2.3.6.
BỆNH DO HERPESVIRUS Ở CÁ CHÉP KOI
(KOI HERPESVIRUS DISEASE)
1. Phạm vi
Bnh do herpesvirus  cá chép koi (KHVD) là bnh nhim herpesvirus (18) có kh 
gây nhim virus huyt cng (carp: Cyprinus carpio) và các bin th 
cá chép koi (koi carp) và cá chép ma (ghost carp) (16).
2. Thông tin về bệnh
2.1. Các yếu tố thuộc về tác nhân gây bệnh
2.1.1. Tác nhân sinh bệnh học (aetiological agent), các dòng (strains) tác nhân gây bệnh
Tác nhân sinh bnh hc là koi herpesvirus (KHV) thuc h Herpesviridae (18, 45) mc dù virus
        n k và hoi t mang th ca cá chép (carp interstitial
nephritis and gill necrosis virus  CNGV) (20, 30). Waltzek và cng s (42) ng ch
giúp phân lot tên là cyprinid herpesvirus 3 (CyHV-3), kèm theo
danh pháp ca các cyprinid herpesvirus khác: CyHP-u cá chép [carp pox virus], virus
n sn  cá [fish papilloma virus]) và CyHV-2 (virus gây hoi t h thng to huyt ca
cá vàng [goldfish haematopoietic necrosis]). Các phân tích kt chui ca phn gen di truy
cho thy rng KHV có liên quan gn vi CyHV-1 và CyHV-2, và có liên quan xa vi virus cá da
c ngt (Ictalurid herpesvirus: IvHV-1) và Ranid (ch) herpesvirus (RaHV-1) (42). G,
Aoki và cng s   kt chui gen di truyn ca KHV và nhn di gen
mã hóa các protein. H ch ra rng 15 gen cng vi các gen trong IcHV-1, xác
nh xut xp KHV vào h Herpesviridae. c tính g gen di truyn ca KHV bin
thiên t ít nhc này gc xác nhn là
295 kbp (2, 42). c tính v c ca hg có khác nhau. V bao ht
nhân (nucleocapsid) cm âm (negative-ng
kính 103  c bao quanh bi v bao ngoài (envelope) (18, 20, 40). V bao ht nhân
cc ct lát mng (thin-sectionedng kính là 7884, 80110 và 110
120 nm (5, 6, 18, 28).
So sánh các di truyn ca các dòng KHV phân lc t a lý khác nhau, bng các
phân tích gii hn enzyme (restriction enzyme analysis) (12, 16) hay bng các phân tích kt chui

y di truyn ca các dòng KHV này thc t là ging nhau. Ging vy, các
polypeptides ca các dòng KHV phân lc t  nhau,
mc dù mt dòng phân lc t Israel có thêm hai polypeptide (11, 12). Aoki và cng s (2) 
 kt chui di truyn ca ba dòng KHV phân lc t Nht Bn, Israel và M.
Các di truyn này cho thy rt ging nhau  m kt chui, vi dòng ca Israel và M thì gn
i dòng ca Nht Bnc gic sinh ra t hai nhánh
(lineage) là nhánh Nht Bn và nhánh Israel-M, vn có ngun gc chung.
2.1.2. Sống sót bên ngoài ký chủ
Các nghiên cu  Israel cho thy rng KHV vn còn ho  c trong ít nht 4 gi,
n 24 gi,  nhi c là 23  25
o
C (28). Các nghiên cu  Nht
Bn cho thy có gim nhiu v hiu giá gây nhim ca KHV trong vòng 3 ngày trong các mu
ng và bùn lng (sediment)  15
o
C. Tuy nhiên, kh y nhim vn > 7
 trong các m c x lý tit trùng bng hp autoclave
:

hay qua lc (35). Nghiên cng chi vi s hin din ca các dòng vi
khung kháng virus. Gn thy DNA
ca KHV trong các mc sông  nhi 9  11
o
c khi xy ra mt  dch
KHVD trong mt con sông (17). Tuy nhiên, s tn ti ca virus có th c tr giúp bi s hin
din cng vt làm trung gian truyn lây và vic phát hin DNA có th không luôn là ch th
v s hin din ca virus gây bnh.
2.1.3. Tính bền bỉ của tác nhân gây bệnh
Virus b bt hot bi bc x UV và nhi trên 50
o

C trong 1 phút. Các ch
iu qu  làm bt hot virus: iodophor  200 mg lít
1
trong 20 phút, benzalkonium chloride
 60 mg lít
1
trong 20 phút, ethyl alcohol  30% trong 20 phút và sodium hypochlorite  200 mg lít

1
trong 30 giây, tt c u  15°C (22).
2.1.4. Vòng đời
Các báo u tra gy rng mang th ng vào ch yu ca virus trong cá
chép (9, 13, 24, 29). Tuy nhiên, mt thc nghim gng minh da ph ngoài các
vây cng vào chính ca KHV (7). Sau khi xâm nhp, virus phân tán t mang th
n các ni tn thy s ng nhiu DNA ca KHV trong các mô thn,
lách, gan và rut (9, 29). S lp ghép và to hình ca KHV trong các t bào b nhic mô
t là gi các herpesvirus khác. Mt kim tra siêu cu trúc cc gây nhim
thc nghing chng v các v bao hnh ln hoàn chc
lp ghép trong nhân và có s phát trin tip ca ha t bào b nhim
(24). S t cht nhày là bng chng rõ rn sm ca nhi
phát hin thy DNA ca KHV vi m cao trong các mu cht nhày cc gây
nhim thc nghing chn da trong sinh
bnh hc ca virus và da là v trí quan trng trong thi tit virus. S thi ting niu
  quan trng cho thi ting ADN cao
cc trong các mô ca rut và thn, và virus gây nhic
trong các mu phân thu thp t  nhim (9, 13).
2.2. Các yếu tố thuộc về ký chủ
2.2.1. Các loài ký chủ có mẫn cảm
Bnh nhim KHV xy ra trong t nhiên ch ghi nhng (Cyprinus carpio
carpio), cá chép koi (koi carp: Cyprinus carpio koi) và cá chép ma (ghost carp: Cyprinus carpio

goi), và xy ra  các lai ghép các loài cá này. Các lai ghép ca cá vàng (goldfish) x cá chép
ng, sinh ra t lai gic v là th hin kh
n ci vi bnh nhim KHV. mc dù t l t vong là thp (5%), khong 50% các cá lai
c kim tra vào 25 ngày sau khi tiêm xoang bng vi liu cao c
gen di truyn ca virus, theo phát hin bng phn ng chui phân t (polymerase chain reaction 
PCR) (19).
2.2.2. Các giai đoạn mẫn cảm của ký chủ
Tt c các nhóm tui ca cá, t cá thiu niên (juveniles) tr u th hin có mn cm vi
u kin thc nghim, cá t 2,5  6 g là có mn c
vi cá 230 g (28). Mt nghiên cu  Nht Bn cho thy rng u trùng (larvae) ca cá chép (3  4
ngày sau khi n tr i vi bnh nhia cá này s có t l
t vong 100% khi b m vi KHV vào 2 tháng sau (21).
2.2.3. Các loài hay tiểu quần thể có thiên hướng (khả năng phát hiện bệnh)
ng), là
có mn cp cho chn l phát hilà mng lai
có my mng hay cá chép hng (crucian carp) x chép
ng.
2.2.4. Các cơ quan mục tiêu và mô bị nhiễm
Mang th, thu nht trong tin trình ca bnh phát l
(13).
2.2.5. Bệnh nhiễm dai dẳng với các cá thể mang trùng suốt đời
 u kin t nhiên, các cá th sng sót vi KHVD là b
nhim dai dng vi virus, và nu có thì có hay không chúng thi tit virus bao lâu hay chún
gi virus bao lâu. Mt s nghi vc gây nhim thc nghim, 
y virus có th tn tng b nhim  nhi cho phép và sau
  nhi th
2.2.6. Các trung gian truyền lây (vectors)
c là trung gian vô sinh (abiotic) ch yng vt trung gian truy

vt dó liên quan trong quá trình truyn lây.

2.2.7. Các động vật thủy sinh đã biết hay có nghi ngờ mang trùng
c nuôi chung các loài cá khác trong các h th
y các du hiu bnh hay t vong trong các loài khác khi xy ra các 
du king (5, 18, 28, 38). Tuy nhiên, c li vi
phát hin  nh liu thc nghim t c cho thy có mn cm ca cá vàng và cá
trm c i vi KHV (15). Gn thy trong mô ca cá
vàng khe mnh sng chung vnh thc nghim vy  cá
vàng b m t nhiên trong các trn d nhiên do KHV  cá chép koi (10,
31). Cn có nghiên c nh virus tn tu
thêm nu cá mang trùng thi tit ra virus có kh ng. Tuy nhiên,  ng chng gia
y rng cá vàng có kh m i vi KHV. Ha, nu các phát
hin t c xác nhn, thì tt c các loài cá chép cyprinid s cc coi là có kh
i vi KHV.
2.3. Mô hình bệnh
2.3.1. Các cơ chế truyền lây
Kiu truyn lây ca KHV là truyn trng
gi là truyn nay không th b qua. Truyn lây ngang có th là trc tin
c là trung gian vô sinh chính. Các ngun tàng tr ca KHVD là cá b
nhim th hin lâm sàng và các mang trùng n cha virus trong cá nuôi nh hay hoang
c lc thi ting niu, mang th và cht nhày ci
u kin thc nghim, virus gây nhic thi tit liên tc trong thi gian dài  cá
 nhim, trong nhi 16
o
C, thi gian thi tit ra virus ng 23
o
C hay 28
o
C
(44). Tin trình bnh có th c bit  các nhi t 25
o


ch nhi i 23
o
C. Bnh có th xut hin trong 3 ngày sau khi cho cá khe mnh
vào mt h có cha cá b b 21 ngày mi phát
hin thy bnh l ra  
2.3.2. Lưu hành bệnh
 c công b v  các qun th hoang dã ln
a cá chép.  ng chng t các th nghim thc nghim v tn ti ca virus
c gây nhim  nhi c tàng tr  mt nhi thp
n 2.2.5). Tuy nhiên, trong các thc nghim khác  cùng mt nghiên
cu tra cho rng không có cá nào b nhim dai dng sau khi phát bnh do KHV.
Trong các nghiên cu khác, DNA cn thy trong cá chép không phát bnh, bi
phân tích PCR, trong nhi 13
o
C, và cho thy kh  nhim sng sót  các nhi
thp có th n tàng tr ca virus (13).
2.3.3. Phân bố địa lý
u v KHVD  c (5, 28), gii ha lý ca bnh tr nên lan
rng. Bn nhiu quc gia trên th gii, ch y
c hiu bit v bn bnh. Bnh hin nay xy ra,
hoc ghi nhn trong cá nhp khu vào,  ít nht 22 quc gia khác nhau.  Châu Âu bao
gm Austria, Belgium, Denmark, France, Italy, Luxembourg, The Netherlands, Poland, Switzerland
và Anh Quc (4, 8, 16, 33).  Châu Á, Trung Qu (40), Indonesia
(37), Japan (32), Hàn Quc (Rep. of) (6), Malaysia (16, 23, 25), Singapore ( cá nhp khu t
Malaysia) và Thái Lan ( cá nhp khu t c, 16).  (14, 18,
n din ca KHVD. n din trong nhiu quc gia khác,
 nhn din hay báo cáo.
2.3.4. Tỷ lệ tử vong (mortality) và tỷ lệ mắc bệnh (morbidity)
T l mc bnh ca các qun th b nhim có th là 100%, và t l t vong 70  80% (5, 41),

  l t vong có th  n 90 hay 100% (5, 40). Nhim ph và vy nhim vi khun
và/hoc nhing thy  cá chép b bnh và có th n t l t vong và
th hin ra các du hiu (16).
2.3.5. Các yếu tố môi trường
Các mô hình bnh b chi phi bi nhi c lc ca virus, la tui và tình trng sc khe
ca cá, m qun th và các yu t n chuy trng, chc
kém). Bnh là ph thuc vào nhi c, xy ra t n 25
o
C (8, 18, 28, 32, 39, 40). i
u kin thc nghim, b l t vong cao  28
o
 l t vong
không cao  29 hay 30
o
C (20, 27), ln  13
o
C (13). Tuy nhiên, DNA cc
trong cá bng PCR  13
o
C, và có th là cá b nhim sng sót  các nhi thp có th là các
ngun tàng tr cho virus 913).
2.4. Kiểm soát và phòng ngừa
m soát và phòng nga KHVD s ch yu là di
vi virus, kèm theo các thc hành v sinh tt và an toàn sinh hu này là có th  các trang
tri nh c cung cc t sui hay h ao và có mt h th a cá xâm
nhp trang trc thi thoát.
2.4.1. Sử dụng vaccin
Mt vaccin an toàn và hiu qu hin nay không sn có r      c
c s d chng nga cho cá chép và có bo h i vi th thách
bng virus (27, 30). Ch phm vaccin này có kích thích kháng th kháng v

dài bo h t. Vaccin này hic cp phép s dng tc s
dng rng rãi trong các trang tri nuôi cá chép khp quc gia này. Các kt qu nghiên cu  Nht
B hin rng vic cng ming mt loi vaccin da vào liposome có ch
làm bt hot là có hiu qu trong bo h i vi bnh nhim KHV (43).
2.4.2. Hóa trị liệu
Không áp dng.
2.4.3. Kích thích miễn dịch (immunostimulation)
Hin nay không có thông tin v s dng tác nhân kích thích min d kim
soát KHVD  c nghiên cc quan tâm.
2.4.4. Giống có đề kháng
 hin khác bit v  kháng vi KHVD trong các dòng cá chép khác nhau (34) và các
nghiên cy r kháng là theo la tui (28). Trong các nghiên cu gi
kháng, con cháu ca lai ging gia hai dòng cá chép thung vi mt dòng cá chép hoang dã
 nghim bng thc nghim hay gây nhim t nhiên. T l sng sót thp nht
kho l sng sót c kháng nht 61  64% (34).
2.4.5. Tái đàn với các loài có đề kháng
Các  dch t nhiên c c
i, bao gm cá chép bc (silver carp: Hypophthalmichthys molitrix), cá trm c
(grass carp: Ctenopharyngodon idella), u to (bighead carp: Aristichthys nobilis). Các
 c nuôi l
du hiu bnh hay t vong nào quan sát thy trong các loài này, k c u kin 
hay sau khi thc nghim sng chung vi cá b bnh, m trc tip vi virus (27,
33, 37, 38). Các lai ghép c hin là kh m
 a các tn tht ln bi KHVD. Các nghiên cu trên mt qun th lai ghép ca cá
ng cho th kháng vi KHVD (19). Các lai ghép này th hin
phát trin nhanh chóng và có th hin hình thái ging nht vi th h cha m. Tuy nhiên, DNA ca
n thy bng PCR trong các cá lai sng sót, cho thy rng chúng có kh 
mani vi virus (19).
2.4.6. Các tác nhân chặn đứng bệnh (blocking agents)
Không áp dng.

2.4.7. Sát trùng trứng và ấu trùng
Vic sát trùng trng có th c bng x lý v hin là b bt hot bi
iodophor  200 mg lít
-1
trong 30 giây  15
o
C (22).
2.4.8. Các thực hành chăn nuôi thông thường
Các bin pháp an toàn sinh hc s bao gm bo rng cá m là t các ngun sch
bnh và thit lp h thng cách ly mà cá mi nhp có th i cá ch m (sentinel)
 các nhi  phát hic cách ly trong ti thiu 4
tuc khi chuyn v  nhp chung vi cá trong trang
tri. Các bin pháp v sinh trong trang ti s  c khuyên áp di vi SVC và
bao gm sát trùng trng xuyên sát trùng h nuôi, sát trùng bng hóa cht cho thit b
trang tri, qun lý cá cn th tránh stress và tiêu hi vi cá cht.
3. Lấy mẫu
3.1. Chọn lựa các cá thể lấy mẫu
Tt c các nhóm tui cu th hin mn cm vi KHVD, tuy nhiên, cá non tu
ng có mn ci vi bc khuyên cho ly mu. Tính
thích hp ca các m  c chn trong mt  dch nghi ng KHVD s tùy thuc vào xét
nghim chc áp dng. Cá chép hp hi hay mi cht th hin các du hiu lâm sàng
n hình ca bnh là thích hp cho xét nghim bi hu ht các xét nghic mô t trong
n 4. Các xác cá th hin các du hiu v phân hy mô có th ch thích h
pháp da vào PCR. Ging vy, các mu thu thp t cá th hin khe mnh, trong mt qun th có
nghi ng bnh, có th ch xét nghic mt cách tin cy ba vào PCR
nh
3.2. Bảo quản các mẫu để gởi đi
Cá nguyên con s c gn phòng thí nghim còn sng hay git cht
trong các vt chc niêm kín. Tuy nhiên, thích hp nht và khuyên rng nên thu thp
các m c chn t sn xut cá. Cá nguyên con

hay các m c gn phòng thí nghim trong các vt cha làm lp
i vi cá hay ph tng thu thp làm mu. Tuy nhiên, nu ch nhn
c mu cá hay ph tnh, thì các mu này ch thích h
nghim da vào PCR. Các mu nh c c go qun bng alcohol
  xét nghim ba vào PCR.
3.3. Gom chung (pooling) các mẫu
Khi xét nghim cá bnh lâm sàng ba vào PCR, c bit nu có c gng
 phân lp virus, nên tránh gom chung các mu hay ch gii hn ti mu
gom. Vi xét nghi giam sát sc khe ba vào PCR, mu gom chung
s gii hn tron ti mu gom.
3.4. Các cơ quan hay mô tốt nhất
Khi xét nghim cá b bnh lâm sàng ba vào PCR, c bit nu có c
g phân lp virus, khuyên rng nên ly mu  các mô ca mang th, thn và lách. Virus có
nhiu nht trong các mô này trong quá trình bnh bc l (13). Khi xét nghim cá nhim bnh cn
lâm sàng, có biu hin khe mnh, ba vào PCR, khuyên r
gm rut và não trong mu thu thp.
3.5. Các mẫu/mô không thích hợp
Xác cá cht th hin du hiu rt tin trin ca phân hy có th không thích hi vi bt k
m nào.
4. Các phương pháp chẩn đoán
Ch KHVD trong cá bnh lâm sàng có th c bng nhip
bng t bào nuôi cho KHV hic coi là nha vào
 phát hin DNA ca KHV. Virus ch phân lc trên mt s loi t bào nuôi và các loi
t bào nuôi này khó qun lý. Kt qu là vic phân lp virus trong t bào nuôi là phn
i vn dch hc, gi
pháp áp dng cho chnh nhim virus huyt mùa xuân  cá chép (spring viraemia of carp
 m min dch hunh quang [immunofluorescence  IF] hay xét nghim
phân tích hp ph min dch kt hp enzyme [enzyme-linked immunosorbent assay  ELISA]), có
th thích hp cho nhn din nhanh và ch      c báo cáo, so
n hin nay, do các xét nghin có, chn

 KHVD s ch da vào ch mt kim tra mà có kt hp cn ba xét nghim (16).
4.1. Các phương pháp chẩn đoán thực địa
4.1.1. Các dấu hiệu lâm sàng
Trong mt  dch KHVD   t cá t l t vong trong qun th. Tt
c các nhóm la tui cu th hin có mn cm vu kin thc
nghii thì mn ci vi bnh. Trong kim tra k i vi
cá th cá, các du hiin hình bao gm bi ng   có cu trúc xù
xì, biu bì tróc ra tm hay tng mng, cht nhày sinh ra quá nhiu hay quá ít trên da và
mang th, bin màu nh   mang th. Các du hi i th khác bao gm lõm mt
(enophthalmia: mt huyt trên da và gc các vây, và loét  vây.
4.1.2. Các biến đổi tập tính
Cá tr nên l , tách ra khi bc chy vào hay các thành h nuôi và
ngáp th  mc. Mt s cá có th gp phi m ng và m  
 th hin các du hiu cng vng.
4.2. Các phương pháp lâm sàng
4.2.1. Bệnh tích đại thể (gross pathology)
 i th là bnh tích hc (pathognomonic lession). Kt lun chn
 phi ch n khi phát hin DNA ca virus hay phân lp ra virus và nhn din. Tuy nhiên,
bi th thc cht nht là thy  mang th và có th khác nhau v m, t các mng
hoi t nhn bin màu lan rng, hoi t nng n và viêm. Kim tra thêm có th phát hin
loét  phip ca mang th, tan chy  phin th c các chót ca phin mang
th p và th cp. Các bnh tích bên trong khác là có v ng không có
ng hp t t ngt. Các bnh i th c báo cáo bao gm viêm
dính trong xoang bng vi có hay không màu bng c
n hay gan có th  th him xut huyt
(petechial haemorrhagic). S hin din ca các bi th  phc tp thêm do cá
chc bit là  ng, mà cùng b nhim bi các ngoArgulus sp.,
Chilodonella sp., Cryptobia sp., Dactylogyrus sp., Gyrodactylus sp., Ichthyobodo sp.,
Ichthyophthirius sp., Trichodina sp., và các monogeneans khác  mang thu loài vi
khuc bit là Flavobacterium columnare  các nhi c 

4.2.2. Hóa chất dùng trong lâm sàng (clinical chemistry)
Không có thông tin.
4.2.3. Bệnh tích vi thể (microscopic pathology)
Mô bnh hc (histophathology) ca bnh có th c hiu và bii
t  các mang th     m thc cht. Mang th   hi  
(hyperplasia) và teo (hypertrophy)  biu bì ca mang cá, và có th thy có tan chy ca phin
mang th th cp (secondary lamellae) và kt dính ca các si mang th (gill filaments). Hoi t
mang th, gii hn t các vùng nh hoi t ca các t bào biu bì ca phin mang th th cp
n hoàn toàn mn mang th. Các t bào biu bì ca mang cá và các t bào bch cu
(leucocytes) có th có ch ym sc th dch ra vi cho ra du
y có các th vùi ni nhân nht màu ri rác. Viêm, hoi t và các th vùi trong nhân
c bit là thn,
y tng, gan, não, rut và biu bì vùng ming.
4.2.4. Tiêu bản ướt (wet mounts)
Không áp dng.
4.2.5. Tiêu bản khô (smears)
n dic trong các mu ép (imprint) t gan, thn và não ca cá b nhim, qua xét
nghim min dch hunh quang (immunofluorescence  IF). Các m cao ca IF thy  thn và
virus có th phát hic bng IF trong mu ép ca thn vào 1 ngày sau khi gây nhim (29, 34).
4.2.6. Soi kính hiển vi điện tử (electron microscopy)/bệnh tích tế bào (cytopathology)
Vic phát hin các ht virus bng kính hin vi chuyn t (transmission electron microscopy 
i vi các mô ca cá chép bnh y. Các
mnh mô ca mang và thc c nh trong glutaraldehyde s c ly mu t cá chép b
nhim nng n (> 10
6
ht virus). Các kt qu tt nhc t ly mu mt s cá trong mt
qun th b nhim  n khác nhau ca bnh nhimm bo rng
mt s mu mô là ly t các cá th b nhim nng n.
4.3. Các phương pháp phát hiện và nhận diện tác nhân gây bệnh
n này, không phi tt c c th hin thành chi tit vì  

n và nhn din KHV. Trong
ng hp này, s có mt mô t ngn v       c công b. Các
khuyn cáo v  da vào xét nghim thêm  liu có thêm t các
phòng thí nghi quynh r
hp vi m
4.3.1. Các phương pháp phát hiện trực tiếp
c trong các ma gan, thn và não ca cá bnh,
bng min dch hunh quang (IF). Các m cao ca IF thy  thn và virus có th phát hin
c bng IF trên ma thn vào 1 ngày sau khi b nhim (29, 34). Kháng nguyên ca
c trong các mô b nhim bm min dch ô xy
hóa (immunoperoxidase staining). Kháng nguyên cc lúc 2 ngày sau khi
b nhim  thy  mang th và gan (29). Tuy nhiên, vic phát hin KHV
bng nhum màu min dch (immunostaining) phc din gii cn thn, do các t bào nhum
 là kt qu ca phn ng chéo vi virus có huyt thanh hc có liên quan
-1) hay mt protein không phi ca virus (29). Mn trc tip
KHV t m   a thn, bng xét nghim kháng th hunh quang gián tip (indirect
fluorescent antibody test  c mô t chi ti
a vào ELISA cho phát hin trc tip kháng nguyên ca KHV trong các mô b
nhi c phát trin trong mt s phòng thí nghim trên th gi 
      c công b rng rãi. Hi      
 c phát trin   phát hin KHV trong cht tit ca cá (phân)
(9).
c áp dng ph bin nht cho phát hin KHV mt cách trc tip trong các mô
ca cá là áp dng các xét nghim phân tích dc hii vi KHV.
4.3.1.1. Các phương pháp dùng kính hiển vi (microscopic methods)
4.3.1.1.1. Tiêu bản ướt (wet mounts)
Không áp dng.
4.3.1.1.2. Tiêu bản khô (smears)/mẫu ép tươi (imprints)
4.3.1.1.2.1. Xét nghiệm kháng thể huỳnh quang gián tiếp trên mẫu ép tươi của thận
i) Ly huyt hoàn toàn cho cá.

ii) To ma thn trên các phin kính sch hay  a các ging ca phin plastic
dùng nuôi t bào.
iii)  m
iv) Ra mt ln vi dch mum phosphate 0,01 M (phosphate buffered saline  PBS), pH 7,2,
a nhanh ba ln vi acetone lnh (bo qun  -20
o
C) cho các phin kính hay dùng hn
hp c -20
o
C, cho các phin plastic.
 hp cht làm c nh này phn ng trong 15 phút. Mt th tích 0,5 ml/2 cm
2
gi cho
các mu ép trong phin plastic nuôi t bào.
 các m nh này khô trong không khí trong ít nht 30 phút và x lý ngay hay bo
qunh  -20
o
C.
vii) Tái hc cho các mu ép bng bc ra vi dung dch PBS 0,01 M, pH 7,2, có cha
 b hoàn toàn dm này sau ln ra cui cùng.
viii) Chun b mt dung dch ca kháng th c hay huyt thanh kháng KHV pha trong PBS
0,01 M, pH 7,2, có cha 0,05% Tween 20 (PBST),   pha loãng thích hc pha
c pha sn t nhà cung cp).
ix) Kt khi (block) vi 5% sa tách béo hay 1% albumin huyt thanh bò, pha trong PBST trong 30
phút  37
o
C.
x) Ra bn ln bng PBST.
xi) X lý các mu ép bng dung dch kháng th n b t c viii) trong 1 gi  37
o

C trong
bung m  xy ra bt th tích là 0,25 ml/2 cm
2
mi gi cho mu ép
trong các phin plastic nuôi t bào.
xii) Ra bn ln vi PBST.
xiii) X lý các mu ép trong 1 gi  37
o
C vi dung dch ca hp cht kháng th kháng globulin
min dch (kháng vi kháng th   dng    c kt hp vi fluorescein
isothiocyanate (FITC) và chun b ng dn ca nhà sn xut. Các kháng th kt hp vi
ng là kháng th t th hay t dê.
xiv) Ra bn ln vi PBST.
xv) Cho PBS vào  0,5 ml/2 cm
2
mi gi x lý các mu ép trong phin plsatic và kim tra
y lên các phin kính bng lam kính (cover-slip) cùng vi glycerol saline có pH 8,5
c khi quan sát bng kính hin vi.
xvi) Kii tia UV, s dng kính hin vi vi th kính x 10 và vt kính x 20  40, có kh
hi t lt là > 0.65 và > 1,3. Phi ch cho ra các kt
qua mong mun  so sánh vi mi quan sát khác.
4.3.1.1.3. Các lát cắt đã cố định
  c mô t tro       p cho phát hin kháng
nguyên ca KHV trong các lát c  m nh  c c nh trong 10%
  m trung hòa (neutral buffered formalin  NBF). Tuy nhiên, các lát c  
  c tái h c trong PBS, có th cn ph c x    bt l kháng
nguyên mà có th b che lp bi quá trình làm c nh mô. Mt x ng là  các lát ct
vi 0,1% trypsin pha vi PBS  37
o
C trong 30 phút. a các lát ct trong PBS lc

khi tic viii  n 4.3.1.1.2 nêu trên.
 phát hin trc tip kháng nguyên virus bng IFAT hay hóa min dch mô bào, các mô
s c c nh trong 24  48 gi t làm c c thay th bng
 bo qun lâu dài.
4.3.1.2. Phát hiện, phân lập và nhận diện tác nhân gây bệnh
4.3.1.2.1. Tế bào nuôi cấy
Chnh lâm sàng có th thc hic bng phân lp virus trong t bào
nuôi. Tuy nhiên, virus ch phân lc gi hn trong mt s loi t bào nuôi và các t bào này
có th y, phân lp bng t bào nuôi thì không nha
c công b phát hin DNa ca virus, nên nuôi cy phân lc cho là
i vi KHVD (16).
Các lớp tế bào nuôi (cell line) sẽ sử dụng: KF-1 hay CCB
Chiết xuất ra virus
Áp dc mô t n A.2.2.2.
Cấy gây nhiễm (inoculation) vào các đơn lớp tế bào
c khi cy gây nhim cho t bào nuôi, các huyn d c
x lý vi các chn A.2.2.1 và A.2.2.2.
ii) Nng t bào (cytotoxic effect) quan sát thy sau khi cy vào huyn d
c x lý cht kháng sinh, thì lc ít nht 1 ml dch phù ni ca huyn d  c
cellulose acetate c 0,45 µm (hay lc c  có màng ít kt bám protein).
 cy trc tip, chuyn mt th tích thích hp huyn d c lên
các lp t c 24  48 gi trong các bình nuôi flask hay các phin nhiu ging. Cy
vào ít nht 5 cm
2
ca lp t bào vi 100 µl dch phù nc. Cách khác, t pha loãng
gi ln ca dch phù ni qua lc pha vng nuôi t m  pH 7,6 và
c b sung 2% huyt thanh phôi bê (fetal calf serum   hp ph trong 0,5  1 gi 
18  22
o
 dch cy, thêm vào mt th tích thích hng nuôi t bào

(1  1,5 ml/5 cm
2
cho bình nuôi flask), và   n 25
o
C.
 dng các phin nhiu ging,  i khí quyn CO
2
s c pH trong quá
trình .
Theo dõi quá trình ủ cấy
i) Theo dõi tin trình gây nhii chtính và các t bào nuôi cy khác bng
kim tra hàng ngày vi kính hin vi   i x 40  100 trong 14 ngày. Khuyên nên s dng
kính hin vi phn quang (phase-contrast microscope).
ii) Duy trì pH cng nuôi t bào  t n 7,6 trong quá trình  cu này có th
c bng nuôi t bào dng
  m (HEPES-buffered medium: HEPES = N-2-hydroxyethyl-piperazine-N-2-
ethanesulfonic acid) cho các bình nuôi cy flask có ny kín.
iii) Nu xut hin ng gây bnh tích t bào (cytopathic effect  CPE) trong các m cy này vi
 pha loãng ca dch phù nn din s c tin hành ngay (xem

iv) Nu không phát trin CPE trong các m cy (mc dù có tin tring trong các
i chng có virus), cy truyn tip các m cy trong 14 ngày. Ni chng không phát
tric CPE, xét nghim phc lp li vi các lp t bào mi có mn cm vi các lô mi
ca mu.
Phương pháp cấy truyền tiếp (subcultivation)
i) Chuyng dch cng nuôi t bào t tt c các m cc cy bng dch
phù ni ca huyn dch mu, lên các lp t bào nuôi mi.
ii) Cy vào các lp t   n 4.3.1.2.1 phc iii.
iii)   n 4.3.1.2.1 phn trên.
Nu không phát hin thy CPE, xét nghim có th tuyên b là âm tính.

Nhận diện để xác nhận (confirmatory identification)
y nht cho xác nhn nhn din ca mt CPE là b
tích kt chui ca sn phc khuyên áp d nhn din
KHV là gic khuyên áp dng cho phát hin trc tip trong mô ca cá
 xác nhn cui cùng, các sn phm c
c nhn din là có ngun gc t KHV bng các phân tích kt chui
.
Xác nhận bằng PCR
i) Chit xut DNA t dch phù ni ca m t bào cy virus, s dng b kit chit xut DNA thích
hp. Mt thí d cho chit xut DNA, áp dt xut da vào mui (tác nhân
DNAzol® reagentc mô t n 4.3.1.2.3.1.
ii) DNA chit xui bng các giao th i
n 4.3.1.3.1.1. Các sn ph c hin th
c phân tích kt chuc mô t n 4.3.1.2.3.
4.3.1.2.2 Các phương pháp phát hiện kháng nguyên dựa vào kháng thể
a vào xét nghim phân tích hp ph min dch kt hp enzyme (enzyme-
linked immunosorbent assay   phát hin trc tip kháng nguyên ca KHV trong các mô
b nhin  mt s phòng thí nghi
th thích hp cho xác nhn nhn din v KHV. Hin nay, mc công
b hin sc phát trin   phát hin KHV trong cht tit ca cá (phân cá)
(9).
n din virus mà da vào to nên t bào nuôi cy b nhi
nghim IFAT, min dch ô xy hóa [immunoperoxidase] và trung hòa huyt thanh [serum
c khuyên áp du này là do virus phát trin chm và không
chun xác trong các t bào nuôi cy.
4.3.1.2.3. Các phương pháp phân tử
Vt ln (single-c công b, chi tit v các giao thc
c coi là nhy nht cho phát hin DNA ca KHV trong các m
t cá chép bnh lâm sàng. Các giao thc này có th  phát hin các m cn lâm sàng
(subclinical) c nht s dng b n mc phát

trin bi Bercovier và cng s  Hebrew University-Hadassah Medical School ca Israel (3).
 c phát trin bi Yuasa và cng s  Vin nghiên cu Quc gia v Thy
sn (National Research Institute of Aquaculture  NRIA), Watarai, Mie, Nht Bn (45) và là mt ci
tin t giao thc phát trin và công b ca Gray và cng s (14). Nu mu mô th hin
bng chng phân hy thì nên s dng các b n mi nhn các vùng nga gen di
truy n mc phát trin bi Hutoran và cng s (20). Cách khác, các b
n mi m rng có th c ci tin các kt chui mc tiêu ngng gen di truyn
ca KHV.
Giao thc chun b mu nêu chi tit xut da vào mui (salt-
based extraction: s dng tác nhân DNAzol® reagent)  chit xut DNA c
thc d dàng áp dng, thi gian ng i r tin so vi mt s b kit. Các phòng
thí nghim không quen vi DNAzol® hay các tác nhân chit xut da vào mui khác có th tìm
kim tay. Tuy nhiên có nhiu b kit chit xut DNA,
da vào mui và da vào sinh khi silica (salt-based and silica-matrix based) s
mi (các nhà sn xut quen thuc gm Roche, Qiagen và Invitrogen) mà s cho ra DNA cht
ng cao thích hp cho s dng trong các giao thc PCR.
4.3.1.2.3.1. Phát hiện trực tiếp bằng PCR
Chuẩn bị mẫu và chiết xuất DNA bằng sử dụng tác nhân DNAzol®
Chit xut virus t      c thc hi    c mô t trong
n A.2.2.2.
i) Cho 100 µl huyn dch mô (1/10 [w/v]) vào ng vi ly tâm (microcentrifuge) dung tích 1,5 ml có
cha 1 ml tác nhân DNAzol®.
ii) Trn nh nhàng bc  yên  nhi 
ly tâm  10.600 g trong 10 phút vi máy vi ly tâm.
iii) Ly ra 1 ml dch phù ni cho vào mt ng vi ly tâm mi có cha 0,5 ml ethanol.
iv) Trn nh nhàng bc  yên  nhi 
ly tâm  18.000 g trong 30 phút bng máy vi ly tâm.
v) Loi b dch phù ni và ra phn trm lng vi 250 µl dung dch 70% ethanol pha vc loi
dùng cho xét nghim phân t (molecular biology grade water).
vi) Ly tâm các mu AND này trong 5 phút  18.000 g.

vii) Loi b ethanol bng s dng  phn trm lng khô trong không khí, bng
t nghiêng  ming ng m, trong 5 phút.
viii) Tái hòa tan phn trm lc loi dùng cho xét nghim phân tm
n 60
o
C, và   60
o
C trong 5 phút. Các mu AND này có th c bo qun  -20
o
C cho
n khi s dng.
Các lưu ý chung
PCR có khuynh ng cho ra các kt qu ng xét nghim
và chit xut mô phc bao gm mi ch loi tr vy nhi gim thiu
y nhim, các u tránh to khí dung s c s dng cho tt c các mu và
c chun b PCR. Ngoài ra, tt c các PCR phc chun b trong mt khu vc sch mà
tách bit vi khu v thc hin khuu này s gic nguy
 các kt qu y nhim.
Giao thức 1 (với các đoạn mồi Bercovier TK)
i) Vi tng mu, chun b mt hn hp chính (master mix) cha:
 Dm phn ng (reaction buffer) ( ×10)
 MgCl2 (25 mM stock)
 dNTPs (25 mM mix)
 n mi chiorward primer: 
1
stock)
 n mi chiu v (reverse primer: 
1
stock)
 

 c loi dùng cho xét nghim phân t (molecular biology grade water)
n mi Bercovier TK:
Chi = -GGG-TTA-CCT-GTA-CGA-G-
Chiu v = -CAC-CCA-GTA-GAT-TAT-GC-
c sn phm = 409 bp
Vi tng mu, chia 47,5 µl vào ng vi ly tâm vách mng dung tích 0,5 ml. Ph lên b mt hn hp
vi hai git du khoáng.
ii) Thêm vào 2,5 µl DNA chit xuc. Bo qun phn DNA còn li  -20
o
C.
t các ng vào mày gia nhit chu k (thermal cycler) và ch
1 chu k vi: 5 phút  94°C;
40 chu k vi: 1 phút  95°C
1 phút  55°C
1 phút  72°C
Mc dui dài (extension) cui cùng trong 10 phút  72
o
C.
 n di (electrophoresis) các th tích 20 µl ca sn ph      c
nhum ethidium bromide (4% agarose khi phân tách các sn phm khui nh 
n di  120 V trong 20 phút và hin th i tia UV. S bao g thích h 
t kh c ca sn phm PCR.
v) Các sn ph c xác nhn là có ngun gc t KHV bng các phân
tích kt chui (sequence analysis).
Giao thức 2 (với các đoạn mồi cải tiến của Gray Sph /Yuasa)
i) Vi tng mu, chun b mt hn hp chính có cha:
 Dm phn ng (reaction buffer  ×10)
 dNTPs (2.5 mM mix)
 n mi chiorward primer: 1 stock)
 n mi chiu v (reverse primer: 1 stock)

 DNA polymerase
 c loi dùng cho phn ng phân t (molecular biology grade water)
ng cui cùng ca MgCl
2
trong hn hp chính là 2 mM)
n mi Gray Sph:
Chi= -GAC-ACC-ACA-TCT-GCA-AGG-AG-
Chiu v = -GAC-ACA-TGT-TAC-AAT-GGT-CGC-
c sn phm = 292 bp
Vi tng mu, chia 19 µl vào ng vi ly tâm vách mng dung tích 0,2 ml. Ph lên b mt hn hp
hai git du khoáng.
ii) Thêm vàp  chit xuc.
t các ng vào mày gia nhit chu k và thc hi
1 chu k vi: 30 giây  94°C
40 chu k vi: 30 giây  94°C
30 giây  63°C
30 giây  72°C
Mc dui dài cui cùng 7 phút  72
o
C.
iv) Thêm 3 µl dm ch x 6 vào tng sn phm n hn
n di  120 V trong 20 phút và quan sát
i tia UV. M thích h khi s bao g nh kích
c ca sn phm PCR.
v) Các sn ph c xác nhn là có ngun gc t KHV, bng các phân
tích kt chui.
Phân tích kết chuỗi nucleotide cho các sản phẩm PCR
Các sn phc trích ly ra khc làm tinh khit, s dng mt b 
mi cho tinh lGeneclean®, Q-BIOgene,UK). Các sn ph l, tinh khit, sau khi
tinh lt chui mt cách trc tip vn mc s dng trong

khuu. Cách khác, các sn phm PCR kém tinh khic sao chép bng s
dng m và c c phân
tích kt chui, s dng các b n mi tng hp M13. Quá trình khui, sao chép và phân
tích kt chuc thc hi gim thiu các li có kh i Taq
n ng kt chuc phân tích trong máy phân tích gen (Genetic
Analyser) và th t sp xp kt chuc tính ra bi phn mm máy tính thích hn
mm Sequencher
TM
4.0, Gene Codes Corporation, Ann Arbour, MI, USA). Các phòng thí nghim
xét nghim mà không có thit b phân tích kt chuc khuyên s dng các phòng thí nghim
i mà có dch v phân tích kt chui. Các phòng thí nghim xét nghim s theo các
ng d c cung cp bi dch v phân tích kt chu  n  g n các mu xét
nghim.
4.3.2. Các phương pháp huyết thanh học
Tình trng min dch ca cá là yu t quan trm vi KHV, vi c min dch
 c hiu (cht cn nhim interferon) ln min d c hiu (các kháng th trong huyt
thanh, min dch quan trung gian t  u có các vai trò quan trng trong bnh nhim
herpesvirus. Bnh lâm sàng xy ra ch yu  các nhi c t 18
o
ng
min dch ca ký ch là t nhim sn sinh ra các kháng th kháng virus, và các xét
nghic công b s da vào phát hin các kháng th này   pha loãng cao ca
huyt thanh (1, 26, 30, 36). Kháng th n thy trong huyt thanh  3 tun sau khi gây
bnh thc nghim và tn ti trong cá s nhim t nhiên (1, 30, 36).
Huyt thanh t cá chép koi cha các kháng th  hin có phn ng chéo,  ma
 thp, vi CyHV-1, là mt ch th thêm cho s liên quan gn gi gia các virus này. Bng chng
v các phn c trong ELISA thun nghch (reciprocal ELISA) và các
phân tích thm thu ci vi huyt thanh t cá chép koi b nhim
bi CyHV-1 hay KHV (1). Các nhà ch  c    ng cá m c cp
vaccin kháng KHV có th có xét nghin kháng th.

Vic phát hin các kháng th có th chng minh là m v nhn bi
nhii vi KHV trong cá có biu hin khe m
dc phát trin mà có kh n mt cách tin cy virus tn ti trong cá
 m, thì các xét nghim da vào kháng th có th vn là công c giám sát duy nht.
Tuy nhiên, do  hiu bit v ng huyt thanh hc ci vi virus gây nhim,
vic phát hin các kháng th ci vi các virus vc chp nh
 làm th tnh tình trng nhim virus ca các qun th cá. Vit
s k thut huyt thanh hi vi mt s bnh do virus  cá s n,
n vic áp dng huyt thanh hc  c chp nhn r
theo dõi sc khe.
5. So sánh các xét nghiệm theo mục dích áp dụng
n nay sn có cho giám sát mc tiêu (targeted surveillance) và chi
vc lit kê trong Bng 5.1. Ký hiu s dng trong Bng gc
khuyên áp dng vì các lý do v s sn có, tính tin dng nhc hiu ca chn
n v nhc hiu tt cho ch
ng trong mt s hoàn c, hay các yu t
khác làm gii hn nhiu ng dng cn nay
không khuyên áp dng cho m t s v n
các tiêu chí v  tin c nhc hiu và tính tin dng. Mc dù không phi tt c các
xét nghic lic tri qua th thc chu
n cht th tc ca các xét nghim này và thc t c áp dng rng rãi mà không
cho ra các kt qu nhm lc chp nhn.
Bảng 5.1. Các phương pháp cho giám sát tập trung và chẩn đoán
Phương pháp
Giám sát tập trung
Chẩn
đoán ban
đầu
Chẩn
đoán xác

nhận
Ấu trùng
(larvae)
Sau ấu trùng
(post
larvaes)
Thiếu trùng
(juveniles)
Trưởng
thành
(adults)
Các du hii th
d
d
c
c
c
d
Trc tip soi kính hin vi
quang hc
d
d
c
c
c
d
Mô bnh hc (histopathology)
d
c
c

c
c
c
Phân lp trong t bào nuôi
d
d
d
d
c
d
Soi kính hin vi chuyn
t
d
d
d
d
c
c
Các xét nghim phân tích
phát hin virus da vào
kháng th
d
d
c
c
c
b
Ti phòng thí
nghiệm (DNA probes  in situ)
d

d
c
c
b
c
PCR
d
d
b
b
a
a
Phân tích kt chui
(sequence)
NA
NA
NA
NA
NA
a
Các xét nghim phân tích
phát hin kháng th (huyt
thanh hc)
d
d
c
b
d
d
Phân tích sinh hc (bioassay)

NA
NA
NA
NA
NA
NA
PCR = phn ng chui phân t (polymerase chain reaction); NA = Không áp dng.
6. (Các) khuyến cáo cho giám sát tập trung để tuyên bố sạch đối với bệnh do
herpesvirus ở cá chép koi
Giám sát tp trung s dng xuyên các v trí có các loài có mn cm. Các v trí
s c theo dõi khi các nhi n các m mà cho phép phát trin bnh (> 17
o
C)
và không sn sau khi các nhi n. Mi cá cht, hay cá th hin tp
tính bng, mà tìm thy trong các v trí này, s c ly mu và xét nghim, áp dng các xét
nghim nhy nht sng cho
xét nghim các qun th khe mnh ca cá có mn c tuyên b là sch bi vi KHV.
Tuy nhiên, nhiu phòng thí nghim phát triu tra thêm v a vào phân t
  nhi gian thc [real-time PCR] hay PCR kt  [nested PCR]) và
phát hic mt cách tin cy các m thp ca DNA ca virus tn ti. Các xét nghim phân
tích này có th chng minh thích hp tc phát hin
các kháng th có th ch  nhn bii
vi KHV trong cá th hing. Vi nghim phân tích min dch enzyme
 phát hin kháng th i vi KHV s n
vic áp dng các xét nghic chp nhn r
dõi sc khe.
7. Kết hợp tiêu chí chẩn đoán
7.1. Định nghĩa trường hợp nghi ngờ
S có nghi ng là KHV nu h ít nht m
i) S th hin các du hin hình ca KHVD trong mt qun th cá có mn cm.

ii) Th hin mô bnh hn hình, trong các lát ct mô, là thc cht ca KHVD.
n hình quan sát thy trong t bào nuôi cy có mn cm, mà không nhn din tác
nhân gây bnh tích.
iv) Mt kt qu     t mt xét nghim ch     u mô ép
c mô t n 4.3.1 phn trên.
v) S di chuyn cá t v trí mà s hin din cc xác nhn, hay có nghi ng, do có
th hin bnh lâm sàng, sang các v  KHV.
vi) Thit lc các liên kt dch t hn các v n KHV.
c kháng th kháng vi KHV.
 c nhn ra là nghi ng i tiêu chí v) và vi), vic xét nghim KHV s
ch c tin hành nu các nhi n các m mà cho phép phát tric
bnh (> 17
o
C). Nu các nhi i các m cho phép phát trin bnh, thì mu cá
còn sng có th t vào các nhi ng là 20  24
o
c xét nghim
vào 14  21 ngày sau.
7.2. Định nghĩa các trường hợp được xác nhận
ây s h cho xác nhn KHV:
i) T l t vong, các du hiu lâm sàng và các bii bnh tích thc cht ca bnh do KHV
n 4.2) và phát hin có KHV bng mt hay nhi
a) Phát hin KHV bc mô t on 4.3.1.2.3.
b) Phát hin KHV trong các mô x lý b    a kháng th c hiu
u mô ép theo mô t n 4.3.1.1.2);
c) Phân lp và nhn din KHV trong t bào nuôi t ít nht mt mu t bt k cá nào trong
v trí, n n 4.3.1.2.1.
ii) Khi không có t vong hay du hiu lâm sàng, thì phát hin bng m
sau:
d) Phát hin và xác nhn KHV b         n

4.3.1.2.3;
e) Các kt qu  hay xét nghim ch phn trên.
8. Tham khảo
1. ADKISON M.A., GILAD O. & HEDRICK R.P. (2005). An enzyme linked immunosorbent assay
(ELISA) for detection of antibodies to the koi herpesvirus (KHV) in the serum of koi Cyprinus
carpio. Fish Pathol., 40, 5362.
2. AOKI T., HIRONO I., KUROKAWA K., FUKUDA H., NAHARY R., ELDAR A., DAVISON A.J., WALTZEK
T.B., BERCOVIER H. & HEDRICK R.P. (2007). Genome sequences of three koi herpesvirus isolates
representing the expanding distribution of an emerging disease threatening koi and common carp
worldwide. J. Virol., 81 (10), 50585065.
3. BERCOVIER H., FISHMAN Y., NAHARY R., SINAI S., ZLOTKIN A., EYNGOR M., GILAD O., ELDAR A. &
HEDRICK R.P. (2005). Cloning of the koi herpesvirus (KHV) gene encoding thymidine kinase and its
use for a highly sensitive PCR based diagnosis. BMC Microbiol., 5, 19.
4. BERGMANN S.M., KEMPTER J., SADOWSKI J. & FICHTNER D. (2006). First detection, confirmation
and isolation of koi herpesvirus (KHV) in cultured common carp (Cyprinus carpio L.) in Poland.
Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol., 26, 97104.
5. BRETZINGER A., FISCHER-SCHERL T., OUMOUNA M., HOFFMANN R. & TRUYEN U. (1999). Mass
mortalities in koi carp, Cyprinus carpio, associated with gill and skin disease. Bull. Eur. Assoc. Fish
Pathol., 19, 182185.
6. CHOI D.L., SOHN S.G., BANG J.D., DO J.W. & PARK M.S. (2004). Ultrastructural identification of a
herpes-like virus infection in common carp Cyprinus carpio in Korea. Dis. Aquat. Org., 61, 165
168.
7. COSTES B., STALIN RAJ V., MICHEL B., FOURNIER G., THIRION M., GILLET L., MAST J., LIEFFRIG F.,
BREMONT M. & VANDERPLASSCHEN A. (2009). The major portal of entry of koi herpesvirus in
Cyprinus carpio is the skin. J. Virol., 83, 28192830.
8. DENHAM K. (2003). Koi herpesvirus in wild fish. Vet. Rec., 153, 507.
9. DISHON A., PERELBERG A., BISHARA-SHIEBAN J., ILOUZE M., DAVIDOVICH M., WERKER S. &
KOTLER M. (2005). Detection of carp interstitial nephritis and gill necrosis virus in fish droppings
Appl. Environ. Microbiol., 71, 7285-7291.
10. EL-MATBOULI M., SALEH M. & SOLIMAN H. (2007) Detection of cyprinid herpesvirus type 3 in

goldfish cohabiting with CyHV-3-infected koi carp (Cyprinus carpio koi). Vet. Rec., 161, 792-793.
11. GILAD O., YUN, S. ADKISON M.A., WAY K., WILLITS N.H., BERCOVIER H. & HEDRICK R.P. (2003).
Molecular comparison of isolates of an emerging fish pathogen, koi herpesvirus, and the effect of
water temperature on mortality of experimentally infected koi. J. Gen. Virol., 84, 26612667.
12. GILAD O., YUN S., ANDREE K.B., ADKISON M.A., ZLOTKIN A., BERCOVIER H., ELDAR A. & HEDRICK
R.P. (2002). Initial characteristics of koi herpesvirus and development of a polymerase chain
reaction assay to detect the virus in koi, Cyprinus carpio koi. Dis. Aquat. Org., 48, 101108.
13. GILAD O., YUN S., ZAGMUTT-VERGARA F.J., LEUTENEGGER C.M., BERCOVIER H. & HEDRICK R.P.
(2004). Concentrations of a Koi herpesvirus (KHV) in tissues of experimentally infected Cyprinus
carpio koi as assessed by real-time TaqMan PCR. Dis. Aquat. Org., 60, 179187.
14. GRAY W.L., MULLIS L., LAPATRA S.E., GROFF J.M. & GOODWIN A. (2002). Detection of koi
herpesvirus DNA in tissues of infected fish. J. Fish Dis., 25, 171178.
15. HAENEN O. & HEDRICK R.P. (2006). Koi herpesvirus workshop. Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol.
(Section 2: Workshops), 26 (1), 2637.
16. HAENEN O.L.M., WAY K., BERGMANN S.M. & ARIEL E. (2004). The emergence of koi herpesvirus
and its significance to European aquaculture. Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol., 24, 293307.
17. HARAMOTO E., KITAJIMA M., KATAYAMA H. & OHGAKI S. (2007). Detection of koi herpesvirus
DNA in river water in Japan. J. Fish Dis , 30, 5961.
18. HEDRICK R.P., GILAD O., YUN S., SPANGENBERG J.V., MARTY G.D., NORDHAUSEN R.W., KEBUS
M.J., BERCOVIER H. & ELDAR A. (2000). A herpesvirus associated with mass mortality of juvenile
and adult koi, a strain of common carp. J. Aquat. Anim. Health, 12, 4457.
19. HEDRICK R.P., WALTZEK T.B. & MCDOWELL T.S. (2006). Susceptibility of koi carp, common
carp, goldfish and goldfish x common carp hybrids to cyprinid herpesvirus-2 and herpesvirus-3. J.
Aquat. Anim. Health, 18, 2634.
20. HUTORAN M., RONEN A., PERELBERG A., ILOUZE M., DISHON A., BEJERANO I., CHEN N. & KOTLER
M. (2005). Description of an as yet unclassified DNA virus from diseased Cyprinus carpio species.
J. Virol., 79, 19831991.
21. ITO T., SANO M., KURITA J., YUASA K. & IIDA T (2007). Carp larvae are not susceptible to koi
herpesvirus. Fish Pathol., 42, 107109.
22. KASAI H., MUTO Y. & YOSHIMIZU M. (2005). Virucidal effects of ultraviolet, heat treatment and

disinfectants against koi herpesvirus (KHV). Fish Pathol., 40, 137138.
23. LATIFF F.A. (2004). Current status of transboundary fish diseases in Malaysia: occurrence,
surveillance, research and training. In: Transboundary Fish Diseases in Southeast Asia:
Occurrence, Surveillance, Research and Training, Lavilla-Pitogo C.R. & Nagasawa K., eds.
SEAFDEC Aquaculture Department, Tigbauan, Iloilo, Philippines, pp. 131157.
24. MIYAZAKI T., KUZUYA Y., YASUMOTO S., YASUDA M. & KOBAYASHI T. & (2008). Histopathological
and ultrastructural features of koi herpesvirus (KHV)-infected carp Cyprinus carpio, and the
morphology and morphogenesis of KHV. Dis. Aquat. Org., 80, 111.
25. MUSA N., LEONG N.K. & SUNARTO A. (2005). Koi herpesvirus (KHV)  an emerging pathogen in
koi. Colloquium on Viruses of Veterinary and Public Health Importance, Bangi, Malaysia, 146147.
26. PERELBERG A., ILOUZE M., KOTLER M. & STEINITZ M., (2008). Antibody response and resistance
of Cyprinus carpio immunized with cyprinid herpes virus 3 (CyHV-3). Vaccine, 26, 37503756.
27. PERELBERG A., RONEN A., HUTORAN M., SMITH Y. & KOTLER M. (2005). Protection of cultured
Cyprinus carpio against a lethal viral disease by an attenuated virus vaccine. Vaccine, 23, 3396
3403.
28. PERELBERG A., SMIRNOV M., HUTORAN M., DIAMANT A., BEJERANO Y. & KOTLER M. (2003).
Epidemiological description of a new viral disease afflicting cultured Cyprinus carpio in Israel.
Israeli J. Aquaculture, 55, 512.
29. PIKARSKY E., RONEN A., ABRAMOWITZ J., LEVAVI-SIVAN B., HUTORAN M., SHAPIRA Y., STEINITZ
M., PERELBERG A., SOFFER D. & KOTLER M. (2004). Pathogenesis of acute viral disease induced in
fish by carp interstitial nephritis and gill necrosis virus. J. Virol., 78, 95449551.
30. RONEN A., PERELBERG A., ABRAMOWITZ J., HUTORAN M., TINMAN S., BEJERANO I., STEINITZ M. &
KOTLER M. (2003). Efficient vaccine against the virus causing a lethal disease in cultured Cyprinus
carpio. Vaccine, 21, 46774684
31. SADLER J., MARECAUX E. & GOODWIN A.E. (2008). Detection of koi herpesvirus (CyHV-3) in
goldfish, Carassius auratus (L.), exposed to infected koi. J. Fish Dis., 25, 171178.
32. SANO M., ITO T., KURITA J., YANAI T.,WATANABE N., MIWA S. & IIDA T. (2004A). First detection of
koi herpesvirus in cultured common carp Cyprinus carpio in Japan. Fish Pathol., 39, 165167.
33. SCHLOTFELDT H.F. (2004). Severe losses of common carp in Germany due to Koi Herpesvirus
(KHV). Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol., 24, 216217.

34. SHAPIRA Y., MAGEN Y., ZAK T., KOTLER M., HULATA G. & EVAVI-SIVAN B. (2005). Differential
resistance to koi herpes virus (KHV)/carp interstitial nephritis and gill necrosis virus (CNGV) among
common carp (Cyprinus carpio L.) strains and crossbreds. Aquaculture, 245, 111.
35. SHIMIZU T., YOSHIDA N., KASAI H. & YOSHIMIZU M. (2006). Survival of koi herpesvirus (KHV) in
environmental water. Fish Pathol., 41, 153157.
36. ST-HILAIRE S., BEEVERS N., WAY K., LE DEUFF R.M., MARTIN P. & JOINER C. (2005).
Reactivation of koi herpesvirus infections in common carp Cyprinus carpio. Dis. Aquat. Org., 67,
1523.
37. SUNARTO A., RUKYANI A. & ITAMI T. (2005). Indonesian experience on the outbreak of koi
herpesvirus in koi and carp (Cyprinus carpio). Bull. Fish. Res. Agency, Supplement No. 2: 1521.
38. TAKASHIMA Y., WATANABE N., YANAI T. & NAKAMURA T. (2005). The status of koi herpesvirus
disease outbreaks in Lake Kasumigaura and Kitaura. Bull. Fish. Res. Agency, Supplement No. 2:
6571.
39. TERHUNE J.S., GRIZZLE J.M., HAYDEN K. & MCCLENAHAN S.D. (2004). First report of koi
herpesvirus in wild common carp in the Western Hemisphere. Fish Health Newsletter.American
Fisheries Society, Fish Health Section, 32, 89.
40. TU C., WENG M.C., SHIAU J.R. & LIN S.Y. (2004). Detection of koi herpesvirus in koi Cyprinus
carpio in Taiwan. Fish Pathol., 39, 109110.
41. WALSTER C. (1999). Clinical observations of severe mortalities in koi carp, Cyprinus carpio,
with gill disease. Fish Vet. J., 3, 5458.
42. WALTZEK T.B., KELLEY G.O., STONE D.M., WAY K., HANSON L., FUKUDA H., HIRONO I., AOKI T.,
DAVISON A.J. & HEDRICK R.P. (2005). Koi herpesvirus represents a third cyprinid herpesvirus
(CyHV-3) in the family Herpesviridae. J. Gen. Virol., 86, 16591667.
43. YASUMOTO S., KUZUYA Y., YASUDA M., YOSHIMURA T. & MIYAZAKI T. (2006). Oral immunization
of common carp with a liposome vaccine fusing koi herpesvirus antigen. Fish Pathol., 41, 141145.
44. YUASA K., ITO T. & SANO M. (2008). Effect of water temperature on mortality and virus shedding
in carp experimentally infected with koi herpesvirus. Fish Pathol., 43, 8385.
45. YUASA K., SANO M., KURITA J., ITO T. & IIDA T. (2005). Improvement of a PCR method with the
Sph 15 primer set for the detection of koi herpesvirus (KHV). Fish Pathol., 40, 3739.
*

* *
NB: There are OIE Reference Laboratories for Koi herpesvirus disease (see Table at the end of
this Aquatic Manual or consult the OIE Web site for the most up-to-date list: www.oie.int)