ỨNG DỤNG CỦA VACXIN DNA
ỨNG DỤNG CỦA VACXIN DNA
TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
GVHD
GVHD: Ths.
Nguyễn Minh Nhựt
Nguyễn Minh Nhựt
Nhóm
Nhóm:
Bùi Thị Anh Thư
Bùi Thị Anh Thư
Lữ Minh Vũ
Lữ Minh Vũ
Nguyễn Khánh Ngân
Nguyễn Khánh Ngân
Nguyễn Vi Thảo
Nguyễn Vi Thảo
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐH KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM
KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

1.Giới thiệu

Vacxin có hiệu quả cao nhất trong việc
Vacxin có hiệu quả cao nhất trong việc
kiểm soát mầm bệnh lây nhiểm giúp ích
kiểm soát mầm bệnh lây nhiểm giúp ích
cho việc phòng ngừa 1 số bệnh ở cá tôm…
cho việc phòng ngừa 1 số bệnh ở cá tôm…
góp phần tăng năng suất đáp ứng nhu cầu

góp phần tăng năng suất đáp ứng nhu cầu
của người tiêu dùng.
của người tiêu dùng.

Vacxin DNA được ví như những vacxin
Vacxin DNA được ví như những vacxin
kháng nguyên truyền thống đã thành công
kháng nguyên truyền thống đã thành công
trên nhiều vật nuôi khác.
trên nhiều vật nuôi khác.

Ngoài việc tối ưu hóa hiệu quả của vắc-xin
Ngoài việc tối ưu hóa hiệu quả của vắc-xin
DNA, các vấn đề quan trọng khác, chẳng
DNA, các vấn đề quan trọng khác, chẳng
hạn như an toàn và chi phí sản xuất sẽ là
hạn như an toàn và chi phí sản xuất sẽ là
yếu tố quyết định cho các ứng dụng tiềm
yếu tố quyết định cho các ứng dụng tiềm
năng của công nghệ này trong các trang
năng của công nghệ này trong các trang
trại nuôi cá.
trại nuôi cá.
Hình 1. liều vaccine
Hình 1. liều vaccine
1.1 Nhu cầu DNA vaccine cho
cá




Ước tính có khoảng 10% các loài
Ước tính có khoảng 10% các loài
thủy hải sản bị chết do mắc bệnh
thủy hải sản bị chết do mắc bệnh
truyền nhiễm. Dịch bệnh có thể gây
truyền nhiễm. Dịch bệnh có thể gây
ra thiệt hại nghiêm trọng cho nông
ra thiệt hại nghiêm trọng cho nông
dân vì trong nhiều trường hợp
dân vì trong nhiều trường hợp
không có các biện pháp phòng và
không có các biện pháp phòng và
điều trị sẳn có.
điều trị sẳn có.

Tác dụng phụ của các thuốc hóa
chất làm ảnh hưởng không tốt đến
thủy hải sản.

Vacxin đã chứng minh được khả
năng phòng bệnh của nó trên hầu hết
gia súc và vật nuôi, nhưng ở cá và
thủy sản thì vẫn còn nhiều hạn chế.
Hình 2. Cá hồi thương phẩm
Hình 2. Cá hồi thương phẩm
1.2 Ưu điểm của Vaccine DNA

Vắc-xin DNA mang lại một số lợi thế so với vắc-xin kháng nguyên cổ điển (tức là
Vắc-xin DNA mang lại một số lợi thế so với vắc-xin kháng nguyên cổ điển (tức là
giảm độc lực, gây chết toàn bộ và vacxin tiểu đơn vị).

giảm độc lực, gây chết toàn bộ và vacxin tiểu đơn vị).

Chi phí thấp, dễ dàng sản xuất trên quy mô công nghiệp, dễ dàng bảo quản lưu trữ
Chi phí thấp, dễ dàng sản xuất trên quy mô công nghiệp, dễ dàng bảo quản lưu trữ
cũng như vận chuyển.
cũng như vận chuyển.



Đáp ứng miễn dịch cơ thể lâu dài và mạnh mẻ, cũng giống như các vacxin truyền
Đáp ứng miễn dịch cơ thể lâu dài và mạnh mẻ, cũng giống như các vacxin truyền
thống khác nhưng ở vacxin DNA thì không gây nguy cơ nhiễm trùng cơ hội.
thống khác nhưng ở vacxin DNA thì không gây nguy cơ nhiễm trùng cơ hội.

Ở cá, các đáp ứng miễn dịch ít được biết đến sau khi tiêm plasmid, nhưng không
Ở cá, các đáp ứng miễn dịch ít được biết đến sau khi tiêm plasmid, nhưng không
có biểu hiện nào cho thấy nó khác biệt với những ghi nhận ở động vật khác.
có biểu hiện nào cho thấy nó khác biệt với những ghi nhận ở động vật khác.
2. Cấu trúc Plasmid
2.1 Kiểm soát các yếu tố

Trình tự để điều khiển phiên mã trong các vectơ tiêu chuẩn (promoter, enhancer,
Trình tự để điều khiển phiên mã trong các vectơ tiêu chuẩn (promoter, enhancer,
intron, tín hiệu bổ sung, vv) dường như làm việc hiệu quả ở động vật thủy sản.
intron, tín hiệu bổ sung, vv) dường như làm việc hiệu quả ở động vật thủy sản.

Các promoter khác nhau quyết định khả năng điều khiển biểu hiện của gen lạ trong
Các promoter khác nhau quyết định khả năng điều khiển biểu hiện của gen lạ trong
các mô cá
các mô cá

. (bảng 1).
. (bảng 1).
Bảng 1. Các promoter thử nghiệm
trên mô cá
Bảng 1. Các promoter thử nghiệm
trên mô cá

Hiệu quả của chúng khác nhau đáng kể, nhưng nói chung các cytomegalovirus
Hiệu quả của chúng khác nhau đáng kể, nhưng nói chung các cytomegalovirus
(CMV) ngay lập tức cho kết quả tốt nhất.
(CMV) ngay lập tức cho kết quả tốt nhất.

Các yếu tố phiên mã khác trong vắc-xin DNA không có giá trị trong cá, nhưng có
Các yếu tố phiên mã khác trong vắc-xin DNA không có giá trị trong cá, nhưng có
những dấu hiệu cho thấy trong nghiên cứu in vitro intron động vật có vú không
những dấu hiệu cho thấy trong nghiên cứu in vitro intron động vật có vú không
phải lúc nào cũng có thế áp dụng cho tế bào cá.
phải lúc nào cũng có thế áp dụng cho tế bào cá.

Các tính năng tùy chọn của các khung vector như epitope Th không liên quan đến
Các tính năng tùy chọn của các khung vector như epitope Th không liên quan đến
việc bổ sung T , quá trình miễn dịch CpG, hoặc cho những gen thể hiện tương
việc bổ sung T , quá trình miễn dịch CpG, hoặc cho những gen thể hiện tương
đương như các cytokine hoặc các phân tử costimulatory, cuối cùng được bổ sung
đương như các cytokine hoặc các phân tử costimulatory, cuối cùng được bổ sung
vào vắc-xin DNA
vào vắc-xin DNA.

Trình tự để kiểm soát phiên mã trong các vectơ tiêu chuẩn (promoter, enhancer,
Trình tự để kiểm soát phiên mã trong các vectơ tiêu chuẩn (promoter, enhancer,

intron, tín hiệu bổ sung, vv) dường như có hiểu quả ở thủy sản./
intron, tín hiệu bổ sung, vv) dường như có hiểu quả ở thủy sản./
2.2 Mã hóa gen kháng nguyên

Bất kỳ gen mã hóa cho một loại protein của mầm bệnh gây ra một đáp ứng miễn
Bất kỳ gen mã hóa cho một loại protein của mầm bệnh gây ra một đáp ứng miễn
dịch bảo vệ vật chủ có thể được sử dụng trong các vắc-xin DNA, miễn là việc sử
dịch bảo vệ vật chủ có thể được sử dụng trong các vắc-xin DNA, miễn là việc sử
dụng codon của gen cho phép thể hiện trong các tế bào cá.
dụng codon của gen cho phép thể hiện trong các tế bào cá.

Để tạo ra các phản ứng miễn dịch, đầu tiên kháng nguyên tế bào B phải được kích
Để tạo ra các phản ứng miễn dịch, đầu tiên kháng nguyên tế bào B phải được kích
hoạt. Vì vậy, các hoạt chất tiết ra của gen ngoại lai có thể ảnh hưởng đến việc sản
hoạt. Vì vậy, các hoạt chất tiết ra của gen ngoại lai có thể ảnh hưởng đến việc sản
xuất kháng thể. Tuy nhiên, phản ứng miễn dịch là có thể ngay cả khi kháng nguyên
xuất kháng thể. Tuy nhiên, phản ứng miễn dịch là có thể ngay cả khi kháng nguyên
không được tiết ra
không được tiết ra.



Trong trường hợp kháng nguyên không tiết ra, tế bào B-không được kích hoạt đầy
Trong trường hợp kháng nguyên không tiết ra, tế bào B-không được kích hoạt đầy
đủ, trừ khi kháng nguyên được giải phóng từ các tế bào
đủ, trừ khi kháng nguyên được giải phóng từ các tế bào đã được biến nạp. Chẳng
hạn như phân giải bởi kháng nguyên gây độc tế bào tế bào lympho T (CTL)

Do đó vắc-xin DNA có thể bao gồm một peptide tín hiệu để tiết trực tiếp kháng
nguyên đã được mã hóa, nhưng quá trình không xảy ra tuyệt đối.

2.3 DNA là một phân tử gây kích
2.3 DNA là một phân tử gây kích
thích interleukin-2 đáp ứng miễn dịch
thích interleukin-2 đáp ứng miễn dịch
mạnh cytokin cho cá :
mạnh cytokin cho cá :

Phản ứng miễn dịch mạnh gây ra bởi chủng ngừa DNA không phụ thuộc hoàn toàn
Phản ứng miễn dịch mạnh gây ra bởi chủng ngừa DNA không phụ thuộc hoàn toàn
vào biểu hiện của kháng nguyên
vào biểu hiện của kháng nguyên.



Trong thực tế, nó là các trình tự ADN ngắn có chứa dinucleotides CpG
Trong thực tế, nó là các trình tự ADN ngắn có chứa dinucleotides CpG
unmethylated trong điều kiện cụ thể có thể trực tiếp kích thích tế bào hệ miễn dịch
unmethylated trong điều kiện cụ thể có thể trực tiếp kích thích tế bào hệ miễn dịch
như đơn bào, tế bào B, đại thực bào và tế bào đuôi gai(dendritic te bao mien dich)
như đơn bào, tế bào B, đại thực bào và tế bào đuôi gai(dendritic te bao mien dich).
Hình 3. Đáp ứng chế tiết cytokine của đại thực bào và chức năng
của các cytokine do đại thực bào chế tiết
Hình 3. Đáp ứng chế tiết cytokine của đại thực bào và chức năng
của các cytokine do đại thực bào chế tiết

Những hoạt chất tiết ra kích thích hệ miễn dịch được gọi là CpG-S. trong điều
kiện bất lợi, các họat CpG khác trung hòa hoặc chặn kích hoạt miễn dịch bởi các
CpG-S motifs được gọi là các CpG-N motifs.

Vectơ DNA plasmid được sử dụng để tiêm chủng cho cá chắc chắn chứa CpG-S

và các CpG-N trong chuỗi.

Nó có thể là một khung tối ưu hóa CpG , có chứa một số lượng tối ưu của các
CpG-S đặc hiệu cho cá và sự giảm sút của các mô-típ-N CpG có thể cải thiện đáp
ứng miễn dịch ở cá, và có thể cho phép quản lý với lượng nhỏ hơn của DNA.
3. Phương pháp
3.1 Tiêm
3.1.1 Vị trí tiêm



Plasmid DNA được tinh sạch trong một thể tích nhỏ của nước muối hoặc dung dịch
Plasmid DNA được tinh sạch trong một thể tích nhỏ của nước muối hoặc dung dịch
đệm
đệm



Được sử dụng để tiêm cơ bên sườn, bên dưới hoặc gần vây lưng.
Được sử dụng để tiêm cơ bên sườn, bên dưới hoặc gần vây lưng.



Tiêm vào mang kết quả cho thấy không thấy hoạt động của gene chỉ thị , trong khi nó
Tiêm vào mang kết quả cho thấy không thấy hoạt động của gene chỉ thị , trong khi nó
tồn tại ở phúc mạc .
tồn tại ở phúc mạc .
Ví dụ :

Ở chuột:


Tiêm trực tiếp vào cơ bắp (IM) mũi tiêm sẽ gây ra đáp ứng chủ yếu loại Thl, với tỷ
lệ IgG2a : IgGl cao, interferon IFN-γ và mức độ thấp interleukin IL(-4).

Tiêm vào gene biểu bì sẽ gây ra đáp ứng dạng Th2, biểu hiện ưu thế của IgG1 đối
với IgG2a, kém hơn IFN-γ và cao hơn IL-4.

Tiêm DNA vào trong da (ID) có thể là biểu hiện loại Th1 hoặc là Th2.

Ở cá, hầu hết không có thông tin tồn tại trên những tác động khác nhau của phản
ứng miễn dịch,do nghiên cứu hạn chế và đặc tính tương đối kém của hệ miển dịch
của cá.
3.1.2 Liều lượ ng và thể tích:

Liều lượng lớn thường làm sự giảm hoạt động của gene chỉ thị, nhưng ít có sự biến
Liều lượng lớn thường làm sự giảm hoạt động của gene chỉ thị, nhưng ít có sự biến
đổi giữa những cá thể cá.
đổi giữa những cá thể cá.

Liều điển hình cho cá : 1-50 µg DNA
Liều điển hình cho cá : 1-50 µg DNA

Trong thể tích khoảng : 10-50 µl DNA
Trong thể tích khoảng : 10-50 µl DNA

Tuy nhiên, với liều lượng thấp hơn nhiều cũng có hiệu quả.

Liều lượng tối ưu của DNA có thể thay đổi tùy theo loài và kích thước của động vật,
Liều lượng tối ưu của DNA có thể thay đổi tùy theo loài và kích thước của động vật,
nhưng nó không tỷ lệ thuận đối với trọng lượng của cá.

nhưng nó không tỷ lệ thuận đối với trọng lượng của cá.

Ngoài ra, tình trạng sinh lý của động vật có ảnh hưởng đến mức độ biểu hiện.
Ngoài ra, tình trạng sinh lý của động vật có ảnh hưởng đến mức độ biểu hiện.

VD
VD
:
: Những con cá chép con ở giai đoạn phát triển nhanh thì mức độ biểu hiện hoạt
động của Chloramphenycol acetyl transferase (CAT) cao hơn rất nhiều so với cá đã
trưởng thành.

Điều thú vị là, biểu hiện của gene chỉ thị Luciferase (được điều khiển bởi promoter
CMV ) hoạt động ở cá cao hơn trong cơ bắp chuột sử dụng với cùng 1 liều lượng
DNA. Không biết điều này có phải do sự tăng lên ổn định của các protein
luciferase của cá so với tế bào động vật có vú, tới một mức độ biểu hiện cao hơn,
hoặc một hiệu quả biến nạp tốt hơn .

Trong thực tế, liều lượng thấp như 0.1 µg DNA cho mỗi con cá có hiệu quả như 10
µg gây bảo vệ miễn dịch.

Điều đó báo trước tiềm năng của ứng dụng vaccine DNA trong trại cá.
Bảng 3. PP tiêm và liều DNA thử
nghiệm trên mô cá
Bảng 3. PP tiêm và liều DNA thử
nghiệm trên mô cá
3.1.3 Vị trí biểu hiện của gene lạ

Có sự khác biệt rõ ràng trong các tài liệu liên quan tới vị trí biểu hiện của gene lạ sau
khi tiêm vào cơ thể vector plasmid.


Ở những loài cá lớn, biểu hiện của gene chỉ thị dường như chủ yếu giới hạn ở vị trí
tiêm.

Biến nạp vào tế bào không phải tế bào cơ, đặc biệt là tế bào trình diện kháng nguyên
chuyên nghiệp có thể góp phần hoàn thiện đáp ứng miễn dịch.

Đối với cá nhỏ, biểu hiện của gene chỉ thị luciferase được tiêm vào cơ bắp đã được
phát hiện trong các cơ quan khác nhau,có ở gan, lá lách và thận nhưng mức độ cao
nhất là trong cơ.

Sự khác nhau hầu hết giữa cá nhỏ và cá lớn có khả năng là do sự phát tán nhanh chóng
các DNA được tiêm vào cơ cá nhỏ, nhưng đó có thể có những biến thể trong Protocol
,độ nhạy của thử nghiệm và mẫu động vật sử dụng.

Ngoài ra các promoter có thể ảnh hưởng tới vị trí biểu hiện gene lạ, như promoter
CMV được sử dụng trong các nghiên cứu này.
3.1.4 Thờ i gian biểu hiện và hiệu
quả trên mô cá

Tiêm vào cơ bắp IM có hiệu quả trong thời gian dài và mức độ biểu hiện gene tồn
tại trong nhiều năm (bảng 3).
Bảng 3. thời gian và hiệu quả hoat
động của gene chỉ thị trên mô cá
Bảng 3. thời gian và hiệu quả hoat
động của gene chỉ thị trên mô cá
Nghiên cứu biểu hiện của
luciferase

Với lucifer gene, Anderson và cộng

sự đã thấy có sự giảm bớt hoạt tính
của các emzyne sau 7 ngày, nhưng
điều này không đúng ở các enzyme
khác.

Ở chuột,những tế bào biến nạp
luciferase không bị phá hủy bởi CTL
bởi vì không có ( hoặc rất ít) đáp
ứng miễn dịch sinh ra chống lại
protein luciferase do sự kích thích
miễn dịch kém , biểu hiện đã được
nhận thấy trong 2 năm gần nhất.
Nghiên cứu biểu hiện của ge n
lacZ

Ở chuột, hầu hết các tế bào cơ có
biểu hiện của protein miễn dịch đều
phá hủy trong khoảng thời gian từ
ngày 10 và 20.

Ở cá,quá trình loại bỏ này cũng xảy
ra nhưng chậm hơn. Số lượng β-
galactosida biểu hiện trong tế bào
cơ cá giảm từ giữa ngày 21 và 70
sau khi tiêm gene lacZ, nhưng việc
sử dụng pp Đồng tiêm (Co-
injection) với gene GM-CSF của
chuột đã chứng minh có sự đánh
dấu trên tỷ lệ biến mất của các sợi
cơ đã được biến nạp.



Nghiên cứu mô học với gene chỉ thị lacZ cho thấy giải pháp tiêm DNA tinh khiết
vào cơ cá hồi vân không làm tổn thương mô vĩnh viễn.

Xuất hiện viêm ở chổ tiêm sau khi tiêm, nhưng không có dấu hiệu bị hoại tử, và
các mô được tái sinh mà không để lại sẹo vào 28 ngày sau khi tiêm.
3.1.5 Lựa chọn thay thế kim tiêm

Việc thay thế kim tiêm, gene sẽ
được chuyển bằng cách sử dụng hạt
bắn phá, tuy nhiên, kết quả không
tốt như sử dụng kim tiêm ở cả hai
mức độ và tỷ lệ biểu hiện trên gene
chỉ thị ở động vật.

Ngay cả khi hiệu quả kỹ thuật được
cải thiện, cũng không chắc là công
nghệ này sẽ được sử dụng rộng rãi
trong những trại cá bởi vì nó có giá
thành cao và hạn chế về tính thiết
thực. ( VD: DNA bị rơi ra khỏi các
hạt vàng nano trong MT ẩm).

3.2 Cho ăn vaccine và ngâm vaccine

Có lợi thế miễn dịch liên quan đến pp cho ăn vaccine , như biểu hiện miễn dịch
của hệ niêm mạc.

Ưu điểm:


Dễ làm và rẻ tiền

Chúng không gây stress cho vật nuôi.

Khuyết điểm:

Không thể xác định được lượng DNA

Đem hiệu quả thấp hơn so với tiêm hoặc ngâm trong việc ngừa bệnh ở cá.
Ngâm vaccine

PP ngâm vaccine : vật nuôi được nhúng vào hoặc được phun với dung dịch vaccine
đậm đặc.

Ưu điểm:

So với pp tiêm, sử dụng ít thao tác và dùng ngay cả cho cá rất nhỏ

Nhược điểm:

Cần nhiều dd vaccine hơn , đặc biệt là đối với cá lớn.
So sánh giữa pp cho ăn và ngâm
vaccine

Hiệu quả lớn hơn của pp ngâm vaccine so với cho ăn là do kháng thể được hấp thu
qua da hoặc qua mang tốt hơn so với ruột, cũng như là thất thoát lượng vaccine qua
quá trình tiêu hóa.

Một số thí nghiệm gần đây đã chỉ ra rằng cả trên da và mang đều tham gia hấp

thu trong pp ngâm, da( phạm vi hoạt động) có ưu thế hơn.

Tại thời điểm bài báo cáo này được xem xét, không có ghi nhận vaccine DNA nào
dùng cho cá qua pp cho ăn hoặc ngâm.

Bằng việc sử dụng các gene chỉ thị, chúng tôi đã không bao giờ quan sát thấy các
mức độ biểu hiện của gene sau khi ngâm hay qua việc cho ăn các plasmid DNA
tinh sạch ở cá nhỏ. Mặc dù, sự kết hợp của DNA với tác nhân biến nạp như là
liposomes hoặc microcarries có thể mang lại kết quả trong biến nạp của cá.
[Heppel et el.,kết quả chưa được công bố].

Giả thuyết rằng hai pp ngâm hay cho ăn DNA vaccine có thể khả thi và có hiệu
quả.