ĐẶT VẤN ĐỀ
H. influenzae là thành viên của hệ vi khuẩn ký sinh ở đường hô hấp
trên. Trong đó, H. influenzae typ b (Hib) có ở 1-5% trẻ em khoẻ mạnh và
không có biểu hiện bệnh [16]. Tỷ lệ mang vi khuẩn thấp nhất ở người lớn và
trẻ nhỏ, cao nhất ở lứa tuổi mẫu giáo [36], [54], [58]. Tuy vậy, trong một số
điều kiện nhất định như ở các hộ, các trung tâm chăm sóc trẻ ban ngày thì tỷ
lệ trẻ mang vi khuẩn có thể cao hơn một cách đáng kể. Mặc dù nhiều nghiên
cứu đã cho thấy tỷ lệ mang vi khuẩn Hib của trẻ nhỏ là dưới 5%. Tuy nhiên,
tỷ lệ mang vi khuẩn Hib tại các trung tâm như vậy được báo cáo là 15-25%
[26], [36], [54].
Đường lây truyền của H. influenzae từ người này sang người khác
thường thông qua các hạt dịch bắn ra từ đường hô hấp hoặc bởi sự tiếp xúc
với chất tiết của miệng. Những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất lan truyền và
khả năng vi khuẩn thiết lập sự xâm chiếm còn chưa được hiểu rõ [36].
Hiện nay H. influenzae cũng được biết đến là căn nguyên chính gây
viêm màng não mủ và viêm phổi cho trẻ nhỏ. Tuy nhiên, tại các phòng xét
nghiệm vi sinh lâm sàng ở trong nước H. influenzae vẫn được xếp vào loài vi
khuẩn khó nuôi cấy bởi luôn đòi hỏi môi trường phải có cả hai yếu tố phát
triển (growth factors) là X và V. Vì vậy, phần lớn chỉ những phòng xét
nghiệm vi sinh tuyến tỉnh và Trung Ương mới có điều kiện để nuôi cấy chẩn
đoán vi khuẩn này. Thêm vào đó, việc xác định typ huyết thanh và typ sinh
học hầu như tại các bệnh viện đều ít thực hiện, phần lớn chỉ sử dụng trong
nghiên cứu, bởi vậy để xác định được những đặc điểm này đòi hỏi phòng xét
nghiệm phải đầu tư thời gian và sinh phẩm đặc thù [3], [16]. Cho nên, chẩn
đoán xác định H. influenzae thường không được thực hiện một cách hoàn
chỉnh.
1
1
Xuất phát từ vấn đề trên, chúng tôi thực hiện chuyên đề:
"Haemophilus influenzae typ b: Đặc điểm sinh học và tỷ lệ trẻ khỏe mạnh
mang vi khuẩn" nhằm đưa ra những thông tin cơ bản nhất về vi khuẩn này để

góp phần cho công tác chẩn đoán và phòng bệnh do Haemophilus influenzae
typ b trên lâm sàng. Chuyên đề thực hiện với 2 mục tiêu:
1. Tìm hiểu lịch sử phát hiện và đặc điểm sinh học đặc trưng của
Haemophilus influenzae typ b
2. Đánh giá tỷ lệ trẻ khỏe mạnh có mang Haemophilus influenzae
typ b và các yếu tố ảnh hưởng.
2
2
Chương I
ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA
HAEMOPHILUS INFLUENZAE TYP B
1.1. Haemophilus influenzae: lịch sử và tên gọi
H. influenzae được phân lập lần đầu bởi Richard Pfeiffer từ đờm của
một bệnh nhân bị viêm phổi - cúm trong đại dịch cúm năm 1890. Lúc đó, vi
khuẩn này được hiểu lầm là nguyên nhân gây ra bệnh cúm nên được gọi là
trực khuẩn cúm (Influenzae bacteria). Mãi cho đến khi đại dịch cúm xảy ra
trong những năm 1918-1919, người ta mới biết H. influenzae chỉ là thành viên
của hệ vi khuẩn ký sinh ở đường hô hấp trên và không phải lúc nào cũng gây
bệnh. Đến năm 1933, khi phát hiện ra virus cúm là căn nguyên của bệnh cúm,
vai trò của H. influenzae mới được làm sáng tỏ: virus cúm gây ra bệnh cúm,
còn Haemophilus influenzae chỉ là vi khuẩn “ăn theo” (second invader) sau
khi các tế bào đường hô hấp đã bị tổn thương nặng nề bởi virus cúm [3], [16],
[17]. Vì vậy, vi khuẩn này có tên là H. influenzae được xuất phát từ nhu cầu
đòi hỏi môi trường giàu chất dinh dưỡng, đó là các yếu tố phát triển có ở máu
(Haemophilus: ưa máu), đặc biệt là yếu tố X (hemin) và yếu tố V (NAD hoặc
NADP). Thêm vào đó, vi khuẩn này lại có mối liên quan lịch sử với bệnh cúm
(Influenzae: bệnh cúm). Cho nên, vi khuẩn được gọi tên là như vậy [3], [16].
1.2. Đặc điểm sinh học đặc trưng của Haemophilus influenzae typ b
1.2.1. Hình thái và cấu trúc [3], [16].
H. influenzae là một trong những loài vi khuẩn nhỏ nhất, còn được gọi

là cầu trực khuẩn vì vi khuẩn này có dạng trực khuẩn ngắn (1,0–1,5µm)
nhưng uốn cong ở hai đầu trông như hình cầu. Tuy nhiên, khi vi khuẩn này ở
dịch não tuỷ hình thể có thể kéo dài ra gấp vài lần so với chiều dài thông
thường (Hình 1.1). H. influenzae có đặc tính bắt màu Gram âm, không di
động và không hình thành nha bào. Thành tế bào vi khuẩn này có cấu trúc bề
3
3
mặt lipopolysaccharide–protein tương tự như thành của các vi khuẩn Gram
âm khác. Ngoài ra, H. influenzae được phân loại thành 2 nhóm: loại không vỏ
polysaccharide (non-typeable không xác định được typ huyết thanh) và loại
có vỏ (typeable xác định được typ huyết thanh). Loài H. influenzae (Hi) có vỏ
bọc được phân loại tiếp tục theo các typ huyết thanh từ a đến f tuỳ thuộc vào
đặc tính kháng nguyên của vỏ polysaccharide do gen qui định [3][16][17]. Vỏ
bọc typ b là một dạng trùng hợp của ribose, ribitol và phosphate, được gọi là
polyribosyl - ribitol - phosphate (PRP). Polysaccharide bề mặt này liên quan
mạnh mẽ đến tính gây độc của vi khuẩn, đặc biệt là H. influenzae typ b (Hib),
là nguyên nhân của nhiều trường hợp nhiễm trùng hệ thống nghiêm trọng bao
gồm cả viêm màng não mủ (trên 90% các ca nhiễm khuẩn lan tràn do Hib).
Hình 1.1 Hình thể của H. influenzae typ b trên tiêu bản nhuộm gram
dịch não tuỷ dưới kính hiển vi quang học.
Trên thực tế lâm sàng, nếu nhuộm gram bệnh phẩm dịch não tủy từ
bệnh nhân mà trên vi trường cho thấy nhiều vi khuẩn gram (-) nhỏ, đa hình
thái thì đây là dấu hiệu rất quan trọng gợi ý cho chẩn đoán sớm viêm màng
não mủ do H. influenzae typ b [16].
4
4
1.2.2. Sức đề kháng
H. influenzae typ b là loại vi khuẩn chịu đựng rất kém với các yếu tố
ngoại cảnh. Trong bệnh phẩm, chúng chết nhanh chóng nếu để ánh sáng mặt
trời chiếu trực tiếp, để khô hoặc lạnh giá. Các chất sát khuẩn thông thường

tiêu diệt vi khuẩn này một cách dễ dàng [61].
Vì vậy, bệnh phẩm để chẩn đoán vi sinh nên được vận chuyển về
phòng thí nghiệm trong vòng 2h, hoặc không quá 6h ở nhiệt độ phòng thí
nghiệm (24 - 28
o
C). Nếu là tăm bông phải giữ trong môi trường vận chuyển
(bảo quản), có thể giữ ở nhiệt độ 4 - 8
o
C tối đa 24h trong môi trường vận
chuyển [61].
1.2.3. Đặc điểm nuôi cấy [3]
1.2.3.1. Điều kiện nuôi cấy
H. influenzae là loại vi khuẩn khó nuôi cấy. Chúng không mọc trên các
môi trường nuôi cấy thông thường, chỉ mọc khi trong môi trường đã có sẵn cả
hai yếu tố X và V. Yếu tố X có lẽ không phải là một chất thuần tuý mà là hỗn
hợp của các chất màu có chứa sắt (như hemin và hematin), khi không có hai
yếu tố này trong môi trường nuôi cấy thì chúng không phát triển được.
H. influenzae dùng yếu tố X để tổng hợp một số enzym như catalase,
peroxidase và các cytochrom của hệ thống vận chuyển điện tử. Máu và các
sản phẩm của máu, kể cả hemin là nguồn nguyên liệu truyền thống được sử
dụng để sản xuất yếu tố X. Thạch máu (5%) có khả năng cung cấp đủ lượng
yếu tố X mà H. influenzae cần thiết phát triển. Khi dùng hematin tinh chế thì
nồng độ cần thiết là 0,1 – 1,0 µg/ml. Yếu tố V là NAD hoặc NADP mặc dù có
mặt trong máu, nhưng một phần do chúng nằm bên trong tế bào. Mặt khác,
trong máu của nhiều loài động vật có NADase, nên trong máu tươi không có
NAD ở dạng tự do. Trong thạch chocolate, NAD được giải phóng ra khỏi tế
5
5
Hình 1.2. Hiện tượng khuẩn lạc "vệ tinh" của Haemophilus influenzae xung quanh các khuẩn lạc Staphylococcus aureus
bào và NADase bị phá huỷ. Khi dùng NAD tinh chế, nồng độ cần thiết là 0,2

- 1,0 µg/ml.
H. influenzae hiếu khí, đòi hỏi CO
2
(2-5%) khi mới phân lập. Mọc tốt
trên môi trường chocolate và Levinthal ở nhiệt độ khoảng 23-39
0
C, tối ưu là
37
0
C. Không mọc được trên thạch máu cừu; nếu mọc trên các loại thạch máu
khác (ví dụ máu thỏ) thì không gây tan máu và khuẩn lạc nhỏ hơn nhiều so
với trên chocolate trong cùng các điều kiện nuôi cấy khác. Cũng trên thạch
máu, người ta thấy các khuẩn lạc H. influenzae mọc xung quanh các khuẩn
lạc Staphylococcus aureus bội nhiễm thì rất to, trong khi đó ở những vùng xa
thì hoặc là không mọc, hoặc là rất bé. Hiện tượng này gọi là hiện tượng “vệ
tinh” (satellitism), do khả năng tiết ra yếu tố V của vi khuẩn bội nhiễm đã
giúp H. influenzae phát triển được thạch máu thông thường.
1.2.3.2. Các môi trường nuôi cấy và đặc điểm khuẩn lạc
Để nuôi cấy H. influenzae, có 3 loại môi trường có thể được được sử
dụng [3], [16], [17], [61]:
+ Thạch chocolate có hoặc không có 300µg Bacitracin/ml môi trường
(có tác dụng ức chế các vi khuẩn khác, đặc biệt là liên cầu) để tìm H.
6
6
influenzae. Đây là loại môi trường thường được sử dụng nhất trong nuôi cấy
và phân lập H. influenzae.
+ Thạch máu thỏ tươi 7% :
Sau khi nuôi cấy vi khuẩn vào môi trường phân lập, ủ ấm trong khí
trường 5% CO
2

(nếu không có tủ ấm CO
2
, môi trường nuôi cấy được đặt trong
một chuông thủy tinh và đốt 1 cây nến trong quả chuông này. Sau khi ngọn
nến tắt, khí trường bên trong quả chuông có thể là 3 - 5% CO
2
) ở 37
o
C trong
thời gian 18 - 24h.

(1) (2)
Hình 1.3: (1). Khuẩn lạc H. influenzae mọc trên môi trường
chocolate ; (2). Khuẩn lạc H. influenzae mọc trên môi trường thạch máu thỏ
tươi 7%. Sau 18 - 24h, quan sát các khuẩn lạc của H. influenzae mọc trên môi
trường với đặc điểm: khuẩn lạc nhỏ kích thước khoảng 1-2 mm, tròn, vồng
nhẹ và hơi trong, óng ánh khi chiếu sáng và không gây tan huyết.
Sau 16 - 18h nuôi cấy, Haemophilus influenzae phát triển thành những
khuẩn lạc bóng mờ, vồng nhẹ, đường kính từ 1- 2mm và không gây tan huyết.
7
7
Vi khuẩn Hib luôn có vỏ, khuẩn lạc thường sáng bóng, nhày ướt, óng ánh khi
ánh sáng chiếu vào và có đường kính lớn hơn. Ngoài ra, môi trường nuôi cấy
vi khuẩn thuần nhất thường có mùi hăng đặc biệt (hăng indole). Sau 24 - 48h,
trạng thái mất vỏ xuất hiện, tính óng ánh biến mất, vi khuẩn tự ly giải và có
thể tính chất bắt màu Gram thay đổi.
Trên môi trường lỏng, Haemophilus influenzae thường phát triển làm
đục môi trường. Tình trạng mất vỏ xảy ra sớm hơn trên môi trường thạch, vì
vậy nếu muốn xác định vỏ cần chọn thời điểm nuôi cấy thích hợp (18h).
Những đặc điểm này cũng cần phân biệt với các loại Heamophilus khác

ở những đặc điểm sau đây:
Tính chất
Loài
Tan huyết
Cần yếu tố
X
Cần yếu tố V Cần CO
2
H. influenzae - + + +
H. parainfluenzae - - + -
H. hemolyticus + + + -
H. parahemolyticus + - + ±
H. aphrophilus - + - +
H. paraphrophilus - - + +
Bảng 1.1: Những đặc điểm sinh học sinh học để phân biệt H.
influenzae với các Haemophilus khác.
1.2.3.2. Tính chất sinh hóa đặc trưng của H. influenzae và phương pháp xác
định
Tính chất sinh hóa đặc trưng của H. influenzae là nhu cầu đòi hỏi bắt
buộc 2 yếu tố phát triển là X và V trong môi trường nuôi cấy. Tính chất này
có thể được xác định bằng một trong các thử nghiệm sau [3], [16], [17], [61]:
- Thử nghiệm với yếu tố X và V:
8
8
Sử dụng một đĩa môi trường thạch dinh dưỡng Trypticasein Soya, cấy
vi khuẩn phân lập được nghi ngờ là H. influenzae lên một nửa đĩa thạch bằng
cách ria dày theo 3 hướng. Sau đó, đặt các khoanh giấy X, V và XV lên vùng
nuôi cấy, khoảng cách giữa các khoanh giấy là 1,5 - 2,0 cm. Ủ ở 37
o
C với khí

trường 5% CO
2
qua đêm rồi đọc kết quả:
+ Nếu vi khuẩn chỉ mọc xung quanh khoanh giấy XV hoặc giữa 2
khoanh giấy X và V thì đó chính là H. influenzae, nếu chỉ mọc xung quanh V
thì đó là H. parainfluenzae.
+ Nếu vi khuẩn chỉ mọc xung quanh khoanh giấy X và XV thì đó là H.
aphrophilus.
+ Nếu vi khuẩn mọc xung quanh khoanh giấy XV hoặc giữa 2 khoanh
giấy X và V, có gây tan huyết thì đó là H. hemolyticus.
Hình 1.4: Thử nghiệm với yếu tố X, V bằng 2 khoanh giấy X, V cho
kết quả là vi khuẩn đòi hỏi bắt buộc phải có cả 2 yếu tố X, V cho sự phát
triển.
9
9
Hình 1.5: Thử nghiệm với bằng 3 khoanh giấy X, V và XV, cho thấy vi
khuẩn đòi hỏi bắt buộc phải có cả 2 yếu tố X và V cho sự phát triển.
Hình 1.6: Vi khuẩn chỉ đòi hỏi bắt buộc phải có cả 1 yếu tố V cho sự
phát triển (H. parainfluenzae)
1
0
1
0
- Thử nghiệm "vệ tinh":
Hình 1.7: Thử nghiệm "vệ tinh" dương tính
Được thực hiện bằng cách cấy vi khuẩn phân lập được nghi ngờ là H.
influenzae lên cả đĩa thạch hoặc một nửa đĩa thạch máu thỏ (5%) với các
đường ria dày theo 01 hướng. Sau đó, bằng kỹ thuật vô trùng, dùng que cấy
lấy khuẩn lạc S. aureus chuẩn quốc tế cấy một đường thẳng lên bề mặt đĩa
thạch máu vuông góc với các đường đã nuôi cấy vi khuẩn nghi ngờ H.

influenzae. Để đĩa thạch máu đã nuôi cấy vào tủ ấm ở 37
o
C, 5 - 10% CO
2
khoảng 18 - 24 giờ thì đọc kết quả (hình 1.6).
+ Nếu trên đĩa thạch máu chỉ xuất hiện các khuẩn lạc của vi khuẩn thử
nghiệm mọc xung quanh đường cấy của vi khuẩn S. aureus thì được chẩn
đoán là thử nghiệm "vệ tinh" dương tính (vi khuẩn S. aureus có khả năng gây
tan máu, do đó sẽ giải phóng ra yếu tố V từ trong tế bào hồng cầu. Kết quả
môi trường thạch máu ban đầu chỉ có yếu tố X, nay có thêm yếu tố V)
1
1
1
1
+ Nếu trên đĩa thạch máu xuất hiện những khuẩn lạc mọc hầu hết trên
môi trường hoặc không thấy vi khuẩn thử nghiệm mọc, được chẩn đoán là thử
nghiệm "vệ tinh" âm tính.
- Xác định nhu cầu đòi hỏi bắt buộc 2 yếu tố phát triển X và V bằng đĩa
thạch Haemophilus Quad ID:
Hình 1.8: Đĩa thạch Haemophilus Quad ID
Đĩa thạch Haemophilus Quad ID được chia ra thành 4 phần (như hình
1.7): 1/4 đĩa thạch với môi trường có chứa haemin (yếu tố X), 1/4 đĩa thạch
với môi trường có chứa NAD (yếu tố V); 1/4 khác của đĩa thạch với môi
trường có chứa cả 2 yếu tố X và V; 1/4 đĩa thạch còn lại của với môi trường
thạch máu ngựa 5% dùng để phân biệt giữa H. hemolyticus (cũng đòi hỏi bắt
buộc phải có 2 yếu tố phát triển là X và V, nhưng lại có tính chất gây tan
máu) với H. influenzae.
Tiến hành thử nghiệm:
+ Pha chủng vi khuẩn nghi ngờ H. influenzae thuần vào canh thang
Trypticase soy hoặc nước cất để có độ đục tương đương với 0,5 Mc Farland.

+ Sử dụng que cấy vô trùng lấy đầy một ăng huyền dịch vi khuẩn cần
xác định cấy zích zắc lên từng 1/4 đĩa thạch Haemophilus Quad ID, bắt đầu từ
1
2
1
2
Chỉ có yếu tố X
Chỉ có yếu tố V
Gồm có yếu tố X và V
Môi trường thạch máu ngựa (có các khuẩn lạc gây tan máu)
1/4 có chứa yếu tố V và kết thúc ở 1/4 có chứa thạch máu (chú ý: cấy toàn bộ
môi trường ở từng 1/4 đĩa thạch, bắt đầu từ phía thành đĩa tới trung tâm của
đĩa thạch. Chọc que cấy vào phần 1/4 đĩa có chứa thạch máu để xác định tính
chất gây tan máu yếu).
+ Ủ môi trường nuôi cấy ở 37
o
C với khí trường 5% CO
2
qua đêm rồi
đọc kết quả bằng cách quan sát vùng thạch máu để xác định tính chất gây tan
máu và các vùng khác để xác định vi khuẩn có mọc hay không.
Hình 1.9: Đĩa thạch Haemophilus Quad ID: cho thấy vi khuẩn thử
nghiệm mọc trên cả 2 vùng: vùng 1/4 của đĩa thạch với môi trường có chứa cả
2 yếu tố X và V và 1/4 đĩa thạch lại của với môi trường thạch máu ngựa 5%
và có kèm theo tan máu. Vì vậy, vi khuẩn thử nghiệm ở đây là: H.
hemolyticus.
1
3
1
3

/ Nếu vi khuẩn thử nghiệm mọc trên cả 2 vùng: vùng 1/4 của đĩa thạch
với môi trường có chứa cả 2 yếu tố X và V và 1/4 đĩa thạch với môi trường
thạch máu ngựa 5% nhưng không có kèm theo tan máu thì đây là H.
influenzae.
/ Nếu vi khuẩn thử nghiệm mọc trên cả 2 vùng: vùng 1/4 của đĩa thạch
với môi trường có chứa cả 2 yếu tố X và V và 1/4 đĩa thạch chứa môi trường
thạch máu ngựa 5% nhưng có kèm theo tan máu, đây là H. hemolyticus
(không phải H. influenzae).
1.3. Đặc điểm phân loại theo typ huyết thanh, typ sinh học của
Haemophilus influenzae và phương pháp xác định
1.3.1. Đặc điểm phân loại Haemophilus influenzae theo typ huyết thanh
1.3.1.1. Cơ sở phân loại [3], [16], [17]
Năm 1930, H. influenzae được xác định thành 2 nhóm chính, đó là loài
không vỏ (không xác được typ huyết thanh - Non typeable) và loài có vỏ (xác
định được typ huyết thanh - Typeable). Dựa trên tính đặc hiệu kháng nguyên
của vỏ polysaccharide, H. influenzae có vỏ được chia ra thành 6 typ huyết
thanh từ a đến f.
1.3.1.2. Kỹ thuật xác định typ huyết thanh của Haemophilus influenzae typ b
- Xác định typ huyết thanh của Hi bằng phương pháp ngưng kết với
kháng huyết thanh đặc hiệu đa giá và đơn giá hoặc hoặc chỉ huyết thanh đơn
giá typ b [58].
Cách tiến hành:
Cho vào ống nghiệm sạch 0,5ml formalin 0,5% và hoà một ăng vi
khuẩn để tạo thành huyền dịch. Nhỏ một giọt huyền dịch vi khuẩn lên lam
kính và một giọt kháng nguyên Poly, trộn đều bằng cách lắc nhẹ phiến kính,
rồi quan sát bằng mắt thường.
1
4
1
4

(+)
(-)
/ Nếu phản ứng với huyết thanh Poly dương tính (xuất hiện các hạt
ngưng kết trong vòng 1 phút): thực hiện phản ứng ngưng kết với các typ
huyết thanh b. (Chú ý: để xác định những typ còn lại: a, b, c, d, e, f làm tương
tự như trên. Nếu chỉ xác định Hib thì chỉ cần làm phản ứng ngưng kết duy
nhất với huyết thanh mẫu typ b và không cần huyết thanh mẫu đa giá).
Hình 1.10: Phản ứng ngưng kết huyết thanh trong định typ H.
influenzae
/ Nếu phản ứng với huyết thanh Poly âm tính (không xuất hiện các hạt
ngưng kết trong vòng 1 phút), có nghĩa là vi khuẩn thuộc nhóm không xác
định được typ huyết thanh, do vậy không cần thực hiện các phản ứng với các
typ huyết thanh còn lại.
- Xác định typ huyết thanh của Hib bằng phương pháp khuếch đại gen
PCR [23]
+ Cặp mồi để xác định đoạn gen đặc hiệu của H. influenzae typ b:
Hib-1 (GCG AAA GTG ACC TCT TAT CTC TC)
và Hib-2 (GCT TAC GCT TCT ATC TCG GTG AA)
+ Phản ứng PCR của mỗi mẫu được thực hiện với thể tích cuối cùng là
50 µl, bao gồm: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 2 mM MgCl
2
, 200
µM mỗi loại dNTP, 2.5U Taq ADN polymerase và 40 pmol mỗi mồi. Quá
trình khuyếch đại gồm các thông số như sau: Giai đoạn 1: Biến tính: 95
o
C
trong 2 phút; Giai đoạn 2: Gắn mồi: 55
o
C trong 2 phút; Giai đoạn 3: Kéo dài:
72

o
C trong 2 phút. Quá trình này được thực hiện với 35 chu kỳ, sau đó được ủ
1
5
1
5
trên 6 phút ở 72
o
C và sau đó giữ ở 4
o
C cho đến khi phân tích. Sản phẩm
khuyếch đại là đoạn gen có kích thước là 480 bp.
+ Các thành phần tham gia phản ứng ở các mẫu bệnh phẩm được chứa
trong ống nghiệm đều giống nhau, chúng chỉ có thể khác nhau về ADN của
từng chủng (luôn có chứng âm và chứng dương đi kèm mẫu khi làm phản ứng
để kiểm tra kết quả)
+ Các sản phẩm sau khi chạy PCR được điện di trên gel agarose 1,5%
với dung dịch đệm TAE.
+ Điện di với hiệu điện thế 100V, cường độ 80mA trong thời gian 20
phút (các mẫu thực nghiệm được điện di song song cùng với chứng âm và
chứng dương). Luôn có thang ADN chuẩn để đối chiếu kết quả khi đọc.
+ Bản gel sau khi điện di được ngâm trong dung dịch Ethidium
Bromide 1% pha loãng trong nước cất (trong 10 phút), sau đó vớt bản gel ra
ngâm vào nước cất 10 phút để khử Ethidium Bromide bám không đặc hiệu
vào thạch. Sau khi nhuộm, các vạch ADN sẽ phát sáng dưới ánh đèn UV.
+ Đọc kết quả bằng mắt hoặc chụp ảnh trong buồng tối dưới tia UV.
1.3.2. Đặc điểm phân loại Haemophilus influenzae theo typ sinh học
1.3.2.1. Cơ sở phân loại [17]
Kilian đã đưa ra phương pháp sử dụng các thử nghiệm sinh hoá để xác
định biotype và đặc điểm của các loài Haemophilus. Từ kết quả của 3 thử

nghiệm sinh hoá là tìm khả năng sinh Indol, hoạt động của hai enzym Urease
và Decarboxylase của vi khuẩn, Kilian trước đây đã chia H. influenzae thành
4 biotype từ I đến IV. Phân loại theo biotype này độc lập với phân loại theo
typ huyết thanh của H. influenzae, bởi vì những chủng vi khuẩn này không có
vỏ cũng cho kết quả tương tự với các phản ứng sinh hoá. Cho nên, sau này
cũng với các thử nghiệm tương tự Kilian đã bổ sung thêm 4 biotype từ V đến
1
6
1
6
N
H
CH
2
-CH-COOH
NH
2
Tryptophanase
N
H
CH
3
C=O
COOH
+ NH3
+
Tryptophan
Indol
Sơ đồ 1.1: Phản ứng giáng hoá Tryptophan


N
H
HCl
Alcohol
NH
CH
N
+
(CH
3
)
2
+
CHO
N(CH
3
)
2

Phản ứng oxi hoá khử
Sơ đồ 1.2 : Phản ứng tạo phức hợp mầu đỏ
VIII. Vì vậy, H. influenzae được chia ra làm 8 typ như sau theo tiêu chuẩn của
Killian:
Biotype
Các tính chất hoá học
Test urê Test Indol Ornithin decarboxylase (ODC)
I + + +
II + + -
III + - -
IV + - +

V - + +
VI - - +
VII - + -
VIII - - -
Bảng 1.2: Bảng tiêu chuẩn phân loại Haemophilus influenzae theo
biotype.
- Test thử Indol, được dựa trên khả năng sinh enzym tryptophanase của
vi khuẩn. Enzym này có khả năng thuỷ phân acid amin tryptophan trong môi
trường nuôi cấy thành indol, axit pyruvic và amoniac. Indol tạo thành sẽ được
phát hiện bởi thuốc thử Kovac có chứa p - dimethylaminobenzaldehyd để tạo
thành một phức hợp mầu đỏ. (Theo sơ đồ 1.1; 1.2)
1
7
1
7
H
2
N
NH
2
C
O
+ 2H
2
O CO
2
+ H
2
O + 2NH
3

Urease
Urê
Carbonic Amoniac
Sơ đồ 1.3: Phản ứng phân huỷ Urê
NH2 - C - C - C - C - COOH
H H H H
H H H NH2
NH2 - C - C - C - C - NH2
H H H H
H H H H
CO2
+
Onithine
Decarboxylase
Ornithine Putrescine Carbonic
Sơ đồ 1.4: Phản ứng khử carboxyl của ornithine
- Test thử Urease: Dựa trên khả năng sinh enzym urease của vi khuẩn,
enzym này có hoạt động thuỷ phân urê thành carbonic và amoniac, trong đó
amoniac lại có tính chất kiềm. Cho nên, khi trong môi trường nuôi cấy có chất
chỉ thị đỏ - phenol, dẫn đến chuyển mầu môi trường từ mầu đỏ sẫm (red) của
phenol sang mầu đỏ cánh sen (purple) vì môi trường bị kiềm tính. (Sơ đồ 1.3)
- Test thử Ornithin decarboxylase: Dựa trên khả năng sinh enzym
ornithin decarboxylase của vi khuẩn. Enzym này có khả năng khử carboxyl
của ornithin trong môi trường nuôi cấy thành putrescine và carbonic. Do vậy,
quá trình này sẽ làm kiềm hoá môi trường và đây chính là cơ sở của thử
nghiệm này. (Sơ đồ 1.4)
1.3.2.2. Kỹ thuật xác định typ sinh học của Haemophilus influenzae
Hiện nay để xác định typ sinh học của H. influenzae, bộ sinh vật hoá
học Api 10s (bioMérieux) thường được sử dụng nhất. Kỹ thuật này được thực
hiện như sau [2]:

1
8
1
8
- Hoà khuẩn lạc vi khuẩn H. influenzae vào 1 ml dung dịch NaCl 9
o
/oo
vô khuẩn rồi lắc tan thành huyền dịch để tạo huyền dịch 1-2 Mc Faland.
- Tạo hộp ẩm bằng cách nhỏ vài giọt nước sạch.
- Dùng pippett vô khuẩn hút huyền dịch vi khuẩn, nhỏ vào 3 hốc cần
làm phản ứng (Ure, Indol và ODC) của bộ sinh vật hoá học Api 10s (bio
Mérieux).
- Để 24 giờ, sau đó đọc kết quả theo hướng dẫn của nhà sản xuất và xác
định typ sinh học của Haemophilus influenzae theo tiêu chuẩn của Kilian.
1.4. Miễn dịch [6], [16]
Miễn dịch tự nhiên đối với H. influenzae typ b rất đa dạng, bao gồm một
sự hợp nhất phức tạp của nhiều thành phần hệ thống miễn dịch: 1) Các yếu tố
miễn dịch niêm mạc, 2) Các kháng thể dịch thể, 3) Sự opsonin hóa và việc
hoạt hóa các phản ứng viêm qua trung gian bổ thể, 4) Khả năng thực bào, diệt
vi khuẩn bởi những đại thực bào và tế bào đa nhân, 5) Chức năng miễn dịch
qua trung gian tế bào lympho T. Trong đó khó có thể đánh giá rạch ròi những
cơ chế miễn dịch nào là quan trong nhất trong cơ chế bảo vệ cơ thể vật chủ.
Tuy nhiên, hầu hết những cá thể có được khả năng miễn dịch bảo vệ trong
những năm đầu của cuộc đời mà không mắc bệnh nhiễm khuẩn Hib lan tràn.
Khả năng miễn dịch thu được một cách tự nhiên này, đó là kết quả của đáp
ứng với sự xâm nhiễm họng - mũi của Hib cũng như sự xâm nhiễm không
triệu chứng ở ruột của hệ vi khuẩn đường ruột bình thường, dẫn đến có phản
ứng chéo với kháng nguyên Hib [14]. Mối liên quan tỷ lệ nghịch giữa nguy cơ
mắc bệnh nhiễm khuẩn do Hib đặc thù với tuổi và nồng độ kháng thể tự nhiên
kháng Hib có được trong những năm tháng đầu của cuộc đời đã nêu lên tầm

quan trọng của kháng thể trong việc bảo vệ cơ thể khỏi bệnh nhiễm khuẩn lan
tràn do Hib. Hiện tượng này được mô tả đầu tiên bởi Fothergill và Wright
năm 1933 [20], người ta biết trẻ sơ sinh đã có được kháng thể diệt khuẩn
1
9
1
9
Đại thực bào
Hình 1.11 Đại thực bào nuốt vi khuẩn H. influenzae bị opsonin hóa bởi kháng thể đặc hiệu của kháng nguyên vỏ và kháng nguyên thân [16].

Kháng thể (Kháng nguyên thân)
Kháng nguyên thân (LPS và protein màng ngoài)
Vỏ (Polyribosyl-ribitol phosphate)
Kháng thể (Kháng nguyên vỏ)
Immunoglobulin G (IgG) từ mẹ, những kháng thể này yếu dần đi trong những
tháng tuổi đầu tiên, đồng thời với nguy cơ nhạy cảm theo tuổi giữa tháng tuổi
thứ 6 cho đến 2-4 tuổi nên để bảo vệ cơ thể cần phải thông qua việc gây miễn
dịch chủ động.
Mặc dù đặc điểm miễn dịch tự nhiên đối với Hib là miễn dịch đáp ứng
với vài loại kháng nguyên bề mặt của vi khuẩn này, song kháng thể kháng
polysaccharide vỏ thuộc typ b (PRP) dường như có tầm quan trọng nhất. Đối
với loài H. influenzae typ b, 90% tổng số các kháng thể kháng PRP có khả
năng hoạt hóa bổ thể giúp tăng hoạt động thực bào và diệt vi khuẩn nhờ
opsonin hóa để bảo vệ cơ thể. Ở người, trước khi có kháng sinh, việc sử dụng
thụ động globulin miễn dịch chống lại Hib đã là phương pháp để điều trị hiệu
2
0
2
0
quả bệnh nhiễm khuẩn lan tràn này. Tuy nhiên, kháng nguyên vỏ của Hib lại

không được nhận biết bởi đại thực bào và tế bào lympho T nhưng lại kích
thích các dòng tế bào lympho B đặc hiệu, do đó được gọi là kháng nguyên
độc lập với tế bào T. Vì vậy, kháng nguyên vỏ của Hib sẽ bị hạn chế về khả
năng đáp ứng miễn dịch, không hoạt hóa được các tế bào lympho T hỗ trợ đặc
hiệu. Tế bào T hỗ trợ tác động đến sự chín muồi, biệt hóa và tăng sinh các tế
bào B để những tế bào này trở thành tương bào sản xuất kháng thể. Tế bào T
hỗ trợ cũng có một thời gian sống dài và tạo nên trí nhớ miễn dịch cần thiết
cho đáp ứng tăng cường tiếp theo khi cơ thể tiếp xúc trở lại với kháng nguyên
này. Kết quả của những đáp ứng kháng thể thiếu sự tham gia của tế bào T
thì hiệu lực miễn dịch sẽ thấp. Để khắc phục nhược điểm này, thành phần
PRP đã được cộng hợp (liên kết cộng hóa trị) với nhiều loại protein có tính
sinh miễn dịch để tăng cường khả năng nhận biết của đại thưc bào và tế bào T
trong sản xuất vacxin, để có các ưu điểm như sau:
1) Tạo được nồng độ kháng thể cao hơn, đặc biệt ở trẻ nhỏ.
2) Khi nhắc tiêm nhắc lại, vacxin sẽ kích thích miễn dịch tăng lên, vì
thế đây là một phương pháp làm tăng tối đa tính miễn dịch.
3) Đáp ứng miễn dịch chín muồi hơn, đặc thù hơn bởi sự chiếm ưu thế
của các kháng thể IgG-1.
4) Việc dùng trước hay dùng đồng thời các protein mang (dạng hapten-
như độc tố uốn ván hoặc bạch hầu) đã tăng cường sự đáp ứng của tế bào T,
nhờ đó làm tăng tối đa các đáp ứng miễn dịch với PRP khi cộng hợp với chất
mang.
Chương II
ĐẶC ĐIỂM TRẺ KHỎE MẠNH
2
1
2
1
CÓ MANG HAEMOPHILUS INFLUENZAE TYP B VÀ
CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG

2.1. Khái niệm người khỏe mạnh có mang Haemophilus influenzae typ b
và các phương pháp xác định
2.1.1. Khái niệm về người khỏe mạnh mang vi khuẩn (Hib)
Người khỏe mạnh mang vi khuẩn (carriers) là những người mang vi
khuẩn gây bệnh trong cơ thể mà không có biểu hiện triệu chứng hoặc không
phát hiện thấy dấu hiệu đáp ứng miễn dịch của cơ thể [6].
Trạng thái mang vi khuẩn của cơ thể có thể tồn tại với thời gian ngắn
hoặc dài, có thể gián đoạn hoặc liên tục. Những người mang vi khuẩn thường
có khả năng lây truyền cho người khác. Vì vậy, người lành mang Hib đồng
nghĩa với vi khuẩn này định cư trên cơ thể và xác định được sự xuất hiện của
vi khuẩn Hib sống ở màng nhày họng (pharyngeal mucosa). Tuy nhiên, kết
quả xác định này phụ thuộc vào độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp xét
nghiệm tìm vi khuẩn Hib còn sống ký sinh ở màng nhày họng người khỏe
mạnh [6].
2.1.2. Phương pháp xác định
Trong hầu hết các nghiên cứu điều tra về người khỏe mạnh mang Hib,
khó khăn xảy ra trong việc phân lập vi khuẩn này có thể dẫn đến kết quả tỷ lệ
mang Hib thu được thường thấp hơn so với thực tế. Qua một số nghiên cứu,
cho thấy phương pháp sử dụng tăm bông lấy bệnh phẩm từ họng miệng
(oropharyngeal) dùng để nuôi cấy xác định người lành mang Hib thường có
kết quả tương tự hoặc cao hơn so với nuôi cấy từ tăm bông lấy bệnh phẩm ở
họng mũi (nasopharyngeal) [37].
Trạng thái người khỏe mạnh mang Hib thường được xác định bằng các
kỹ thuật nuôi cấy. Vì vậy, tất cả các bước thực hiện trong kỹ thuật xét nghiệm
2
2
2
2
Hốc mũi
Lưỡi

Thanh quản
Họng mũi
Họng miệng
Thanh quản-hầu
(vùng dưới hầu)
Thực quản
dùng cho nghiên cứu điều tra vi sinh này cần phải đạt được độ chuẩn xác tối
đa. Các sai số có khả năng xảy ra trong quá trình xác định tỷ lệ Hib ký sinh ở
họng người khỏe mạnh, bao gồm: kỹ thuật ngoáy họng (đây là kỹ thuật khó
duy trì ổn định), sự sống sót của vi khuẩn trong quá trình vận chuyển bệnh
phẩm cho đến khi nuôi cấy vào môi trường; và sự xuất hiện nhiều vi khuẩn
khác nhau có trong bệnh phẩm nhưng lại có sự tương đồng về hình thái khuẩn
lạc, nên có thể dẫn đến chọn khuẩn lạc nhầm. Sự khác biệt của các phương
pháp nuôi cấy được sử dụng trong phân lập Hib từ tăm bông ngoáy họng là
yếu tố chính dẫn đến những khó khăn và phức tạp trong việc giải thích các số
liệu từ các nghiên cứu khác nhau [6].
Hình 2.1. Hình ảnh giải phẫu đường hô hấp trên
2.2. Dịch tễ học của trẻ khỏe mạnh mang Hib và một số yếu tố ảnh hưởng
2
3
2
3
Những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến dịch tễ học của Hib, đó là
yếu tố xã hội học (soccial) và nhân khẩu học (demographic). Khả năng mang
Hib ở trẻ nhỏ dường như có liên quan rất gần đến khả năng, mức độ phơi
nhiễm (likelihood of exposure to the organisms) đối với vi khuẩn này [6].
H. influenzae là thành viên của hệ vi khuẩn ký sinh ở đường hô hấp
trên. Trong đó, H. influenzae typ b có ở 1-5% trẻ em khoẻ mạnh và không có
biểu hiện bệnh [16]. Tỷ lệ mang vi khuẩn thấp nhất ở người lớn và trẻ nhỏ,
cao nhất ở lứa tuổi mẫu giáo [34], [54], [59]. Hầu hết các điều tra đều cho

thấy, nuôi cấy từ tăm bông bệnh phẩm ngoáy họng miệng hay họng mũi phát
hiện thấy Hib có khoảng 3 - 5% trẻ nhỏ dưới năm tuổi [30], [52], đây là lứa
tuổi với tỷ lệ mang Hib được xem là nổi trội nhất [29]. Một số nghiên cứu
trong nước và trên thế giới đã cho thấy:
- Tại Việt Nam, nghiên cứu của Lê Huy Chính và cộng sự về tỷ lệ trẻ
em dưới 60 tháng mang H. influenzae (chưa có điều kiện định typ huyết
thanh) ở cộng đồng một số tỉnh miền Bắc cho kết quả: 21,4% (trẻ dưới 12
tháng); 35,5% (trẻ 13 - 24 tháng); 32,5% (trẻ 25 - 36 tháng); 27,7% (trẻ 37 -
48 tháng) và 31,6% (trẻ 49 - dưới 60 tháng) [1].
- Trên thế giới, hầu hết các nghiên cứu về trẻ khỏe mạnh mang H.
influenzae đều được định typ huyết thanh. Nghiên cứu của Staphanie H.
Factor và cộng sự về tỷ lệ trẻ dưới 5 tuổi có mang Hib tại Châu Á, cho thấy tỷ
lệ chung là 6%. Trong đó: 3% (trẻ 2 – 5 tháng); 10% (trẻ 6 - 11 tháng); 5%
(trẻ 12 - 23 tháng); 8% (trẻ 24 - 35 tháng); 4% (trẻ 36 - 47 tháng) và 5% (trẻ
48 - 59 tháng) [22]. Nghiên cứu khác của Gómez, Elizabeth và cộng sự về
dịch tễ học của trẻ khỏe mạnh mang Hib tại Santo Domingo, nước cộng hòa
Dominic cho thấy tỷ lệ trẻ mang Hib: 1,5% (trẻ dưới 5 tháng); cao nhất 12,5%
(trẻ 6 - 11 tháng); 6% (trẻ 12 - 23 tháng); 7,9% (trẻ 24 - 35 tháng); 9,8% (trẻ
2
4
2
4
36 - 47 tháng) [26]. Tại Thổ Nhĩ Kỳ, nghiên cứu của Muge Oguzkaya – Artan
và cộng sự cho thấy tỷ lệ trẻ nhỏ ở lứa tuổi 5 – 7 mang Hib với tỷ lệ là 4,2%
[45]. Nghiên cứu của Lucia Ferro Bricks tại Sao Paulo Brasil với 1200 trẻ nhỏ
dưới 6 tuổi được chăm sóc tại 29 Nhà trẻ Taubaté (trong đó, 213 trẻ không
tham dự, còn lại 987) cho thấy 172 trẻ phân lập được Hi (17,4%), trong đó có
73 chủng là Hib. Nghĩa là tỷ lệ trẻ mang Hib ở các nhà trẻ được nghiên cứu là
7,4% [15].
Qua các nghiên cứu, đều cho thấy tỷ lệ mang Hib ở những trẻ được

chăm sóc tại các nhà trẻ thường rất cao. Trong đó, tỷ lệ mang Hib thấp ở lứa
tuổi dưới 6 tháng, tỷ lệ cao nhất trong lứa tuổi từ 6 tháng – 5 tuổi (6 – 11
tháng) và giảm dần cho đến tuổi trưởng thành [6], [22], [36], [37], [52], [54],
[56].
Tuy nhiên, còn một số yếu tố khác có thể làm tăng hoặc giảm tỷ lệ trẻ
khỏe mạnh mang vi khuẩn Hib.
2.2.1. Ảnh hưởng của điều kiện sống lên tỷ lệ trẻ khỏe mạnh mang Hib
Điều kiện sống đông đúc như ở các hộ gia đình, các trung tâm chăm
sóc trẻ ban ngày cũng góp phần làm cho tỷ lệ mang vi khuẩn Hib ở trẻ nhỏ có
thể cao hơn một cách đáng kể. Một số nghiên cứu cho thấy tại những cơ sở
chăm sóc trẻ, khi có xảy một nhiễm khuẩn xâm lấn do Hib, tỷ lệ mang vi
khuẩn này ở những đứa trẻ khác trong nhóm là 58% ở các trung tâm chăm sóc
trẻ ban ngày và 91% ở các nhà giữ trẻ nhỏ hơn. Tương tự, trong một gia đình,
khi có một trường hợp bị nhiễm bệnh xảy ra, tỷ lệ nhiễm khuẩn đã được khảo
sát là 60-70% giữa các anh em ruột và 20% ở các bậc cha mẹ [6], [36], [38].
Tuy nhiên, một số nghiên cứu cũng báo cáo tỷ lệ nhiễm khuẩn H. influenzae
typ b cao ở một số trung tâm chăm sóc trẻ ban ngày cho dù tại đó không có
2
5
2
5