L
LL
Lời
ii
i c
c c
cảm
mm
m

ơn
nn
n


• Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñối với
PGS.TS Lê Văn Phủng, thầy hướng dẫn trực tiếp tôi từ những ngày ñầu của
chuyên ngành vi sinh, người có ảnh hưởng lớn nhất ñối với tôi về sự cẩn thận, ý
thức trách nhiệm trong công việc.
• Tôi xin chân thành cảm ơn :
- Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo Sau ñại học trường Đại học Y Hà Nội,
- Các thầy cô, cán bộ công nhân viên Bộ môn Vi sinh ñã truyền ñạt kiến thức và
tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập.
• Tôi xin gửi lòng biết ơn chân thành tới:
- PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Linh, phó Viện trưởng Viện Kiểm ñịnh Quốc gia
Vắc xin và Sinh phẩm Y tế;
- Ban Lãnh ñạo, Phòng Kiểm ñịnh chất lượng Công ty Vắc xin và Sinh Phẩm
số 1;
- Ban Lãnh ñạo Trung tâm Nghiên cứu, Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế;
- Khoa Quản lý chất lượng Viện Kiểm Định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế;
- Th.S Nguyễn Thị Vân Anh, KTV Lê Thị Kim Thuỷ, KTV Phạm Thị Thu Phương,

chị Nguyễn Thị Ký, anh Đỗ Văn Minh cùng các ñồng nghiệp khác ñã giúp tôi
thực hiện thành công luận văn này.
• Cuối cùng, tôi bày tỏ tình cảm thân thương và lòng biết ơn ñặc biệt ñối
với gia ñình và người thân ñã luôn luôn ở bên cạnh tôi, giúp ñỡ, tạo ñiều kiện
cho tôi học tập, nghiên cứu.

Hà Nội, ngày 15 tháng 11 năm 2010

Nguyễn Thị Kiều

CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ATCC: American type culture collection
(Bộ sưu tập chủng mẫu của Mỹ)
BHB Brain heart broth
(Môi trường canh thang não tim)
CFU: Colony forming unit
(Đơn vị hình thành khuẩn lạc)
FTM :
Fluid thioglycollate medium
(Môi trường lỏng thioglycolat)
GSK Glaxo Smith Kline
(Công ty Glaxo Smith Kline)
HEPA High Efficiency Particulate Arresting
(Hệ thống lọc hiệu năng cao)
ICH International conference on Hamonisation
(Hội nghị hoà hợp quốc tế)
IVAC:
Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế
KĐQG: Viện Kiểm ñịnh Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế
MT:


Môi trường
LAL Limulus Amebocytes Lysate
(Phản ứng xác ñịnh nội ñộc tố)
NMSL: Nước muối sinh lý
OPV:
Vắc xin bại liệt uống
POLYVAC:

Trung tâm nghiên cứu, sản xuất vắc xin và sinh phẩm Y tế
SOP Standard Operating procedure
(Qui trình chuẩn)

TRS:
Technical report series
(Các hướng dẫn kỹ thuật của Tổ chức Y tế Thế giới)

TSA: Tryptic soy agar
(Thạch TSA)
TSB: Tryptic soy broth
(Canh thang TSB)
VABIOTECH:

Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1
VGB Vắc xin viêm gan B
VK: Vi khuẩn
VNNB:
Vắc xin viêm não Nhật Bản
VR: Vi rút
VX: Vắc xin

WHO: World health organization
(Tổ chức Y tế Thế giới)

MỤC LỤC
Trang
Đặt vấn ñề

1
Chương 1. Tổng quan tài liệu
1.1. Vắc xin
1.1.1. Các thành phần trong vắc xin

1.1.2. Các chất ức chế trong vắc xin

1.1.3. Các vắc xin sử dụng trong nghiên cứu

1.1.3.1. BCG

1.1.3.2. OPV
1.1.3.3. Vắc xin viêm gan B
1.1.3.4. Vắc xin viêm não Nhật Bản
1.2. Kiểm ñịnh vắc xin
1.2.1. Kiểm tra vô trùng
1.2.2. Nhận dạng
1.2.3. Xác ñịnh công hiệu

1.2.4. Kiểm tra an toàn chung
1.2.5. Kiểm tra an toàn ñặc hiệu…

1.2.6. Kiểm tra chất gây sốt


1.2.7. Kiểm tra các chỉ tiêu hoá lý

1.3. Thử nghiệm vô trùng
1.3.1. Các phương pháp kiểm tra vô trùng
1.3.2. Điều kiện thực hiện thử nghiệm vô trùng

1.3.3. Vai trò của con người trong thử nghiệm vô trùng
1.3.4. Môi trường dùng trong kiểm tra vô trùng
1.3.5. Các chứng âm, chứng dương của thử nghiệm vô trùng
1.3.6. Việc loại bỏ ảnh hưởng của các chất ức chế
3
3
3
4
5
5
5
6
6
7
8
9
9
10
10
11
12
13
13

15
18
18
21
23
1.3.7. Các thể tích môi trường thử nghiệm

1.3.8. Chủng mẫu
1.4. Quá trình hoàn thiện kỹ thuật kiểm tra vô trùng vắc xin tại Viện Kiểm
ñịnh Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế
1.4.1. Trước năm 2002
1.4.2. Năm 2002-2003

1.4.3. Năm 2004-2005

1.4.4. Từ 2006 ñến nay

1.4.5. Các tồn tại trong thử nghiệm vô trùng tại Viện Kiểm ñịnh Quốc gia
Vắc xin và Sinh phẩm Y tế

25
25

28
28
28
29
29

31

Chương 2: Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.2. Vật liệu
2.2.1. Môi trường, hoá chất

2.2.2. Vắc xin
2.2.3. Chủng mẫu
2.2.4. Trang thiết bị dụng cụ
2.3. Phương pháp nghiên cứu……………………………………………….

2.3.1. Thiết kế nghiên cứu
2.3.2. Nội dung nghiên cứu
2.3.3. Xác ñịnh thể tích môi trường
2.3.4. Xác ñịnh hàm lượng thimerosal của các loạt vắc xin viêm gan B,
viêm não Nhật Bản
2.3.5. Xác ñịnh hàm lượng formaldehyd của các loạt vắc xin viêm gan B,
viêm não Nhật Bản

32
32
33
33
33
35
35
36
36
37
37


41

42
Chương 3: Kết quả nghiên cứu

3.1. Kết quả xác ñịnh thể tích môi trường
44
45
3.1.1. Thể tích môi trường thích hợp ñể kiểm tra vô trùng BCG
3.1.2. Thể tích môi trường thích hợp ñể kiểm tra vô trùng OPV
3.1.3. Thể tích môi trường thích hợp ñể kiểm tra vô trùng vắc xin viêm gan B
3.1.4. Thể tích môi trường thích hợp ñể kiểm tra vô trùng vắc xin viêm não
Nhật Bản

3.1.5. So sánh tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong FTM và TSB
3.2. Kết quả xác ñịnh hàm lượng thimerosal và formaldehyd
3.2.1. Hàm lượng thimerosal và formaldehyd của vắc xin viêm gan B
3.2.2. Hàm lượng thimerosal và formaldehyd của vắc xin viêm não Nhật Bản
3.3. Qui trình xác ñịnh thể tích môi trường thích hợp ñể kiểm tra vô trùng vắc xin
45
47
50

56
60
63
63
65
66
Chương 4: Bàn luận

1. Về thể tích môi trường
2. Nồng ñộ các chất ức chế trong vắc xin viêm gan B, vắc xin viêm não Nhật Bản
3. Qui trình xác ñịnh thể tích môi trường thích hợp ñể kiểm tra vô trùng vắc xin
4. Hạn chế của ñề tài
68
68
75
77
79
Kết luận
80
Kiến nghị

Tài liệu tham khảo
Phụ lục
82





DANH MỤC BẢNG


Trang
Bảng 1.1: Số lượng vắc xin cần lấy ñể kiểm tra vô trùng
Bảng 1.2: Thể tích VX cần lấy từ mỗi lọ ñể cấy vào mỗi loại MT và thể tích
VX cấy vào mỗi ống MT

Bảng 1.3: Giới hạn nhiễm VK và nấm của các cấp ñộ sạch

Bảng 1.4: Giới hạn hạt bụi của các cấp ñộ sạch (hạt/m
3
không khí)

Bảng 1.5: Các chủng mẫu do Dược ñiển Mỹ qui ñịnh
Bảng 1.6: Các chủng mẫu do Dược ñiển châu Âu qui ñịnh

Bảng 1.7: Các chủng mẫu sử dụng trong nghiên cứu
Bảng 2.1: Số lượng ống MT cần cho mỗi loạt của từng VX
Bảng 2.2: Số lượng VX sử dụng cho xác ñịnh thể tích MT

Bảng 2.3: Số lượng ống MT của từng chủng mẫu ở mỗi thể tích MT

Bảng 3.1: Kết quả kiểm tra vô trùng các loạt MT

Bảng 3.2: Kết quả kiểm tra dinh dưỡng các loạt FTM
Bảng 3.3: Kết quả kiểm tra dinh dưỡng các loạt TSB

Bảng 3.4: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong MT cấy BCG, thể tích 20 mL/ống,
loạt VX số 1

Bảng 3.5: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong MT cấy BCG; thể tích 20 mL/ống;
loạt VX số 2, số 3

Bảng 3.6: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong MT cấy OPV, thể tích 20 mL/ống

Bảng 3.7: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong MT cấy OPV, thể tích 30 mL/ống,
loạt VX số 1

Bảng 3.8: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong MT cấy OPV; thể tích 30 mL/ống;

loạt số 2, số 3

Bảng 3.9: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong MT cấy VGB, thể tích 20 mL/ống…
15

15
17
17
26
27
27
32
34
39
44
44
44

45

46
47

48

49
50
Bảng 3.10: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong MT cấy VGB, thể tích 30 mL/ống
Bảng 3.11: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong MT cấy VGB, thể tích 40 mL/ống
Bảng 3.12: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong FTM cấy VGB; thể tích 40

mL/ống; loạt VX số 2, số 3

Bảng 3.13: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong TSB cấy VGB


Bảng 3.14: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong TSB cấy VGB, thể tích 80 mL


Bảng 3.15: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong MT cấy VNNB, thể tích 20 mL/ống
Bảng 3.16: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong MT cấy VNNB, thể tích 30 mL/ống
Bảng 3.17: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong MT cấy VNNB, thể tích 40 mL/ống
Bảng 3.18: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong MT cấy VNNB, thể tích 50 mL/ống
Bảng 3.19: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong MT cấy VNNB, thể tích 60 mL/ống
Bảng 3.20: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong FTM cấy VNNB; thể tích 60
mL/ống; loạt VX số 2, số 3

Bảng 3.21: Tỷ lệ mọc của chủng mẫu trong TSB cấy VNNB, thể tích 60 mL…


Bảng 3.22: Tỷ lệ mọc của B. subtilis trong thử nghiệm ức chế VGB
Bảng 3.23: Tỷ lệ mọc của B. subtilis trong thử nghiệm ức chế VNNB

Bảng 3.24: Tỷ lệ mọc của C. albicans trong thử nghiệm ức chế VGB

Bảng 3.25: Tỷ lệ mọc của C. albicans trong thử nghiệm ức chế VNNB
Bảng 3.26: Tỷ lệ mọc của K. rhizophila trong thử nghiệm ức chế VGB……

Bảng 3.27: Tỷ lệ mọc của K. rhizophila trong thử nghiệm ức chế VNNB…….
Bảng 3.28: Hàm lượng thimerosal và formaldehyd của VGB


Bảng 3.29: Hàm lượng thimerosal và formaldehyd của VNNB……






50
52

53
54

55
56
57
57
58
58

59

60
60
61
61
62
62
63
63

65





DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Kiểm tra găng của kỹ thuật viên

Hình 1.2: Môi trường FTM
Hình 1.3: Môi trường TSB

Hình 1.4: Bảng hiện thị máy ñếm hạt bụi

Hình 1.5: Đầu thu mẫu máy ñếm vi khuẩn và nấm
Hình 1.6: Khuẩn lạc C. albicans (môi trường TSA)

Hình 1.7: Khuẩn lạc K. rhizophila (môi trường TSA)

Hình 1.8: B. subtilis mọc làm mất chỉ thị màu FTM…………
Hình 1.9: C. albicans mọc trong TSB

Hình 1.10: C. albicans mọc trong FTM








Trang

17
19
19
31
31
45
45
47
51
51















1


ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, trên thế giới cũng như trên thị trường Việt Nam có rất nhiều
loại vắc xin. Trước khi sử dụng trên người, các vắc xin phải ñược kiểm tra
nghiêm ngặt trong phòng thí nghiệm về công hiệu, vô trùng và tính an toàn
trên ñộng vật thí nghiệm.
Để kiểm tra tính vô trùng của vắc xin, người ta cho vắc xin vào các môi
trường nuôi cấy phù hợp ñể xem có vi khuẩn hoặc nấm mọc hay không. Môi
trường thường dùng là môi trường lỏng thioglycolat (Fluid thioglycollate
medium: FTM) và canh thang TSB (Tryptic soy broth). Môi trường lỏng
thioglycolat phát hiện vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn kỵ khí; canh thang TSB
phát hiện vi khuẩn hiếu khí và nấm trong vắc xin [6], [43], [58].
Vấn ñề ñặt ra là trong vắc xin có thể chứa các chất ức chế sự phát triển
của vi khuẩn và nấm (chất ức chế), ví dụ: thimerosal, 2 phenoxy ethanol,
phenol, Trong những trường hợp ñó liệu vi khuẩn và nấm có mọc ñược trong
môi trường kiểm tra tính vô trùng của vắc xin hay không?
Để kiểm tra xem môi trường có ñảm bảo cho vi khuẩn và nấm mọc
ñược khi vắc xin chứa các chất ức chế hay không, phải thực hiện thử nghiệm
kiểm tra khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm khi có mặt của
vắc xin, gọi là thử nghiệm thẩm ñịnh hay thử nghiệm ức chế (validation test,
bacteriostasis and fungistasis test) [66], [67], [69], [75]. Thử nghiệm này ñược
thực hiện bằng cách cho chính vắc xin và chủng mẫu vào môi trường, sau ñó
theo dõi sự phát triển của chủng. Nếu chủng mẫu mọc trong tất cả các ống
môi trường cấy vắc xin thì ñiều ñó khẳng ñịnh rằng thử nghiệm vô trùng có
khả năng phát hiện ñược các trường hợp vắc xin bị nhiễm trùng. Nếu chủng
mẫu không mọc ñược trong các ống môi trường cấy vắc xin thì qui trình thực
hiện thử nghiệm vô trùng cần phải thay ñổi. Tổ chức Y tế thế giới khuyến
2

cáo: khi kiểm tra vô trùng bằng phương pháp cấy trực tiếp, có thể loại bỏ ảnh

hưởng của các chất ức chế bằng cách tăng thể tích môi trường [75]. Tuy nhiên
việc này chưa ñược thực hiện tại Viện Kiểm ñịnh Quốc gia Vắc xin và Sinh
phẩm Y tế (KĐQG).
Thử nghiệm thẩm ñịnh ñược yêu cầu thực hiện cho từng vắc xin [63].
Vì mỗi vắc xin có chứa các chất ức chế khác nhau với nồng ñộ khác nhau. Do
ñó, cần có một qui trình chung ñể xác ñịnh thể tích môi trường thích hợp cho
tất cả các vắc xin.
Xuất phát từ nhu cầu trên chúng tôi tiến hành ñề tài "Nghiên cứu thể
tích môi trường thích hợp ñể kiểm tra vô trùng một số vắc xin tại Viện Kiểm
ñịnh Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế" với mục tiêu:
1. Tìm thể tích môi trường thích hợp cho 4 vắc xin ñược lựa chọn nghiên cứu,
cụ thể:
- Vắc xin bại liệt uống (OPV) do Trung tâm nghiên cứu, sản xuất vắc
xin và sinh phẩm Y tế (POLYVAC) sản xuất.
- Vắc xin BCG (BCG) do Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (IVAC) sản xuất.
- Vắc xin viêm gan B (VGB) do do Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1
(VABIOTECH) sản xuất.
- Vắc xin viêm não Nhật Bản (VNNB) do VABIOTECH sản xuất.
2. Đề xuất qui trình xác ñịnh thể tích môi trường thích hợp ñể kiểm tra vô
trùng vắc xin.
3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Vắc xin
Vắc xin (VX) là những chế phẩm sinh học chứa kháng nguyên ñặc hiệu
của vi sinh vật gây bệnh, ñược ñưa vào cơ thể người ñể gây miễn dịch chủ ñộng,
phòng các bệnh truyền nhiễm do chính các vi sinh vật tương ứng gây ra.
1.1.1. Các thành phần trong vắc xin

Trong mỗi VX có 3 thành phần chính: kháng nguyên; tá chất miễn
dịch; chất bảo quản, chất ổn ñịnh [47].
Kháng nguyên là hoạt chất chủ yếu giúp tạo nên phản ứng miễn dịch
chủ ñộng của cơ thể. Kháng nguyên có thể là protein, polysaccharid, hay acid
nucleic của tác nhân gây bệnh; cũng có thể là toàn bộ vi khuẩn hay vi rút sống
giảm ñộc lực; hoặc là giải ñộc tố, là những ñộc tố ñã ñược biến ñổi ñể không
còn tính ñộc nhưng vẫn kích thích cơ thể sản sinh ra kháng thể ñặc hiệu.
Tá chất miễn dịch là những yếu tố có trong thành phần của VX và làm
tăng ñáp ứng miễn dịch. Tá chất làm tăng tính sinh miễn dịch của VX qua ba
cơ chế: Ảnh hưởng lên sự giải phóng và trình diện kháng nguyên, tác ñộng
lên các cytokin và tác ñộng lên tế bào trình diện kháng nguyên [45].
Chất ổn ñịnh giúp kháng nguyên ổn ñịnh.
Chất bảo quản ngăn ngừa vi khuẩn và nấm phát triển. Kháng sinh
thường có trong các VX vi rút sống dưới dạng vết, bao gồm neomycin,
kanamycin, streptomycin, polymycin B [79].
Ngoài ba thành phần chính trên, trong VX còn có dung môi, các chất
ñệm như NaCl, KH
2
PO
4
, Na
2
HPO
4
, Dung môi có thể là nước cất, các dịch
treo phức tạp như môi trường nuôi cấy hoặc các chất tồn dư trong hệ thống
sinh học dùng sản xuất kháng nguyên (ovalbumin của trứng, một số chất
trong môi trường nuôi cấy, )
4


1.1.2. Các chất ức chế trong vắc xin
Các chất ức chế có trong VX bao gồm thimerosal; 2 phenoxy ethanol;
phenol; formaldehyd; cloroform; benzethonium chlorid (phemerol); các loại
kháng sinh như kanamycin, neomycin, polymyxin B. Chúng có mặt trong VX
với chủng loại, số lượng, hàm lượng khác nhau.
Có VX không chứa một loại chất ức chế nào, VD: BCG, ImBCG của
IVAC; HIBERIX, Infanrix của Glaxo Smith Kline (GSK).
Có VX chỉ chứa một chất ức chế như VX thương hàn Vi (Công ty Vắc
xin Đà Lạt), TYPHIM Vi (Sanofi pasteur) chứa phenol; D.T.VAX (Sanofi
pasteur) chứa thimerosal;
Có VX chứa hai chất ức chế. Thuộc loại này có VX uốn ván (IVAC),
mORCVAX (VABIOTECH) chứa thimerosal và formaldehyd; PENTAXIM
(Sanofi pasteur) chứa formaldehyd và 2 phenoxy ethanol,
Có những VX chứa tới ba hoặc bốn chất ức chế như VGB
(VABIOTECH) chứa thimerosal, formaldehyd, neomycin, polymicin;
Infanrix Hexa (GSK) chứa formaldehyd, 2 phenoxy ethanol, neomycin,
polymicin;
Vai trò của các chất ức chế trong VX cũng khác nhau.
Các chất này có thể là chất bảo quản ñược cho vào giai ñoạn cuối của
quá trình sản xuất, ví dụ: thimerosal, 2 phenoxy ethanol, benzethonium
chlorid, [46].
Các chất này cũng có thể là các chất bất hoạt trong quá trình sản xuất
và sót lại, ví dụ: formaldehyd, cloroform. Chúng cũng có thể là các loại kháng
sinh, rất phổ biến trong các VX vi rút. Chất ức chế cũng có thể từ các hoá
chất, môi trường nuôi cấy, dùng trong rất nhiều công ñoạn của quá trình sản
xuất mà người ta không thể kiểm soát hay loại bỏ hết ñược, ví dụ: phenol
trong OPV.
5



1.1.3. Các vắc xin sử dụng trong nghiên cứu
1.1.3.1. BCG
BCG là chế phẩm dạng ñông khô của chủng Calmette-Guerin giảm ñộc
lực, có nguồn gốc từ Mycobacterium bovis. Chủng Calmette-Guerin có ñặc
tính miễn dịch học tương tự như chủng gây bệnh lao ở người là M.
Tuberculosis, do vậy tiêm BCG sẽ tạo ñược miễn dịch chủ ñộng ñể chống lại
bệnh lao. BCG ñược tiêm trong da. 82,5 % trẻ sau tiêm 2 tháng xuất hiện loét,
nốt loét kéo dài 2 tuần, sau ñó hình thành sẹo [9]. BCG sản xuất tại IVAC ñạt
yêu cầu về tính ổn ñịnh trong sản xuất và ngày càng tiến bộ [21]. VX này có
khả năng bảo vệ cao, tỷ lệ mắc lao sau 3 - 4 năm tiêm BCG là 0,43% [22].
Nghiên cứu của Bùi Tấn Đợi và cs cũng chỉ ra BCG sản xuất tại IVAC ñạt
tiêu chuẩn về ñộ ẩm tồn dư và tỷ lệ ổn ñịnh nhiệt của WHO [10].
BCG không chứa chất bảo quản, không chứa kháng sinh. Trong thành
phần của BCG, ngoài BCG sống ñông khô, chỉ chứa glutamate natri.
1.1.3.2. OPV
OPV là VX tam liên gồm 3 týp poliovius 1, 2 và 3. Đây là VX sống
giảm ñộc lực (Chủng Sabin) sản xuất trên tế bào thận khỉ Macaca mulatta
[13], [14] và ñược ổn ñịnh bằng MgCl
2
. VX ñạt các tiêu chuẩn Việt Nam và
tiêu chuẩn của WHO [74].
Nghiên cứu của Nguyễn Thị Hiền Thanh [26] cho thấy OPV có thể
ñảm bảo ñược việc bảo vệ thành quả thanh toán bại liệt với tỷ lệ có kháng thể
bảo vệ 3 týp polio là 78%, týp 1 là 95,8%, týp 2 là 96,6%, týp 3 là 82,9%.
Trong chương trình tiêm chủng mở rộng hiện nay, OPV ñược dùng 3
liều cho trẻ ñủ 2; 3; 4 tháng tuổi. Với phác ñồ này sẽ có hiệu quả 100% phòng
bệnh bại liệt [5]. Việt Nam ñã công bố thanh toán bại liệt vào năm 2000,
nhưng hiện nay trên thế giới vẫn còn một số nước chưa thanh toán ñược bệnh
6


này nên việc bảo vệ thành quả này cần ñược thực hiện một cách chặt chẽ. Các
chất ức chế trong OPV bao gồm phenol; kanamycin, neomycin.
1.1.3.3. Vắc xin viêm gan B
VGB là VX tái tổ hợp ñầu tiên trên thế giới [49]. VGB do Vabiotech
sản xuất là VX phòng viêm gan B thế hệ II, ñược sản xuất bằng cách nuôi cấy
tế bào nấm men ñã ñược xử lý bằng công nghệ di truyền có mang gen mã hoá
sinh tổng hợp HBsAg, sau ñó ñược tinh chế và bất hoạt bằng kỹ thuật hoá lý:
siêu ly tâm, sắc ký cột và bất hoạt bằng formaldehyd. HBsAg tinh chế ñược
hấp phụ với hydroxyd nhôm, cuối cùng ñược cho thêm thimerosal làm chất
bảo quản [31], [32]. VX này có tính an toàn cao, ít phản ứng phụ và có tính
sinh miễn dịch cao [1]. VGB có hai chất ức chế là thimerosal và
formaldehyde. Thimerosal ñóng vai trò chất bảo quản, formaldehyde là chất
bất hoạt trong quá trình sản xuất còn sót lại. Tiêu chuẩn ñăng ký hàm lượng
thimerosal của VGB là dưới 0,01 %, formaldehyd dưới 0,02 %.
1.1.3.4. Vắc xin viêm não Nhật Bản
Bệnh viêm não Nhật Bản là một trong những bệnh thường gặp ở trẻ em
Việt Nam, lứa tuổi 1-5 tuổi với tỷ lệ tử vong cao hoặc nếu sống sót ñể lại di
chứng nặng nề về thần kinh. Việc tiêm VX viêm não Nhật Bản (VNNB) cho
trẻ em có ý nghĩa kinh tế và xã hội rất lớn [37]. VNNB cũng tạo ñược hiệu giá
kháng thể cao [35], có khả năng bảo vệ trẻ em khỏi bệnh viêm não Nhật Bản
[36].
VNNB ñược sản xuất tại VABIOTECH theo qui trình công nghệ của
Viện BIKEN, trường Đại học Osaka, Nhật Bản. VX ñược sản xuất từ não
chuột gây nhiễm với VR viêm não Nhật Bản chủng Nakayama NIH. Chủng
Nakayama này có cùng tính kháng nguyên với các chủng viêm não Nhật Bản
phân lập ñược ở não tử thi, ở muỗi trong các vụ dịch viêm não Nhật Bản ở
nước ta từ trước tới 1994 [23]. Huyền dịch VR ñược xử lý với protamin
7

sulfat, bất hoạt bằng formaldehyd, cô ñặc bằng siêu lọc và sau cùng tinh chế

bằng siêu ly tâm.
VX gây ñáp ứng miễn dịch cao trong quần thể dân cư [15].
VNNB có chứa chất bảo quản là thimerosal, ngoài ra còn có chất ức
chế khác là formaldehyd. Đây là chất bất hoạt trong quá trình sản xuất còn sót
lại. Tiêu chuẩn ñăng ký hàm lượng thimerosal của VNNB là dưới 0,012 %,
của formaldehyd là dưới 0,01 %.
1.2. Kiểm ñịnh vắc xin
Kiểm ñịnh chất lượng VX một cách nghiêm ngặt là ñiều không thể
thiếu vì rất nhiều lý do. Thứ nhất, việc sử dụng VX phải an toàn vì nó ñược sử
dụng với số lượng người rất lớn, trong cùng một thời ñiểm và ñều là những
người khoẻ mạnh. Thứ hai, các sản phẩm phải tạo ñược miễn dịch bảo vệ,
ngăn ngừa bệnh tật. Hơn nữa, các VX là các sản phẩm sinh học, rất khó chuẩn
hóa so với các qui trình khác.
Việc kiểm ñịnh chất lượng ñược thực hiện ở từng công ñoạn quan trọng
của quá trình sản xuất, ở bán thành phẩm và sản phẩm cuối cùng.
Hệ thống kiểm ñịnh VX gồm 3 cấp: Tại ñơn vị sản xuất của nhà sản
xuất (Cấp 1), tại phòng kiểm ñịnh ñộc lập của nhà sản xuất (Cấp 2) và cơ
quan Kiểm ñịnh Quốc gia (Cấp 3). Việc kiểm ñịnh chất lượng không chỉ cho
những số liệu về từng loạt VX cụ thể mà còn cho biết mức ñộ ổn ñịnh của cả
hệ thống sản xuất và hệ thống kiểm ñịnh thông qua việc phân tích xu hướng
(trend analysis) chất lượng sản phẩm từ các số liệu thu ñược [15].
Sau khi ñã ñược kiểm tra chất lượng tại nhà sản xuất, toàn bộ hồ sơ sản
xuất, kiểm ñịnh và các mẫu VX của mỗi loạt VX sẽ ñược chuyển ñến KĐQG
ñể ñược cấp giấy phép xuất xưởng. KĐQG sẽ căn cứ vào các kết quả thanh tra
nhà xưởng, qui trình sản xuất, hồ sơ loạt sản phẩm, số liệu về phân tích xu
hướng các kết quả kiểm ñịnh chất lượng, ñể ñưa ra quyết ñịnh sẽ phải làm
8

những thử nghiệm gì, với tần xuất nào, tại KĐQG ñể kiểm tra chất lượng của
loạt VX ñó.

Có rất nhiều thử nghiệm ñể kiểm tra chất lượng VX. Thông thường là
các thử nghiệm nhận dạng; công hiệu; an toàn chung; an toàn ñặc hiệu; chất
gây sốt; vô trùng và các thử nghiệm kiểm tra các tính chất vật lý, hoá học (thử
nghiệm hoá lý). Ngoài ra, một số VX có thêm những thử nghiệm riêng, ñặc
thù cho từng VX, ví dụ: BCG và ImBCG có thử nghiệm kiểm tra ñộ sống và
ñộ ổn ñịnh nhiệt.
1.2.1. Kiểm tra vô trùng
Thử nghiệm vô trùng là thử nghiệm cơ bản nhất trong kiểm ñịnh vắc
xin [42]. Thử nghiệm vô trùng là một qui trình khó khăn và phải ñược
chuẩn bị cũng như thực hiện sao cho loại trừ ñược các kết quả dương tính
giả và âm tính giả [63].
Mỗi loạt VX ñược tiến hành kiểm tra vô trùng ở từng công ñoạn của
quá trình sản xuất, bán thành phẩm và thành phẩm. Chính vì lý do này mà khi
các mẫu VX ñược gửi ñến KĐQG thì tỷ lệ phát hiện ra các loạt VX bị nhiễm
trùng là rất thấp.
1.2.2. Nhận dạng
Mục ñích của thử nghiệm nhận dạng là ñể xác ñịnh xem VX có chứa
loại kháng nguyên ñã ñăng ký hay không. Thử nghiệm nhận dạng có thể ñược
thực hiện trực tiếp bằng cách tìm kháng nguyên hoặc gián tiếp thông qua tìm
kháng thể ñặc hiệu.
Thử nghiệm nhận dạng tìm kháng nguyên có thể ñược thực hiện bằng
phản ứng khuếch ñại gen (polymerase chain reaction: PCR) ñối với các VX
có chứa acid nucleic. Hiện nay, KĐQG có thể sử dụng phương pháp này ñể
nhận dạng ñược hầu hết các VX. Các VX ñã thực hiện nhận dạng theo
phương pháp này như sởi, quai bị, rubella, cúm, viêm gan A, viêm não,
9

Một số VX, việc nhận dạng ñược thực hiện qua việc tìm phức hợp
kháng nguyên-kháng thể bằng phản ứng miễn dịch gắn men (ví dụ: VX phế
cầu, não mô cầu, HiB) hay các phản ứng ngưng kết như VX thương hàn, bạch

hầu-ho gà-uốn ván [17], [27].
1.2.3. Xác ñịnh công hiệu
Xác ñịnh công hiệu của VX chính là xác ñịnh khả năng bảo vệ con
người trước bệnh tật. Việc xác ñịnh công hiệu của VX có thể ñược thực hiện
trên súc vật thí nghiệm hay trong phòng thí nghiệm.
Trên súc vật thí nghiệm, công hiệu ñược tính toán qua việc ño nồng ñộ
kháng thể có trong huyết thanh sau khi sử dụng VX. Khả năng bảo vệ của VX
cũng có thể ñược ñánh giá bằng cách thử thách trực tiếp súc vật thí nghiệm
sau khi sử dụng VX với nguồn bệnh.
Để ñánh giá ñúng khả năng bảo vệ của VX, thử nghiệm xác ñịnh công
hiệu phải tuân thủ rất nhiều tiêu chuẩn khắt khe về súc vật thí nghiệm (loài,
trọng lượng, tuổi, ñiều kiện nuôi dưỡng, ), chủng VK hoặc vi rút thử thách,
ñiều kiện thực hiện thử nghiệm, phương pháp, kỹ thuật thực hiện, Tuy nhiên,
ngay cả khi những ñiều kiện này ñược tuân thủ thì sự biến ñộng các giá trị
cũng là ñiều không tránh khỏi do bản chất của các thử nghiệm sinh học. Để
hạn chế sai số trong việc ñánh giá công hiệu VX, người ta thường phải tiến
hành song song mẫu thử với mẫu chuẩn quốc gia hoặc quốc tế [8].
1.2.4. Kiểm tra an toàn chung
Thử nghiệm an toàn chung còn ñược gọi là thử nghiệm an toàn không
ñặc hiệu. Thử nghiệm này nhằm phát hiện bất kỳ chất ñộc nào có mặt trong
sản phẩm.
Để thực hiện thử nghiệm này, người ta tiêm VX vào dưới da ở phần ổ
bụng chuột nhắt trắng và chuột lang. Thông thường, mỗi loạt VX ñược tiêm
cho 5 chuột nhắt trắng Swiss trọng lượng 18-22 g/con và 2 chuột lang trọng
10

lượng 250-350 g/con. Chuột ñược theo dõi, cân trọng lượng hàng ngày trong
7 ngày sau khi tiêm. Nếu sau 7 ngày chuột khoẻ mạnh, tăng cân, không có
chuột nào chết hoặc có biểu hiện bất thường như giảm hoạt ñộng, rụng lông,
thì loạt VX ñó ñạt yêu cầu về tiêu chuẩn an toàn chung trên ñộng vật thí

nghiệm [29].
1.2.5. Kiểm tra an toàn ñặc hiệu
Chỉ có một số VX cần phải kiểm tra an toàn ñặc hiệu như BCG,
VNNB, dại, Thử nghiệm an toàn ñặc hiệu nhằm kiểm tra các ñộc tính liên
quan ñến ñặc ñiểm gây bệnh của chủng sản xuất. Do ñây là thử nghiệm an
toàn ñặc hiệu nên mỗi VX có qui trình thử nghiệm, cách ñánh giá kết quả
riêng, ñặc trưng cho VX ñó.
VD: BCG ñược tiêm dưới da bụng phải của chuột thí nghiệm. Trong
tiêu chuẩn ñánh giá kết quả, ngoài tiêu chuẩn chung như chuột tăng cân thì
còn phải ñánh giá xem chuột có biểu hiện bệnh lao hay không. Sau 42 ngày
chuột ñược mổ ñể kiểm tra phủ tạng (gan, lách, phổi,…) xem có biểu hiện
nhiễm lao hay không; các hạch có to không; có khác nhau giữa hạch vùng
khoeo, nách, hạch bên trái so với bên phải (bên tiêm VX ) hay không [34].
1.2.6. Kiểm tra chất gây sốt
Thử nghiệm kiểm tra chất gây sốt (Pyrogens) nhằm phát hiện có hay
không tác nhân gây sốt trong VX.
Theo WHO, thử nghiệm này có thể ñược thực hiện trên thỏ hoặc bằng
thuốc thử lysat [78].
Thử nghiệm chất gây sốt trên thỏ ñược thực hiện dựa trên nguyên tắc so
sánh sự tăng thân nhiệt của hai nhóm thỏ trước và sau khi tiêm VX vào tĩnh
mạch tai thỏ trong vòng 3 giờ [30].
Thuốc thử lysat là dịch phân giải tế bào dạng amip có trong máu một
loài sam biển, là chất nhạy cảm với nội ñộc tố. Dùng thuốc thử lysat chỉ phát
11

hiện ñược chất gây sốt là nội ñộc tố của vi khuẩn. Hiện nay có 3 phương pháp
ñể thực hiện phép thử này: phương pháp tạo gel dựa vào sự hình thành gel khi
cho thuốc thử vào dung dịch có chứa nội ñộc tố, phương pháp ño ñộ ñục dựa
vào sự thay ñổi ñộ ñục của thuốc thử lysat khi tạo gel, phương pháp ño màu
dựa trên sự thay ñổi màu của phức hợp màu-peptid [6].

1.2.7. Kiểm tra các chỉ tiêu hoá lý
Các thử nghiệm hoá lý bao gồm: xác ñịnh các tính chất về hình thức
VX khi nhìn bằng mắt thường, pH, ñộ ẩm tồn dư, hàm lượng các chất ức chế
(thimerosal, phenol, formaldehyd), hàm lượng nitơ toàn phần, hàm lượng nitơ
protein, hàm lượng protein, hàm lượng nhôm, hàm lượng NaCl.
Thử nghiệm xác ñịnh hàm lượng thimerosal ñược thực hiện dựa vào
phản ứng của ion thủy ngân tự do từ thimerosal kết hợp với dithizon thành
dithizon- thủy ngân và ñược xác ñịnh bằng phương pháp so màu [25].
Thử nghiệm xác ñịnh hàm lượng phenol ñược thực hiện dựa vào phản
ứng tạo màu của phenol với thuốc thử folin [7].
Việc ñịnh lượng formaldehyd trong VX ñược thực hiện bằng cách ño
mật ñộ màu của 3,5 diacetyl-1,4 dihydrolutidin ở bước sóng 415 nm. Phức
hợp này màu vàng chanh, ñược tạo thành do phản ứng của formaldehyd tự do
trong mẫu thử với acetylaceton và amoni trong môi trường acid nhẹ [12].
Việc xác ñịnh hàm lượng nitơ toàn phần, nitơ protein dựa trên phản
ứng màu của ion amoni ñược tạo thành khi tác dụng với thuốc thử Nessler sau
khi vô cơ hoá các sản phẩm chứa protein. Sự khác biệt của hai thử nghiệm
này ở chỗ: thử nghiệm xác ñịnh hàm lượng nitơ protein cần có bước tủa và
tách protein, sau ñó mới vô cơ hóa lượng protein thu ñược bằng acid sulfuric
ñậm ñặc. Thử nghiệm xác ñịnh hàm lượng protein toàn phần không cần bước
tủa và tách protein [16], [18].
12

Có 6 phương pháp ñịnh lượng protein toàn phần trong VX: phương
pháp Lowry, phương pháp Bradford, phương pháp ñồng/bicinchoninic acid,
phương pháp biuret, phương pháp quang phổ huỳnh quang, ño ñộ hấp phụ
thực của protein ở bước sóng 280 nm. Phương pháp hiện ñang ñược sử dụng
ở KĐQG là phương pháp Lowry. Phương pháp này dựa trên nguyên lý:
protein trong mẫu thử bị tủa với acid tricloacetic. Xác ñịnh lượng tủa ñể tính
ra lượng protein có trong mẫu thử [6].

Hàm lượng Al
+++
ñược ñịnh

lượng dựa trên sự tạo thành muối natri của
acid ethylendiamintetraacetic (EDTA) với ion Al
+++
, sau ñó chuẩn ñộ dung
dịch EDTA thừa bằng dung dịch ñồng sulfat 0,01 M [19].
Hàm lượng muối NaCl ñược xác ñịnh dựa trên phản ứng của ion Cl
-
với
bạc nitrat 0,1 N, chỉ thị màu kalicromat 10% [11].
Thực hiện những thử nghiệm nào trong số các thử nghiệm nói trên là
phụ thuộc vào bản chất của từng VX.
1.3. Thử nghiệm vô trùng
1.3.1. Các phương pháp kiểm tra vô trùng
1.3.1.1. Hai phương pháp kiểm tra vô trùng
Hiện nay, trên thế giới có hai phương pháp kiểm tra vô trùng VX:
Phương pháp màng lọc và phương pháp cấy trực tiếp [58], [75], [80].
Phương pháp màng lọc là phương pháp dùng một bơm chân không hút
tất cả VX trong các lọ mẫu cần kiểm tra ñi qua một màng lọc có kích thước lỗ
lọc nhỏ hơn 0,45 µm, rửa màng lọc ñể loại bỏ hết các chất ức chế bằng cách
cho các dung dịch rửa ñi qua, sau ñó nuôi cấy màng lọc trong hai môi trường
FTM và TSB.
Phương pháp cấy trực tiếp ñược thực hiện bằng cách hút một lượng VX
trong mỗi lọ chứa theo một tỷ lệ nhất ñịnh rồi cấy vào các ống môi trường
FTM và TSB.
13


Mỗi phương pháp có ưu ñiểm và nhược ñiểm riêng.
Phương pháp cấy trực tiếp có ưu ñiểm:
- Rẻ tiền;
- Dễ áp dụng, không ñòi hỏi trang thiết bị ñắt tiền;
- Áp dụng ñược cho hầu hết các VX.
Tuy nhiên nó có nhược ñiểm:
- Ít chính xác do chỉ kiểm tra ñược một phần VX trong mỗi lọ, ñặc biệt
trong những trường hợp các lọ VX có thể tích lớn;
- Dễ bị nhiễm từ ngoài vào do trong quá trình thực hiện thử nghiệm
phải mở nút các lọ VX và các ống MT;
- Tốn nhiều thời gian, công sức do phải dùng rất nhiều các ống MT, pipét.
Ngược lại, phương pháp màng lọc có ưu ñiểm:
- Chính xác hơn do:
+ Kiểm tra ñược toàn bộ lượng VX trong các lọ.
+ Ít bị nhiễm từ ngoài vào do sử dụng những hệ thống kín hoặc nửa kín.
Đối với hệ thống kín gần như chắc chắn 100% sẽ không bị nhiễm từ ngoài vào.
- Tiết kiệm thời gian, công sức do chỉ cần 1 lọ FTM và 1 lọ TSB.
- Đặc biệt thích hợp cho những VX ñược ñóng trong những lọ có thể
tích lớn, những VX có chứa chất ức chế sự phát triển của VK, nấm.
Và có nhược ñiểm
- Đắt tiền.
- Không áp dụng ñược cho một số VX, ví dụ các VX chứa nhôm sẽ
không ñi qua ñược màng lọc.
Phương pháp hiện nay ñang ñược sử dụng tại KĐQG là phương pháp
cấy trực tiếp [28].
1.3.1.2. Số lượng vắc xin cần cho kiểm tra vô trùng của mỗi loạt sản xuất
Sau khi sản xuất, mỗi loạt VX cần lấy một số lọ nhất ñịnh ñể kiểm tra
vô trùng. Số lượng VX cần cho kiểm tra vô trùng của một loạt sản xuất phụ
14


thuộc vào số lượng sản xuất của loạt ñó và thể tích VX có trong mỗi lọ. Số
lượng này ñược WHO qui ñịnh [75]:
Bảng 1.1: Số lượng vắc xin cần lấy ñể kiểm tra vô trùng
Số lượng (Lọ)


Số lượng thành phẩm
của một loạt (Lọ)
Lượng VX trong mỗi lọ
≥ 2 mL

Lượng VX trong mỗi
lọ < 2 mL
< 100
10% nhưng không ít hơn
4
20% nhưng không ít
hơn 8
≥ 100 và < 500 Ít nhất 10 Ít nhất 20
≥ 500 Ít nhất 20 Ít nhất 40


Công thức tính cỡ mẫu chung mà WHO ñưa ra là :
Nn 4,0=
,
trong ñó: n là số lọ VX cần lấy, N là số lượng VX thành phẩm trong một loạt.
Trong phương pháp cấy trực tiếp, lượng VX cần lấy từ mỗi lọ ñể cấy
vào mỗi loại MT (FTM, TSB) và lượng VX cấy vào mỗi ống MT cũng ñược
qui ñịnh tại tài liệu WHO TRS 530 annex 4 [75], cụ thể như sau:
Bảng 1.2: Thể tích VX cần lấy từ mỗi lọ ñể cấy vào mỗi loại MT và thể tích

VX cấy vào mỗi ống MT
Thể tích có trong
mỗi lọ VX
Lượng VX tối thiểu
dùng cho mỗi loại MT

Lượng VX cấy vào mỗi
ống MT
< 1 mL
Toàn bộ VX có trong
mỗi lọ
Toàn bộ VX có trong mỗi
lọ
1 mL - 20 mL 1 mL 1 mL
> 20 mL và < 100 mL

5 mL 1 mL


Các ống FTM sau khi cấy VX ñược ủ ở nhiệt ñộ 30-35
0
C, các ống TSB
ñược ủ ở 20-25
0
C và theo dõi ít nhất 14 ngày [54], [57], [61].
1.3.2. Điều kiện thực hiện thử nghiệm vô trùng
Thử nghiệm vô trùng ñược thực hiện trong tủ cấy vô trùng cấp ñộ A,
ñặt trong phòng sạch cấp ñộ B hoặc trong một phòng cách ly [43], [58], [61].
15


WHO, Dược ñiển châu Âu chia phòng sạch làm 4 cấp ñộ: A, B, C, D
dựa theo kết quả giám sát môi trường phòng sạch [43], [71].
Các nội dung giám sát môi trường phòng sạch bao gồm: ñếm số lượng
VK và nấm trong không khí, ñếm số lượng VK và nấm trên bề mặt phòng
sạch và găng của cán bộ thực hiện thử nghiệm, ñếm số lượng hạt bụi trong
không khí.
- Đếm số lượng VK và nấm trong không khí bằng 2 phương pháp:
+ Phương pháp thụ ñộng bằng cách ñặt các ñĩa thạch ở các vị trí có khả
năng lây nhiễm khác nhau trong 4 h.
+ Phương pháp chủ ñộng: dùng máy lấy mẫu không khí ñể hút không
khí qua máy. VK và nấm trong không khí sẽ gắn vào ñĩa thạch hoặc màng
gelatin lắp sẵn trong máy. Màng gelatin sau ñó ñược ñặt lên ñĩa thạch. Ủ các
ñĩa thạch trong tủ ấm. Đếm số khuẩn lạc trên ñĩa thạch. Dựa vào vận tốc lấy
mẫu, thời gian lấy mẫu ñể tính số VK và nấm có trong mỗi mét khối không
khí. Đây là phương pháp chính xác nhưng ñòi hỏi phải có trang thiết bị ñắt
tiền.
- Xác ñịnh VK và nấm trên bề mặt: lấy ñĩa thạch tiếp xúc có ñường kính 56
mm, mở nắp ñĩa thạch và cho mặt thạch tiếp xúc với bề mặt cần kiểm tra
trong giây lát. Đóng nắp ñĩa thạch. Ủ ñĩa thạch trong tủ ấm. Đếm số khuẩn lạc
trên ñĩa thạch.
- Kiểm tra găng của kỹ thuật viên: mỗi kỹ thuật viên dùng một ñĩa thạch riêng
biệt, in 10 ñầu ngón tay của mình vào ñĩa thạch theo trình tự tay phải in trước,
tay trái in sau, tay phải ở giữa ñĩa thạch, tay trái bao phía ngoài.
16


Hình 1.1: Kiểm tra găng của kỹ thuật viên
- Đếm số lượng hạt bụi trong không khí: dùng máy ñể ñếm số lượng các hạt
bụi kích thước 0,5 - 5 µm và các hạt có kích thước ≥ 5 µm.
Tiêu chuẩn từng cấp ñộ sạch như sau:

Bảng 1.3: giới hạn nhiễm VK và nấm của các cấp ñộ sạch
Cấp ñộ
sạch
Đặt thạch

(CFU/ñĩa)

Lấy mẫu không
khí bằng máy
(CFU/m
3
)
Thạch tiếp
xúc
(CFU/ñĩa)
Kiểm tra găng
(CFU/ñĩa)
A
<3 <3 <3 <3
B 5 10 5 5
C 50 100 25
D 100 200 50
Không thực
hiện

Bảng 1.4: giới hạn hạt bụi của các cấp ñộ sạch (hạt/m
3
không khí)
Trạng thái nghỉ Trạng thái hoạt ñộng Cấp ñộ
sạch

Hạt 0,5-5 µ
µµ
µm Hạt ≥ 5 µ
µµ
µm Hạt 0,5-5 µ
µµ
µm Hạt ≥ 5 µ
µµ
µm
A 3500 0 3500 0
B 3500 0 350.000 2000
C 350.000 2000 3.500.000 20.000
D 3.500.000 20.000 Không thực hiện