xạ khuẩn đã cho biếu diễn về hoạt động sản xuất cellulase. Trichoderma và
Aspergillus thường dùng để sản xuất cellulase và sản xuất enzyme thô. Trichoderma
sản xuất lớn endo-ß-glucanase và exo-ß-glucanase, nhưng chỉ mức độ thấp ß-
glucosidase, trong khi
Aspergillus sản xuất lớn endo-ß- glucanase,ß-glucosidase, sản
xuất mức độ thấp exo-ß- glucanase. Trichoderma reesei QM-9414 được phân lập bởi
the U.S. Army Natick Laboratory, được lựa chọn là giống tốt nhất sản xuất cellulase.


1.5.3.2 β-glucanase
Glucanase sẽ tấn công trên các sợi cellulose giải phóng thành các đoạn, mảnh nhỏ

hơn của cellulose hay tạo ra các sản
phẩm sẽ được tấn công xa hơn bởi exo -
cellulase thành glucose tự do.
a. Endo-p-glucanase, 1,4 -ß-D-glucan
glucanohydrolase chia cắt ngẫu nhiên các
nhánh của chuỗi cellulose sản phẩm thu
nhận glucose và cello-oligo saccharide.
b. Exo-P- [29]glucanase, 1,4 -ß - D-
glucan cellobiohydrolase, exo-tấn công

Hình 1.3 Hoạt động thủy phân của glucannase

LÂM ĐỨC LẬP

LUẬN VĂN THẠC SĨ

13
trên đầu kết thúc không khử của cellulose với cellobiase như cấu trúc chủ yếu.
Exo-ß-glucanase được xem như nguyên nhân chia cắt trong liên kết hydro của
cellulose(Reese et al. 1950), theo sau đó bằng sự thủy phân của các cellulose có thể
dùng được với endo-ß-gucanase. Endo-ß-glucanase hoạt động ngẫu nhiên trên các
chuỗi cellulose,
trong khi exo-ß-glucanase hoạt động trên phần phơi ra chuỗi cellobiose hoặc
glucose.

1, 4 beta glucan + H
2
O —› các sợi cellobiose
Cellobiose + H2O —› glucose
Beta-glucanase có các ứng dụng khác như:

Tiêu hóa các sợi nhằm cứu chữa các bệnh giảm khả năng tiêu hóa như
malabsorption. Nó rất quan trọng trong cơ thể người vì con người không có khả năng
tổng hợp.

1.5.3.3 Hemicellulase


Hemicellulase là nhóm enzyme
bẻ gãy hemicellulose nên được bổ
sung vào thành phần thức ăn cho
vật nuôi, công nghiệp bánh nướng
và thành phần thực phẩm.

Hình 1.4 Hoạt động của hemicellulase [31]
Ứng dụng
Thường được kết hợp với amylase, glucanase, cellulase hoặc xylanase,
hemicellulase được sử dụng đầu tiên.

LÂM ĐỨC LẬP

LUẬN VĂN THẠC SĨ

14
Hemicellulase thương mại
các enzyme chứa các thành phần xylanase, mananase từ Aspergillus niger Product
Number H2125.
1.5.3.4 Xylanase

Xylanase
EC:3.2.1.8

Synonyms:endo-1,4-β-
xylanase
Xylanase xúc tác sự
thủy phân các liên kết 1,4-
β-D-xylosidic trong xylan
Hình 1.5 Hoạt động của xylanase.[40]
Ngoài ra vi sinh vật là nguồn giàu có các enzyme xylanase, sản xuất bởi các giống
và loài khác nhau của vi khuẩn, xạ khuẩn, và nấm mốc. Trong khi một vài loài
Bacillus tiết ra mức độ cao các xylanase ngoại bào, nấm mốc sợi nhỏ tiết ra lượng cao
protein ngoại bào, sự tiết ra xylanase thườ
ng phụ thêm vào các enzyme cellulotic- ví
dụ như loài Trichoderma, Penicillium và Aspergillus.


1.6 QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BUTANOL TỪ RƠM RẠ
Quy trình sản xuất:
Các biomass sẽ được tiền xử lý để tạo điều kiện cho enzym dễ hoạt động, sau
đó sẽ thủy phân bằng các enzym thích hợp cho ra dung dịch đường có chứa các loại
đường C5 và C6 và các loại đường co khả năng lên men khác. Giai đoạn lên men sẽ sử
dụng các vi sinh vật thích hợp để lên men tạo ra sản phẩm.



LÂM ĐỨC LẬP

LUẬN VĂN THẠC SĨ

15





Hình 1.6 Sơ đồ sản xuất butanol từ rơm rạ [4]
1.6.1 Tiền xử lý rơm rạ
1.6.1.1 Mục đích, nguyên tắc và tầm quan trọng của việc tiền xử lý
Cellulose có cấu trúc polyme mạch thẳng tuyến tính của các phân tử glucose được
nối liền nhau bằng liên kết ß (1-4) glycoside (Gardner, 1974). Có nhiều nhóm
hydroxyl (OH) nằm dọc chuỗi liên kết cellulose với các nhóm hydroxyl của các chuỗi
cellulose khác hình thành cấu trúc tinh thể chặt, kín.
Mục đ
ích của sự tiền xử lý làm giảm tinh thể của cellulose, tăng diện tích bề mặt
biomass, loại hemicellulose và bẻ gãy sự gắn dính của lignin.
Sự tiền xử lý làm cellulose dễ bị enzyme tác động, dễ dàng hơn trong việc chuyển
đổi các polymer cacbohydrate thành các đường, có thể lên men với sản lượng nhiều
hơn và tốc độ chuyển hóa nhanh hơn.
1.6.1.2 Các phương pháp tiền xử lý

Nguồn Dr. K. Subramanian 2009.
Hình 1.7 Sự biến đổi lignocellulose qua tiền xử lý
Enzym thủy
phân
Lên men

Biomass
Dung dịch
thủy phân
chứa đường
Các sản phẩm lên men
( acetone, butanol,
ethanol, CO2, H2 …)


LÂM ĐỨC LẬP

LUẬN VĂN THẠC SĨ

16
Lignocellulose của vách tế bào thực vật bao gồm các thành phần cellulose,
hemicellulose, pectin, lignin. Lignin trong thực vật tập trung vào không gian giữa các
tế bào và tích tụ ở đó. Lignin tan trong các dung môi thông thường và không bị thủy
phân trong các polysaccharide khác. Mặt khác lignin cùng với cellulose và
hemicellulose tạo nên cấu trúc bền chắc làm ảnh hưởng lớn đến hoạt động của
enzyme. Do đó cần phải có các quá trình tiền xử lý để xử lý lignin tạo điều kiện cho
quá trình thủy phân xảy ra tối ưu nhất. Các phương pháp ti
ền xử lý đã được nghiên
cứu như sau
• Lý học
Tiền xử lý vật lý sẽ làm tăng diện tích bề mặt sử dụng và kích thước của các lỗ,
làm giảm tinh thể, giảm đơn vị polyme của cellulose. Các phương pháp tiền xử lý vật
lý bao gồm: nổ hơi, xay nghiền và xử lý vi sóng. Trong đó phương pháp xay nghiền
được xem là bước đầu tiên của việc tiền xử lý cho tất cả các nguyên li
ệu. Xử lý vi
sóng phổ biến ở nhiều khu vực bởi vì hiệu quả nhiệt đốt nóng cao dễ dàng tổ chức
thực hiện, vi sóng có thể chuyển đổi siêu cấu trúc của cellulose, thoái hóa lignin và
hemicellulose trong các nguyên liệu lignocellulose. Tạo điều kiện thuận lợi cho
enzyme thủy phân rơm rạ.
• Hóa học
Kỹ thuật tiền xử lý hóa học lignocellulose thường sử dụng các phương pháp sau:
a. Tiền xử lý axit: các axit thường sử d
ụng là axit HCl và H
2

SO
4
. Các axit sẽ làm tan
hemicellulose điều đó dẫn đến các enzyme sẽ thủy phân cellulose tốt hơn. Tuy nhiên
dung dịch axit dư phải được trung hòa với kiềm như Ca(OH)
2
, NaOH, NH
4
OH. Các
muối tạo ra sau trung hòa sẽ ảnh hưởng đến sự lên men của giống vi sinh vật.[24]
[22][17]
b. Tiền xử lý oxi hóa: bao gồm sự thêm vào các dung dịch oxi hóa như hydrogen
peroxide hoặc acid peracetic vào biomass. Tiền xử lý loại bỏ hemicellulose và lignin
dẫn tới sự tăng lên của cellulose. Hydrogen peroxide tiền xử lý tiêu thụ oxi hóa loại bỏ

LÂM ĐỨC LẬP

LUẬN VĂN THẠC SĨ

17
thành lignin tháo gỡ và hòa tan lignin và làm mất mạng lưới lignocellulose như vậy cải
thiện khả năng tác động của enzyme.
c. Tiền xử lý alkali bao gồm sự ứng dụng của các dung dich kiềm như NaOH hoặc
KOH loại bỏ lignin và một phần hemicellulose, tăng hiệu quả thủy phân của enzyme
tới cellulose. Tiền xử lý kiềm bẻ gãy các liên kết ester giữa lignin, cellulose và
hemicellulose, ngăn ngừa sự vỡ ra từng mảnh của các polymer hemicellulose. Tiền xử
lý có th
ể thực hiện tại nhiệt độ thấp nhưng đòi hỏi thời gian dài và nồng độ bazơ
cao.[17]
d.Tiền xử lý ammonia khi phản ứng tiền xử lý ammonia đã có vài tính chất đáng quan

tâm. Nó có hiệu quả phản ứng đặc sắc cho nguyên liệu lignocellulose, tính chọn lọc
cao cho phản ứng với lignin. Nó dễ bay hơi cao làm cho nó dễ dàng thu nhận và sử
dụng lại. Nó không làm ô nhiễm và không ăn mòn hóa học. Phản ứng của aqueous
amonnia v
ới lignin chia cắt các liên kết C-O-C trong lignin tốt như các liên kết ether
và ester trong phức hợp lignin-carbohydrate. Trên thế giới hiện nay đã phát triển các
quy trình tiền xử lý amonia là ARP[21] [11], SSA, SSCF, AFEX [ 13,25,10] đã chứng
minh hiệu quả của phương pháp này.
e.Tiền xử lý Organosolv : Tiền xử lý Organosolv thuận lợi cho sự tiêu hóa của enzyme
chủ yếu bởi sự khử lignin và loại bỏ hemicellulose, phần còn lại rất giàu cellulose.
Quy trình Organosolv sử dụng các dung môi hữu cơ nóng như ethanol tại pH axit tới
việ
c cắt phân đoạn các thành phần biomass. Tuy nhiên phương pháp này vẫn có những
nhược điểm như sau: dung môi tiền xử lý Organosolvent mắc tiền, việc tách riêng, thu
hồi và dùng lại các dung môi đòi hỏi một quy trình tốn kém, yêu cầu sự đòi hỏi
nghiêm ngặt về ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự bay hơi và khả năng hòa tan. [15]





LÂM ĐỨC LẬP

LUẬN VĂN THẠC SĨ

18
• Tiền xử lý sinh học
Hiệu quả của tiền xử lý rơm rạ được sử dụng 4 loại nấm trắng thối rữa là
hanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor, Ceriporiopsis subvermispora, và
Pleurotus ostreatus có khả năng thay đổi cấu trúc trong thành phần của rơm rạ được

tiền xử lý tốt như sự thủy phân của các enzyme . [18] [12].
1.6.2 Thủy phân
Thủy phân là quá trình thủy giải các nguồn nguyên liệu thành dung dịch đường
có khả năng lên men.Glucose cấ
u thành khoảng 60% của đường tổng có giá trị trong
nguyên liệu cellulose.
Có 3 hướng chính để thủy phân rơm rạ:
a. Thủy phân cellulose bằng acid ở nhiệt độ và áp suất cao tạo glucose.
b. Dùng enzyme cellulase bẻ gãy mạch cellulose thành glucose.
c. Quá trình khí hóa: cellulose, biomass được đốt cháy không hoàn toàn, chuyển thành
syngas (CO
2
, CO, H
2
).
Trong đó phương pháp sử dụng enzyme để thủy phân cấu trúc của cellulose ưa chuộng
nhất.
Quá trình thủy phân bằng enzym bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như : cấu trúc nguyên
liệu, nhiệt độ , pH, nồng độ enzym, nồng độ cơ chất, ảnh hưởng của các chất kìm hãm.
Mỗi yếu tố đều có sự ảnh hưởng nhất định, tuy nhiên yếu tố nhiệt độ
và pH là ảnh
hưởng mạnh nhất.


LÂM ĐỨC LẬP

LUẬN VĂN THẠC SĨ

19


Nguồn theo Gustavo H. Goldman
Hình 1.8 Sự tấn công của các enzyme lên cấu trúc cellulose
1.6.3 Lên men Aceton-Butanol
1.6.3.1 Khái niệm chung
Lên men acetone - butanol là một dạng của quá trình lên men butyric, xảy ra
trong môi trường kị khí và pH môi trường lên men axít yếu. Tác nhân lên men là nhóm
vi khuẩn Clostridium, chúng lên men được Saccarose, polysaccarit, dịch thủy phân.
Sản phẩm chính là acetone, butanol, sản phẩm phụ là axit acetic, CO
2
, H
2
O.