1
I. PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN TINH TRÙNG CÁ TRA VÀ BA SA DÀI NGÀY
BẰNG NITƠ LỎNG
a/ Thí nghiệm: Đánh giá sự vận động tinh trùng bảo quản trong Nitơ lỏng.
Qui trình bảo quản tinh trùng được trình bày các bước sau.

Đ
ôn
g
lạnh ở tốc độ hạ
nhiệt 5
-
7
0
Cđatđe
á
n
–
80
0
C
Tinh trùn
g
sau
khi được vuốt
Dun
g
dòch
cố đ
ò
nh
Pha loãn
g
tỉ lệ 1: 10
Chất bảo vệ ở
nồng độ 5-20%

Thời
g
ian cân bằn
g
10
p
hút
Thả trực tiế
p
vào
bình Nitơ lỏng
Sau 3 thán
g
bảo
q
uản
Đánh
g
iá chất
lượng tinh
Cho vào ốn
g
nhựa
0,5mL

2

Với chất bảo vệ là
- Dimethyl sulfoxide (DMSO) (theo Tiersch và ctv., 1994)
- Glycerol (G) (Theo Tiersch và ctv., 1994)

- Methanol (M) (theo Tiersch và ctv., 1994).
Và ở 4 nồng độ: 5%, 10%, 15%, 20%.
II. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
A. Kết Quả Cá Tra
1. Phương pháp bảo quản ngắn ngày tinh trùng cá tra Pagasius
hypophthalmus
Tinh trùng được vuốt ra khỏi cá đực và chỉ hoạt động khi được tiếp xúc với nước. Sự
thụ tinh giữa tinh trùng và trứng diễn ra rất nhanh trong vòng vài giây sau khi tinh trùng
hoạt động. Để bảo quản tinh trùng sau khi rời khỏi cơ thể, tiến hành trữ tinh trùng trong
các dung dòch cố đònh. Chúng tôi sử dụng bốn dung dòch cố đònh tinh trùng. Đó là dung
dòch nước muối sinh lý NaCl 0,9%, dung dòch HBSS (dung dòch muối cân bằng Hank),
dung dòch CF-HBSS (dung dòch muối câng bằng Hank không chứa Calcium) và dung dòch
đệm Tris (gồm NaCl 0,9% và pH=7), với tỷ lệ pha loãng giữa tinh và dung dòch cố đònh
tinh trùng là 1:10, trữ ở nhiệt độ 4-10
0
C.
Để đánh giá chất lượng tinh trùng bảo quản thay đổi theo thời gian và dung dòch cố
đònh, thông qua chỉ tiêu đánh giá phần trăm vận động tinh trùng, thời gian tinh trùng vận
động, kiểu tinh trùng vận động cũng như đánh giá qua tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ nở, tỷ lệ sống
và tỉ lệ dò hình.
2. Đánh giá sự vận động tinh trùng theo thời gian bảo quản
Sự vận động tinh trùng được bảo quản trong các dung dòch cố đònh thay đổi theo thời
gian bảo quản từ 12 giờ đến 96 giờ. Kết quả được trình bày ở bảng 1
Theo kết quả bảng 4.1, phần trăm tinh trùng vận động giảm dần theo thời gian bảo
quản và cũng thay đổi theo dung dòch cố đònh tinh trùng. Kết quả thí nghiệm cho thấy ở
thời gian bảo quản 24 giờ, phần trăm vận động tinh trùng bảo quản trong dung dòch cố đònh
Tris so với phần trăm vận động tinh trùng đối chứng (100%) thì không sai khác. Trái lại,
các dung dòch cố đònh tinh trùng còn lại cho thấy phần trăm tinh trùng vận động còn lại
63,3- 73,3% so với đối chứng có sự sai khác. Vậy ở thời gian bảo quản 24 giờ thì dung dòch
cố đònh Tris giúp tinh trùng vận động tốt nhất.

Tinh trùng bảo quản sau thời gian 48 giờ bắt đầu có sự thay đổi khá rõ. Trong dung
dòch cố đònh HBSS, phần trăm tinh trùng vận động bằng không, nghóa là sự sống của chúng
không còn nữa. Tuy nhiên, đối với dung dòch cố đònh CF-HBSS, Tris và nước muối sinh lý
NaCl 0,9% thì kết quả thí nghiệm cho thấy phần trăm vận động tinh trùng bảo quản còn

3
tốt, mặc dù so với đối chứng (100%) thì đã giảm khá nhiều. Cụ thể như dung dòch Tris
(43,3%), CF-HBSS (36,7%) và dung dòch NaCl (50,0%).
Đến thời gian bảo quản sau 72 giờ, phần trăm vận động tinh trùng bảo quản trong
các dung dòch cố đònh giảm rất nhiều. Cụ thể như dung dòch cố đònh Tris(26,7%), dung dòch
CF-HBSS và NaCl (13,3%), rồi đến HBSS (bằng không). Thời gian bảo quản tinh trùng
càng kéo dài thì phần trăm tinh trùng vận động càng giảm. Đến thời gian bảo quản 96 giờ,
chỉ còn khoảng 10% tinh trùng vận động được bảo quản trong dung dòch cố đònh Tris và
NaCl 0,9%. Nhận xét thấy rằng, chất lượng tinh trùng thông qua chỉ tiêu đánh giá phần
trăm tinh trùng vận động trong điều kiện không cung cấp oxygen và thuốc kháng sinh,
50% tinh trùng còn sống và vận động sau 48 giờ trong dung dòch cố đònh Tris và NaCl
0,9%.

Bảng 1
Phần trăm tinh trùng vận động theo thời gian bảo quản và dung dòch cố đònh

Dung dòch cố đònh
Thời gian Đối chứng HBSS CF-HBSS Tris NaCl
12 giờ 100,0
a
100,0
a
100,0
a
100,0

a
100,0
a

24 giờ 100,0
b
73,3
a
63,3
a
93,3
b
73,3
a
36 giờ 100,0
d
0,0
a
56,7
b
73,3
c
70,0
c
48 giờ 100,0
d
0,0
a
36,7
b

43,3
bc
50,0
c
60 giờ 100,0
d
0,0
a
26,7
b
36,7
c
30,0
b
72 giờ 100,0
d
0,0
a
13,3
b
26,7
c
13,3
b
84 giờ 100,0
d
0,0
a
0,0
a

23,3
c
13,3
b
96 giờ 100,0
c
0,0
a
0,0
a
13,3
b
8,3
b
Các giá trò cùng hàng có cùng mẫu tự thì không có sự sai khác ở xác suất 95%
(P<0,05)
.
Ngược lại, các giá trò cùng hàng không cùng mẫu tự thì có sự sai khác.
Dung dòch cố đònh HBSS đem lại kết quả là chất lượng tinh trùng kém nhất. Điều
này có thể giải thích do áp suất thẩm thấu của dung dòch cố đònh tinh trùng. Nghiên cứu về
thành phần tinh dòch, Mongkonpunya và ctv., 1996, cho rằng, dung dòch cố đònh tinh trùng
nên điều chỉnh ở khoảng 300 mOsmol/Kg để giữ cho tinh trùng sống lâu. Trong khi đó,
dung dòch cố đònh HBSS có áp suất thẩm thấu thấp (286 mOsmol/Kg), có thể là nguyên

4
nhân dẫn đến phần nào chất lượng tinh trùng kém. Ngược lại, áp suất thẩm thấu dung dòch
nước muối sinh lý NaCl 0,9% là 300 mOsmol/Kg, CF-HBSS là 320 mOsmol/Kg và Tris là
310 mOsmol/Kg cao hơn dung dòch cố đònh HBSS nên chất lượng tinh trùng được bảo quản
mang lại kết quả tốt hơn.
Khi so sánh với kết quả của Mongkopunya và ctv., 1996 bảo quản tinh trùng cá tra

với các dung dòch cố đònh. Kết quả tinh trùng bảo quản đến thời gian 96 giờ thì kết quả
tương tự. Tuy nhiên, theo báo cáo kết quả của Mongkopunya và ctv., 1996 có sử dụng
thuốc kháng sinh nên đã kéo dài thời gian sống tinh trùng được 6 ngày. Tuy nhiên, cả hai
kết quả này thì thấy rằng phần trăm tinh trùng vận động tốt nhất là 2 ngày.

Bảng 2 Thời gian tinh trùng vận động theo thời gian bảo quản và dung dòch cố đònh

Dung dòch cố đònh
Thời gian Đối chứng HBSS CF-HBSS Tris NaCl
12 giờ 50,3
ab
57,3
b
52,7
ab
55,0
b
43,7
a
24 giờ 50,3
b
42,7
a
43,3
ab
47,7
ab
41,0
a
36 giờ 50,3

d
0,0
a
37,3
b
45,0
cd
42,0
bc
48 giờ 50,3
c
0,0
a
31,0
b
37,3
b
31,7
b
60 giờ 50,3
d
0,0
a
28,0
b
34,0
c
26,7
b
72 giờ 50,3

c
0,0
a
21,3
b
27,3
b
22,0
b
84 giờ 50,3
c
0,0
a
0,0
a
20,0
b
22,0
b
96 giờ 50,3
c
0,0
a
0,0
a
17,7
b
16,3
b
Các giá trò cùng hàng có cùng mẫu tự thì không có sự sai khác ở xác suất 95%

(P<0,05). Ngược lại, các giá trò cùng hàng không cùng mẫu tự thì có sự sai khác.
Qua bảng 2, Theo tác giả nhận thấy thời gian tinh trùng vận động cũng giảm dần
theo thời gian bảo quản. Khi tinh trùng đïc trữ trong các dung dòch cố đònh ở nhiệt độ
4
0
C- 6
0
C nhằm làm tinh trùng bất động và giảm khả năng trao đổi chất, mặc dù vậy, tinh
trùng vẫn hoạt động hô hấp, nghóa là đã có sự tiêu hao O
2
và năng lượng ATP. Như thế,
khi thời gian bảo quản tinh trùng càng kéo dài thì thời gian tinh trùng vận động càng giảm
dần, dẫn đến chất lượng tinh trùng cũng giảm dần. Tương tự như kết quả về phần trăm tinh
trùng vận động, trong các dung dòch cố đònh thì dung dòch Tris, NaCl 0,9%, CF-HBSS là tốt

5
so với dung dòch cố đònh HBSS (chỉ sau 36 giờ bảo quản, tinh trùng đã không còn sống
sót).
Đến thời gian 96 giờ bảo quản tinh trùng trong dung dòch cố đònh Tris và NaCl 0,9%
thì tinh trùng vẫn còn vận động trung bình từ 16-17 giây so với 50 giây của đối chứng, còn
dung dòch cố đònh HBSS và CF-HBSS mang lại kết quả kém nhất.
Để đánh giá chất lượng tinh trùng khi qua chỉ tiêu đánh giá sự vận động tinh trùng
thì kiểu vận động tinh trùng là yếu tố quan trọng, ảnh hưởng đến khả năng tiếp xúc giữa
tinh trùng và trứng. Kiểu vận động tinh trùng giảm dần theo thứ tự từ tinh trùng di động rất
nhanh không thể nhìn thấy từng cá thể, rồi đến kiểu di động chậm, di động tại chỗ và bất
động. Dựa vào thang đánh giá kiểu vận động tinh trùng của Sanchez- Rodiguez và Billard
(1977), để tiến hành đánh giá sự vận động tinh trùng. Kết quả được thể hiện qua bảng 4.3
sau.

Bảng 3 Kiểu tinh trùng vận động theo thời gian bảo quản và dung dòch cố đònh


Dung dòch cố đònh
Thời gian Đối chứng HBSS CF-HBSS Tris NaCl
12 giờ 5,0
a
5,0
a
5,0
a
5,0
a
5,0
a
24 giờ 5,0
b
4,3
a
4,0
a
5,0
b
4,3
a
36 giờ 5,0
c
0,0
a
3,7
b
4,0

b
4,0
b
48 giờ 5,0
d
0,0
a
2,7
b
3,0
bc
3,3
c
60 giờ 5,0
e
0,0
a
1,3
b
2,7
d
2,0
c
72 giờ 5,0
d
0,0
a
1,0
b
1,7

c
1,0
b
84 giờ 5,0
c
0,0
a
0,0
a
1,3
b
1,0
b
96 giờ 5,0
c
0,0
a
0,0
a
1,0
b
1,0
b
Các giá trò cùng hàng có cùng mẫu tự thì không có sự sai khác ở xác suất 95%
(P<0,05). Ngược lại, các giá trò cùng hàng không cùng mẫu tự thì có sự sai khác.
Tương tự như kết quả đánh giá phần trăm tinh trùng vận động, thời gian tinh trùng
vận động thì kiểu tinh trùng vận động sau thời gian bảo quản 24 giờ bảo quản trong các
dung dòch cố đònh Tris không sai khác so với đối chứng (kiểu 5: tinh trùng vận động thật

6

nhanh mà mắt thường không thể nhìn thấy rõ từng cá thể). Tuy nhiên các dung dòch cố
đònh khác cho kết quả tương đối thấp hơn (trung bình từ kiểu 4-5).
Khi thời gian tinh trùng bảo quản đến 48 giờ trong các dung dòch cố đònh, kiểu tinh
trùng vận động đã có sự thay đổi lớn hơn. Dung dòch cố đònh HBSS cho kết quả tinh trùng
bất động (kiểu 0). Đối với dung dòch cố đònh Tris, NaCl 0,9% và dung dòch CF-HBSS thì
kiểu tinh trùng vận động giảm xuống (kiểu 3: tinh trùng vận động bao gồm tinh trùng vận
động nhanh, vận động chậm và không vận động). Sau thời gian 72 giờ tinh trùng bảo quản
trở đi thì kiểu vận động giảm hẳn (từ kiểu 2 giảm xuống đến kiểu 0).
Qua việc đánh giá chất lượng tinh trùng thông qua chỉ tiêu đánh giá sự vận động tinh
trùng bảo quản trong các dung dòch cố đònh, cho thấy rằng chất lượng tinh trùng bảo quản
giảm dần theo thời gian bảo quản và thay đổi theo dung dòch cố đònh tinh trùng. Trong thí
nghiệm này, việc đánh giá ban đầu cho thấy dung dòch cố đònh Tris, nước muối sinh lý
NaCl 0,9% là tốt nhất, kế đến là dung dòch CF-HBSS và sau cùng là dung dòch cố đònh
HBSS.

3. Khả năng thụ tinh của tinh trùng bảo quản
Đây là chỉ tiêu đánh giá quan trọng nhất để cho thấy chất lượng tinh trùng được bảo
quản trong các dung dòch cố đònh. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm cho thụ tinh giữa trứng
và tinh trùng bảo quản trong các dung dòch cố đònh theo thời gian bảo quản từ 24-72 giờ.
Do kết quả thụ tinh, ngoài việc lệ thuộc vào chất lượng tinh trùng còn lệ thuộc đến chất
lượng trứng, cho nên chúng tôi tiến hành thí nghiệm lập lại sự thụ tinh trên ba cá cái.
Sau đây là kết quả tỉ lệ thụ tinh, tỉ lệ nở, tỉ lệ dò hình, và chất lượng cá bột theo thời
gian bảo quản tinh trùng và dung dòch cố đònh tinh trùng.
a/ Đánh giá tỉ lệ thụ tinh
Bảng 4 Tỉ lệ thụ tinh sau thời gian bảo quản 24 giờ tinh trùng được bảo quản trong
các dung dòch cố đònh

Dung dòch cố đònh
Đối chứng HBSS CF-HBSS Tris NaCl
Cá cái 1 80,7

a
92,8
b
92,4
b
93,5
b
83,6
a
Cá cái 2 93,5
c
69,4
a
72,9
ab
87,6
bc
91,2
c
Cá cái 3 80,1
bc
68,6
a
72,8
a
86,2
c
79,4
b
Trung bình

86,0
a
76,9
a
79,3
a
89,1
a
84,7
a

7
Các giá trò cùng hàng có cùng mẫu tự thì không có sự sai khác ở xác suất 95%
(P<0,05). Ngược lại, các giá trò cùng hàng không cùng mẫu tự thì có sự sai khác.
Qua bảng 4, theo tac giả nhận thấy tỉ lệ thụ tinh sau thời gian 24 giờ tinh trùng bảo
quản trong các dung dòch cố đònh không sai khác so với đối chứng (86,0%), nhất là dung
dòch cố đònh Tris (89,1%) và dung dòch NaCl 0,9% (84,7%) cho kết quả rất tốt.
Bảng5 Tỉ lệ thụ tinh sau thời gian bảo quản 48 giờ tinh trùng được bảo quản trong
các dung dòch cố đònh

Dung dòch cố đònh
Đối chứng HBSS CF-HBSS Tris NaCl
Cá cái 1 94,6
b
50,0
a
52,7
a
88,0
b

51,4
a
Cá cái 2 96,8
c
50,8
a
74,4
b
96,8
c
43,5
a
Cá cái 3 97,8
c
50,8
a
56,7
a
74,4
b
52,0
a
Trung bình
96,4
b
50,5
a
61,2
a
86,4

a
49,0
a
Các giá trò cùng hàng có cùng mẫu tự thì không có sự sai khác ở xác suất 95%
(P<0,05). Ngược lại, các giá trò cùng hàng không cùng mẫu tự thì có sự sai khác.
Khi thời gian bảo quản tinh trùng tăng lên đến 48 giờ thì mang lại kết quả thụ tinh có
sự sai khác so với đối chứng (bảng 4.5). Dung dòch cố đònh CF-HBSS, HBSS và nước muối
sinh lý NaCl 0,9% thì tỉ lệ thụ tinh giảm xuống khá nhiều từ 49% đến 61,2% so với đối
chứng (96,4%). Nhưng riêng với dung dòch cố đònh Tris, tỉ lệ thụ tinh (86,4%)so với đối
chứng (96,4%) thì sai khác ít.
Tỉ lệ thụ tinh sau thời gian 72 giờ tinh trùng bảo quản trong các dung dòch cố đònh so
với đối chứng có sự sai khác rõ rệt (bảng 4.6). Cụ thể như dung dòch cố đònh Tris (56,1%),
dung dòch HBSS (46,8%), dung dòch CF-HBSS (44,4%), dung dòch nước muối sinh lý NaCl
0,9% (36,9%) so với đối chứng (91,2%).







8

Bảng 6 Tỉ lệ thụ tinh sau thời gian bảo quản 72 giờ tinh trùng được bảo quản
trong các dung dòch cố đònh

Dung dòch cố đònh

Đối chứng HBSS CF-HBSS Tris NaCl
Cá cái 1 93,6

c
38,9
ab
42,5
b
49,5
b
27,7
a
Cá cái 2 88,0
c
48,5
b
40,3
ab
45,3
b
32,1
a
Cá cái 3 92,0
c
53,0
a
50,4
a
73,5
b
50,9
a
Trung bình

91,2
c
46,8
ab
44,4
ab
56,1
b
36,9
a
Các giá trò cùng hàng có cùng mẫu tự thì không có sự sai khác ở xác suất 95%
(P<0,05). Ngược lại, các giá trò cùng hàng không cùng mẫu tự thì có sự sai khác.
Liên hệ với kết quả đánh giá sự vận động tinh trùng cho thấy rằng sự vận động tinh
trùng có liên quan đến kết quả thụ tinh. Ở thời gian 24 giờ bảo quản tinh trùng trong các
dung dòch cố đònh thì phần trăm tinh trùng vận động (63,3-93,3%) và kiểu tinh trùng vận
động (4-5) ứng với tỉ lệ thụ tinh (76,9-89,1%) so với đối chứng vẫn không sai khác. Đến
thời gian 48 giờ bảo quản tinh trùng, khả năng tinh trùng vận động giảm xuống (36,7-
50,0% tinh trùng vận động và kiểu tinh trùng vận động là 2- 3) ngoại trừ trường hợp dung
dòch cố đònh HBSS. Riêng ở dung dòch cố đònh Tris, kết quả tỉ lệ thụ tinh sau 48 giờ tinh
trùng bảo quản đạt tỉ lệ cao (86,4%) so với đối chứng (96,4%) thì sai khác ít. Điều này có
thể giải thích do dung dòch cố đònh Tris ngoài việc chứa nước muối sinh lý NaCl 0,9% còn
có dung dòch đệm giữ pH trung tính, tạo môi trường ổn đònh giúp cho tinh trùng bảo quản
được ổn đònh hơn, ít thay đổi so với các dung dòch cố đònh khác.
Với kết quả tỉ lệ thụ tinh cho thấy rằng tỉ lệ thụ tinh của tinh trùng bảo quản trong
các dung dòch cố đònh giảm dần theo thời gian bảo quản và thay đổi theo dung dòch cố
đònh. Trong các dung dòch cố đònh, thì dung dòch Tris là dung dòch đạt kết quả cao nhất. Và
thời gian bảo quản hiệu quả chỉ hai ngày để cho kết quả tương đương với đoiá chứng, nhưng
đến thời gian bảo quản sau 72 giờ thì kết quả thụ tinh chỉ còn phân nữa so với đối chứng.
b/ Đánh giá tỉ lệ nở
Sau khi trứng thụ tinh, chúng tôi tiếp tục đánh giá tỉ lệ nở để xem chất lượng tinh

trùng bảo quản trong các dung dòch cố đònh thay đổi theo thời gian bảo quản và dung dòch
cố đònh. Kết quả được trình bày sau đây

9
Theo thời gian tinh trùng bảo quản, kết quả thí nghiệm ở bảng 4.7 cho thấy sau 24
giờ tinh trùng bảo quản trong dung dòch cố đònh HBSS và CF-HBSS cho kết quả tỉ lệ nở cá
bột (85,7- 89,0%) so với đối chứng (92,6%) có sai khác nhưng rất ít. Đối với hai dung dòch
cố đònh Tris và NaCl 0,9% cho kết quả tỉ lệ nở (91,9- 92,0%) không sai khác so với đối
chứng (92,6%).
Khi thời gian bảo quản tinh trùng đến 48 giờ, tỉ lệ nở có sự sai khác với đối chứng
(bảng 4.8). Tinh trùng bảo quản trong dung dòch NaCl 0,9%, HBSS có tỉ lệ nở bằng không,
trong khi hai dung dòch cố đònh Tris và CF-HBSS dẫn đến tỉ lệ nở khá cao lần lượt là
82,6% và 61,8%. Như vậy, sau 48 giờ tinh trùng bảo quản, chỉ có dung dòch cố đònh Tris
cho kết quả tương đương với đối chứng, kế đến là dung dòch cố đònh CF-HBSS, còn hai
dung dòch cố đònh HBSS và NaCl 0,9% cho kết quả kém nhất.

Bảng 7
Tỉ lệ nở cá bột sau thời gian 24 giờ bảo quản tinh trùng trong các dung
dòch cố đònh
Dung dòch cố đònh
Đối chứng HBSS CF-HBSS Tris NaCl
Cá cái 1 89,0
ab
87,1
a
87,6
ab
88,9
ab
90,6

b
Cá cái 2 93,7
a
83,5
a
93,3
a
94,4
a
94,9
a
Cá cái 3 94,9
d
86,6
ab
85,9
a
92,7
cd
90,2
bc
Trung bình
92,6
b
85,7
a
89,0
ab
92,0
b

91,9
b
Các giá trò cùng hàng có cùng mẫu tự thì không có sự sai khác ở xác suất 95%
(P<0,05). Ngược lại, các giá trò cùng hàng không cùng mẫu tự thì có sự sai khác.
Sau thời gian 72 giờ tinh trùng bảo quản, tỉ lệ nở giảm xuống đang kể (bảng 9). Chỉ
có dung dòch cố đònh Tris đạt kết quả cao nhất (42,1%), kế đến là dung dòch CF-HBSS
(14,1%) so với đối chứng (92,0%).







10


Bảng .8 Tỉ lệ nở cá bột sau thời gian 48 giờ bảo quản tinh trùng trong các dung
dòch cố đònh

Dung dòch cố đònh
Đối chứng HBSS CF-HBSS Tris NaCl
Cá cái 1 94,5
d
0,0
a
71,5
b
86,8
c

0,0
a
Cá cái 2 83,7
c
0,0
a
58,5
b
82,9
c
0,0
a
Cá cái 3 80,0
c
0,0
a
55,4
b
78,1
c
0,0
a
Trung bình 86,1
c
0,0
a
61,8
b
82,6
c

0,0
a
Các giá trò cùng hàng có cùng mẫu tự thì không có sự sai khác ở xác suất 95%
(P<0,05). Ngược lại, các giá trò cùng hàng không cùng mẫu tự thì có sự sai khác.

Bảng 9 Tỉ lệ nở cá bột sau thời gian 72 giờ bảo quản tinh trùng trong các dung
dòch cố đònh

Dung dòch cố đònh
Đối chứng HBSS CF-HBSS Tris NaCl
Cá cái 1 83,2
c
0,0
a
6,9
a
34,9
b
0,0
a
Cá cái 2 97,4
d
0,0
a
19,3
b
40,0
c
0,0
a

Cá cái 3 95,3
d
0,0
a
16,2
b
51,3
c
0,0
a
Trung bình
92,0
d
0,0
a
14,1
b
42,1
c
0,0
a
Các giá trò cùng hàng có cùng mẫu tự thì không có sự sai khác ở xác suất 95%
(P<0,05). Ngược lại, các giá trò cùng hàng không cùng mẫu tự thì có sự sai khác.
Như vậy, khi bảo quản tinh trùng ngắn ngày, bốn dung dòch cố đònh Tris, nước muối
sinh lý NaCl 0,9%, CF-HBSS, HBSS cho kết quả tỉ lệ nở tương đương với đối chứng chỉ

11
trong vòng 24 giờ. Nhưng khi thời gian bảo quản kéo dài (từ 48- 72 giờ), thì chỉ có dung
dòch cố đònh Tris là tốt nhất. Nhận xét thấy rằng, tương tự như việc đánh giá sự vận động
tinh trùng cũng như đánh giá tỉ lệ thụ tinh, thì tỉ lệ nở sau thời gian bảo quản tinh trùng

trong dung dòch cố đònh giảm dần theo thời gian bảo quản và thay đổi theo dung dòch cố
đònh.
c/ Đánh giá tỉ lệ sống
Ở cá tra P. hypophthalmus, khi cá bột được một ngày tuổi thì chúng bắt đầu có hiện
tượng cắn nhau. Do đó, để đánh giá tỉ lệ sống cá bột chúng tôi tiến hành đánh giá sau 24
giờ cá bột sống. Ở kết quả bảng 4.10, tỉ lệ sống tương tự như kết quả tỉ lệ thụ tinh và tỉ lệ
nở, nghóa là thời gian 24 giờ tinh trùng bảo quản trong dung dòch cố đònh (94,5- 96,4%)
không có sai khác so với đối chứng (95,0%).

Bảng 10 Tỉ lệ sống cá bột sau thời gian 24 giờ bảo quản tinh trùng trong các dung
dòch cố đònh
Dung dòch cố đònh
Đối chứng HBSS CF-HBSS Tris NaCl
Cá cái 1 96,6
bc
97,2
c
92,5
ab
96,5
bc
91,8
a
Cá cái 2 96,7
a
98,3
ab
99,6
b
98,2

ab
98,8
ab
Cá cái 3 91,8
a
93,3
a
96,2
a
94,6
a
92,9
a
Trung bình
95,0
a
96,3
a
96,1
a
96,4
a
94,5
a
Các giá trò cùng hàng có cùng mẫu tự thì không có sự sai khác ở xác suất 95%
(P<0,05). Ngược lại, các giá trò cùng hàng không cùng mẫu tự thì có sự sai khác.
Đến thời gian 48 giờ tinh trùng bảo quản, thể hiện ở bảng 4.11 cho thấy tinh trùng
bảo quản trong dung dòch cố đònh HBSS và nước muối sinh lý NaCl 0,9% cho kết quả tỉ lệ
sống cá bột bằng không. Còn lại hai dung dòch cố đònh Tris và CF-HBSS cho kết quả tỉ lệ
sống cao (92,5-93,1%), tương đương với đối chứng (96,9%).







12



Bảng 11
Tỉ lệ sống cá bột sau thời gian 48 giờ bảo quản tinh trùng trong các dung
dòch cố đònh

Dung dòch cố đònh
Đối chứng HBSS CF-HBSS Tris NaCl
Cá cái 1 98,1
c
0,0
a
87,9
b
89,9
b
0,0
a
Cá cái 2 95,9
b
0,0
a

96,4
bc
98,1
c
0,0
a
Cá cái 3 96,8
c
0,0
a
93,3
b
91,4
b
0,0
a
Trung bình
96,93
b
0,0
a
92,53
b
93,13
b
0,0
a
Các giá trò cùng hàng có cùng mẫu tự thì không có sự sai khác ở xác suất 95%
(P<0,05). Ngược lại, các giá trò cùng hàng không cùng mẫu tự thì có sự sai khác.


d/ Đánh giá tỉ lệ dò hình
Qua bảng 4.12 và bảng 4.13, cho thấy tỉ lệ dò hình sau 24 giờ mà tinh trùng bảo quản
(0,9- 1,4%) so với đối chứng (0,9%) không có sự sai khác. Điều này chứng tỏ thành phần
các dung dòch cố đònh không gây ảnh hưởng xấu đến cá bột. Đến thời gian 48 giờ tinh
trùng bảo quản, do tinh trùng bảo quản trong dung dòch cố đònh HBSS và NaCl 0,9% cho
kết quả tỉ lệ nở bằng không, nên dẫn đến tỉ lệ dò hình cũng bằng không. Riêng đối với
dung dòch cố đònh CF-HBSS và Tris mà tinh trùng bảo quản ở thời gian 48 giờ cho kết quả
tỉ lệ dò hình (1,07- 1,33%) không sai khác với với đối chứng (1,07%).

Bảng 12 Tỉ lệ dò hình sau thời gian 24 giờ bảo quản tinh trùng trong các dung dòch cố đònh

Dung dòch cố đònh
Đối chứng HBSS CF-HBSS Tris NaCl
Cá cái 1 0,5
a
1,4
a
2,4
a
1,0
a
1,8
a
Cá cái 2 1,0
a
1,2
a
1,1
a
1,1

a
0,5
a

13
Cá cái 3 1,3
a
1,6
a
0,5
a
0,5
a
0,8
a
Trung bình
0,9
a
1,4
a
1,3
a
0,9
a
1,0
a
Các giá trò cùng hàng có cùng mẫu tự thì không có sự sai khác ở xác suất 95%
(P<0,05). Ngược lại, các giá trò cùng hàng không cùng mẫu tự thì có sự sai khác.

Bảng 13

Tỉ lệ dò hình cá bột sau thời gian 48 giờ bảo quản tinh trùng trong các
dung dòch cố đònh
Dung dòch cố đònh
Đối chứng HBSS CF-HBSS Tris NaCl
Cá cái 1 0,4
a
0,0
a
2,6
b
1,9
b
0,0
a
Cá cái 2 1,3
a
0,0
a
1,4
a
1,3
a
0,0
a
Cá cái 3 1,5
b
0,0
a
0,0
a

0,0
a
0,0
a
Trung bình
1,1
a
0,0
a
1,3
a
1,1
a
0,0
a
Các giá trò cùng hàng có cùng mẫu tự thì không có sự sai khác ở xác suất 95%
(P<0,05). Ngược lại, các giá trò cùng hàng không cùng mẫu tự thì có sự sai khác.
Tỉ lệ dò hình của tinh trùng được bảo quản sau 72 giờ không được đánh giá do ở thời
điểm này trứng thụ tinh càng ít dần đi.
Như vậy, qua các chỉ tiêu đánh giá khả năng thụ tinh của tinh trùng bảo quản trong
các dung dòch cố đònh thì thời gian bảo quản sau 24 giờ đem lại kết quả tốt hơn so với thời
gian bảo quản sau 48 và 72 giờ. Trong bốn dung dòch cố đònh Tris, HBSS, CF-HBSS, nước
muối sinh lý NaCl 0,9%; thì Tris là dung dòch cho khả năng thụ tinh tốt hơn so với các dung
dòch cố đònh còn lại.
Với phương pháp bảo quản ngắn ngày cho tinh trùng cá tra (Pangasius
hypophthalmus) trong thí nghiệm này, đã cho kết quả bảo quản tinh trùng mang lại hiệu
quả nhất là trong hai ngày. Trong đó, dung dòch cố đònh Tris là tốt nhất.

4. Phương pháp bảo quản bằng nitơ lỏng cho tinh trùng cá tra
Pagasius hypophthalmus

Để bảo quản dài ngày tinh trùng cá tra Pangasius hypophthalmus, chúng tôi dùng
phương pháp trữ tinh bằng Nitơ lỏng. Qui trình bảo quản tinh trùng bao gồm các khâu sau

14
Tinh trùng được pha loãng với dung dòch cố đònh, sau đó cho vào dung dòch chất bảo
vệ vào để hạ thấp điểm đông của môi trường ngoại bào và tốc độ khử nước của tế bào.
Trong thí nghiệm, chúng tôi sử dụng ba dung dòch cố đònh cho kết quả tốt nhất (kết quả ở
phần bảo quản ngắn ngày) là dung dòch cố đònh Tris, CF-HBSS, nước muối sinh lý NaCl
0,9%, và sử dụng ba chất bảo vệ là DMSO (dimethyl sulfoxide), methanol, glycerol ở
nồng độ 5%, 10%, 15%, 20%. Sau đó, bắt đầu đông lạnh với tốc độ hạ nhiệt 5-7
0
C cho đến
khi đạt đến -80
0
C, rồi thả trực tiếp vào Nitơ.
Kiểm tra chất lượng tinh trùng thông qua sự vận động tinh trùng sau thời gian trữ
tinh ba tháng với chế độ giải đông bằng phương pháp xoa tay trong 15 giây. Kết quả đánh
giá hoạt lực và sự sống tinh trùng bảo quản trong 3 tháng trong Nitơ lỏng được trình bày ở
bảng 14, 15, 16.
Bảng 14 Phần trăm vận động tinh trùng bảo quản trong Nitơ lỏng

Chất bảo vệ tinh trùng
DMSO Glycerol Methanol
Dung
dòch
Đối
chứng
5% 10% 15% 20% 5% 10% 15% 20% 5% 10% 15% 20%
Tris 70,0 26,7 23,3 16,7 5,0 0,0 23,3 16,7 6,7 0,0 0,0 6,7 6,7
CF-HBSS 70,0 36,7 33,3 16,7 16,7 0,0 33,3 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

NaCl 70,0 5,0 1,7 16,7 1,7 0,0 23,3 30,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Bảng 15 Thời gian vận động tinh trùng bảo quản trong Nitơ lỏng
Chất bảo vệ tinh trùng
DMSO Glycerol Metanol
Dung
Dòch
Đối
chứng
5% 10% 15% 20% 5% 10% 15% 20% 5% 10% 15% 20%
Tris
51,0 56,3 54,3 52,3 55,0 0,0 61,3 53,0 57,0 0,0 0,0 24,7
37,7
CF-HBSS 51,0 61,3 68,7 67,3 66,0 0,0 66,3 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
NaCl 51,0 11,0 5,7 3,7 2,3 0,0 73,0 56,7 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0



15





Bảng 16 Kiểu vận động tinh trùng bảo quản trong Nitơ lỏng
Chất bảo vệ tinh trùng
DMSO Glycerol Metanol
Dung
dòch
Đối

chứng
5% 10% 15% 20% 5% 10% 15% 20% 5% 10% 15% 20%
Tris
4,0 2,0 2,0 1,3 1,7 0,0 1,0 1,0 1,0 0,0 0,0 0,7
0,7
CF-HBSS 4,0 2,0 2,0 2,0 1,7 0,0 2,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
NaCl 4,0 2,0 0,3 0,3 1,7 0,0 1,3 1,0 1,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Qua các bảng kết quả đánh giá khả năng vận động tinh trùng bảo quản trong Nitơ
lỏng, theo tác giả nhận xét thấy rằng ở nồng độ DMSO 5% và 10% thì khả năng vận động
tinh trùng (26,7-33,3% tinh trùng vận động và kiểu tinh trùng vận động là 2 ở dung dòch cố
đònh Tris và CF-HBSS) tốt hơn so với nồng độ DMSO 15% và 20% (1,7-16,7% tinh trùng
vận động và vận động kiểu 1-2).
Đối với chất bảo vệ glycerol ở nồng độ 10% thì có kết quả sự vận động tinh trùng
(22,3-33,3% tinh trùng vận động và kiểu tinh trùng vận động là 1-2) trong các dung dòch cố
đònh cao hơn so với các nồng độ khác của chất bảo vệ glycerol. Riêng đối chất bảo vệ
methanol cho kết quả hoạt lực tinh trùng kém nhất. Tuy nhiên, chất lượng tinh trùng bảo
quản trong Nitơ lỏng rất kém so với đối chứng (70% tinh trùng vận động và vận động kiểu
bốn).
Nhận xét thấy rằng, sức sống tinh trùng bảo quản trong Nitơ lỏng so với tinh trùng
tươi thì không đạt kết quả như ý muốn. Điều này có thể giải thích do trong quá trình bảo
quản, sự thẩm thấu chất bảo vệ chưa được xác đònh tốt nhất cũng như tốc độ hạ nhiệt chưa
phù hợp…
Thời gian cân bằng nhằm giúp cho chất bảo vệ thẩm thấu vào tế bào tinh trùng, giữa
môi trường ngoài và bên trong tế bào được cân bằng trước khi cho hạ tốc độ nhiệt. Điều
này còn tùy thuộc vào chất bảo vệ và nồng độ chất bảo vệ. Đối với chất bảo vệ là dung
dòch chứa nhiều nước và khả năng gây độc cho tế bào. Các chất bảo vệ như DMSO,

16
methanol, glycerol là những chất có khả năng thẩm thấu vào trong tế bào. Khả năng thẩm

thấu này có liên quan đến trọng lượng phân tử của chất bảo vệ. Chất bảo vệ có trọng
lượng phân tử thấp thì có khả năng xuyên qua màng tế bào một cách dễ dàng (gọi là chất
bảo vệ nội bào). Trong thí nghiệm, chất bảo vệ methanol có trọng lượng phân tử thấp nhất
(32,04), đến DMSO (78,13) và glycerol (92,1). Đối với nồng độ chất bảo vệ, do bản thân
chúng là chất gây độc cho giao tử nhất là ở nồng độ cao; làm giảm sự sống tinh trùng.
Chất bảo vệ methanol dể dàng thẩm thấu nhất nhưng nếu kéo dài thời gian cân bằng làm
cho tế bào protein bò biến tính (Shlafer, 1981), điều này ảnh hưởng đến khả năng sống sót
của tinh trùng trước khi đông. Chất bảo vệ mang tính thấm cho vào dung dòch tinh trùng thì
có hiện tượng nước từ môi trường ngoại bào bắt đầu đi vào bên trong tế bào tinh trùng.
Khi hạ điểm đông xuống thì tế bào có hiện tượng trương phồng lên; nếu hạ nhiệt độ xuống
chậm quá, việc hình thành các tinh thể đá sẽ gây hại đến tế bào tinh trùng bằng cách làm
các tế bào phồng lên và có thể bò vỡ tung. Do đó, chất bảo vệ ngoại bào có vai trò trong
việc giúp môi trường ngoại bào và nội bào được cân bằng. Điều này có nghóa là tế bào
phồng lên (đã cho chất bảo vệ nội bào vào) rồi cho chất bảo vệ ngoại bào vào thì có hiện
tượng nước bên trong tế bào sẽ thoát ra ngoài, lúc này tế bào không hồng lên mà được co
lại. Khi hạ nhiệt độ xuống điểm đông, các tế bào tinh tùng trở lại trạng thái cân bằng.
Quay lại với kết quả trong thí nghiệm cho thấy đã không sử dụng chất bảo vệ ngoại bào,
cho nên đã ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng. Tuy nhiên, trong dung dòch CF-HBSS có
chứa lượng glucose nên phần nào giúp được chất lượng tinh trùng bảo quản tốt hơn so với
các dung dòch cố đònh khác.
Tốc độ làm lạnh là chìa khóa dẫn đến thành công trong việc bảo quản tinh trùng.
Nếu tế bào được làm làm lạnh nhanh quá thì việc khử nước không xảy ra thỏa đáng và sự
hình thành tinh thể đá là nguyên nhân gây hại đến các cơ quan và màng tế bào; ngược lại,
nếu tế bào tinh được làm lạnh chậm quá thì cũng ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng.
Trong thí nghiệm, có thể chưa điều chỉnh được tốc độ hạ nhiệt hoặc nhiệt độ hạ chưa phù
hợp.
Qua việc đánh giá chất lượng tinh trùng thông qua chỉ tiêu đánh giá sự vận động tinh
trùng, bước đầu cho thấy trong thí nghiệm chất bảo vệ DMSO (nồng độ 5%- 10%) và
glycerol (nồng độ 10%) trong dung dòch cố đònh tinh trùng CF-HBSS và Tris mang lại kết
quả cao so với chất bảo vệ methanol và trong dung dòch cố đònh nước muối sinh lý NaCl

0,9%.
B. KẾT QUẢ CÁ BASA
1. Phương pháp bảo quản ngắn ngày tinh trùng cá basa
Tinh trùng cá sau khi vuốt ra được giữ cố đònh và bảo quản trong các dung dòch
NaCl 0,9%, CF-HBSS, HBSS và Tris với tỉ lệ pha loãng 1/10 sau đó dung dòch tinh trùng
này được giữ lạnh trong tủ lạnh có nhiệt độ từ 4-10
0
C. Chất lượng tinh trùng cá sẽ thay đổi
tùy theo thời gian bảo quản và dung dòch cố đònh tinh trùng.

17
Để đánh giá chất lượng tinh trùng sau thời gian bảo quản trong các dung dòch này
chúng tôi dựa vào các chỉ tiêu sau

a. Phần trăm tinh trùng vận động
Tinh trùng cá Basa được bảo quản trong các dung dòch làm bất hoạt tinh trùng là
NaCl 0,9%, CF-HBSS, HBSS và Tris. Theo thời gian, cứ sau 12 giờ bảo quản chúng tôi
kiểm tra tinh trùng một lần. Lấy khoảng 0,1mL tinh trùng được giữ trong mỗi dung dòch cố
đònh quan sát dưới kinh hiển vi để đánh giá phần trăm tinh trùng vận động. Kết quả thu
được ở bảng 4.17
Bảng 17 Phần trăm tinh trùng vận động theo thời gian bảo quản và dung dòch cố
đònh tinh trùng (đơn vò %)
Dung dòch cố đònh tinh trùng
Thời gian
Đối chứng
HBSS CF-HBSS TRIS NaCl
12giờ 100,0
a
100,0
a

100,0
a
100,0
a
100,0
a

24 giờ 100,0
b
76,7
a
100,0
b
100,0
b
100,0
b
36 giờ 100,0
c
58,3
a
46,7
a
86,7
b
86,7
b
48 giờ 100,0
c
23,3

a
20,0
a
80,0
b
80,0
b
60 giờ 100,0
c
10,0
a
10,0
a
36,7
b
33,3
b
72 giờ 100,0
c
0,0
a
0,0
a
16,7
b
16,7
b
84 giờ 100,0
c
0,0

a
0,0
a
6,7
b
5.0
b
Các giá trò cùng hàng có cùng mẫu tự thì không có sự sai khác ở xác suất 95%
(P<0,05). Ngược lại, các giá trò cùng hàng không cùng mẫu tự thì có sự sai khác.
Kết quả bảng 4.17 cho thấy, sau 12 giờ thì phần trăm tinh trùng vận động không
thay đổi so với đối chứng (tinh trùng tươi) là 100%. Số lượng tinh trùng giảm dần theo thời
gian bảo quản từ 24-84 giờ. Thấy rõ nhất là tinh trùng được giữ trong hai dung dòch cố
đònh là HBSS và CF-HBSS. Sau 48 giờ bảo quản thì số lượng tinh trùng vận động ở dung
dòch cố đònh HBSS là 23,3%, ở dung dòch CF-HBSS là 20%. Sau 72 gi bảo quản thì tinh
trùng bảo quản trong hai dung dòch HBSS và CF-HBSS không vận động nữa tức là tinh

18
trùng bảo quản trong hai dung dòch này đã bò chết hoàn toàn. Chất lượng tinh trùng bảo
quản trong hai dung dòch cố đònh NaCl 0,9% và Tris tốt hơn ở hai dung dòch cố đònh HBSS
và CF-HBSS. Sau 48 giờ bảo quản thì số lượng tinh trùng vận động ở dung dòch cố đònh
Tris và NaCl 0,9% là như nhau bằng 80% so với đối chứng 100%. Đến 84 giờ sau khi vuốt,
tinh trùng trong hai dung dòch cố đònh Tris và NaCl 0,9% còn sống nhưng số lượng không
nhiều. Số lượng tinh trùng vận động ở dung dòch Tris là 6,7% và ở dung dòch NaCl là 5%.
Để giải thích điều này, theo tác giả dựa vào áp suất thẩm thấu của các dòch bảo
quản. Theo nghiên cứu về thành phần tinh dòch của Mongkonpunya và ctv., 1996 (trích bởi
Terrence R. Tiersch và Patricia M. Mazik, 2000), cho rằng, dung dòch cố đònh tinh trùng
nên điều chỉnh ở khoảng 300 mOsmol/kg để giữ cho tinh trùng sống lâu. Trong khi đó, áp
suất thẩm thấu của dung dòch Tris là 310 mosmol/kg, dung dòch NaCl 0,9% là 300
mosmol/kg. Hai áp suất thẩm thấu này làm cho chất lượng tinh trùng tốt. Còn áp suất thẩm
thấu của dung dòch HBSS là hơi thấp 286 mosmol/kg, và hơi cao ở dung dòch CF-HBSS là

320 mosmol/kg nên cho chất lượng tinh trùng không tốt.
b. Thời gian tinh trùng vận động
Song song với việc đánh giá % tinh trùng vận động, chúng tôi dùng đồng hồ bấm
giây để tính thời gian từ khi tinh trùng bắt đầu vận động đến khi tinh trùng ngừng hẳn. Kết
quả thu được ở bảng 18
Bảng 18
Thời gian tinh trùng vận động thay đổi theo thời gian bảo quản và dung
dòch cố đònh tinh trùng (đơn vò: giây)
Dung dòch cố đònh tinh trùng
Thời gian
Đối chứng
HBSS CF-HBSS TRIS NaCl
12 giờ 95,3
c
52,0
a
60,0
a
92,7
a
73,3
b
24 giờ 95,3
c
40,0
a
55,3
b
89,3
a

60,7
b
36 giờ 95,3
d
38,7
a
49,3
b
71,3
c
50,7
b
48 giờ 95,3
d
22,3
a
24,7
a
65,3
c
49,3
b
60 giờ 95,3
c
10,7
a
9,3
a
28,0
b

24,7
b
72 giờ 95,3
c
0,0
a
0,0
a
15,3
b
15,3
b
84 giờ 95,3
c
0,0
a
0,0
a
8,3
b
7,0
b

19
Các giá trò cùng hàng có cùng mẫu tự thì không có sự sai khác ở xác suất 95%
(P<0,05). Ngược lại, các giá trò cùng hàng không cùng mẫu tự thì có sự sai khác.
Kết quả bảng 4.18 cho thấy, thời gian tinh trùng vận động cũng giảm dần theo thời
gian bảo quản, và cũng thay đổi ở từng dung dòch cố đònh tinh trùng. Bởi vì các dung dòch
cố đònh làm tinh trùng bất động và giãm khả năng trao đổi chất nên tinh trùng vẫn hoạt
động hô hấp tiêu hao oxy và năng lượng ATP nên khi thời gian bảo quản tinh trùng kéo

dài thì chất lượng tinh trùng cũng giãm dần. Cụ thể, sau 12 giờ bảo quản thời gian vận
động của tinh trùng trong dung dòch Tris tương đương đối chứng và các dung dòch khác đều
cho thời gian vận động thấp hơn đối chứng. Sau 24 giờ bảo quản, thời gian tinh trùng vận
động ở dung dòch Tris là 89,3 giây, NaCl 0,9% là 60,7 giây đã giảm hơn so với đối chứng
là 95,3 giây. Thời gian tinh trùng vận động giảm càng nhiều hơn ở hai dung dòch cố đònh là
HBSS: 40 giây và CF-HBSS là 55,3 giây. Sau 48 giờ bảo quản, thời gian tinh trùng vận
động đã giảm nhiều hơn, ở dung dòch cố đònh Tris thời gian tinh trùng vận động là 65,3
giây, dung dòch cố đònh NaCl là 60,7 giây. Thời gian tinh trùng vận động ở dung dòch cố
đònh HBSS chỉ còn 22,3 giây và dung dòch cố đònh CF-HBSS là 24,7 giây. Sau 72 giờ bảo
quản thì tinh trùng bảo quản trong hai dung dòch cố đònh Tris và NaCl còn sống nhưng có
thời gian vận động rất ngắn là 15,3 giây.
Qua đó, cho thấy tinh trùng bảo quản trong hai dung dòch cố đònh Tris và NaCl có
thời gian vận động dài hơn tinh trùng bảo quản trong hai dung dòch cố đònh HBSS và CF-
HBSS.
c. Kiểu vận động tinh trùng (theo thang điểm đánh gía tinh trùng của Sanchez-
Rodiguez và Billard 1977)
Cùng lúc với việc đánh giá phần trăm tinh trùng và thời gian tinh trùng vận động,
chúng tôi quan sát kiểu tinh trùng vận động. Dựa vào thang đánh gía kiểu vận động tinh
trùng của Sanchez-Rodiguez và Billard (1975). Đây là chỉ tiêu rất quan trọng ảnh hưởng
đến khả năng tiếp xúc giữa tinh trùng và trứng. Qua đó chúng tôi có thể đánh giá được ảnh
hưởng của các chất cố đònh tinh trùng và thời gian bảo quản lên sự thay đổi ở kiểu vận
động tinh trùng. Kiểu vận động tinh trùng giãm dần theo thứ tự từ tinh trùng vận động
nhanh không thấy rỏ từng cá thể, rồi đến kiểu di động chậm, di động tại chổ và bất động.
Kết quả thu được ở bảng 19




20




Bảng 19 Kiểu vận động tinh trùng thay đổi theo từng dung dòch cố đònh tinh trùng và
thời gian bảo quản (đơn vò: điểm)
Dung dòch cố đònh tinh trùng
Thời gian
Đối chứng
HBSS CF-HBSS TRIS NaCl
12giờ 5,0
a
5,0
a
5,0
a
5,0
a
5,0
a
24 giờ 5,0
b
4,0
a
4,0
a
4,0
a
4,0
a
36 giờ 5,0
d

2,7
ab
2,3
a
3,7
c
3,3
bc
48 giờ 5,0
c
1,7
ab
1,3
a
2,3
a
2,3
b
60 giờ 5,0
d
0,7
ab
0,3
a
1,7
c
1,3
bc
72 giờ 5,0
c

0,0
a
0,0
a
1,3
b
1,0
b
84 giờ 5,0
c
0,0
a
0,0
a
1,0
b
1,0
b

Các giá trò cùng hàng có cùng mẫu tự thì không có sự sai khác ở xác suất 95%
(P<0,05). Ngược lại, các giá trò cùng hàng không cùng mẫu tự thì có sự sai khác.
Kết quả bảng 4.19 cho thấy, điểm đánh giá cho tinh trùng vận động được bảo quản
trong các dung dòch cố đònh thấp dần theo thời gian bảo quản. Sau 24 giờ bảo quản, điểm
đánh giá cho tinh trùng vận động trong các dung dòch cố đònh là 4 điểm thấp hơn điểm đối
chứng là 5 điểm. Sau 48 bảo quản, điểm đánh giá cho tinh trùng vận động trong các dung
dòch cố đònh thấp hơn cả điểm đánh giá cho tinh trùng vận động trong các dung dòch cố
đònh ở thời gian bảo quản 24 giờ, cụ thể là tinh trùng được giữ trong hai dung dòch cố đònh
Tris và NaCl được đánh giá ở điểm 2,3. Còn các dung dòch cố đònh HBSS được đánh giá ở
điểm 1,7 và CF-HBSS ở điểm 1,3. Và sau 72 giờ bảo quản thì tinh trùng trong hai dung
dòch cố đònh HBSS và CF-HBSS bò chết, còn điểm đánh giá cho tinh trùng vận động trong

dung dòch cố đònh Tris chỉ còn 1,3 điểm và NaCl còn 1 điểm.
Qua đó, theo tác giả nhận xét thấy ba chỉ tiêu theo dõi chất lượng tinh trùng được
giữ cố đònh trong các dung dòch cố đònh Tris, NaCl, HBSS, CF-HBSS, bảo quản theo thời
gian là phần trăm tinh trùng vận động, thời gian tinh trùng vận động và kiểu tinh trùng vận

21
động có liên quan tỉ lệ thuận với nhau và đều giảm dần theo thời gian bảo quản. Chất
lượng tinh trùng bảo quản trong dung dòch cố đònh Tris và NaCl tốt hơn chất lượng tinh
trùng bảo quản trong dung dòch cố đònh tinh trùng HBSS và CF-HBSS.
Để có thể kết luận được chính xác chất lượng tinh trùng bảo quản trong các dung
dòch cố đònh theo thời gian, chúng tôi còn kiểm tra tinh trùng này bằng các chỉ tiêu tiếp
theo là tỉ lệ thụ tinh, tỉ lệ nở, tỉ lệ sống và dò hình của cá Basa con theo thời gian bảo quản.
d. Tỉ lệ thụ tinh của tinh trùng
Cứ sau mỗi 24 giờ, theo tác giả lấy tinh trùng bảo quản trong các dung dòch cố đònh
tinh trùng Tris, NaCl, HBSS, CF-HBSS đem đi thụ tinh với trứng cá cái, thu được kết quả
về tỉ lệ thụ tinh ở bảng 20 như sau.
Bảng 20 Tỉ lệ thụ tinh của trứng với tinh trùng cá Basa bảo quản ngắn ngày
(đơn vò %)
Dung dòch cố đònh tinh trùng
Thời gian
Đối chứng
HBSS CF-HBSS TRIS NaCl
24giờ 76,2
b
58,5
a
65,1
a
78,8
b

76,8
b
48giờ 78,9
b
66,7
a
67,3
a
75,6
b
74,9
b
72giờ 91,6
c
0,0
a
0,0
a
42,6
b
32,5
b
Các giá trò cùng hàng có cùng mẫu tự thì không có sự sai khác ở xác suất 95%
(P<0,05). Ngược lại, các giá trò cùng hàng không cùng mẫu tự thì có sự sai khác.

Kết quả bảng 20 cho thấy, sau thời gian bảo quản 24 giờ và 48 giờ thì tỷ lệ thụ tinh
của tinh trùng trong hai dung dòch HBSS và CF-HBSS thấp hơn so với đối chứng. Ngược
lại, tỷ lệ thụ tinh của tinh trùng bảo quản trong hai dung dòch cố đònh Tris và NaCl tương
đương tỷ lệ thụ tinh của mẫu đối chứng. Khi thời gian bảo quản kéo dài đến 72 giờ đã làm
tỷ lệ thụ tinh của tinh trùng bảo quản trong dung dòch cố đònh Tris và NaCl giảm xuống

thấp hơn so với mẫu đối chứng là 91,6%. Trong đó, tỷ lệ thụ tinh của tinh trùng trong dung
dòch cố đònh Tris là 42,6% cao hơn tỷ lệ thụ tinh của tinh trùng trong dung dòch cố đònh
NaCl 0,9% là 32,5%, còn tỷ lệ thụ tinh của tinh trùng bảo quản trong hai dung dòch cố đònh
HBSS và CF-HBSS bằng không. Điều này có thể giải thích do dung dòch cố đònh Tris chứa
đồng thời nước muối sinh lý 0,9% và dung dòch đệmgiữ pH ở trung tính (pH=7), tạo môi
trường ổn đònh giúp cho tinh trùng bảo quản được ổn đònh hơn.


22




e. Tỷ lệ nở của trứng cá Basa ở thí nghiệm bảo quản tinh trùng ngắn
Chỉ tiêu được chúng tôi theo dõi tiếp theo sau tỷ lệ thụ tinh là tỷ lệ nở. Trứng cá
Basa thụ tinh sau 36 giờ sẽ nở ra cá con, chúng tôi dùng phương pháp đếm từng cá thể con
để tính được tỷ lệ nở, thu được kết quả ở bảng 21

Bảng 21
Tỷ lệ nở của trứng cá Basa bảo quản ngắn ngày (đơn vò %).

Dung dòch cố đònh tinh trùng
Thời gian
Đối chứng
HBSS CF-HBSS TRIS NaCl
24giờ 80,8
a
81,5
b
82,3

b
80,3
a
84,8
c
48giờ 80,1
a
79,7
a
81,1
a
83,3
ab
87,7
b
72giờ 78,0
d
0,0
a
0,0
a
64,1
c
51,2
b
Các giá trò cùng hàng có cùng mẫu tự thì không có sự sai khác ở xác suất 95%
(P<0,05). Ngược lại, các giá trò cùng hàng không cùng mẫu tự thì có sự sai khác.

Kết quả bảng 21 cho thấy, tỷ lệ nở của trứng với tinh trùng cá Basa bảo quản trong
các dung dòch cố đònh HBSS, CF-HBSS sau thời gian 24 giờ và 48 giờ tương đương với kết

quả của mẫu đối chứng, nhưng dung dòch Tris, NaCl 0,9% cho kết qủa tốt hơn. Tuy nhiên,
sau thời gian bảo quản tinh trùng kéo dài đến 72 giờ thì tỷ lệ nở đã giảm so với mẫu đối
chứng là 78%, cụ thể là ở hai dung dòch cố đònh HBSS và CF-HBSS tỷ lệ nở bằng không.
Tỷ lệ nở ở dung dòch cố đònh Tris là 64,1% cao hơn tỷ lệ nở ở dung dòch cố đònh NaCl là
51,2%.

Cuối cùng, chúng tôi xem xét đến tỷ lệ dò hình và tỷ lệ sống của cá Basa con để
kiểm tra xem tinh trùng bảo quản trong các dung dòch cố đònh Tris, NaCl, HBSS, CF-HBSS
có ảnh hưởng xấu lên cá Basa con hay không.

f. Tỷ lệ dò hình và tỷ lệ sống của cá Basa con ở thí nghiệm bảo quản tinh trùng
ngắn ngày


23
theo như tác giả kiểm tra tỷ lệ sống của cá Basa con sau 12 giờ kể từ khi trứng cá
Basa nở hoàn toàn. Kết quả thu được ở bảng 22






Bảng 22 Tỷ lệ sống của cá Basa con ở thí nghiệm bảo quản tinh trùng ngắn ngày
(đơn vò %).

Dung dòch cố đònh tinh trùng
Thời gian
Đối chứng
HBSS CF-HBSS TRIS NaCl

24giờ 99,0
ab
99,0
ab
98,1
a
99,0
ab
99,35
b
48giờ 99,2
a
99,4
a
99,0
a
99,5
a
99,4
a
72giờ 98,7
b
0,0
a
0,0
a
98,5
b
99,5
b

Các giá trò cùng hàng có cùng mẫu tự thì không có sự sai khác ở xác suất 95%
(P<0,05). Ngược lại, các giá trò cùng hàng không cùng mẫu tự thì có sự sai khác.

Tỷ lệ dò hình của cá Basa con được chúng tôi kiểm tra ngay sau khi trứng cá Basa nở
hoàn toàn bằng cách đếm từng cá thể thu được kết quả ở bảng 23

Bảng 23 Tỷ lệ dò hình của cá Basa con ở thí nghiệm bảo quản tinh trùng ngắn ngày
(đơn vò %).

Dung dòch cố đònh tinh trùng
Thời gian
Đối chứng
HBSS CF-HBSS TRIS NaCl
24giờ 0,8
ab
2,5
b
0,9
ab
0,0
a
0,3
ab
48giờ 0,4
ab
0,0
a
1,3
b
0,4

ab
0,0
a
72giờ 1,6
b
0,0
a
0,0
a
0,9
ab
0,4
ab

24
Các giá trò cùng hàng có cùng mẫu tự thì không có sự sai khác ở xác suất 95%
(P<0,05). Ngược lại, các giá trò cùng hàng không cùng mẫu tự thì có sự sai khác.

Kết quả bảng 22 và bảng 23 cho thấy không có sự khác biệt lớn trong tỷ lệ sống và
tỷ lệ dò hình của các cá thể trong mẫu thí nghiệm với mẫu đối chứng khi tinh trùng bảo
quản trong các dung dòch và thời gian bảo quản kéo dài đến 48 giờ. Điều đó cho thấy tinh
trùng bảo quản trong các dung dòch cố đònh Tris, NaCl, HBSS, CF-HBSS không ảnh hưởng
xấu đến cá Basa con khi tinh trùng được bảo quản đến 48 giờ. Tuy nhiên, đến 72 giờ hai
dung dòch HBSS và CF-HBSS cho tỷ lệ sống bằng không, trong khi dung dòch Tris và NaCl
cho kết qủa tương tương đối chứng.
Qua các chỉ tiêu đánh giá chất lượng tinh trùng bảo quản trong các dung dòch cố đònh
trên. Chúng tôi nhận thấy, ở kết quả thí nghiệm bảo quản tinh trùng ngắn ngày thì chất
lượng của tinh trùng bảo quản trong dung dòch cố đònh Tris cho kết quả tốt nhất so với các
dung dòch cố đònh khác, tỷ lệ thụ tinh, nở và sống của cá bột từ tinh trùng bảo quản hai
ngày không khác với đối chứng.

Điều đó cho thấy là dung dòch cố đònh Tris có một áp suất thẩm thấu và hệ đệm
thích hợp với tinh trùng hơn các dung dòch khác.
2. Phương pháp bảo quản bằng nitơ lỏng cho tinh trùng cá Basa
Dựa trên nền tảng thí nghiệm thí nghiệm bảo quản tinh trùng cá tra dài ngày vừa
được chúng tôi tiến hành. Tác giả chọn ra những nghiệm thức có kết quả chất lượng tinh
trùng tốt nhất để tiến hành thí nghiệm bảo quản tinh trùng cá Basa dài ngày. Thí nghiệm
bảo quản tinh trùng cá Basa dài ngày dùng hai dung dòch làm bất động tinh trùng là Tris
và CF-HBSS với ba chất bảo vệ là DMSO, glycerol và methanol ở bốn nồng độ khác nhau
là 5%, 10%, 15%, 20%, dùng một tốc độ hạ nhiệt là 5
0
C/phút. Sau thời gian bảo quản
trong nitơ lõng một tháng, chúng tôi tiến hành kiểm tra kết qủa.
a. Chất lượng tinh trùng cá basa ở chất bảo vệ DMSO.
Do điều kiện thí nghiệm, tác giả chỉ tiến hành đánh giá chất lượng tinh trùng dựa
trên ba chỉ tiêu: phần trăm, thời gian và kiểu tinh trùng vận động, kết qủa thụ tinh với tinh
trùng bảo quản không không thể tiến hành do sau khi bảo quản đã cuối mùa vụ nên không
có cá cái thành thục. Đối với chất bảo vệ DMSO chúng tôi cũng dùng phương pháp đánh
gía sự sống và hoạt động của tinh trùng như ở thí nghiệm ngắn ngày và thu được kết quả
như sau.

Bảng 24
Chất lượng tinh trùng với chất bảo vệ DMSO trong thí nghiệm bảo quản
tinh trùng cá Basa dài ngày

Dung dòch cố đònh tinh trùng
Nồng độ
DMSO
Đối chứng
TRIS CF-HBSS


25

VĐ TG Đ VĐ TG Đ VĐ TG Đ
5% 85,0
b
94,0
c
5,0
b
35,0
a
67,0
b
3,0
a
30,0
a
55,0
a
3,0
a
10% 85,0
b
94,0
b
5,0
c
30,0
a
53,0

a
2,0
a
37,5
a
57,0
a
3,0
b
15% 85,0
b
94,0
b
5,0
b
17,5
a
56,0
a
2,0
a
15,0
a
44,0
a
2,0
a
20% 85,0
b
94,0

b
5,0
b
12,5
a
53,5
a
2,0
a
10,0
a
42,0
a
2,0
a
Các giá trò cùng hàng có cùng mẫu tự thì không có sự sai khác ở xác suất 95%
(P<0,05). Ngược lại, các giá trò cùng hàng không cùng mẫu tự thì có sự sai khác.
Ghi chú
VĐ: là phần trăm tinh trùng vận động (đơn vò %).
TG: thời gian tinh trùng vận động, tính bằng giây.
Đ: kiểu tinh trùng vận động (theo thang điểm đánh gía tinh trùng của Sanchez-Rodiguez và
Billard 1975)
.
Kết quả bảng 24 cho thấy, chất lượng tinh trùng bảo quản ở tất cả các nồng độ của
chất bảo vệ DMSO ( 5%, 10%, 15%, 20% ) ở cả hai dung dòch cố đònh tinh trùng là Tris và
CF-HBSS đều thấp hơn so với chất lượng tinh trùng ở mẫu đối chứng. Xét riêng từng nồng
độ của chất bảo vệ DMSO, chúng tôi nhận thấy chất lượng tinh trùng trong dung dòch cố
đònh Tris ở hai nồng độ chất bảo vệ DMSO 5% và 10% cho kết quả tốt nhất. Cụ thể ở
nồng độ DMSO 5% thì phần trăm tinh trùng vận động là 35%, thời gian là 67 giây và có
điểm 3 (gồm ba chuyển động: nhanh, chậm và không chuyển động), nồng độ DMSO 10%

thì số lượng tinh trùng vận động là 30% với thời gian là 53,6 giây có điểm 2 (vài tinh trùng
chuyển động nhanh, vài tinh trùng chuyển động chậm và đa số không chuyển động). Đối
với chất cố đònh CF-HBSS, thì chất lượng tinh trùng cũng tốt nhất ở hai nồng độ DMSO
5% và 10%. Kết quả cho thấy ở nồng độ DMSO 5% thì số lượng tinh trùng vận động là
30%, thời gian vận động là 55 giây đạt điểm 3. Nồng độ DMSO 10% số lượng tinh trùng
vận động là 37,5%, thời gian vận động là 57 giây đạt điểm 3. Khi nồng độ DMSO tăng lên
15% và 20% thì chất lượng tinh trùng giảm thấp rõ rệt ở cả hai dung dòch cố đònh Tris và
CF-HBSS. Xét giữa hai dung dòch cố đònh Tris và CF-HBSS thì thấy chất lượng tinh trùng
ở dung dòch Tris tốt hơn.

Qua đó, cho thấy khi nồng độ DMSO tăng thì chất lượng tinh trùng giảm chứng tỏ
là khi nồng độ DMSO cao đã gây độc cho tinh trùng và nồng độ DMSO 5% và 10% là
thích hợp với tinh trùng.

b. Chất lượng tinh trùng cá Basa ở chất bảo vệ Glycerol