Từ những phân tích trên, so sánh các ưu nhược điểm của các phương pháp sản
xuất acid acetic, cũng như đánh giá tình hình nhu cầu và tiến bộ khoa học trong
nước, luận văn chọn phương pháp lên men vi sinh để nghiên cứu công nghệ sản
xuất acid acetic.
2.3 Sản xuất acid acetic bằng phương pháp vi sinh
2.3.1 Quá trình lên men acid acetic
Lên men là quá trình oxy hóa-khử sinh học để thu năng lượng và các chất
trung gian.
Mọi quá trình muốn tiến hành được đòi hỏi phải có năng lượng. Để thực hiện
các hoạt động sống như sinh trưởng, sinh sản và phát triển của mình, vi sinh vật
cũng đòi hỏi phải có năng lượng. Năng lượng đó được tạo ra trong quá trình lên
men.
Tế bào sống chỉ sử dụng năng lượng dưới dạng hóa năng tàng trữ trong các
mạch cacbon và được giải phóng ra trong các phản ứng enzym do sự chuyển hóa
electron từ mức năng lượng này sang mức năng lượng khác. Các phản ứng xảy ra
trong các quá trình lên men là những phản ứng chuyển hydro. Nhưng sự chuyển
hydro cũng tương đương với sự chuyển electron. Các enzym xúc tác trong quá trình
tách nguyên tử hydro khỏi cơ chất gọi là enzym dehydrogenase.
Trong qúa trình lên men giấm, rượu etylic được oxy hóa thành acid acetic. Ở
đây, sự chuyển hóa hydro được thực hiện nhờ sự xuất hiện của NADP nhận (trở
thành NADPH
2
) được chuyển qua chuỗi hô hấp để thu nhận năng lượng, song cơ
chất không bò phân giải hoàn toàn nên được gọi là quá trình oxy hóa không hoàn
toàn.
2.3.2 Cơ chế phản ứng của quá trình lên men acid acetic
Lên men giấm là quá trình oxy hóa rượu etylic thành acid acetic nhờ có
enzym alcohol oxydase xúc tác trong điều kiện hiếu khí:
11

CH
3
CH
2
OH + O
2
= CH
3
COOH + H
2
O + 117KCal
Để chuyển hóa thành acid acetic, rượu và oxy phải thâm nhập vào tế bào vi
khuẩn, ở đây nhờ có enzym của vi khuẩn xúc tác, rượu được chuyển hóa thành acid
acetic theo một quá trình sau:
CH
3
CH
2
OH +
2
1
O
2
= CH
3
CHO + H
2
O
CH

3
CHO + H
2
O = CH
3
CH(OH)
2

CH
3
CH(OH)
2
+
2
1
O
2
= CH
3
COOH + H
2
O
Acid acetic tạo thành sẽ thoát khỏi tế bào vi khuẩn và đi vào môi trường. Khi
môi trường hết rượu, vi khuẩn giấm sẽ oxy hóa acid actic thành CO
2
và nước theo
phương trình sau:
CH
3
COOH + 2O

2
= 2CO
2
+ 2H
2
O
Đây chính là sự “quá oxy hóa” rất có hại cho quá trình lên men giấm. Vì vậy,
trong lên men phải có dư một lượng rượu khoảng 0,3 - 0,5% để đảm bảo không bao
giờ cho oxy hóa hết rượu.
2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến qúa trình lên men acid acetic
2.3.3.1 Ảnh hưởng của hàm lượng oxy (O
2
)
Theo cơ chế phản ứng, giấm hóa là phản ứng dehydro hóa. Trong đó, oxy
hóa đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men. Từ phản ứng trên ta thấy, để
oxy hóa hết 1 mol rượu thì cần có 1mol O
2
tự do, tức là để oxy hết 1 kg rượu thì
cần 2,3 m
3
không khí (tính theo 20,9% O
2
).
Trong sản xuất giấm, điều kiện thoáng khí càng tốt thì quá trình lên men càng
mạnh. Ở phương pháp chậm, dòch lên men tiếp xúc với không khí và hấp thu oxy
qua bề mặt thoáng, do hạn chế của bề mặt thoáng nên phương pháp này chậm,
năng suất thấp. Trong phương pháp nhanh, do bổ sung các vật liệu xốp (vỏ bào,
than gỗ, than cốc, nhiều vật liệu trơ khác) nên đã làm tăng bề mặt tiếp xúc giữa
12



môi trường dinh dưỡng và không khí, cải thiện điều kiện thông khí do đó thúc đẩy
quá trình lên men.
2.3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nồng độ của môi trường ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động sinh lý của vi sinh
vật, do đó nó sẽ ảnh hưởng đến quá trình lên men. Nhiệt độ thích hợp để vi khuẩn
giấm sinh trưởng và phát triển mạnh đối mỗi loài khác nhau là khác nhau nhưng
nhìn chung khoảng nhiệt độ để vi khuẩn giấm tồn tại và phát triển là khá rộng từ
15 - 34
o
C.
Nếu nhiệt độ quá thấp thì tốc độ lên men sẽ chậm, ngược lại khi nhiệt độ quá
cao sẽ làm tăng tổn thất do bay hơi rượu và acid acetic. Do đó, nhiệt độ thích hợp
cho quá trình sản xuất là khoảng 30
o
C.
2.3.3.3 Hàm lượng acid (độ pH)
Thường môi trường acid (pH = 3) là điều kiện thuận lợi đối với sự phát triển
của vi khuẩn giấm. Acid acetic tích tụ trong môi trường đến mức nào đó sẽ ức chế
hoạt động của chính vi khuẩn. Khi trong dung dòch có khoảng 8% acid acetic thì
hoạt động của vi khuẩn trở nên ngày càng giảm và ngừng hoạt động khi hàm lượng
đạt 12 - 14%.
Trong sản xuất giấm, thường cho vào cơ chất ban đầu một lượng giấm nhất đònh
để acid hóa môi trường nhằm thỏa mãn :
- Ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật có hại và không có lợi vì môi
trường acid là một chất độc đối với nhiều vi sinh vật.
- Cho vào dòch lên men một lượng vi khuẩn cần thiết để bổ sung lượng giấm.
Lượng giấm đưa vào là tùy yêu cầu của phương pháp sản xuất.
Khi sản xuất giấm theo phương pháp nhanh, cần đưa vào dòch lên men một
lượng acid acetic sao cho thoả mãn hai mục đích trên, đồng thời phải có nồng độ

nhỏ hơn ngưỡng có tác dụng ức chế cho chính bản thân vi khuẩn, với nồng độ 8%
13


acid acetic thì vi khuẩn giấm hoạt động rất kém. Vì vậy hàm lượng acid acetic có
thể dao động trong khoảng 1 - 7%.
2.3.3.4 Hàm lượng rượu
Tuỳ từng loại vi sinh vật mà chúng có khả năng tồn tại trong nồng độ rượu
khác nhau, thường sử dụng nồng độ từ 2 - 10%V. Theo Ebner (1985) và Heirich
(1987) thì lượng rượu etylic sử dụng từ 2 - 10%V.
Để tránh hiện tượng oxy hóa tiếp tục acid acetic đến CO
2
và H
2
O cần có một
lượng rượu dư trong giấm từ 0,3 - 0,5%V. Lượng rượu sót trong giấm có tác dụng ức
chế sự tổng hợp enzym oxy hóa acid acetic và muối axetat (Dires, 1973).
2.3.3.5 Các chất dinh dưỡng
Trong cơ thể vi sinh vật có khoảng 40 hợp chất khoáng khác nhau có thể ở
dạng tự do hay liên kết hữu cơ cao phân tử, thông thường tổng hàm lượng khoáng
trong vi khuẩn chiếm khoảng 5 - 8% trọng lượng chất khô. Các chất khoáng chia
làm hai loại:
- Khoáng đa lượng: S, P, K, Na, Fe, Mg, Cu,…
- Khoáng vi lượng: Cl, Br, I, As, Pb, Zn, Mn,…
Do đó, để cho vi khuẩn giấm phát triển tốt, khi sản xuất giấm ngoài các chất:
nước, acid, rượu thì cần đưa vào môi trường lên men các muối tan có chứa các
nguyên tố khoáng cần thiết. Nếu sản xuất giấm từ rượu vang, bia, nước quả ép,…thì
trong dòch lên men đã có đủ các nguyên tố khoáng đa lượng và vi lượng nên không
cần bổ sung. Nếu sản xuất giấm từ dòch cồn pha loãng thì cần bổ sung các nguyên
tố khoáng cần thiết nhờ các muối vô cơ dễ tan. Mỗi cơ sở sản xuất giấm đưa ra

hàm lượng các chất dinh dưỡng khác nhau.


14


2.3.3.6 Các chất gây độc và các kim loại nặng
Các chất gây độc hại và ức chế: các chất như tinh dầu, lignin, tanin,… và một
số hợp chất khác khi có mặt trong môi trường lên men với nồng độ vượt quá
ngưỡng giới hạn cho phép đều có tác dụng gây độc hại cho vi sinh vật.
Các kim loại nặng: khi có mặt 5 kim loại Pb, Cu, Fe, Zn, Sn trong dung dòch lên
men sẽ làm giảm hiệu suất lên men, ngưỡng độc hại của 5 kim loại trên là: 10, 15,
50, 100 và >100 ppm.
2.3.3.7 Chất lượng nước pha dòch
Chất lượng nước pha loãng cũng có ảnh hưởng đáng kể đến quá trình lên
men giấm, yếu tố quan trọng nhất của nước pha loãng là có độ sạch sinh học cao
(vô trùng) và hàm lượng Clo thấp. Nhìn chung, nước pha loãng tốt là nước có độ
sạch sinh học cao, hàm lượng Clo, các kim loại nặng và các chất rắn thấp, có đủ
các nguyên tố vi lượng.
2.3.4 Các phương pháp sản xuất acid acetic bằng cách lên men
Yếu tố quan trọng quyết đònh hiệu suất và năng suất của một phương pháp
sản xuất acid acetic chính là bề mặt tiếp xúc giữa Oxy của không khí và cơ chất.
Đến thời điểm hiện tại đã có bốn phương pháp sản xuất acid acetic bằng cách lên
men:
- Phương pháp chậm
- Phương pháp nhanh
- Phương pháp chìm
- Phương pháp hỗn hợp
2.3.4.1 Phương pháp chậm
Phương pháp chậm còn gọi là phương pháp Orleans hay phương pháp Pháp.

Phương pháp này được biết đến năm 1670, khởi đầu là vùng trồng nho nổi tiếng ở
15


nước Pháp. Do người ta nhận thấy dòch vang nho để trong những thùng gỗ hở nắp
dần dần bò đục, có màng phủ trên bề mặt và trở nên chua.
Đây là phương pháp lâu đời nhất, quá trình lên men giấm diễn ra ở bề mặt tiếp
xúc giữa khối dòch lên men và không khí (bề mặt thoáng) trong những thùng lên
men đặt nằm ngang.
Để tiến hành sản xuất giấm theo phương pháp này, tiến hành như sau: đổ vào
thùng 1/5 thể tích giấm tươi chất lượng cao để acid hóa, sau đó đổ thêm dòch lên
men vào cho đến 1/2 thể tích thùng. Tiếp theo cứ mỗi chu kỳ đổ thêm dòch lên men
cho đến khi đầy. Khi nào nhận thấy rượu đã được oxy hóa gần hết lấy một phần
giấm ra để đem chế biến và bảo quản, đồng thời cho tiếp dòch lên men vào để lên
men tiếp.
Khi lên men, vi khuẩn giấm phát triển tạo thành màng vi sinh vật trên bề mặt
thoáng, khi bò chấn động (do va chạm hay quá trình đổ dòch lên men vào và tháo
sản phẩm ra) nó sẽ bò phá vỡ, chìm xuống tiêu thụ cơ chất mà không tạo acid
acetic. Dần dần trên bề mặt thoáng lại hình thành màng vi khuẩn mới và lại diễn ra
quá trình lên men tiếp tục.
Do hạn chế của bề mặt thoáng nên phương pháp này có những nhược điểm sau:
thời gian lên men dài, nồng độ acid acetic thấp, năng suất thấp, cồng kềnh.Tuy
vậy, phương pháp này có ưu điểm là cho giấm thơm, ngon, thiết bò dễ chế tạo.
2.3.4.2 Phương pháp nhanh
Phương pháp này tạo được bề mặt tiếp xúc pha giữa lỏng, khí và vi sinh vật
lớn nhờ bổ sung vật liệu bám trong thiết bò nên năng suất và hiệu suất cao hơn.
Ở phương pháp này người ta tưới dòch lên men cho chảy qua thùng lên men, bên
trong có đổ đầy vật liệu bám và màng vi khuẩn ở trên bề mặt, không khí đi ngược
chiều từ dưới lên, dòch lên men được chuyển hóa nhanh nhờ vi khuẩn.Nếu thiết bò
16



lên men đủ cao, điều kiện vận hành được khống chế tốt thì chỉ cần cho dòch lên
men qua tháp một lần đã có thể thu được giấm đặc ở đáy.
Ưu điểm của phương pháp:
- Thời gian lên men ngắn
- Thiết bò tương đối đơn giản, năng suất cao, ổn đònh
- Giấm thu được có nồng độ acid acetic cao (có thể đến 11-12%)
Nhược điểm của phương pháp:
- Hiệu suất không cao
- Phải chọn vật liệu bám phù hợp
2.3.4.3 Phương pháp chìm
Ở phương pháp này, không khí sục qua khối dòch lên men mãnh liệt sẽ tạo
thành một thể huyền phù có pha rắn là vi khuẩn giấm, pha lỏng là dòch lên men
trong các thiết bò lên men có tên là acetator, dòch lên men được chuyển hóa thành
giấm rất nhanh.
2.3.4.4 Phương pháp tổ hợp
Đây là phương pháp lai giữa hai phương pháp nhanh và chìm. Thiết bò lên
men này gồm hai phần:
-Phần trên như generator có đổ đầy đệm, hoạt động theo nguyên tắc lên
men nhanh
- Phần dưới (phần chứa dòch sau khi đi qua vật liệu bám) có lắp thêm bộ
phận sục khí tạo thành vùng oxy hóa bổ sung như một acetator trong phương pháp
chìm.
Khi ngừng cung cấp oxy qua bộ phận sục khí (khi ngắt điện) vẫn không ảnh
hưởng đến vi khuẩn vì lúc đó các van thông khí trong thiết bò được mở ra và không
17


khí đi vào nhờ thông khí tự nhiên, do đó màng vi khuẩn trên đệm vẫn không bò

chết.
Phương pháp này khắc phục được nhược điểm và phát huy ưu điểm của hai
phương pháp nhanh và chìm.
2.3.4.5 Chọn phương pháp lên men
Phương pháp chậm do có nhiều nhược điểm như đã nói ở trên nên khi lựa
chọn phương pháp sản xuất giấm trong công nghiệp sẽ không lựa chọn phương
pháp này.
Phương pháp chìm tuy có nhiều ưu điểm nhưng trong tình hình hiện nay Việt
Nam chưa thể đi theo hướng này được, trình độ khoa học kỹ thuật còn hạn chế
không thể đáp ứng được nhu cầu nghiêm ngặt khắc khe về thông khí và tính chất
phức tạp của bộ phận làm sạch khí khỏi những tạp chất, dầu mỡ làm cho không khí
bò tạp nhiễm sau khi đi qua máy nén, máy quạt,…
Vì vậy chọn phương pháp nhanh để sản xuất acid acetic là hợp lý ở nước ta
trong giai đoạn hiện nay. Tuy nhiên, với phương pháp này vẫn chưa có được các
thông số và các dữ kiện cụ thể để triển khai sản xuất nên còn trong giai đoạn thăm
dò mang tính chất đònh tính ở qui mô phòng thí nghiệm, làm cơ sở cho việc nghiên
cứu toàn diện về một qui trình công nghệ và thiết bò sản xuất acid acetic theo
phương pháp nhanh ở Việt Nam.
2.3.5 Chọn chủng vi khuẩn acid acetic
Hiện nay trên thế giới đã tìm ra trên 20 loại vi khuẩn acetic – gọi chung là
acetobacter- là một loại trực khuẩn khá lớn thuộc loại hiếu khí bắt buộc, nhiệt độ
thích hợp cho chúng phát triển từ 30-40
o
C.
Vi khuẩn acetic thuộc hai giống acetobacter (chu mao) acetomonas (tiên mao ở
một đầu). Nhiều loại khi phát triển lâu trên môi trường dễ dàng sinh ra những dạng
có hình thái đặc biệt (tế bào phình to hay kéo dài, có thể phân nhánh).
18

Vi khuẩn acetobacter phân bố rộng trong tự nhiên, nhất là trên thực phẩm, hoa

quả, không khí, nhiều trường hợp có thể phát triển đồng thời với nấm men trên cơ
chất thực vật có nhiều đường.
Việc nghiên cứu vi khuẩn do Pasteur thực hiện từ năm 1862 khi ông dùng kính
hiển vi quan sát màng mỏng xuất hiện trên rượu vang chua.
Một số chủng vi khuẩn acetobacter điển hình (Đinh Thò Kim Nhung, 1996)
- Acetobacter aceti: thực khuẩn ngắn, có dạng hình que, kích thước 0,4 – 0,8
x 1,0 x 1,2

m, không di động, thường xép thành chuỗi dài, bắt màu gram âm, cho
màu vàng với thuốc nhuộm Iod. Chúng tạo thành khuẩn lạc to, sáng trên gelatin
với dòch lên men chứa 10% đường saccharose tạo thành màng nhầy nhẵn, không
được nâng lên theo thành bình. Có khả năng phát triển trên môi trường có nồng độ
rượu khá cao (11%), có khả năng tích luỹ 6% acid acetic, nhiệt độ phát triển thích
hợp 30
o
C, thường phát triển trên bia.
- Acetobacter pasteurianum: có hình dạng giống Acetobacter aceti, bắt màu
xanh với thuốc nhuộm Iod, tạo thành váng khô và nhăn nheo, tế bào xếp rời nhau
thành chuỗi, đôi khi bắt gặp tế bào có dạng chuỳ phồng lên, di động không thường
xuyên. Khuẩn lạc trên gelatin và dòch lên men nhỏ tròn, thích hợp phát triển ở
30
o
C.
- Acetobacter kiitzigianum: có màng nhày nhẵn mép, nó được nâng lên thành
bình (dính), trực khuẩn ngắn, to, thô, không di động. Khuẩn lạc trên gelatin với
dòch lên men nhớt , nhỏ, tạo thành màng xếp nếp to trên các môi trường lỏng, thích
hợp phát triển ở 30
o
C.
- Acetobacter lindreni: trực khuẩn xếp riêng rẽ và tạo thành chuỗi, thỉnh

thoảng bắt gặp các tế bào phồng to như hình cầu, không di động. Khuẩn lạc trên
gelatin với dòch lên men nhỏ tròn, màu vàng. Trên các môi trường lỏng váng vi
khuẩn màu vàng nâu, nhớt, thích hợp phát triển ở 25
o
C. (Lê Văn Nhương,1990)
19


- Acetobacter acetosum: trực khuẩn có kích thước 0,1 - 0,8 x 1

m. Các tế
bào xếp riêng rẽ và thành từng chuỗi, không di động, nhiệt độ thích hợp nhất để
phát triển ở 30 – 36
o
C. (Lê Văn Nhương,1990)
- Acetobacter xylinum: trực khuẩn hình que 2

m,đứng riêng rẽ hoặc xếp
thành từng chuỗi, không di động. Các tế bào được bao bọc bởi chất nhầy, tạo váng
nhăn khá dày, bắt màu xanh với thuốc nhuộm Iod và H
2
SO
4
(phản ứng của
hemixelluloza) vì váng có chứa hemixellulozo, có thể tích lũy 4,5% acid acetic
trong môi trường. Thường sống chung với nấm men trong một loại nước giải khát
dân gian làm bằng nước chè đường loãng còn gọi là “Thủy Hoài Sâm”. Ở Nga có
tên gọi là “Nấm Chè”, “Nấm Nhật Bản”, Ở Trung Quốc có tên là “Hoài Bảo” hay
“Vò Hảo”.
- Acetobacter Schiitzenbachii: có dạng hình que 0,3 - 0,4 x 1,0 - 3,6


m,
thường đứng riêng rẽ hay xếp thành đôi, có thể tạo thành những dạng tế bào đặc
biệt, tạo váng dày và không bền vững trên các môi trường già. Có thể tích lũy
trong môi trường tới 11,5% acid acetic. Thường được dùng để sản xuất giấm theo
phương pháp nhanh.
- Acetobacter Suboxydans: có dạng hình que ngắn, không có khả năng di
động, tạo thành những váng mỏng dễ tan vỡ. Nó có thể chuyển hóa glucose thành
acid gluconic, sorbic thành sorboza. Loại vi khuẩn này để phát triển tốt cần được
cung cấp paraaminobenzoic, acid pantotenic và acid nicotinic.
- Acetobacter hoshigaki: trực khuẩn có kích thước 0,7 - 0,8 x 1,5 - 1,8

m.
Thường xếp riêng rẽ không di động, khuẩn lạc trên thạch với chất chiết rút đậu
nành nhỏ, tròn, dạng hạt sáng, sau đó trở thành màu nâu, phần phía ngoài màu
vàng nhạt. Tạo thành acid gluconic từ dextroza, thích hợp phát triển ở 30 - 35
o
C.
20