TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP




NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH NẤM MEN
SACCHAROMYCES CEREVISIAE TRÊN MÍA VÀ THỬ
KHẢ NĂNG LÊN MEN DỊCH ĐƢỜNG MÍA





GVHD: PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC LƢỢNG
SVTH : PHAN THỊ TƢỜNG VI
MSSV : 60602963




TP. HỒ CHÍ MINH, 1/2011



LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trƣờng Đại học Bách
Khoa Thành phố Hồ Chí Minh đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Công nghệ
sinh học đã tận tình chỉ dạy cho em kiến thức cũng nhƣ phƣơng pháp luận trong
suốt 4 năm qua. Sự chỉ dạy tận tình của thầy cô là nền tảng cho em trong quá trình
làm luận văn này.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy PGS. TS Nguyễn Đức Lƣợng, chủ
nhiệm bộ môn công nghệ sinh học. Thầy đã tận tình giúp đỡ và hƣớng dẫn em
trong suốt quá trình làm luận văn.
Em cũng xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Nguyễn Anh Khoa, phụ trách
phòng thí nghiệm 117B2. Thầy đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho chúng em trong
suốt quá trình thí nghiệm. Đây là một sự giúp đỡ rất lớn để em hoàn thành luận
văn này.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình cũng nhƣ bạn bè đã ủng hộ không chỉ
tinh thần mà còn cả vật chất cho em trong suốt quá trình học đặc biệt trong thời
gian làm luận văn tốt nghiệp.
Chúc quý thầy cô và các bạn nhiều sức khỏe, tiếp tục gặt hái nhiều thành
công trong sự nghiệp!

TP Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 01 năm 2011

Phan Thị Tƣờng Vi
Luận văn tốt nghiệp

SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi i


TÓM TẮT

Việc gia tăng giá xăng dầu trong thời gian qua do những bất ổn về chính trị cũng

nhƣ sự cạn kiệt của nhiên liệu hóa thạch đang thôi thúc các nhà khoa học tìm ra một
nguồn nhiên liệu thay thế phù hợp mà ít ảnh hƣởng đến môi trƣờng hơn so với nhiên liệu
hóa thạch. Ethanol sinh học là một nguồn nhiên liệu đầy hứa hẹn trong tƣơng lai. Ethanol
sinh học đang đƣợc sản xuất ngày càng nhiều trên thế giới không những từ nguồn nguyên
liệu giàu tinh bột hay đƣờng mà đang trong quá trình nghiên cứu tận dụng nguồn nguyên
liệu lignocellulose. Tuy nhiên, để có đƣợc quá trình sản xuất ethanol từ nguyên liệu
lignocellulose hiệu quả và kinh tế thì cần thêm nhiều thời gian để nghiên cứu. Hiện tại, để
nâng cao sản lƣợng ethanol sản xuất từ các nguồn nguyên liệu quen thuộc nhƣ tinh bột và
đƣờng, một phƣơng pháp đƣợc quan tâm là sử dụng nấm men cố định.
Luận văn tốt nghiệp này tập trung vào quá trình nghiên cứu cố định nấm men
Saccharomyces cerevisiae trên mía và thử nghiệm lên men dịch đƣờng mía. Nấm men cố
định trên mía ở điều kiện lắc 100 vòng/phút, trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng cho mật độ tế
bào cố định khoảng 2.11. 10
7
tế bào/g mía. Quá trình lên men dịch đƣờng mía bằng chế
phẩm nấm men cố định này cho kết quả lên men tốt nhất ở Brix 20%, tỷ lệ giống 10%
(10g/100ml dịch lên men) và pH 4 sau 4 ngày lên men trong điều kiện tĩnh ở nhiệt độ
phòng. Chế phẩm cố định vẫn cho kết quả lên men tốt sau 6 chu kỳ lên men. Cần nghiên
cứu thêm về khả năng tái sử dụng của chế phẩm nấm men cố định.
Luận văn tốt nghiệp

SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi ii

MỤC LỤC

MỤC LỤC ii
DANH MỤC BẢNG iv
DANH MỤC ĐỒ THỊ v
DANH MỤC HÌNH vi
CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

1.1. Tính cấp thiết của đề tài 2
1.2. Nội dung đề tài 3
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 4
2.1. Công nghệ sản xuất cồn từ dịch đƣờng mía 5
2.2. Phƣơng pháp cố định tế bào 8
2.2.1. Một số kỹ thuật cố định tế bào 8
2.2.2. Yêu cầu đối với chất mang 11
2.2.3. Tác động của kỹ thuật cố định đến tế bào 11
2.3. Giá thể mía 13
2.3.1. Cellulose 14
2.3.2. Hemicellulose 15
2.3.3. Lignin 16
2.3.4. 19
2.4. Ứng dụng phƣơng pháp cố định tế bào trong sản xuất bioethanol 19
2.5. Tình hình nghiên cứu và sản xuất bioethanol trên thế giới và trong nƣớc 24
2.5.1. Tình hình sản xuất bioethanol trên thế giới 24
2.5.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất bioethanol trong nƣớc 25
CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27
3.1. Vật liệu và dụng cụ 28
Luận văn tốt nghiệp

SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi iii

3.1.1. Vật liệu nghiên cứu 28
3.1.2. Dụng cụ 29
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 29
3.2.1. Phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm 29
3.2.2. Phƣơng pháp vi sinh vật 31
3.2.3. Phƣơng pháp hóa lý 34
3.2.4. Các công thức tính 35

CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 37
4.1. Đƣờng chuẩn và đƣờng cong sinh trƣởng của nấm men 38
4.1.1. Đƣờng chuẩn của nấm men 38
4.1.2. Đƣờng cong sinh trƣởng của nấm men 38
4.1.3. Đƣờng chuẩn đƣờng tổng 40
4.2. Kết quả cố định 41
4.2.1. Ảnh hƣởng của thời gian đến khả năng cố định 41
4.2.2. Ảnh hƣởng của chế độ lắc đến khả năng cố định 43
4.3. Kết quả khảo sát quá trình lên men nƣớc mía bằng nấm men cố định 44
4.3.1. Ảnh hƣởng đến thời gian lên men 44
4.3.2. Ảnh hƣởng của độ Brix 46
4.3.3. Ảnh hƣởng của tỷ lệ giống 48
4.3.4. Ảnh hƣởng của pH 49
4.4. Số lần tái sử dụng nấm men cố định 51
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO 58
Luận văn tốt nghiệp

SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi iv


DANH MỤC BẢNG


Bảng 4. 1: Kết quả lập đƣờng chuẩn nấm men 38
Bảng 4. 2: Kết quả lập đƣờng cong sinh trƣởng của nấm men 38
Bảng 4. 3: Kết quả lập đƣờng chuẩn đƣờng tổng 40
Bảng 4. 4: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến khả năng cố định 41
Bảng 4. 5: Kết quả ảnh hƣởng của chế độ lắc đến khả năng cố định 43
Bảng 4. 6: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến khả năng lên men 44

Bảng 4. 7: Kết quả ảnh hƣởng của độ Brix đến khả năng lên men 46
Bảng 4. 8: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ giống đến khả năng lên men 48
Bảng 4. 9: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của pH đến khả năng lên men 49
Bảng 4. 10: Kết quả khảo sát số chu kỳ sử dụng chế phẩm cố định 51


Luận văn tốt nghiệp

SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi v


DANH MỤC ĐỒ THỊ

Đồ thị 4. 1: Đƣờng chuẩn nấm men 38
Đồ thị 4. 2: Đƣờng cong sinh trƣởng của nấm men 39
Đồ thị 4. 3: Đƣờng chuẩn đƣờng tổng 40
Đồ thị 4. 4: Ảnh hƣởng của thời gian đến khả năng cố định 41
Đồ thị 4. 5: Ảnh hƣởng của chế độ lắc đến khả năng cố định 43
Đồ thị 4. 6: Ảnh hƣởng của thời gian lên men 45
Đồ thị 4. 7: Ảnh hƣởng của độ Brix đến khả năng lên men 47
Đồ thị 4. 8: Ảnh hƣởng của tỷ lệ giống đến khả năng lên men 48
Đồ thị 4. 9: Ảnh hƣởng của pH đến khả năng lên men 50
Đồ thị 4. 10: Kết quả tái sử dụng chế phẩm nấm men cố định 51

Luận văn tốt nghiệp

SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi vi


DANH MỤC HÌNH



Hình 2. 1: Con đƣờng Embden-Meyerhoff- Parnas glycolytic của Saccharomyces
cerevisiae 6
Hình 2. 2: Các phƣơng pháp cố định cơ bản 9
Hình 2. 3: Cấu trúc lignocellulose. 13
Hình 2. 4: Cấu trúc cellulose 15
Hình 2. 5: Cấu trúc của hemicellulose 16
Hình 2. 6: Ba tiền chất phenyl - propane của lignin 17
Hình 2. 7: Cấu trúc lignin 18
Hình 2. 8: Hình chụp mía dƣới kính hiển vi điện tử quét 20
Hình 2. 9: Hình chụp dƣới kính hiển vi điện tử quét phần giữa của giá thể mía sau cố
định. 21
Hình 2. 10: Hình chụp dƣới kính hiển vi điện tử quét của bề mặt giá thể trong quá trình
lên men 22
Hình 2. 11: Các nƣớc sản xuất bioethanol chủ yếu trên thế giới 24
Hình 3. 1: Mía sau khi tiền xử lý 28
Hình 3. 2: Khuẩn lạc nấm men Saccharomyces cerevisiae trên môi trƣờng Hansen 29
Hình 3. 3: Sơ đồ quá trình thí nghiệm 31
Hình 4. 1: Chế phẩm mía cố định nấm men S.cerevisiae sau 6 chu kỳ lên men 52
Chƣơng 1: Mở đầu

SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 1














CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU
Chƣơng 1: Mở đầu

SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 2


1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Khi nào dầu cạn kiệt? Nhiều ƣớc đoán khác nhau cho rằng điều đó sẽ xảy ra bất cứ
khi nào trong vòng 20 năm đến hơn một thế kỷ. Sự giảm sút nhanh của năng lƣợng hóa
thạch thúc đẩy sự phát triển của năng lƣợng hạt nhân, nhiên liệu tế bào và năng lƣợng
mặt trời. Nhƣng cái gì có thể thay thế cho xăng dầu dùng trong các động cơ đốt trong của
các phƣơng tiện giao thông trên thế giới. Và cái gì sẽ đại diện cho dầu hóa học nhƣ là
nền tảng cho sự mở rộng tổng hợp cái trở nên không thể thiếu trong thế kỷ thứ 20. Đó
chính là nhiên liệu sinh học.
Thử nghiệm sản xuất nhiên liệu sinh học hiện đại và kinh tế đầu tiên đƣợc Brazil
tiến hành dùng glucose (nhƣ sucrose) hiện diện trong mía đƣờng cung cấp nguồn vật liệu
lên men sẵn có. Mỹ là quốc gia sản xuất ethanol đứng thứ hai thế giới chủ yếu sản xuất
ethanol từ bắp (ngô). Hiện nay, các nhà khoa học đang mở rộng nghiên cứu sản xuất
ethanol sinh học từ các nguồn nguyên liệu lignocellulose vì tính sẵn có với trữ lƣợng lớn
và rẻ tiền của chúng. Đây là một hƣớng đi đầy hứa hẹn trong tƣơng lai. Tuy nhiên, sản
xuất ethanol sinh học từ vật liệu lignocellulose còn nhiều hạn chế cần phải khắc phục nhƣ
hiệu suất lên men thấp, tiêu tốn nhiều năng lƣợng để xử lý nguyên liệu, lƣợng ethanol tạo
ra thấp…Hƣớng đi này cần thêm nhiều nghiên cứu để đƣa vào sản xuất ở qui mô lớn
trong tƣơng lai.

Hiện tại, để nâng cao hiệu suất lên men và giảm chi phí cho quá trình sản xuất
ethanol sinh học, chúng ta cần tập trung vào cải thiện các quá trình sẵn có. Một trong
những phƣơng pháp đƣợc chú ý nhiều là sử dụng nấm men cố định trong lên men. Nấm
men cố định có hiệu suất lên men cao, có khả năng chịu đƣợc nồng độ cơ chất cao, lên
men đƣợc trong điều kiện pH thấp và thời gian lên men ngắn là những ƣu điểm nổi bật.
Có nhiều giá thể đã đƣợc nghiên cứu để ứng dụng trong sản xuất ethanol nhƣ alginate,
mạt cƣa, dăm bào, vỏ cam, bã mía, mía…Trong số đó, mía là một cơ chất rẻ tiền, sẵn có
và có nhiều triển vọng đặc biệt trong việc ứng dụng lên men dịch đƣờng và mật rỉ đƣờng.
Với cấu trúc cellulose, mía có khả năng thu hút đƣợc nấm men hấp phụ lên bề mặt.
Cấu trúc mao mạch với lƣợng đƣờng sẵn có trong mía có thể cung cấp cho nấm men tăng
sinh và phát triển sâu bên trong cấu trúc giá thể. Cấu trúc chắc chắn của mía, giúp chế
phẩm mía cố định có thể đƣợc tái sử dụng nhiều lần và chịu đƣợc những tác động trong
quá trình lên men. Sự gần gũi giữa mía và dịch đƣờng lên men cũng là một yếu tố thuận
Chƣơng 1: Mở đầu

SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 3

lợi. Việc ứng dụng chế phẩm mía cố định trong sản xuất ethanol sinh học từ dịch đƣờng
là hoàn toàn có thể thực hiện và giúp tăng năng suất lên men.

1.2. Nội dung đề tài
Đề tài “Nghiên cứu cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae trên mía và thử
nghiệm khả năng lên men dịch đƣờng mía” tập trung vào việc khảo sát các yếu tố ảnh
hƣởng đến quá trình cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae trên mía, cũng nhƣ quá
trình lên men dịch đƣờng mía bằng chế phẩm nấm men cố định đƣợc ở trên. Các yếu tố
nhƣ thời gian và chế độ lắc là hai yếu tố đƣợc quan tâm khi cố định nấm men trên mía
bằng phƣơng pháp hấp phụ và tăng sinh. Mía đã cố định nấm men đƣợc thử nghiệm sản
xuất ethanol từ dịch đƣờng mía. Tiến hành khảo sát các yếu tố thời gian lên men, độ Brix,
tỷ lệ giống và pH để tối ƣu các yếu tố này trong quá trình lên men bằng chế phẩm nấm
men cố định. Đồng thời kiểm tra khả năng tái sử dụng của chế phẩm nấm men cố định

trên mía ứng dụng trong lên men dịch đƣờng mía.

Chƣơng 2: Tổng quan lý thuyết

SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 4










CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT
Chƣơng 2: Tổng quan lý thuyết

SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 5


2.1. Công nghệ sản xuất cồn từ dịch đƣờng mía
Mía đƣờng (Saccharum officinarum) là cây chịu hạn nhiệt đới và cận nhiệt đới chứa
12 -17% tổng đƣờng trên khối lƣợng ƣớt với 68-72% độ ẩm (90% sucrose và 10%
glucose hoặc fructose). Hiệu suất chiết tách trung bình để sản xuất dịch đƣờng mía bởi ép
lên đến 95% và phần bã rắn còn lại là xơ mía (bã mía) [4, 7,21].
Chƣơng 2: Tổng quan lý thuyết

SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 6



Hình 2. 1: Con đƣờng Embden-Meyerhoff- Parnas glycolytic của Saccharomyces cerevisiae [20]
Dịch đƣờng mía thông thƣờng chứa đủ các chất dinh dƣỡng hữu cơ và khoáng chất
thích hợp cho sản xuất ethanol bằng con đƣờng lên men bởi Saccharomyces cerevisiae.
Các phản ứng biến đổi sucrose trong dịch đƣờng mía đƣợc thực hiện bởi tổ hợp enzyme
thủy phân có sẵn trong nấm men theo con đƣờng lên men đƣờng đơn. Đầu tiên, enzyme
invertase xúc tác phản ứng thủy phân sucrose thành glucose và fructose. Sau đó tổ hợp
Chƣơng 2: Tổng quan lý thuyết

SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 7

enzyme xúc tác phản ứng chuyển glucose và fructose thành ethanol và CO
2
. Theo lý
thuyết, một tấn đƣờng hexose (glucose hoặc fructose) sản xuất ra 511 kg ethanol. Tuy
nhiên, hiệu suất lên men thực tế chỉ đạt đƣợc khoảng 92% giá trị lý thuyết này [3, 6].
Trong những nhà máy chỉ sản xuất ethanol, nƣớc mía đƣợc gia nhiệt lên đến 110
o
C
để loại bỏ vi sinh vật, lọc, đôi lúc cô đặc bằng bay hơi và sau đó lên men. Trong những
kết hoạch kết hợp sản xuất đƣờng-ethanol (thêm chƣng cất), tinh thể sucrose đƣợc hình
thành sau khi cô đặc dịch đƣờng mía đƣợc loại ra bằng ly tâm, phần dịch còn lại (mật rỉ)
chứa đến 65% khối lƣợng đƣờng. Cả dịch đƣờng mía và mật rỉ đƣờng (sau khi chỉnh nồng
đồ đƣờng) thƣờng chứa những khoáng chất và chất dinh dƣỡng hữu cơ thích hợp cho sản
xuất ethanol bằng lên men bởi Saccharomyces cerevisiae [4].
Ở Brazil, 70% nhà máy sản xuất ethanol từ mía đƣờng dùng quá trình lên men theo
chu kỳ với khả năng lên men lên đến 1.5 triệu lít ethanol/ngày. Một quá trình lên men liên
tục tƣơng tự cũng đƣợc dùng trong khoảng 350 nhà máy chƣng cất, cái gần đây nhất đƣợc
xây dựng năm 1995. Trong cả quá trình, nấm men đƣợc phân tách khỏi môi trƣờng lên
men bằng phƣơng pháp ly tâm và tái sử dụng trong quá trình lên men tiếp theo sau khi

đƣợc rửa bằng acid sulphuric loãng để loại vi khuẩn tạp nhiễm. Mật độ tế bào cao (8-
17%v/v) và nhiệt độ 33-35
o
C góp phần làm giảm sự phát triển của tạp nhiễm đồng thời
cho nồng độ ethanol cao (8-11% v/v) và sản lƣợng ethanol cao (90-92%). Thời gian lên
men ngắn (6-10 giờ) cho phép nấm men xoay vòng 3 lần một ngày trong khoảng 200
ngày. Sự nhiễm vi khuẩn có thể xuất hiện nhƣng bị hạn chế bởi kháng sinh. Một ƣu điểm
của các nhà máy chƣng cất là hoàn toàn tự động.
Cuối cùng, dịch sau lên men đƣợc chƣng cất, sản xuất hỗn hợp ethanol và nƣớc ở
nồng độ 95.5% v/v. Để sản xuất ethanol khan, nƣớc đƣợc loại bỏ bằng phƣơng pháp đề
hydrate carbohydrate; hoặc gần đây, với sàn kích thƣớc phân tử để hấp thụ nƣớc. Phần
loại bỏ sau chƣng cất gọi là stillage (hoặc vinasse ở Brazil) gấp 10 – 15 lần thể tích
ethanol sản xuất đƣợc. Trong các nhà máy chƣng cất mía đƣờng, tất cả vinasse đƣợc dùng
nhƣ là phân bón và trong tƣới tiêu. Nhiều nhà máy chƣng cất của ngƣời Brazil loại bỏ
phần nấm men từ quá trình lên men nhƣ là nấm men khô cho thức ăn gia súc. Bằng cách
này, họ tận dụng đƣợc nguồn carbohydrate dự trữ trong nấm men (glycogen và trehalose)
cũng nhƣ lƣợng protein của nấm men đó. Do đó, có thể làm tăng giá trị thƣơng mại lên
nếu lƣợng protein trong nấm men cao hơn 40% khối lƣợng [4].
Chƣơng 2: Tổng quan lý thuyết

SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 8

Brazil và Ấn Độ là hai quốc gia đứng đầu thế giới về sản xuất bioethanol từ mía
đƣờng. Năm 2005, Brazil sản xuất đƣợc 16 tỉ lít ethanol nhiên liệu, 2 tỉ lít đƣợc xuất khẩu.
Ấn Độ sản xuất đƣợc khoảng 300 triệu lít ethanol nhiên liệu chủ yếu từ mật rỉ đƣờng. Bên
cạnh đó, các quốc gia nhƣ Trung Quốc, Thái Lan, Guatemala, Cuba, El Salvador cũng
đang xúc tiến nhiều dự án phát triển ethanol nhiên liệu từ mía đƣờng. Do điều kiện thổ
nhƣỡng và khí hậu thích hợp, mía đƣờng trở thành nguồn nguyên liệu sẵn có và rẻ tiền ở
các quốc gia này, hứa hẹn nhiều tiềm năng trong việc sản xuất ethanol sinh học giá rẻ
không những từ dịch đƣờng mía, mật rỉ mà còn từ bã mía [6].

2.2. Phƣơng pháp cố định tế bào
2.2.1. Một số kỹ thuật cố định tế bào
Kỹ thuật cố định tế bào đƣợc định nghĩa là “sự giam cầm vật lý hoặc sự hạn
chế vị trí của tế bào nguyên vẹn trong vùng không gian nhất định mà vẫn giữ đƣợc
toàn bộ các hoạt tính của tế bào đó”. Sự cố định tế bào thƣờng bắt chƣớc điều xảy ra
trong tự nhiên khi những tế bào phát triển trên bề mặt hoặc trong cấu trúc tự nhiên của
các cơ chất. Nhiều vi sinh vật có khả năng bám vào nhiều loại bề mặt tự nhiên khác
nhau.
Nhiều quá trình sinh học trở nên thuận lợi bởi kỹ thuật cố định. Do đó, nhiều kỹ
thuật cố định và giá thể đƣợc đề xuất. Những kỹ thuật này có thể đƣợc chia thành 4
nhóm chính dựa trên đặc tính vật lý của kỹ thuật nhƣ: hấp phụ lên bề mặt chất mang
rắn, nhốt trong cơ chất xốp, sự tự kết hợp bởi kết bông hoặc bởi tác nhân liên kết
ngang và sự giới hạn tế bào bởi các vật cản.
Chƣơng 2: Tổng quan lý thuyết

SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 9


Hình 2. 2: Các phƣơng pháp cố định cơ bản [25]
Sự cố định tế bào lên chất mang rắn đƣợc tiến hành bởi hấp thụ vật lý do lực
tĩnh điện hoặc bằng liên kết đồng hóa trị giữa màng tế bào và chất mang. Độ dày của
lớp màng tế bào thƣờng trong khoảng một lớp của tế bào đến 1mm hoặc hơn. Hệ
thống dùng tế bào cố định trên bề mặt khá phổ biến do tƣơng đối dễ tiến hành cố định
theo cách này. Sức bền của những tế bào đƣợc gắn với chất mang cũng nhƣ độ dày
của lớp màng sinh học thƣờng khác nhau và không dễ xác định. Không có vật cản
giữa tế bào và dung dịch, sự tách rời và tái phân bố tế bào có thể xảy ra với khả năng
thành lập trạng thái cân bằng giữa tế bào hấp phụ và tế bào tự do trong huyền phù.
Những cơ chất rắn dùng trong kiểu cố định này là vật liệu cellulose (DEAE-cellulose,
Chƣơng 2: Tổng quan lý thuyết


SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 10

gỗ, mùn cƣa, mùn cƣa đề lignin), vật liệu vô cơ (polygorskite, montmorilonite,
hydromica, đồ sứ xốp, thủy tinh xốp)… Những vật liệu rắn nhƣ thủy tinh hoặc
cellulose có thể đƣợc xử lý với nhiều cation, chitosan hoặc những hóa chất khác (tiền
tạo thành chất mang) để gia tăng khả năng hấp phụ của chúng.
Trong kiểu cố định bằng cách nhốt tế bào trong cơ chất xốp, những tế bào thâm
nhập vào cơ chất xốp cho đến khi tính lƣu động của chúng bị cản trở bởi sự hiện diện
của những tế bào khác, hoặc vật liệu xốp đƣợc hình thành trong quá trình nuôi tế bào.
Phƣơng pháp này dựa trên cả tế bào với mạng lƣới cứng nhắc để ngăn cản tế bào
khuếch tán ra môi trƣờng xung quanh, trong khi vẫn cho phép chất dinh dƣỡng và chất
chuyển hóa di chuyển. Ví dụ đặc trƣng của loại cố định này là nhốt trong gel
polysaccharide nhƣ alginate, -carrageenan, agar, chitosan và polygalacturonic acid
hoặc những cơ chất khác nhƣ gelatin, collagen và polyvinyl alcohol. Sự phát triển của
tế bào trong cơ chất xốp dựa vào giới hạn khuếch tán qui định bởi độ xốp của vật liệu
và sau đó là bởi sự va chạm của sinh khối tích tụ. Một trong những vấn đề của việc
nhốt tế bào trong cơ chất xốp nhƣ gel polysaccharide là khả năng tế bào định vị trên
bề mặt ngoài của hạt để nhân lên và giải phóng khỏi hạt. Điều này dẫn đến một hệ
thống bao gồm tế bào cố định và tự do. Để tránh vấn đề này, hai lớp hạt đƣợc phát
triển khi hạt hydrogel với một nhân trong chứa tế bào và một lớp ngoài ngăn tế bào từ
nhân thoát ra.
Sự kết bông tế bào đƣợc định nghĩa nhƣ một sự kết hợp của những tế bào tạo
thành một đơn vị lớn hơn hoặc thuộc tính của tế bào trong huyền phù để dính chặt
thành cục và lắng nhanh. Sự kết bông có thể đƣợc coi nhƣ một kỹ thuật cố định khi
kích thƣớc của khối kết có khả năng sử dụng trong thiết bị phản ứng nhƣ thiết bị nhồi,
tầng sôi và thiết bị phản ứng quay liên tục. Khả năng hình thành khối kết đƣợc quan
sát chính với mốc, nấm sợi và tế bào thực vật. Tuy nhiên những tác nhân kết bông
nhân tạo hoặc cầu nối ngang có thể đƣợc dùng để tăng sự kết hợp trong tế bào nuôi
cấy cái không kết bông tự nhiên. Sự kết bông của nấm men là đặc điểm quan trọng
chính trong công nghiệp bia vì nó tác động đến khả năng lên men và chất lƣợng bia

trong việc loại bỏ và thu hồi nấm men. Điều này bị tác động bởi nhiều nhân tố nhƣ
thành phần cấu tạo vách tế bào, pH, oxygen hòa tan và thành phần môi trƣờng. Sự
ngăn chặn cơ học sau các vật cản
Chƣơng 2: Tổng quan lý thuyết

SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 11

Sự giới hạn tế bào bởi các vật cản có thể đạt đƣợc bằng cách dùng màng lọc vi
sinh xốp hoặc bởi sự nhốt tế bào trong vi vỏ hoặc bởi sự cố định tế bào lên bề mặt
tƣơng tác của hai dung dịch không hòa tan vào nhau. Kiểu cố định này thì lý tƣởng khi
tế bào tự do sản xuất và vận chuyển các hợp chất nhỏ. Kỹ thuật bioreactor màng đƣợc
dùng rộng rãi trong xoay vòng tế bào và quá trình liên tục. Nhƣợc điểm chính của sự
cố định tế bào giữa màng vi sinh xốp là giới hạn vận chuyển sinh khối và khả năng tắc
nghẽn màng do sự phát triển của tế bào [19, 25].
2.2.2. Yêu cầu đối với chất mang
Một chất mang thích hợp để cố định tế bào phải thỏa mãn những yêu cầu sau:
- Chất mang có diện tích bề mặt lớn với những nhóm chức năng để tế bào đính
vào.
- Chất mang phải dễ sử dụng và phục hồi.
- Khả năng tồn tại của tế bào và hoạt tính ổn định của xúc tác cố định phải cao và
đƣợc duy trì trong thời gian dài.
- Hoạt tính sinh học của tế bào cố định không bị tác động bất lợi bởi quá trình cố
định.
- Độ xốp của chất mang cần đồng đều và có thể kiểm soát, cho phép sự trao đổi
của cơ chất tự do, sản phẩm, cofactor và khí.
- Chất mang duy trì tính bền vững cơ, hóa, nhiệt và sinh học tốt; không dễ bị phá
hủy bởi enzyme, dung môi, sự thay đổi áp suất hoặc lực kéo lớn.
- Chất mang và kỹ thuật cố định nên dễ thực hiện, chi phí hiệu quả và dễ mở
rộng [25].
2.2.3. Tác động của kỹ thuật cố định đến tế bào

Sự thay đổi trong sự phát triển tế bào, hoạt tính sinh lý và chuyển hóa có thể
gây ra bởi quá trình cố định cho cả nấm men và vi khuẩn. Nhiều nghiên cứu đã đƣợc
thực hiện để tìm hiểu những nguyên nhân làm thay đổi đặc tính chuyển hóa của tế bào
cố định. Và ngƣời ta nhận thấy rằng khó để tiên đoán loại và độ lớn của những thay
đổi chuyển hóa có thể xảy ra trong suốt quá trình cố định. Một số yếu tố đƣợc cho là
nguyên nhân cho những thay đổi này, chẳng hạn nhƣ giới hạn vận chuyển sinh khối
bởi sự rƣờm rà, sự xáo trộn trong con đƣờng phát triển, sự căng bề mặt do tác động
của áp suất thẩm thấu, sự giảm hoạt độ của nƣớc, sự liên lạc giữa tế bào với tế bào, sự
Chƣơng 2: Tổng quan lý thuyết

SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 12

thay đổi trong hình thái học tế bào, sự thay đổi tính thấm của màng tế bào và thành
phần môi trƣờng có sẵn.
So sánh những báo cáo của các nghiên cứu về tế bào cố định và tự do cho thấy
có những tác động lên sự hoạt hóa năng lƣợng chuyển hóa của nấm men, gia tăng hấp
thụ cơ chất và sản xuất sản phẩm, sản lƣợng phụ phẩm lên men thấp, giá trị pH nội
bào của nấm men cố định cao hơn, sự gia tăng tính chống chịu những chất độc và chất
ức chế và gia tăng hoạt tính chuyển đổi. Trong số những tác động này, những tác động
nổi bật nhất nhƣ tác động lên sự phát triển sinh lý, tác động lên sự trao đổi chất, tác
động lên khả năng chống chịu.
Tác động lên sự phát triển sinh lý trong quá trình cố định là do thuộc tính thiếu
không gian để phát triển trong cơ chất. Tế bào cố định có khả năng sống sót và duy trì
đƣợc hoạt tính khi giữ ở nhiệt độ thấp trong một thời gian dài.Melzoch và cộng sự
(1994) thu đƣợc những hình thái và hình dạng khác nhau giữa tế bào Saccharomyces
cerevisiae tự do và cố định trên alginate. Khi lên men dùng S.cerevisiae cố định trên
hạt gel calcium alginate trong bioreactor nhồi hay tầng sôi, tế bào cho đáp ứng phát
triển thay đổi so với tế bào tự do; đặc điểm đáng chú ý là giảm mức độ phát triển khi
có sự cân xứng của nấm men gia tăng trong hạt gel. Sự hấp phụ nấm men lên những
bề mặt rắn khác nhau cũng đƣợc cho là tác động đến mức độ phát triển của tế bào.

Tế bào cố định thƣờng chịu tác động lên sự trao đổi chất mà thấy rõ nhất là ở
các điều kiện hoạt động tối ƣu của tế bào. Buzas và cộng sự (1989) cho rằng pH tối ƣu
cho lên men khi dùng S.cerevisiae tự do là 4, trong khi khả năng lên men của tế bào cố
định trong alginate thì độc lập với pH. Sự định lƣợng pH nội bào trong tế bào
S.cerevisiae tự do và cố định trên alginate lần lƣợt là 6.9 và 6.8. Sự giảm giá trị pH nội
bào trong tế bào nấm men cố định là do sự gia tăng hoạt tính của enzyme và vì vậy
khả năng sản xuất tăng. Sự giảm pH nội bào đƣợc cho là để tăng tính thấm của màn
nguyên sinh chất với proton, dẫn đến tiêu thụ ATP cao hơn làm gia tăng hoạt tính
glucolytic và hấp thụ glucose. Sự hấp thụ của S.carlsbergensis lên hạt thủy tinh xốp
làm gia tăng sản lƣợng của ethanol từ glucose và làm giảm lƣợng CO
2
. Những quan
sát tƣơng tự đƣợc báo cáo với S.cerevisiae cố định trên ceramics. Tế bào S.cerevisiae
nhốt trong gelatine cũng cho nồng độ polysaccharide, DNA và RNA cao hơn khi so
sánh với tế bào tự do.
Chƣơng 2: Tổng quan lý thuyết

SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 13

Quá trình cố định cải thiện đáng kể đến khả năng chống chịu stress của tế bào
vi sinh vật. Nấm men cố định có khả năng chịu đƣợc nồng độ cơ chất và ethanol cao
hơn nấm men tự do. Bên cạnh đó, nấm men cố định cũng chịu đƣợc pH thấp và có khả
năng chống chịu với những thay đổi về nhiệt độ tốt hơn nấm men tự do [19, 25].
2.3. Giá thể mía
Thân mía chứa chủ yếu là nƣớc, đƣờng (sucrose và glucose hoặc fructose) và thành
phần lignocellulose (hay còn gọi là bã mía). Trong đó phần lignocellulose đóng vai trò
chính trong việc cố định nấm men lên giá thể mía.
25%
lignin. Trong tế bào thực vật, bao gồm cả bã mía, có một bức tƣờng thứ hai gồm có 3 lớp
( S1. S2, S3) đƣợc bao quanh bởi lignin. Các lớp S1, S3 chứa chủ yếu là cellulose và

hemicellulose vô định hình. Lớp S2 chứa cellulose kết tinh. Vùng kết tinh đƣợc dịnh dạng
bởi liên kết hydrogen theo một sự sắp xếp có thứ tự. Tuy nhiên, các vùng vô định hình
cũng tồn tại trong cellulose. Cellulose, hemicellulose, lignin hiện diện giữa 3 lớp S1, S2,
S3 [26]. Sự minh hoạ cho cấu trúc thành tế bào với sự sắp xếp các thành phần của nó sẽ
đƣợc thể hiện qua hình sau:

Hình 2. 3: Cấu trúc lignocellulose. Lớp S1 và S3 chứa hemicellulose và cellulose vô định hình.
Lớp S2 chứa các vùng cellulose kết tinh [26].
Chƣơng 2: Tổng quan lý thuyết

SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 14

2.3.1. Cellulose
Cellulose là một loại polysaccharide đƣợc tạo thành bởi nhiều phân tử đƣờng.
Số lƣợng phân tử đƣờng lặp lại đƣợc gọi là mức độ polymer hoá (DP). Cellulose của
gỗ mềm tự nhiên và của các thớ gỗ làm giấy có DP lần lƣợt là 3500 và 600-1500 DP =
Khối lƣợng phân tử cellulose/khối lƣợng phân tử của một phân tử đƣờng [17].
Cellulose chiếm khoảng một nửa khối lƣợng của thực vật (Klass, 1998). Cotton
thì chứa hầu hết là cellulose, trong khi bã mía chứa khoang 40% cellulose.
Cellulose là một polymer mạch thẳng của D-glucose đựơc liên kết với nhau bởi
liên kết -1,4-glycoside giữa nguyên tử carbon số 1 với nguyên tử carbon số 4 của phân
tử glucose kế tiếp. Liên kết glycoside giúp tạo dạng sợi khó cắt, và bản chất không tan
trong nƣớc bởi vì cấu tạo này bảo đảm mỗi đơn vị glucose đƣợc định hƣớng “ trans”
với glucose bên cạnh. Sản phẩm thuỷ phân của cellulose là một loạt oligosaccharide
nhƣ cellobiose, cellotriose, và cellotetrose [17].
Ngoài ra, liên kết hydrogen nội phân tử giữa các nhóm hydroxyl trong cùng
một mạch cellulose làm cho cellulose trở nên cứng, căng, và dai. Các nhóm hydroxyl
ở mỗi đầu mạch cellulose có đặc điểm khác nhau. Carbon số 1 ở đầu mạch cellulose
chứa nhóm aldehyde có tính khử. Ở cuối mạch cellulose, carbon số 4 chứa nhóm
hydroxyl không có tính chất của rƣợu [17].

Liên kết hydrogen giữa các mạch cellulose cạnh nhau dẫn đến các bó mạch
song song ( mỗi bó khoảng 40-70 mạch), gọi là vi sợi cellulose. Mỗi đơn vị đƣờng
glucose của một mạch cellulose có 3 nhóm hydroxyl tƣơng tác với 3 nhóm hydroxyl
trong mạch kia bởi liên kết hoá trị thứ cấp. Lực liên kết khoảng 25 KJ/mol, mạnh hơn
gấp 100 lần so với lực Van der Waals ( khoảng 0,15kJ/mol), nhƣng chỉ bằng khoảng
1/10 liên kết cộng hoá trị O-H ( 460kJ/mol). Tƣơng tác giữa các nhóm hydroxyl nội
phân tử và các nhóm hydroxyl giữa các phân tử cạnh nhau cũng góp phần duy trì cấu
trúc của cellulose [26].
Cellulose không đồng nhất,có thể tồn tại ở dạng kết tinh hoặc vô định hình.
Vùng cấu trúc vô định hình chiếm ít hơn vùng kết tinh. Vùng cấu trúc kết tinh là vùng
có trật tự cao và khó bị thuỷ phân bởi enzyme cellulase, hoá chất hoặc dung môi. Là
vùng mà các vi sợi đƣợc định hƣớng, ví dụ nhƣ một đầu có tính khử và một đầu không
khử của cellulose. Còn các vùng lộn xộn trong mạch cellulose trộn lẫn với vùng kết
tinh, gọi là vùng vô định hình. Các vùng này thì dễ bị tổn thất bởi sự thuỷ phân. Các vi
Chƣơng 2: Tổng quan lý thuyết

SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 15

sợi tập hợp lại trong thành tế bào thành các lớp ( hoặc phiến mỏng) với khoảng trống
giữa mỗi vi sợi khoảng 20-40 nm, đƣợc liên kết bởi lignin và các glycan liên kết
ngang với nhau gọi là hemicellulose [17].

Hình 2. 4: Cấu trúc cellulose [26]
2.3.2. Hemicellulose
Hemicellulose hiện diện trong thành tế bào có mối liên quan với cellulose. Nó
là một polysaccharide phức tạp có thể tan đƣợc trong cả kiềm và acid. Công thức hoá
học của hemicellulose là (C
5
H
8

O
4
)n. Hemicellulose là polymer hỗn tạp, không nhƣ
cellulose, và đƣợc cấu thành bởi 50-200 đơn vị đƣờng đơn [26].
Các đƣờng đơn có thề tồn tại trong hemicellulose bao gồm đƣờng pentose
(arabinose, xylose) và đƣờng hexose ( galactose, glucose, mannose). Trong đó, xylose
chiếm số lƣợng nhiều hơn cả. Xylan chứa D-xylose đƣợc liên kết với nhau bởi liên kết
β-1,4-glycoside. Arabinose là thành phần có số lƣợng lớn thứ 2 trong hemicellulose.
Các thành phần còn lại thƣờng chỉ chiếm với số lƣợng ít. Một vài hemicellulose chứa
cả glucomannan và galactoglucomannan. Glucomannan chứa D-glucose và D-
mannose với tỷ lệ 30:70. Galactoglucomannan bao gồm D-galactose, D-glucose, và D-
mannose với tỷ lệ 2:10:30 [26].
Hemicellulose là một polymer phân nhánh với cấu trúc ngẫu nhiên, vô định
hình, trái với cấu trúc kết tinh, không phân nhánh của cellulose. Mạch nhánh có cấu
trúc đơn giản, thƣờng là disaccharide hoặc trisaccharide. Và chính cấu trúc phân
nhánh này làm cho sự tận dụng hemicellulose khó khăn hơn, do nó sẽ làm quá trình
Chƣơng 2: Tổng quan lý thuyết

SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 16

thuỷ phân xảy ra chậm hơn. Sự liên kết hemicellulose với các polysaccharide khác và
lignin chính là nhờ mạch nhánh này [26].

Hình 2. 5: Cấu trúc của hemicellulose [26]
2.3.3. Lignin
Trong tế bào thực vật, các xơ sợi đƣợc kết dính với nhau nhờ một vật liệu nội
bào gọi là lignin. Lignin là một polymer phân nhánh tìm thấy trong thành tế bào thực
vật, có khả năng chống lại sự phát triển của vi sinh vật và tích tụ đƣợc nhiều năng
lƣợng mặt trời hơn so với cellulose và hemicellulose. Cấu trúc phức tạp, ngẫu nhiên,
lộn xộn, và chứa chủ yếu là các vòng thơm của lignin sẽ làm tăng tính đàn hồi, mềm

dẻo cho việc kết dính cellulose và hemicellulose, tạo nên một hàng rào phòng thủ
mạnh mẽ nhằm chống lại sự tấn công của enzyme và các hoá chất khác, bằng cách
gắn chặt và làm cứng các sợi cellulose lại với nhau. Để thuỷ phân đƣợc lignin và tiếp
cận đƣợc cellulose là một thử thách lớn. Thậm chí khi ta vƣợt qua đƣợc thử thách này,
nhƣng ta lại gặp một vấn đề khác là các sản phẩm thủy phân trung gian của lignin
(nhƣ các hợp chất phenol) lại là các chất độc kiềm hãm sự lên men đề chuyển thành
ethanol sau này.
Chƣơng 2: Tổng quan lý thuyết

SVTH: Phan Thị Tƣờng Vi 17

Lignin đƣợc chia thành 3 nhóm chính: lignin của gỗ cứng, lignin gỗ mềm và
lignin trong cỏ. Sự khác biệt giữa các nhóm phụ thuộc vào cấu trúa hoá học của các
đƣờng đơn cấu tạo nên lignin [17].
Thành phần chủ yếu của lignin là các đơn vị phenylpropane ( C9).Vòng thơm
chứa trong lignin rất nhiều, do bởi enzyme xúc tác phản ứng polymer hoá 3 đơn vi
phenyl-propane là: guaiacylpropane, syringylpropane, p-hydroxyphenylpropane, với
các tiền chất tƣơng ứng là rƣợu coniferyl, rƣợu sinapyl, và rƣợu p-coumaryl . Hàm
lƣợng tiền chất của lignin phụ thuộc vào nguồn gốc lignin. Chẳng hạn nhƣ, gỗ mềm
chứa chủ yếu là coniferyl alcohol, trong khi đó gỗ cứng thì chứa coniferyl alcohol và
sinapyl alcohol với hàm lƣợng ngang nhau. Còn para-coumaryl alcohol hầu hết chỉ tìm
thấy trong cỏ [17].

Hình 2. 6: Ba tiền chất phenyl - propane của lignin [17]
Sự sinh tổng hợp lignin đƣợc gây ra bởi phản ứng nối gốc tự do, nơi mà các
enzyme sẽ bẻ gãy liên kết cộng hoá trị giữa oxy và hydro của phenol. Sự bẻ gãy liên
kết này sẽ dẫn đến việc các gốc tự do sẽ cố gắng ổn định chính nó trở lại bằng cách di
chuyển electron thông qua các phân tử, quá trình này đƣợc gọi là sự ổn định cộng
hƣởng. Khi một gốc tự do gặp một gốc tự do khác chúng sẽ tự kết hợp nhau hình
thành một liên kết cộng hoá trị khác. Chất nhị trùng hợp này vẫn còn một nhóm

hydroxyl tự do ccủa phenol và enzyme có thề loại bỏ hydro và electron để tạo nên
thêm một gốc tự do nữa. Quá trình này sau đó cứ tiếp tục và sẽ hình thành nên một cấu
trúc polymer ngẫu nhiên và dài hơn.
Lignin có cấu trúc không đồng nhất, chứa đựng các vùng vô định hình và các
vùng hình cầu hoặc dài. Cấu trúc và thành phần hoá học của mỗi lignin đƣợc tạo