BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
o0o

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
THỬ NGHIỆM VÀ SO SÁNH CÁC PHƯƠNG PHÁP
ĐO HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA VI
KHUẨN LÊN MEN LACTIC ĐỂ CHỌN CHỦNG TIỀM
NĂNG PROBIOTIC
Ngành học: Công Nghệ Sinh Học
Mã ngành : 111
GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI
HƯƠNG
SVTH : ĐỖ QUẾ MI HƯƠNG
MSSV : 105111016
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2009
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
ĐẠI HỌC KTCN TP.HCM ĐỘC LẬP – TỰ DO – HẠNH PHÚC
KHOA: MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
BỘ MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
HỌ VÀ TÊN: ĐỖ QUẾ MI HƯƠNG MSSV: 105111016
NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỚP: 05DSH
1. Đầu đề Đồ án tốt nghiệp:
“ THỬ NGHIỆM VÀ SO SÁNH CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐO HOẠT TÍNH
KHÁNG VI SINH VẬT CỦA VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC ĐỂ CHỌN
CHỦNG TIỀM NĂNG PROBIOTIC”
2. Nhiệm vụ đồ án tốt nghiệp:
Tổng hợp, biên tập tài liệu có liên quan tới đề tài.
Thử nghiệm và so sánh các phương pháp đo hoạt tính kháng vi sinh vật của vi
khuẩn lên men lactic.

Chọn lọc vi khuẩn lên men lactic có hoạt tính Probiotic.
3. Ngày giao Đồ án tốt nghiệp: 01/04/2009
4. Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 24/06/2009
5. Họ tên người hướng dẫn Phần hướng dẫn
TS. Nguyễn Hoài Hương Toàn bộ

Nội dung và yêu cầu LVTN đã được thông qua Bộ môn.
Ngày tháng năm 2009
CHỦ NHIỆM BỘ MÔN NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHÍNH
(Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)
LỜI CẢM ƠN
PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN
Người duyệt (chấm sơ bộ):
………………………………………
Đơn vị:
……………………………………………………
…………………………
Ngày bảo vệ:
……………………………………………………
Qua bốn năm học tập tại Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ em đã được
Thầy Cô trong Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học hướng dẫn, dạy dỗ,
giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập tại trường và quá trình làm khóa luận.
Em xin được tỏ lòng biết ơn của mình tới quí Thầy Cô. Nhờ Thầy Cô mà từng lớp
sinh viên chúng em đã tự tin trên đường đời sau này.
Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Hoài Hương, Cô là người
trực tiếp hướng dẫn cho em và đã hết lòng quan tâm, chỉ bảo cho em trong suốt
quá trình thực hiện khóa luận. Cám ơn Cô đã cho em những bài học quí giá sẽ là
hành trang quí giá để bước vào đời.
Em cũng gửi lời cảm ơn các Thầy Cô trong phòng thí nghiệm đã giúp đỡ và
tạo điều kiện tốt cho em thực tập tại phòng thí nghiệm.

Sau cùng em xin chân thành cảm ơn đến tất cả người thân, bạn bè đã nhiệt
tình giúp đỡ vào tạo điều kiện thuận lợi, đóng góp ý kiến giúp em hoàn thành bài
khóa luận này.
Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn!
TP. HCM, ngày 20 tháng 6 năm 2009
Sinh viên
Đỗ Quế Mi Hương
MỤC LỤC
Nhiệm vụ đồ án tốt nghiệp
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục kí hiệu và viết tắt
Danh mục bảng biểu
Danh mục hình ảnh
Danh mục đồ thị
Chương 1: Mở Đầu
1.1. Đặt vấn đề 01
1.2. Mục tiêu nghiên cứu 03
1.3. Đối tượng nghiên cứu 03
1.4. Phương pháp nghiên cứu 04
1.4.1. Phương pháp luận 04
1.4.2. Phương pháp xử lý số liệu 04
1.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 05
Chương 2: Tổng Quan Tài Liệu
2.1. Tổng quan về probiotic 06
2.1.1. Giới thiệu sơ lược về probiotic 06
2.1.1.1. Giới thiệu chung 06
2.1.1.2. Hiệu quả sử dụng probiotic 08
2.1.1.3. Các thành phần của probiotic 11
2.1.1.4. Tiêu chí chọn lọc chủng probiotic 11

2.1.2. Qui trình chọn lọc các chủng probiotic 16
2.1.3. Các tiêu chuẩn đánh giá hoạt tính của vi sinh vật probiotic 19
2.1.3.1. Khả năng bám dính (Adhesion assay) 19
2.1.3.2. Khả năng chịu acid dạ dày 20
2.1.3.3. Khả năng chịu được muối mật 21
2.1.3.4. Khả năng kháng vi sinh vật 21
2.1.3.5. Thử nghiệm In vivo 25
2.1.4. Ứng dụng probiotic trong chăn nuôi 25
2.1.4.1. Trong chăn nuôi gia cầm 27
2.1.4.2. Trong chăn nuôi gia súc 28
2.2. Vi khuẩn lên men lactic 30
2.2.1. Đặc điểm vi khuẩn 30
2.2.2. Quá trình lên men lactic 33
2.2.3. Khả năng tổng hợp các enzyme tiêu hóa 35
2.2.4. Khả năng tổng hợp Vitamin và các chất trao đổi có lợi cho sự tăng trưởng
của vật chủ 36
2.2.5. Khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn 36
2.2.5.1. Bacteriocin 36
2.2.5.2. Các chất có khả năng kháng khuẩn khác 40
2.3. Vi sinh vật chỉ thị 41
2.3.1. Giới thiệu về vi sinh vật chỉ thị (indicator strains) 41
2.3.2. Vi sinh vật chỉ thị gây bệnh đường ruột – Escherichia coli 43
2.3.2.1. Đặc điểm hình dạng, nuôi cấy và tính chất sinh hóa 43
2.3.2.2. Đặc điểm kháng nguyên và độc tố 45
2.3.2.3. Một số bênh điển hình do E.coli gây ra cho gia súc gia cầm 45
Chương 3: Vật Liệu & Phương Pháp Nghiên Cứu
3.1. Vật liệu 50
3.1.1. Địa điểm thực hiện đồ án 50
3.1.2. Giống vi sinh vật 50
3.1.3. Môi trường và hóa chất sử dụng 52

3.1.3.1. Môi trường 52
3.1.3.2. Hóa chất 53
3.1.4. Dụng cụ và thiết bị 53
3.1.4.1. Dụng cụ 53
3.1.4.2. Thiết bị 54
3.2. Phương pháp nghiên cứu 54
3.2.1. Chuẩn bị giống vi sinh vật 54
3.2.2. Chuẩn bị môi trường test 55
3.2.3. Bố trí thí nghiệm 56
3.2.3.1. Thí nghiệm xác định khả năng đối kháng bằng phương pháp Spot on
lawn (khuếch tán trên bề mặt thạch) 56
3.2.3.2. Thí nghiệm xác định khả năng đối kháng bằng phương pháp Agar spot
test (khuếch tán trên bề mặt thạch) 57
3.2.3.3. Thí nghiệm xác định khả năng đối kháng bằng phương pháp Disc
diffusion assay (Khuếch tán qua vòng giấy lọc) 58
3.2.3.4. Thí nghiệm xác định khả năng đối kháng bằng phương pháp Well
diffusion assay (khuếch tán qua giếng thạch) 59
3.2.3.5. Thí nghiệm xác định khả năng đối kháng bằng phương pháp
Turbidometric assay (đo độ đục) 60
Chương 4: Kết Quả Và Biện Luận
4.1. Kết quả thí nghiệm xác định khả năng đối kháng bằng phương pháp Spot on lawn
(khuếch tán trên bề mặt thạch) 63
4.2. Kết quả thí nghiệm xác định khả năng đối kháng bằng phương pháp Agar spot test
(khuếch tán trên bề mặt thạch) 64
4.3. Kết quả thí nghiệm xác định khả năng đối kháng bằng phương pháp Disc diffusion
assay (Khuếch tán qua vòng giấy lọc) 66
4.4. Kết quả thí nghiệm xác định khả năng đối kháng bằng phương pháp Well diffusion
assay (khuếch tán qua giếng thạch) 68
4.5. Kết quả thí nghiệm xác định khả năng đối kháng bằng phương pháp Turbidometric
assay (đo độ đục) 74

Chương 5: Kết Luận Và Kiến Nghị
5.1. Kết luận 80
5.2. Kiến nghị 81
Phụ Lục
Tài Liệu Tham Khảo
DANH MỤC KÍ HIỆU & VIẾT TẮT
LAB: Vi khuẩn lên men lactic
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1: Một số sản phẩm sữa lên men có chứa đựng các vi khuẩn probiotic 07
Bảng 2.2: Tác dụng lâm sàng của một số chủng probiotic 09
Bảng 2.3: Những vi sinh vật được xem như là Probiotics 11
Bảng 2.4: Vi sinh vật probiotics và tính an toàn của chúng 12
Bảng 2.5: Các phương pháp kiểm tra khả năng kháng vi sinh vật 22
Bảng 2.6: Một số đặc điểm của các chi vi khuẩn lactic 32
Bảng 2.7: Một số Bacteriocin và đặc điểm của chúng 39
Bảng 2.8: Kiểu hoạt động đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng 41
Bảng 2.9: Một số vi sinh vật chỉ thị điển hình sử dụng trong nghiên cứu chọn lọc
probiotic
Bảng 3.1: Các chủng được kiểm tra hoạt tính probiotic 50
Bảng 4.1: Đường kính vịng khng khuẩn đo đường bằng phương pháp khuếch tán qua
giếng thạch (well diffusion assay)
Bảng 4.2: Tỉ lệ sống sót của E. coli sau khi ủ với dịch nuôi cấy LAB ly tâm 76
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Sơ đồ nghiên cứu 04
Hình 2.1: Sơ đồ hướng dẫn của FAO và WHO trong tuyển chọn probiobic
Hình 2.2: Sơ đồ tuyển chọn các vi sinh vật dùng làm Probiotic 18
Hình 2.3: Sơ đồ khái quát hóa tiêu chuẩn đánh giá hoạt tính của vi sinh vật
Hình 2.4: Minh họa các vi khuẩn probiotic bám dính lên bề mặt ruột tác động đối
kháng với các vi khuẩn gây bệnh
Hình 2.5: Sơ đồ khái quát hóa các phương pháp in vitro trong kiểm tra đánh giá hoạt

tính kháng vi sinh vật của probiotic 22
Hình 2.6: Minh họa các phương pháp kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật 24
Hình 2.7: Vi khuẩn lên men lactic trong hệ thống phân loại 31
Hình 2.8: Quá trình lên men lactic của LAB. (A): Lên men lactic đồng hình.
(B): Lên men lactic dị hình 34
Hình 2.9: Cơ chế kháng khuẩn của một số loại Bacteriocin 39
Hình 2.10:Giới thiệu về hình thái Escherichia coli 45
Hình 2.11:Anh hưởng do E.coli gây ra ở gà 46
Hình 2.12:Anh hưởng của bệnh tiêu chảy phân trắng lên heo con 48
Hình 2.13:Anh hưởng của bệnh phù thủng trên heo cai sữa 49
Hình 4.1: Thử nghiệm không thành công phương pháp Agar spot test
Hình 4.2: Thử nghiệm không thành công phương pháp Disc diffusion assay 67
Hình 4.3: So sánh kết quả C1 ở hai đĩa môi trường với độ dày và nồng độ vi khuẩn chỉ
thị khác nhau 69
Hình 4.4: Vòng kháng của những chủng điển hình 70
Hình 4.5: Kết quả kiểm tra hoạt tính bằng phương pháp đo đô đục 75
DANH MỤC ĐỒ THỊ
Đồ thị 4.1:Tỉ lệ ức chế tăng trưởng E. coli của dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic ly tâm
không trung hòa và sau khi trung hòa
77
th 4.2:Đồ ị S t ng quan gi a ph ng pháp đo đ đ c (turbidimetric assayự ươ ữ ươ ộ ụ
method) và ph ng pháp khu ch tán qua gi ng th ch (well diffusion assay)ươ ế ế ạ
79
Chương 1: Mở Đầu
1.1. Đặt vấn đề
Hiện nay công nghệ sinh học là một lĩnh vực đang phát triển và có nhiều tiềm
năng lớn. Việt Nam cũng đã từng bước tạo điều kiện để phát triển công nghệ sinh học,
đặc biệt là những ứng dụng trong nông nghiệp và cả trong công nghiệp.
Probiotic một thành quả khoa học, một thành quả của công nghệ sinh học. Nó
đang được ứng dụng rộng rãi vào đời sống con người bởi ví tính hợp lý và hiệu quả mà

nó thể hiện. Hiệu quả tác dụng của probiotic không chỉ đơn thuần là làm thức ăn ngon
hơn mà có rất nhiều tác dụng, như: tiêu hoá thức ăn và làm bớt sự rối loạn tiêu hoá; đẩy
mạnh sự tổng hợp vitamin B và một số enzyme tiêu hoá; cải thiện sự dung nạp lactose;
cải thiện chức năng miễn dịch; ngăn chặn những chỗ loét trong hệ thống tiêu hoá; ngăn
chăn chứng viêm; giảm cholesterol; giảm tỷ lệ chết non; làm giảm số lượng vi khuẩn
gây hại; tăng trọng nhanh…
Trên quan điểm về an toàn sinh học, an toàn thiết thực thì probiotic đang chiếm
thế thượng phong so với một số phương cách khác. Vì tính hiệu quả của probiotic (tính
trị bệnh) là sự điều hoà tự nhiên không làm tồn dư kháng sinh, tồn dư tác hại trong sinh
vật chủ. Mà với sự khắt khe của con người thì điều này là số một.
Như đã biết trước đây và cả hiện nay nhiều nông dân sử dụng chất kháng sinh
trong chăn nuôi như là biện pháp tối ưu nhất bởi những lợi ích mà nó mang lại như:
• Tăng năng suất sinh trưởng và sinh sản ở gia súc, gia cầm
• Tăng hiệu quả sử dụng thức ăn, làm cho vật nuôi thích ứng nhanh chóng
với sự thay đổi bất thường về cơ cấu và chủng loại nguyên liệu trong khẩu phần ăn
• Nâng cao chất lượng sản phẩm (giảm tỷ lệ thịt mỡ, tăng tỷ lệ thịt nạc, làm
cho thịt trở nên mềm hơn và không nhiễm mầm bệnh).
• Phòng các bệnh mãn tính và ngăn chặn xẩy ra những dịch bệnh do vi
trùng.
• Tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi.
Tuy nhiên, thế giới đã nhanh chóng nhận ra những tác động xấu do việc làm này
mang lại. Sử dụng kháng sinh liều thấp trong chăn nuôi (sử dụng không đúng cách
trong điều trị, phòng bệnh và dùng trong thức ăn chăn nuôi như chất kích thích sinh
trưởng) đã dẫn đến một hậu quả rất nghiêm trọng là làm tăng hiện tượng kháng kháng
sinh của các loài vi khuẩn gây bệnh trên người và vật nuôi. Có ý kiến cho rằng, việc sử
dụng kháng sinh liều thấp trong chăn nuôi đã biến vật nuôi thành nơi để một số loài vi
khuẩn “ học” cách vô hiệu hoá tác dụng của các loại kháng sinh. Hậu quả của sự kháng
kháng sinh ở vi khuẩn về kinh tế rất lớn. Tuy nhiên, những thiệt hại về kinh tế không
phải là chính yếu mà vấn đề đáng lo ngại là không chỉ vật nuôi mà ngay cả loài người
đang đứng trước hiểm hoạ xẩy ra các thảm dịch do những loài vi khuẩn kháng thuốc

gây ra mà không thể kiểm soát được.
Như vậy nghiên cứu phát triển và ứng dụng probiotic vào cuộc sống là một công
việc cần được quan tâm và đầu tư nhiều hơn nữa. Có như vậy mới tiếp tục hoàn thiện
probiotic đem lại hiệu quả cao hơn, chất luợng cuộc sống ngày được cao hơn, an toàn
hơn đáp ứng nhu cầu ngày càng cao và khắt khe của chúng ta. Có thể nói đây là sự tác
động thân hữu của con người vào tự nhiên nên đã mở ra một chiến lược phát triển bền
vững và an toàn.
Khoa học công nghệ luôn phát triển nhằm để đáp ứng lại nhu cầu ngày càng cao
của con người. Trên phương trình tăng tiến này, con người đòi hỏi khắt khe hơn về chất
lượng của mọi loại sản phẩm đặc biệt là sự an toàn về sức khoẻ của chính bản thân họ.
Mà chính những nhu cầu này là kích thích tố trực tiếp thúc đẩy khoa học phát triển. “
Probiotic” là một phần của sự phát triển ấy.
Để có thể có một chế phẩm probiotic có đầy đủ những hoạt tính cần thiết, khâu
chọn lọc chủng vi khuẩn để làm probiotic là cực kì quan trọng. Bởi vì ngay tại khâu này
sẽ quyết định vai trò và tác dụng của chế phẩm lên đối tượng cần quan tâm. Tuy nhiên,
trong phạm vi nhỏ hẹp của nghiên cứu này, tôi chỉ thực hiện đề tài ở bước kiểm tra
hoạt tính kháng vi sinh vật vì thời gian thực hiện đề tài chỉ trong 12 tuần không cho
phép tôi thực hiện hoàn chỉnh tất cả các tiêu chí tuyển chọn Probiotic. Chính vì thế tôi
đã chọn đề tài “THỬ NGHIỆM VÀ SO SÁNH CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐO HOẠT
TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC ĐỂ CHỌN
CHỦNG TIỀM NĂNG PROBIOTIC”.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Thử nghiệm và so sánh các phương pháp đo hoạt tính kháng vi sinh vật của vi
khuẩn lên men lactic.
Chọn lọc vi khuẩn lên men lactic có hoạt tính probiotic.
1.3. Đối tượng nghiên cứu
Vì thời gian hạn hẹp, đề tài chỉ tập trung ở những đối tượng sau :
- Vi khuẩn lên men lactic có nguồn gốc từ thực phẩm lên men ( cà muối, dưa muối,
nem, sữa lên men) và có nguồn gốc từ các chế phẩm dược.
- Vi sinh vật chỉ thị Escherichia coli.

1.4. Phương pháp nghiên cứu
1.4.1. Phương pháp luận
Trước khi bắt tay vào thực hiện đề tài này, tôi đã tham khảo khá nhiều các nghiên
cứu từ trước tới nay về probiotic cũng như các phương pháp tuyển chọn nó. Nhận thấy
có khá nhiều phương pháp được sử dụng để thực hiện việc chọn lọc này, tôi đã xem xét
và chọn ra những phương pháp điển hình nhất cho đề tài của mình.
Tôi xin đề xuất sơ đồ tiến hành nghiên cứu như sau:
Tổng hợp biên tập tài liệu
Phân tích các nghiên cứu liên quan
Tiến hành thử nghiệm các phương phápTrao đổi ý kiến với giáo viên hướng dẫn
Phân tích ưu điểm – khuyết điểm của các phương pháp
Chọn phương pháp tối ưu, tiến hành chọn lọc probiotic
Đưa ra kết quả nghiên cứu
Hình 1.1: Sơ đồ nghiên cứu
1.4.2. Phương pháp xử lý số liệu
Sử dụng phần mềm Excel vẽ đồ thị biểu diễn.
Sử dụng phần mềm Statgraphics xử lý số liệu thô, tính giá trị trung bình, độ lệch
chuẩn, vè đồ thị tương quan.
1.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Tìm hiểu về các phương pháp đánh giá khả năng kháng vi sinh vật chỉ thị của các
vi khuẩn lên men lactic.
Tạo tiền đề cho các nghiên cứu liên quan sau này tại phòng thí nghiệm.
Góp phần chọn lọc được chủng vi khuẩn lên men lactic có hoạt tính probiotic.
Chương 2: Tổng Quan Tài Liệu
2.1. Tổng quan về Probiotics
2.1.1. Giới thiệu sơ lược về probiotic
2.1.1.1. Giới thiệu chung
Việc sử dụng các vi khuẩn lactic như thức ăn bổ sung đã xuất hiện từ lâu khi con
người biết đến sữa lên men. Việt nghiên cứu được bắt đầu từ Metchnikoff làm việc ở
viện Pasteur Paris. Ông ta cho rằng vi sinh vật trong ruột có ảnh hưởng xấu tới sức

khỏe vật nuôi và những ảnh hưởng xấu này có thể được cải thiện bởi việc sử dụn sữa
chua. Ông đã trích dẫn các quan sát về nông dân Bungari sử dụng số lượng lớn sữa
chua và có tuổi thọ rất cao. Ông phân lập được hệ sinh vật từ sữa chua ông gọi là
“Bulgarian bacillus” và sử dụng chúng trong các thử nghiệm. Những sinh vật này được
xác định và được biết đến là Lactobacillus bulgaricus và ngày này được gọi là L.
delbrueckii subsp bulgaricus là một trong số sinh vật được sửdụng để lên men sữa và
sản xuất yoghurt. Sau khi Metchnikoff mất vào năm 1916, hoạt động nghiên cứu này
chuyển về USA. Được biết ở thời điểm đó người ta đã đề xuất việc sử dụng các L.
acidophilus và nhiều thử nghiệm đã được thực hiện với sinh vật này. [34]
Thuật ngữ probiotic vốn có nhiều định nghĩa khác nhau, nó được sử dụng lần đầu
tiên năm 1965 (Lilly & Stillwell ) để mô tả một chất được tạo bởi một protozoan để
kích thích sự tăng trưởng của một sinh vật khác. Đến năm 1974, Parker đã sử dụng để
chỉ các chất bổ sung thức ăn động vật: là các sinh vật và chất có tác động tích cực lên
động vật bằng cách cân bằng vi sinh vật ruột. Fuller (1989) đã đưa ra định nghĩa rất gần
với hiện nay là “ một bổ sung vi sinh vật sống qua thức ăn có tác động tích cực lên ký
chủ bằng cách cải thiện cân bằng vi sinh vật đường ruột”. [33]
Bảng 2.1: Một số sản phẩm sữa lên men có chứa đựng các vi khuẩn probiotic (T.
Mattila-Sandholm, M. Saarela, Probiotic functional foods)
Dạng sản
phẩm
Tên sản
phẩm
Công ty
Vi Khuẩn probiotic bổ
sung (10
7
-10
8
LAB/ml)
Nơi sản xuất

Yoghurt LC1 Nestle L. johnsonii LC-1
France,
Belgium,
Spain,
Switzerland,
Portugal, Italy,
Germany, UK
Yoghurt Gefilus Valio L. rhamnosus GG Finland
Yoghurt Vifit Mona L. rhamnosus GG
Netherlands,
Ireland
Yoghurt Vifit Sudmilch L. rhamnosus GG Germany
Yoghurt
drink
Yo-Plus
Waterford
Foods
L. acidophilus Ireland
Yoghurt Bio-Pot Onken Biogarde cultures Europe
Yoghurt LA7 Bauer L. acidophilus Germany
Fermented
milk drink
Yakult Yakult L. casei Shirota strain
Nertherlands,
UK, Germany
Cultures
yoghurt-
style
product
Gaio MD-Foods E. faecium Denmark

Yoghurt SNO Dairygold L. acidophilus Ireland
Yoghurt
Actimel
Cholesterol
Control
Danone L. acidophilus Belgium
Fermented
milk drink
Actimel Danone L. casei Europe
Yoghurt Yoplait
Waterford
-Foods
L. acidophilus Ireland
Fermented
milk drink
Bra-Mjolk Arla
Bifidus, L. reuterii, L.
acidophilus
Sweden
Fermented
milk drink
Fyos Nutricia L. casei Netherlands
Yoghurt
Symbalanc
e
Tonilait
L. reuterii, L. casei, L.
acidophilus
Switzerland
Yoghurt Shape St Ivel L. acidophilus Ireland, UK

2.1.1.2. Hiệu quả sử dụng probiotic
Đã có rất nhiều chế phẩm probiotic dành cho người hay cho vật nuôi được đăng kí
bảo hộ sáng chế. Hầu hết các sản phẩm này chứa Lactobacillus spp. hoặc Streptococcus
spp., một số chứa Bifidobacteria spp., Saccharomyces boulardii, hay Bacillus subtilis.
Ảnh hưởng của các chế phẩm probiotic có thể là trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua sự
điều chỉnh hệ vi sinh vật đường ruột. Những chế phẩm này có những hiệu quả sử dụng
được biết tới như sau: [2], [3], [5], [25], [32], [33]
 Có khả năng kháng ung thư và chống các yếu tố đột biến
 Kìm hãm vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa
 Cải thiện việc sử dụng lactose ở những người không dung nạp lactose
 Làm giảm Cholesterol trong huyết thanh
 Kích thích hệ thống miễn dịch
 Giảm nhiễm trùng đường niệu
 Tăng trọng (5%) ở gia cầm
 Giảm bệnh nhiễm trùng ở gia cầm
 Giảm tiêu chảy ở dộng vật non
 Giảm tác dụng phụ của chất kháng sinh
Hiệu quả lâm sàng của một vài chủng probiotic được trình bày trong Bảng dưới
đây:
Bảng 2.2: Tác dụng lâm sàng của một số chủng probiotic [8], [15]
Chủng Tác dụng lâm sàng trên người
Lactibacillus rhamnosus GG
(ATCC 53103)
Giảm hoạt tính enzyme phân, giảm tiêu chảy do
kháng sinh ở trẻ em, điều trị và dự phòng
rotavirus và tiêu chảy cấp ở trẻ em, điều trị tiêu
chảy tái phát do Clostridium difficile, kích thích
miễn dịch, giảm nhẹ triệu chứng viêm da không
điển hình ở trẻ em
Lactobacillus johnsonii

(acidophilus) LJ-1 (La1)
Cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, tăng cường
miễn dịch, hỗ trợ điều trị Helicobacter pylori
Bifidobacterium lactis Bb-12 Dự phòng tiêu chảy du lịch, điều trị tiêu chảy do
virus, kể cả rotavirus, cân bằng hệ vi sinh vật
đường ruột, cải thiện tình trạng táo bón, kích
thích hệ miễn dịch, giảm nhẹ triệu chứng viêm da
không điển hình ở trẻ em
Lactobacillus reuteri (BioGaia
Biologics)
Rút ngắn thời gian bị tiêu chảy do rotavirus ở trẻ
em, điều trị tiêu chảy cấp ở trẻ em, an toàn và
dung nạp tốt ở bệnh nhân trưởng thành HIV
dương tính
Lactobacillus casei Shirota Cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, giảm hoạt
tính enzyme phân, có tác động tích cực đối với
ung thư mặt bàng quang và ung thư cổ tử cung,
không ảnh hưởng tới hệ miễn dịch của người
khỏe mạnh
Lactobacillus plantarum
DSM9843 (299v)
Cân bằng hệ bi sinh vật đường ruột, tăng hàm
lượng acid béo mạch ngắn trong phân
Saccharomyces boulardii Dự phòng tiêu chảy do kháng sinh, điều trị viêm
ruột kết do Clostridium difficile, dự phòng tiêu
chảy ở bệnh nhân sử dụng dinh dưỡng qua ống
Chủng trong sữa chua
(Streptococcus thermophilus
hay L. delbrueckii subsp
bulgaricus

Không có tác dụng trên tiêu chảy do rotavirus,
không có hiệu ứng tăng cường miễn dịch khi bị
tiêu chảy do rotavirus, không có tác dụng lên hoạt
tính enzyme phân
Vào cuối năm những năm 1940 có hai nghiên cứu phát triển về hệ vi sinh vật
đường ruột này. Đầu tiên, thấy rằng thuốc kháng sinh bổ sung trong thức ăn đã thúc
đẩy tăng trưởng của vật nuôi. Mong muốn khám phá cơ chế này đã ảnh hưởng tới việc
tăng cường nghiên cứu về thành phần của hệ vi sinh vật đường ruột này và cách thức
mà nó tác động lên vật chủ. Thứ hai, càng ngày càng có nhiều vật nuôi bị bệnh, cung
cấp cho những thí nghiệm để khám phá hệ sv trong đường ruột bởi những vật chủ có
sẵn. Và cuối cùng cho thấy rằng L. acidophilus không là vi khuẩn lactobacillus duy
nhất có trong ruột non mà có nhiều sinh vật khác cần được nghiên cứu để sử dụng làm
probiotics. Những nghiên cứu tiếp sau đó cho thấy có khoảng 10
14
vi sinh vật thuộc
khoảng 400 loài khác nhau tồn tại ở trong ruột (Moore & Holdemann 1974), chính vì
vậy việc nghiên cứu về những sinh vật có thể sử dụng làm probiotic ngày càng được
mở rộng. [30]
Sau nhiều nghiên cứu, người ta đã tổng kết lại được rất nhiều sinh vật có thể sử
dụng làm probiotic. Điều này sẽ được trình bày ở mục tiếp theo.
2.1.1.3. Các thành phần của Probiotics
Bảng 2.3: Những vi sinh vật được xem như là probiotic (Holzapfel et al. 2001) [5]
Lactobacillus Bifidobacteriu
m
Other lactic acid
Bacteria
Non-lactic acid
bacteria
L. acidophilus
L. amylovorus

L. casei
L. cripatus
L. delbrueckii
subsp.Bulgaricus
L. gallinarum
L. gasseri
L. johnsonii
L. paracasei
L. plantarum
L. reuteri
L. rhamnosus
B. adolescentis
B. animalis
B. bifidum
B. breve
B. infantis
B. lactis
B. Longum
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
Lactococcus lactis
Leuconostoc mesenteroides
Pediococcus acidolactici
Streptococcus thermophilus
Sporolactobacillus inulinus
Bacillus cereus var. Toyoi
Escherichia coli Nissle 1917
Propionibacterium freudenreichii
Saccharomyces cerevisiae
Saccheromyces boulardii

2.1.1.4. Tiêu chí chọn lọc chủng probiotic [2], [3], [33], [34]
Các sinh vật được lựa chọn làm probiotic phải đáp ứng được các tiêu chuẩn như:
 Tiêu chuẩn về an toàn
 Tiêu chuẩn về đặc điểm và chức năng
Đã có nhiều nghiên cứu, nhiều thông tin về những tiêu chuẩn dành cho probiotic,
ta có thể tổng kết lại như sau:
 Khía c nh an toàn c a probiotic bao g m nh ng i m c thạ ủ ồ ữ đ ể ụ ể
sau:
• Có định danh chính xác
• Những chủng sử dụng cho người tốt nhất là có nguồn gốc từ người
• Được phân lập từ đường tiêu hóa của người khỏe mạnh
• Được chứng minh là không có khả năng gây bệnh
• Không liên quan tới bệnh tật
• Không gây khử liên hợp muối mật
• Đặc điểm di truyền ổn định
• Không mang các gen đề kháng kháng sinh có thể truyền được
Tính an toàn của các chủng probiotic là điều được quan tâm hàng đầu. Có một số
phương thức giúp tiến hành đánh giá tính an toàn của probiotic như: nghiên cứu trên
các đặc tính của chủng probiotic, nghiên cứu về dược động học của chủng probiotic,
nghiên cứu các tác động qua lại giữa probiotic và vật chủ. Các probiotic thường thuộc
nhóm vi sinh vật GRAS (Generally Regarded As Safe)
Bảng 2.4: Vi sinh vật probiotics và tính an toàn của chúng [2], [15]
Vi sinh vật Khả năng lây nhiễm
Lactobacillus
Không gây bệnh, đôi khi gây nhiễm trùng cơ hội ở các bệnh
nhân suy giảm miễn dịch (AIDS)
Lactococcus Không gây bệnh
Streptococcus
Gây bệnh cơ hội, có S. thermophilus được sử dụng trong các
sản phẩm sữa

Enterococcus
Gây bệnh cơ hội, một vài chủng có khả năng kháng kháng
sinh
Bacillus Chỉ có Bacillus subtilis được sử dụng làm probiotics
Bifidobacterium Phần lớn không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng ở người
Propionobacterium Có tiềm năng trong việc sử dụng làm probiotic
Saccheromyces Phần lớn không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng ở người
Phần lớn những vi sinh vật sử dụng làm probiotic cho người đều phải đạt những
yêu cầu khắc khe như đã nêu trên. Còn đối với vật nuôi ta có thể nới lỏng những yêu
cầu này, tùy thuộc vào từng loại vật nuôi và tính an toàn khi sử dụng của nó.
 Trước khi một probiotic có thể mang lại những lợi ích trên sức khỏe
con người chúng thường phải có những đặc điểm sau: [2], [4], [23]
• Chủng vi sinh vật phải có những đặc điểm phù hợp với công nghệ để có
thể đưa vào sản xuất. dễ nuôi cấy.
• Có khả năng sống và không bị biến đổi chức năng khi đưa vào sản phẩm.
• Không gây các mùi vị khó chịu cho sản phẩm.
• Các vi khuẩn sống phải đi đến được nơi tác động của chúng. Để tồn tại
được nó phải có đặc tính sau:
Có khả năng dung nạp với acid (chịu pH thấp ở dạ dày) và dịch vị của
người.
Có khả năng dung nạp với muối mật (là đặc tính rất quan trọng để
probiotic có thể sống sót được khi đi qua ruột non).
• Có khả năng bám dính và niêm mạc đường tiêu hóa vật chủ.
• Có khả năng sinh các enzyme hoặc các sản phẩm cuối cùng mà vật chủ có
thể sử dụng.
• Có khả năng kích thích miễn dịch nhưng không có tác động gây viêm.
• Có khả năng cạnh tranh với hệ vi sinh vật tự nhiên, có hoạt tính đối kháng
với các vi sinh vật gây bệnh, đặc biệt là sinh vật gây bệnh đường ruột.
• Sản xuất các chất kháng vi sinh vật ( ví dụ như bacteriocin, hydrogen
peroxide, acid hữu cơ).

• Có khả năng chống đột biến và các yếu tố gây ung thư.
Sau đây là một số chức năng quan trọng của những chủng được sử dụng làm
probiotic
 Khả năng bám dính [1], [2], [10]
Khả năng bám vào bề mặt và sau đó là phát triển trong đường tiêu hóa người
được xem là điều kiện tiên quyết quyết định chức năng của probiotic. Những vi khuẩn
có khả năng bám dính vào bề mặt ruột sẽ tồn tại lâu hơn và do đó có điều kiện để biểu
hiện những tác động điều hòa miễn dịch hơn là những chủng không có khả năng nám
dính
Khả năng bám dính sẽ tạo nên một mối tương tác giữa probiotic và bề mặt niêm
mạc ruột là nơi chứa các tế bào lympho, điều này sẽ kích thích tính miễn dịch tại chỗ và
toàn bộ cơ thể. Do đó người ta cho rằng chỉ có những chủng probiotic có khả năng bám
dính mới tạo được hiệu quả cảm ứng miễn dịch và làm ổn định hàng rào bảo vệ niêm
mạc ruột.
Sự bám dính của probiotic cũng tạo nên khả năng cạnh tranh gắn kết vào biểu mô
ruột, giữa những vi khuẩn gây bệnh và probiotic. Qua một số thử nghiệm, đều cho thấy
Lactobacillus acidophilus còn sống hay đã chết do nhiệt đều có khả năng ức chế sự
bám dính của các vi khuẩn gây bệnh.
Trong thử nghiệm về khả năng bám dính của probiotic người ta thường kiểm tra
trên những dòng tế bào ung thư trực tràng như HT-29 và Caco-2. Hai dòng tế bào này
được biệt hóa thành tế bào ruột, được sử dụng như là một mô hình cho biểu mô ruột
non. Những thử nghiệm này cho ta biết được sự khác biệt về khả năng bám dính của
những chủng probiotic khác nhau.
Ngoài sử dụng hai dòng tế bào trên, người ta còn có thể nghiên cứu bằng kỹ thuật
sinh thiết, bằng cách sinh thiết một mẫu mô sau một thời gian sử dụng probiotic. Kỹ
thuật này được xem là cho kết quả chính xác nhất về khả năng bám dính của probiotic.
Tuy nhiên vẫn còn gặp nhiều hạn chế trong vấn đề về đạo đức của việc lấy mô, đòi hỏi
người thực hiện có chuyên môn cao, và có thể mắc sai số.
 Khả năng điều hòa miễn dịch [1], [2]
Những cải thiện hệ miễn dịch bởi probiotic có thể được trình bày theo 3 cách sau:

1. Tăng cường hoạt động của đại thực bào, nâng cao khả năng thực bào của sv hay
hạt carbon
2. Tăng khả năng sản xuất kháng thể thường là loại IgG và IgM và interferon (nhân
tố kháng virus không đặc hiệu)
3. Tăng cường khả năng định vị kháng thể trên bề mặt ruột, thường là IgA
 Khả năng chống lại các yếu tố gây bệnh [2], [5]
Để có thể tác động lên hệ sinh thái vi khuẩn đường ruột thì điều khá quan trọng
đó là probiotic phải có khả năng chống lại các vi khuẩn gây bệnh bằng cách tiết ra các
kháng sinh hay là những chất cạnh tranh.
Vi khuẩn probiotic tạo ra các chất đa dạng mà ức chế cả vi khuẩn Gram dương và
Gram âm. Những hợp chất này có thể làm giảm không chỉ những sinh vật mang mầm
bệnh có thể sống được mà còn ảnh hưởng đến sự trao đổi chất của vi khuẩn và sự tạo ra
các độc tố.
Qua nghiên cứu cho thấy các kháng sinh và chất cạnh tranh thường thấy ở các
chủng probiotic là:
• Bacteriocin
• Hydrogen peroxide
• Acid hữu cơ (acid lactic, acid acetic )
• Diacetyl…
Cơ chế tác động: cạnh tranh với các nguồn bệnh để ngăn chặn sự bám dính vào
đường ruột, cạnh tranh dinh dưỡng cần thiết cho sự sống sót của mầm bệnh, tác động
kháng độc tố.
 Khả năng chống đột biến và các yếu tố gây ung thư [2], [5], [18]
Trong nhiều năm qua, có những nghiên cứu cho thấy vi sinh vật trong thực phẩm
hay trong hệ sinh thái ruột có khả năng chống đột biến và chống lại các yếu tố gây ung
thư. Cơ ché này được nghiên cứu và kết luận như sau:
Nhờ sự gắn kết và phân hủy các chất gây ung thư
Sản xuất các hợp chất kháng ung thư
Điều hòa những enzyme tiền chất gây ung thư ruột, như các enzyme phân
(nitroreductase, -glucuronidase ) có khả năng chuyển các chất tiền sinh ung thư thánh

chất gây ung thư trong trực tràng
Ức chế khối u bằng một cơ chế đáp ứng miễn dịch
Những vấn đề vẫn còn giới hạn trong mô hình in vitro hay in vivo, việc mở rộng
ra trên người để dự phòng ung thư còn đang là vấn đề còn nhiều tranh cãi.
2.1.2. Qui trình chọn lọc các chủng Probiotic
Quá trình chọn lọc chủng probiotic xây dựng theo hình 2.2 và 2.3 được trình bày sau
đây:
Tuyển chọn và xác định chủng dựa trên kiểu hình và kiểu gen
Tên chi, loài, ký hiệu chủng
Đăng ký trong bảo tàng giống quốc tế nào?
Xác định chức năng
In vitro
Trên động vật
Dánh giá độ an toàn
In vitro và trên động vật
Trên người: pha 1
Pha 2: Thử nghiệm mù kép ngẫu nhiên
gồm nhóm thử nghiệm và nhóm đối chứng
uống thuốc vờ (DBPC) để xác định tính
công hiệu của chủng hoặc sản phẩm
Tốt nhất nên thử nghiệm
DBPC độc lập lần 2 để khẳng
định kết quả
Dán nhãn
Tên chi, loài, ký hiệu chủng
Số lượng tối thiểu vi khuẩn sống
Điều kiện bảo quản thích hợp
Thông tin liên hệ với khách hàng
PROBIOTIC
Pha 3: Kiểm nghiệm mức độ hiệu quả trên người

So sánh hiệu quả điều trị 1 bệnh đặc trưng bằng
probiotic với phương pháp điều trị thông thường.
Hình 2.1: Sơ đồ hướng dẫn của FAO và WHO trong tuyển chọn Probiobic
Hình 2.2 : Sơ đồ tuyển chọn các vi sinh vật dùng làm Probiotic
2.1.3. Các tiêu chuẩn đánh giá hoạt tính của vi sinh vật
Probiotics
Phân lập các dòng
vi khuẩn
Sàng lọc in vitro
Sàng lọc in vivo
quy mô nhỏ
Kiểm tra khả năng gây bệnh
đối với vật chủ
Không đạt
OK
?
Đạt
Đạt
Thử nghiệm in vivo
quy mô pilot
OK
?
Khả năng gây bệnh đối với
điều kiện nuôi (nếu cần)
OK
?
OK
?
Loại
bỏ

PROBIOTIC
Đạt
Đạt
Không đạt
Không đạt
Không đạt
Các tiêu chuẩn để đánh giá hoạt tính của vi sinh vật Probiotics đều dự trên cơ sở
sự ức chế tăng trường vi sinh vật chỉ thị của các chủng probiotic, được khái quát như
sau:
Hình 2.3: Sơ đồ khái quát hóa tiêu chuẩn đánh giá hoạt tính của vi sinh vật
Các chỉ tiêu và phương pháp trên sẽ được giới thiệu kĩ hơn ở phần tiếp theo.
2.1.3.1. Khả năng bám dính (Adhesion assay) [9], [24], [41]
Nguyên tắc: dựa trên mối quan hệ tương tác giữa probiotic và bề mặt niêm mạc
ruột là nơi chứa các tế bào lympho. Ngoài ra sự bám dính của probiotic tạo nên khả
năng cạnh tranh gắn kết vào biểu mô ruột giữavi khuẩn gây bệnh và probiotic.
Tế bào Caco2 ở nội tạng thường được sử dụng trong nghiên cứu in vitro dựa trên
hệ thống tế bào bám dính của Lactobacilli không gêy bệnh. Chuỗi tế bào này được sử
dụng để kiểm tra hện thống tế bào bám dính và sự xâm nhập của các vi sinh vật chỉ thị
Tế bào Caco2 được nuôi cấy tăng sinh khối tế bào trong Eagle’s minimum
essential medium (MEM). Hỗn hợp chứa vi khuẩn khoảng 10
8
tb/ml và 240µl MEM
được sử dụng để ủ với tế bào Caco2. Sau khi nuôi ủ, sinh khối tế bào được nhuộm với
dung dịch màu Giema. Lúc này quan sát được các tế bào Lactobacilli bám chặt trên tế
bào Caco2 dưới kính hiển vi độ phòng đại 100.
Probiotics
Sự bám
dính
Chịu
acid dạ

dày
Kháng
vi sinh
vật
Chịu
được
muối
mật
Thử
nghiệm
in vivo
Hình 2.4: Minh họa các vi khuẩn probiotic bám dính lên bề mặt ruột tác động đối
kháng với các vi khuẩn gây bệnh [47]
2.1.3.2. Khả năng chịu acid dạ dày [24], [41]
Nguyên tắc: pH của dạ dày và ruột thường thấp do các acid gây ra như oxalic
acid, butylic acid, folic acid Chính vì vậy các vi khuẩn probiotic cần phải chịu được
điều kiện pH thấp, hay là dung nạp được với acid trong dạ dày và ruột thì mới có thể
phát huy được tác dụng probiotic của mình.
Để kiểm tra khả năng này, người ta nuôi cấy các vi khuẩn probiotic trên môi
trường MRS với điều kiện pH là 2.5 và đối chứng trên MRS thông thường. Sau đó quan
sát mật độ vi sinh vật ở bước sóng 600nm. Tiếp tục so sánh sự sống sót dưới điều kiện
này ở các mốc thời gian, từ 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7 và 24h.
2.1.3.3. Khả năng chịu được muối mật [24], [41]
Có loại muối mật: glycochalat Natri và Taruocholat Natri. Muối mật có chức
năng quan trọng trong việc tiêu hóa và hấp thu lipid ở ruột non kéo theo sự hấp thu
các vi ta min tan trong lipid như A, D, E, K. Khi xuống đến hồi tràng, 95% muối
mật được tái hấp thu rồi theo theo tính mạch của trở về gan và được tái bài tiết, gọi
là chu trình ruột gan. Còn lại 5% muối mật được đào thải theo phân có tác dụng giữ
nước trong phân và duy trì nhu động ruột già. Chính vì khả năng này mà khả năng
chịu được muối mật cũng là một điều kiện để đánh giá hoạt tính của probiotic, đòi

hỏi các vi khuẩn probiotic không gây ảnh hưởng gì tới lượng muối mật ở trong
ruột.
Để kiểm tra khả năng này, tương tự như kiểm tra khả năng chịu pH thấp, cũng
dùng môi trường MRS có bổ sung 0.3% muối mật và đối chứng trên MRS thông
thường. Sau đó so sánh mật độ tế bào vi khuẩn ở bước sóng 600µnm.
2.1.3.4. Khả năng kháng vi sinh vật
Điển hình về nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật của probiotic đó chính là
nghiên cứu của Schillinger và Lucke [28]. Sau này phát triển thêm nhiều nghiên cứu
mới, tuy nhiên tất cả những nghiên cứu từ trước tới giờ đều dựa trên khả năng sinh
kháng sinh hay các chất cạnh tranh để ngăn chặn sự phát triển của các vi sinh vật gây
bệnh.
Hình 2.5 sẽ cho thấy sơ đồ khái quát hóa về các phương pháp đánh giá hoạt tính
kháng vi vinh vật dựa trên dạng vật liệu khác nhau.
Hình 2.5: Sơ đồ khái quát hóa các phương pháp in vitro trong kiểm tra đánh giá hoạt
tính kháng vi sinh vật của probiotic.
Sau đây là giới thiệu chi tiết hơn về các phương pháp giới thiệu tại bảng 2.5
Bảng 2.5: Các phương pháp kiểm tra khả năng kháng vi sinh vật
Phương pháp Nguyên tắc sử dụng Cách thực hiện
Turbidometric
assay method
(Đo độ đục) [16],
[31]
Ức chế tăng trưởng
vi khuẩn chỉ thị
bằng các sản phẩm
trao đổi chất của vi
khuẩn Probiotic
Trong môi trường lỏng(1). Cho dịch ly
tâm môi trường(2) nuôi cấy LAB vào môi
trường phát triển của vi khuẩn chỉ thị. Sau

21h đo OD ở bước sóng 600nm, so sánh %
với ống đối chứng không sử dụng dịch ly
tâm trên.
Disc diffusion
assay
(khuếch tán qua
vòng giấy lọc) [7],
[11], [19], [31]
Như trên Trên môi trường agar(3). Thấm giấy vào
dịch ly tâm môi trường (2) nuôi cấy LAB.
Đặt giấy thấm lên bề mặt môi trường agar
đã trải vi khuẩn chỉ thị trước đó. Ủ qua
đêm, kiểm tra vùng kháng khuẩn.
Well diffusion
assay
(khuếch tán qua
giếng thạch) [12],
[19], [20], [25],
[41]
Như trên Trên môi trường agar (3). Trải vi khuẩn
chỉ thị, đục lỗ đường kính 8mm. Cho dịch
ly tâm môi trường(2) nuôi cấy LAB. Ủ qua
đêm, kiểm tra vùng kháng khuẩn
Đấu tranh trực tiếp Giống như trên. Tuy nhiên sử dụng trực
Turbidometric
assay method
well
diffusion
assay
Spot

on
lawn
Disc
diffusion
assay
Agar
spot test
Dùng sản phẩm thô
(dịch nuôi cấy)
Sản phẩm đã qua tinh
chế (dịch nuôi cấy ly
tâm loại bỏ tế bào)
của Probiotic với vi
khuẩn chỉ thị
tiếp dịch nuôi cấy LAB. Ủ qua đêm, kiểm
tra vùng kháng khuẩn
Spot on lawn [12],
[11], [31],
Đấu tranh trực tiếp
của Probiotic với vi
khuẩn chỉ thị
Trên môi trường agar (4). Nhỏ dịch chứa
tế bào LAB, cố định bằng 1 giọt môi
trường (5). Đổ hỗn hợp vi khuẩn chỉ thị
với 7ml môi trường (5) lên, để đông, được
hai mặt kẹp của hai môi trường (4) và (5).
Ủ qua đêm, kiểm tra vùng kháng khuẩn.
Agar spot test
(khuếch tán trên bề
mặt thạch) [27],

[19], [5]
Đấu tranh trực tiếp
của Probiotic với vi
khuẩn chỉ thị.
Trên môi trường agar (3). Trải vi khuẩn
chỉ thị, nhỏ giọt môi trường (2) nuôi cấy
LAB. Ủ qua đêm, kiểm tra vùng kháng
khuẩn.
Giải thích thêm:
Môi trường (1) BHI Broth
Môi trường (2) MRS Broth
Môi trường (3) BHI Agar 2%
Môi trường (4) MRS Agar 2%
Môi trường (5) BHI Agar 0,7%
Kiểm tra vùng kháng khuẩn là đo vòng trong suốt không có sự phát triển của vi
khuẩn chỉ thị.
Agar spot test
Well diffusion assay
Disc diffusion assay
Spot on lawn
Hình 2.6: Minh họa các phương pháp kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật [19]
2.1.3.5. Thử nghiệm in vivo [10], [41]
Đây là khâu quan trọng trong quá trình hình thành nên một chế phẩm Probiotic.
Vì nó thể hiện được tính an toàn của sản phẩm cũng như là vấn đề về đạo đức. Một chế
phẩm probiotic trước khi trở thành thành phẩm để sản xuất và tiêu thụ, phải trải qua
công đoạn thử nghiệm in vivo nhằm kiểm tra ảnh hưởng của chế phẩm lên cơ thể tiếp
nhận. Tức là kiểm tra độc tính hay những biến đổi xấu lên cơ thể tiếp nhận khi sử dụng
chế phẩm này. Qui trình kiểm tra này có thể bắt đầu với thử nghiệm in vivo trên chuột
hoặc thỏ, sau đó mới được thử nghiệm trực tiếp trên cơ thể tiếp nhận như gia súc gia
cầm với chế phẩm trong chăn nuôi Đặc biệt nếu là chế phẩm dành cho người thì việc

thử nghiệm càng phải gắt gao và đòi hỏi tính chính xác, tính an toàn cao.
2.1.4. Ứng dụng Probiotics trong chăn nuôi [1], [3]
Phương pháp chăn nuôi hiện đại trong đó bao gồm các điều kiện và chế độ ăn gây
ra stress và có thể gây ra những thay đổi trong thành phần của hệ vi sinh vật mà làm
cho vật nuôi giảm sự đề kháng đối với bệnh tật.
Probiotic được bổ sung vào thức ăn để tăng cường tốc độ tăng trưởng của vật
nuôi và cải thiện sức khỏe của chúng bằng cách tăng sự đề kháng. Mục đích của
phương pháp tiếp cận probiotic là để cân bằng lại hệ vi sinh vật và phục hồi sức đề
kháng của động vật. Sự điều trị như vậy không đưa bất cứ hóa chất vào bên trong cơ thể
động vật. Giảm nguy cơ nhiễm bệnh và không đưa hóa chất độc hại vào trong chuỗi
thức ăn.
Nó được giả định rằng probiotic đã tác dụng đến cả vùng dạ dày và tác dụng lên
bệnh tiêu chảy và các bệnh nhiễm trùng khác. Tuy nhiên, gần đây có những nghiên cứu
tại một số quốc gia khác nhau đã chỉ ra rằng các tác động này có thể được tổng quát
hơn. Các kết quả thu được đã chứng tỏ rằng một số vi khuẩn được sử dụng trong
probiotic (lactobacilli) có khả năng kích thích hệ miễn dịch. Điều này được đặt ra hoàn
toàn mới đối với những ảnh hưởng của probiotics đã biết, trong đó nó có thể tác động
tới tình hình bệnh dịch về đường ruột, cũng như phòng chống các bệnh về đường ruột.
Probiotic hiện nay đã thay thế các hóa chất tăng trưởng vẫn thường quảng bá cho
các nông trại chăn nuôi và sự yêu cầu tăng khả năng kháng bệnh cũng được thực hiện.
Yêu cầu về lợi ích mà probiotic mang lại trong chăn nuôi gia súc như sau:
 Tăng trưởng nhanh
 Nâng cao khả năng sinh sản
 Nâng cao sức đề kháng bệnh tật
 Nâng cao năng suất và chất lượng sữa
 Nâng cao sản xuất trứng
Probiotic không phải là một thực thể đơn lẻ, những chế phẩm probiotic khác nhau
chứa đựng hệ vi sinh vật khác nhau thì có tác động khác nhau. Ngay cả những chủng
khác nhau của cùng một loài có thể có hoạt động trao đổi chất khác nhau sẽ ảnh hưởng
đến kết quả khi chúng được sử dụng như probiotic. Kết quả tiêu cực có thể được giải

thích ở những vật nuôi có sức đề kháng yếu hay do giai đoạn tăng trưởng của vật nuôi,
liều lượng sử dụng, các điều kiện vệ sinh chuồng trại.
Với những điều ngạc nhiên mang lại, cũng như những kết quả chưa như mong
muốn của probiotic, nhưng thực tế là những kết quả đạt được rất có ý nghĩa, bằng cách
sử dụng probiotic hợp lý, theo đúng các điều kiện và sử dụng đúng phương pháp sẽ
mang lại nhiều lợi ích cho việc bổ sung nguồn dinh dưỡng trong chăn nuôi.
2.1.4.1. Trong chăn nuôi gia cầm [4]
Trong quá trình cải tiến di truyền, năng suất của gà thịt đã được cải thiện đáng kể.
Khi mà điều này là tốt cho ngành chăn nuôi gia cầm, việc tăng mật độ nuôi và lúc đó thì
thách thức bệnh tật gia tăng gây cho gia cầm dễ nhiễm các loại nguồn bệnh khác nhau,
đặc biệt là vi khuẩn đường ruột như E.coli, Salmonella spp, Clostridium perfringens và
Campylobacter spp…
Sự nhạy cảm với mầm bệnh dẫn đến việc sử dụng các chất kích thích sinh trưởng
chống vi khuẩn – các chất vốn căn bản được sử dụng để tăng sức khoẻ cho đường ruột
và kiểm soát các kích thích phụ lâm sàng.
Với ý thức ngày càng tăng của xã hội về sự kháng thuốc của vi khuẩn, thì việc sử
dụng kháng sinh trong các liều thuốc chữa bệnh hoặc phòng bệnh cho gia cầm đã được
hạn chế một cách nghiêm ngặt thậm chí bị loại bỏ hẳn ở rất nhiều quốc gia.
Từ lâu đã có nhiều quan tâm đến việc tìm ra một loại chất để thay thế kháng sinh
trong chăn nuôi gia cầm. Vi khuẩn sống trong ống tiêu hóa của gia cầm có ảnh hưởng
sâu sắc đến một vài quá trình sinh lý của vật chủ (gia cầm). Với suy nghĩ đó, điều quan
trọng là phải hiểu cơ chế của hệ vi khuẩn đường ruột gia cầm nhằm tìm ra các chất thay
thế thuốc kháng sinh. Trong bối cảnh bình thường, thì trong đường ruột có một sự cân
bằng tinh tế giữa các vi khuẩn có lợi và gây bệnh. Nó bị ảnh hưởng bởi các tương tác
và quan hệ cộng sinh và cạnh tranh. Cộng đồng vi khuẩn đó không chỉ bảo vệ bộ máy
tiêu hoá mà còn tăng khả năng sản xuất trong động vật chủ.
Sử dụng Probiotic và Prebiotic là hai phương pháp đã được nghiên cứu và có tiềm
năng giảm bớt nguồn dịch bệnh đối với chăn nuôi gia cầm và đồng thời nâng cao năng
suất của chúng. Các chất này mới được đề nghị dùng để hỗ trợ bảo vệ nhiễm bệnh của
thịt và cải tiến phản ứng miễn dịch cho gà ( Theo Huang và cộng tác viên - 2004). Thực

phẩm Probiotics và Prebiotics vào thức ăn không còn là những phương pháp mới, mà
thực tế, chúng đã được sử dụng trong hàng thế kỷ như là một thành phần tự nhiên của
thức ăn hoặc như thức ăn lên men, thí dụ như sữa chua (yoghurt).
Bệnh đường ruột có ảnh hưởng đến ngành chăn nuôi gia cầm. Chúng làm giảm
năng suất, tăng tỷ lệ chết và cũng là nguồn nhiễm tiềm năng cho các sản phẩm gia cầm,
và gây nên mất an toàn thực phẩm cho con người. Việc sử dụng các thuốc kháng sinh
trong thức ăn gia cầm đã được giảm bớt do vấn đề kháng kháng thuốc của vi khuẩn.
Các chất thay thế cho kháng sinh trong dinh dưỡng gia cầm cần được đánh giá nghiêm
túc trên thực địa. Probiotics và Prebiotics là các “thí sinh” thay thế khả quan.
2.1.4.2. Trong chăn nuôi gia súc [4]
Gần đây, nhiều báo cáo nghiên cứu chứng minh hiệu quả rõ ràng của probiotic
trên heo, bao gồm:
- Lactobacillus spp và Bifidobacteria spp làm tăng trọng lượng và giảm tỉ lệ chết
non.
Lactobacillus casei cải thiện tăng trưởng của heo con và giảm bệnh tiêu chảy, tác dụng
của nó hiệu quả hơn so với việc dùng kháng sinh liều thấp.
- Enteracide, một probiotic chứa Lactobacillus acidophilus và Streptococcus
faecium thêm vào thức ăn cho heo con cai sữa kích thích sự tăng trưởng và hoạt động
của hệ thống tiêu hóa. Sự thêm Streptococcus faecium vào khẩu phần ăn cho heo con
làm tăng trọng lượng và tăng hiệu quả thức ăn.
- Hỗn hợp Lactobacillus spp. và Streptococcus spp. tăng sự sinh trưởng và chức
năng miễn dịch ở heo con.
- Bột tế bào vi khuẩn tiêu hóa từ Brevibacterium lactofermentum giảm sự tác động
và sự nguy hiểm của bệnh tiêu chảy ở heo con.
- Heo con ăn Bacillus coagulans có tỉ lệ chết giảm và cải thiện việc tăng trọng
lượng, sự chuyển hóa thức ăn tốt hơn heo con không có ăn bổ sung cũng như so với heo
dùng kháng sinh liều thấp.
- Bacillus licheniformis cải thiện trọng lượng, chuyển hóa thức ăn và giảm bệnh
tiêu chảy, tỉ lệ chết non.
- Biomate 2B plus (B.licheniformis và B. subtilis) tăng hiệu quả thức ăn và tăng

trưởng của heo con hơn dùng kháng sinh.
- Heo con ăn probiotic Bacillus toyoi hoặc hỗn hợp Saccharomyces cerevisae,
Lactobacillus acidophilus và Streptococcus faecium làm tăng trọng lượng đáng kể so
với việc dùng kháng sinh.