BULLERA NINHBINHENSIS SP. NOV., MỘT LOÀI
NẤM MEN MỚI SINH BÀO TỬ BẮN ĐƯỢC PHÂN
LẬP Ở VIỆT NAM

Đào Thị Lương, Phạm Văn Ty, Nguyễn Lân Dũng.
Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật, Trung tâm Công nghệ
Sinh học, ĐHQGHN
Masako Takashima, Takashi Nakase
Bảo tàng Vi sinh vật Nhật Bản, Viện nghiên cứu Hoá Lý,
Saitama, Nhật Bản.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ 20 mẫu lá cây thu thập ở Vườn Quốc gia Cúc Phương,
đã phân lập được 120 chủng nấm men sinh bào tử bắn.
Năm chủng thuộc chi Kockovaella là đại diện của 4 loài
mới là: Kockovaella calophylli, K. cucphuongensis, K.
litsea và K. vietnamensis đã được công bố [6]. Trong bài
báo này chúng tôi thông báo một trong số 17 các loài chưa
biết của chi Bullera [1].

II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

- Chủng nấm men sử dụng: Chủng nấm men VY-112 được
phân lập từ bề mặt lá cây dong (Phrygnum parviflorum
Gagnep), thuộc họ Marantaceae mọc ở Vườn Quốc gia Cúc
Phương, Ninh Bình, theo phương pháp của Nakase và
Takashima [9].

- Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá: Theo mô tả của
Yarrow [16]. Khả năng đồng hoá nitơ được xác định theo
phương pháp của Nakase và Suzuki [8]. Vitamin đòi hỏi

bắt buộc được xác định theo Komagata và Nakase [5].

- Các đặc điểm hoá phân loại (chemotaxonomy): Tách
chiết, tinh sạch và xác định ubiquinone theo phương pháp
của Nakase và Suzuki [8]. Xyloza trong tế bào được phân
tích bằng sắc ký lớp mỏng theo Nakase và cộng sự [7], sau
khi thuỷ phân tế bào bằng axit trifluroaxetic theo Suzuki và
Nakase [12].

- Phân tích trật tự và xây dựng cây phát sinh: Trật tự của
rADN 18S và ITS bao gồm cả rADN 5,8S được xác định
theo phương pháp của Takashima và Nakase [13], sử dụng
chương trình computer CLUSTAL W ver 1.74 của
Thompson và cộng sự [15]. Các trật tự tham khảo dùng
trong nghiên cứu cây phát sinh chủng loại được lấy từ dữ
liệu của DDBJ, EMBL, Gen Bank. Cây phát sinh được xây
dựng theo Kimura [4] sử dụng phương pháp của Saitou và
Nei [10]. Các khoảng trống tồn tại trong các sequence được
loại trừ. Các phân tích Bootstrap theo Felsenstein [2] được
thực hiện từ 1000 mẫu. Để so sánh các sequence của vùng
rADN ITS trong các loài có quan hệ họ hàng gần, các
sequence được so sánh từng cặp bằng mắt thường.

- Thí nghiệm lai ADN-ADN: Phân lập và tinh sạch ADN
thực hiện theo phương pháp của Takashima và Nakase
[14]. Thành phần của ADN được xác định bằng sắc ký lỏng
cao áp. Các thí nghiệm lai ADN-ADN được thực hiện theo
phương pháp lọc màng của Hamamoto và Nakase [3].

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN


Bullera, một chi nấm men sinh bào tử bắn đã được mô tả từ
năm 1930 bởi Derx [1]. Chi này được đặc trưng bởi bào tử
dạng đối xứng; khuẩn lạc màu trắng đến ngà; sinh sản theo
2 cách: Bằng bào tử bắn và bằng tế bào nảy chồi;
ubiquinone chủ yếu là Q-10 và chứa xyloza trong tế bào.
Chủng nấm men VY-112, phân lập từ bề mặt lá cây dong
(Phrygnum parviflorum Gagnep), thuộc họ Marantaceae ở
Vườn Quốc gia Cúc Phương, có đầy đủ các đặc điểm đặc
trưng trên và được xác định vào chi Bullera.

Trật tự 1780 bazơ của rADN 18S của chủng VY-112 đã
được xác định. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng
giữa chủng VY-112 với 34 loài của các chi Bullera,
Cryptococcus, Fellomyces, Kockovaella và các chi nấm
men khác. Kết quả cho thấy chủng VY-112 nằm trên một
nhánh tách rời và có quan hệ gần gũi với Cryptococcus
podzolicus (Hình 1).

Xác định thành phần ADN của G+C cho thấy chủng VY-
112 có tỷ lệ 59,9 G+C mol%, còn Cryptococcus podzolicus
lại có tỷ lệ 56,8 G+C mol%.

Trật tự 274 bazơ của các đoạn rADN ITS cũng đã được xác
định (Hình 2) và tỷ lệ bazơ giống nhau đã được tính giữa
VY-112 và Cryptococcus podzolicus. Ở đoạn ITS 1 có tỷ lệ
85,8 % ba zơ giống nhau và 81,5% giống nhau ở đoạn ITS
2. Kết quả này cho thấy chủng VY-112 khác biệt với
Cryptococcus podzolicus [11].


Nghiên cứu về các đặc điểm sinh lý và sinh hoá cũng chỉ rõ
chủng VY-112 khác hẳn Cryptococcus podzolicus (Bảng 1)

Các kết quả trên khẳng định chắc chắn rằng chủng VY-112
là đại diện của một loài mới.
Loài này được chúng tôi đặt tên là Bullera ninhbinhesis.

Mô tả loài mới

Bullera ninhbinhensis Luong, Takashima, Ty, Dung et
Nakase, sp. nov.
In liquido “YM” post dies 5 ad 17˚C, cellulae vegetativae
sphaericae vel ovoideae aut elongatae, 2.0-6.0x3.0-8.0 m,
singulae, binae aut in catenis. Post unum mensem ad 17˚C,
pellicula et sedimentum formantur. Cultura in agaro “YM”,
subflava, glabra, non-nitida, mollis,butyracea et margine
glabra. Mycelium et pseudomycelium non formatur.
Ballistoconidia rotundae vel napiformes, 2.0-2.5x1.5-2.0
m
Fermentatio nulla. Glucosum, galactosum, L-sorbosum
(exiguum), sucrosum, maltosum, cellobiosum, trehalosum,
lactosum(exiguum), melibiosum(exiguum),
raffinosum(exiguum), melezitosum, amylum solubile, D-
xylosum, L-arabinosum, D-arabinosum, D-
ribosum(exiguum), L-rhamnosum, ethanolum, glycerolum
(exiguum), erythritolum (exiguum), galactitolum, D-
mannitolum (lente), D-glucitolum (lente), -methyl-D-
glucosidum, salicinum (exiguum), glucuno--lactonum,
acidum 2-ketogluconicum, acidum 5-ketogluconicum,
acidum D-glucuronicum, acidum D-galacturonicum,

acidum DL-lacticum, acidum succinicum, acidum citricum
(exiguum) et inositolum(exiguum) assimilantur at non
ribitolum nec inulinum,. Ammonium sulfatum,
cadaverinum, ethylaminum, kalium nitricum et L-lysinum
assimilantur at non natrium nitrosum. Maxima temperatura
crescentiae: 32-33˚C. Ad crescentiam thiaminum
necessarium est. Materia amyloidea iodophila non
formantur. Ureum hydrolysatur. Diazonium caeruleum B:
Positivum. Proportio molaris guanini+cytosini in acido
deoxyribonucleico: 59,9 mol% per HPLC. Systema
ubiquini: Q-10. Xylosum in cellulis presens.

Holotypus: Isolatus ex folio Phrygnum parviflorum,
Vietnam, VTCC1 0184 (originaliter ut VY-112)
conservatur in collectionibus culturarum quas “Vietnam
Type Culture Collection”, Hanoi, Vietnam sustentat.

Nuôi cấy trên môi trường YM dịch thể: Sau 5 ngày nuôi ở
17
0
C các tế bào dinh dưỡng có dạng cầu tới oval, một số tế
bào dạng thuôn dài, kích thước 2,0-6,0x3,0-8,0 m, chúng
thường đơn độc, thành cặp hoặc thành nhóm, sinh sản bằng
nảy chồi. Sau một tháng nuôi ở 170C thấy xuất hiện một
lớp cặn mỏng ở đáy và một lớp váng mỏng dễ tan ở thành
ống nổi trên bề mặt môi trường.

Nuôi cấy trên môi trường YM thạch nghiêng: Sau một
tháng nuôi cấy vạch, khuẩn lạc màu vàng nhạt, nhẵn đục,
mềm và có mép trơn.


Nuôi cấy trên môi trường thạch-bột ngô ở đĩa Petri: Khuẩn
ty thật và khuẩn ty giả đều không được tạo thành sau 2 tuần
ở 250C.

Bào tử bắn: Bào tử bắn được tạo thành nhiều trên môi
trường thạch -bột ngô, sau 3 ngày nuôi ở nhiệt độ 17
0
C.
Bào tử bắn có dạng cầu tới nhọn một đầu, kích thước 2,0-
2,5x1,5-2,0 m.

Khả năng lên men: Không có khả năng lên men.
Khả năng đồng hoá các nguồn cacbon:



Khả năng đồng hoá các nguồn Nitơ:



Nhiệt độ sinh trưởng cực đại: 32-33
0
C.
Vitamin đòi hỏi bắt buộc: Tiamin.
Cơ chất tạo thành giống tinh bột: Âm tính.
Phản ứng mầu với Diazonium blue B: Dương tính.
Phân giải ure: Dương tính.
Tách axít béo: Âm tính.
Hoá lỏng gelatin: Yếu

Sinh trưởng trên môi trường chứa 50% glucoza: Âm tính.
Sinh axít trên môi trường glucoza: Yếu
Thành phần C+G của DNA: 59,9 mol % (bằng sắc ký lỏng
cao áp).
Hệ thống ubiquinon: Q-10.
Xyloza trong tế bào: Có mặt

Chủng kiểm tra: Chủng VY-112 do Đào Thị Lương phân
lập năm 1999 từ lá cây dong (Phrygnum parviflorum
Gagnep), mọc ở vườn Quốc gia Cúc Phương, Ninh Bình.
Chủng này đang được bảo quản tại Bảo tàng Giống Vi sinh
vật, Đại học Quốc gia Hà Nội.


TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Đào Thị Lương, Phạm Văn Ty, Nguyễn Lân
Dũng(2001). Khảo sát các loài nấm men sinh bào tử bắn
thuộc các chi Bullera và Kockovaella mới tìm thấy ở Việt
Nam. Hội thảo Quốc tế Sinh học. Hà Nội – Việt Nam (2-5
tháng 7). Tr. 140-145
2. Boekhout, T. & Nakase, T. (1998). Bullera Derx. In
The Yeasts, a Taxonomic Study, 4th ed., ed. By Kurtzman,
C. P. and Fell, J. W., Elsevier, Amsterdam, pp. 731-741.
3. Felsenstein, J. (1985). Confidence limits on
phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution.,
39, 783-791.
4. Hamamoto, M. and Nakase, T. (1995). Ballistosporous
yeasts found on the surface of plant materials collected in
New Zealand. Six new species in the genus

Sporobolomyces. Antonie van Leeuwenhoek., 67, 151-171.
5. Kimura, M. (1980). A simple method for estimating
evolutionary rate of base substitutions through comparative
studies of nucleotide sequences. J. Mol. Evol., 16, 111-120.
6. Komagata, K. and Nakase, T. (1967). Reitoshokuhin
no biseibutsu ni kansuru kenkyu. V. Shihan reitoshokuhin
yori bunri shita kobo no seijo (Microbiological studies on
frozen foods. V. General properties of yeast isolated from
frozen foods) (in Japanese). Shokuhin Eiseigaku Zasshi., 8,
53-57.
7. Luong, D.T., Takashima, M., Ty, P. V., Dung, N. L.,
and Nakase, T. (2000). Four new species of Kockovaella
isolated from plant leaves collected in Vietnam. J. Gen.
Appl. Microbiol., 46, 297-301.
8. Nakase, T., Komagata, K. and Fukazawa, Y. (1976).
Candida pseudointermedia sp. nov. isolated from
“Kamaboko”, a traditional fish-past product in Japan. J.
Gen. Appl. Microbiol., 22, 177-182.
9. Nakase, T. and Suzuki, M. (1986). Bullera
megalospora, a new species of yeast forming large
ballistospores isolated from dead leaves of Oryza sativa,
Miscanthus sinensis, and Sasa sp. in Japan. J. Gen. Appl.
Microbiol., 32, 225-240.
10. Nakase, T. and Takashima, M. (1993). A simple
procedure for the high frequency isolation of new taxa of
ballistosporous yeast living on the surfaces of plants.
RIKEN Rev., 3, 33-34.
11. Saitou, N. and Nei, M. (1987). The neighbor-joining
method: A new method for reconstructing phylogenetic
tree. Mol. Biol. Evol., 4, 406-425.

12. Sugita, T., Nishikawa, A., Ikeda, R. and Shinoda, T.
(1999). Identification of Medically Relevant Trichosporon
Species Based on Sequences of Internal Transcibed Spacer
Regions and Construction of a Database for Trichosporon
Identification. J. Clin. Microbiol., 37, 1985-1993.
13. Suzuki, M. and Nakase, T. (1988). The distribution
of xylose in the cells of ballistosporous yeasts. Application
of high performance liquid chromatography without
derivatization to the analysis of xylose in whole cell
hydrolysates. J. Gen. Appl. Microbiol., 34, 95-103.
14. Takashima, M. and Nakase, T.(1999). Molecular
phylogeny of the genus Cryptococcus and related species
based on the sequences of 18S rDNA and internal
transcribed spacer regions. Microbiol. Cult. Coll., 15, 33-
45.
15. Takashima, M. and Nakase, T. Four new species of
the genus Sporobolomyces isolated from leaves in
Thailand, Mycoscience (Accepted).
16. Thompson, J. D., Higgins, D. G. and Gibson, T. J.
(1994). CLUSTAL W: Improving the sensitivity of
progressive multiple sequence alignment through sequence
weighting, position-specific gap penalties and weight
matrix choice. Nucleic Acids Res., 22, 4673-4680.
17. Yarrow, D. (1998). Methods for the isolation,
maintenance and identification of yeasts. In The Yeasts, a
Taxonomic Study, 4th ed., ed. by Kurtzman, C. P. and Fell,
J. W., E lsevier, Amsterdam, pp. 77-100.

SUMMARY


BULLERA NINHBINHENSIS SP. NOV., A NEW
BALLISTOCONIDIOGENOUS YEAST ISOLATED
FROM VIETNAM

Dao Thi Luong, Pham Van Ty, Nguyen Lan Dung
Masako Takashima, Takashi Nakase

A ballistoconidiogenous yeast strain (VY-112), isolated
from a leaf of Phrygnum parviflorum Gagnep at Cuc
Phuong National Park of Ninh Binh Province, Vietnam,
was assigned to the genus Bullera based on morphological
and chemotaxonomical characteristics by the reproduction
of ballistoconidia and budding cells, Q-10 as the major
ubiquinone, and the presence of xylose in the cells. The
phylogenetic tree constructed based on the comparision of
18S rDNA sequences of VY-112 and 34 known species of
the genera Bullera, Cryptococcus, Fellomyces, Kockovaella
and other by the neighbor-joyning method showed that VY-
112 made a group separated with Cryptococcus podzolicus.
The sequences of ITS regions was determined, the
sequence similarties was compared and showed 83,2%
sequence similarities between VY-112 and Cryptococcus
podzolicus. The results showed that VY-112 represent as a
new species. Bullera ninhbinhensis is proposed for this
strain.

Hình 2. So sánh trật tự r ADN ITS của C. podzolicus và
Bullera ninhbinhensis VY-112



Bảng 1 . So sánh các đặc điểm sinh lý, sinh hoá của chủng
VY-112 và Cryptococcus podzolicus*.



Hình 1. Cây phát sinh chủng loại của Bullera ninhbinhensis
VY-112 và các loài có quan hệ gần