NHÂN GEN MÃ HỐ RARN 5,8S Ở LỒI TRÀ HOA
VÀNG CAMELLIA PETELOTII VƯỜN QUỐC GIA
TAM ĐẢO

Nguyễn Thị Nga, Nguyễn Văn Mùi, Trương Quốc
Phong
Khoa Sinh học, ĐHKHTN Hà Nội

1. MỞ ĐẦU

Chi Trà - Camellia thuộc họ Chè - Theaceae là một thực
vật q của Việt Nam. Các lồi Camellia khơng những có
vai trị quan trọng tham gia vào cấu trúc hệ thực vật nhiệt
đới vùng núi mà cịn có ý nghĩa về mặt kinh tế. Nhiều loài
Trà được dùng làm đồ uống, dầu ăn, làm thuốc... và đặc
biệt phải kể đến đó là giá trị về mặt cây cảnh. Các lồi
trong chi Camellia đều có hoa to và đẹp, nhiều màu sắc
khác nhau, mùa nở hoa của chúng lại đúng vào dịp Tết (từ
tháng 10 năm trước đến tháng 2 năm sau). Chính vì vậy
tiềm năng kinh tế về mặt làm cây cảnh của các loài trong


chi Camellia là rất lớn, trong số đó các lồi Trà hoa vàng
hiện nay đang được đặc biệt quan tâm.

Theo những thống kê chưa đầy đủ thì số lượng lồi trong
chi Camellia khá lớn (khoảng 300 lồi), trong đó nhiều lồi
có dạng đồng hình. [1] Chính vì vậy việc phân loại chi
Camellia dựa trên các phương pháp phân loại cổ điển như:
phương pháp hình thái so sánh, phương pháp giải phẫu so
sánh,.. đơi khi gặp phải những khó khăn nhất định, cần phải

có sự hỗ trợ của các phương pháp phân loại hiện đại.

Thực tế hiện nay với sự phát triển của sinh học phân tử,
phương pháp phân loại phân tử đã và đang được ứng dụng
rộng rãi và hiệu quả trong phân loại học nói chung và phân
loại thực vật nói riêng. Các nhà khoa học đã chứng minh
rằng đối với đối tượng thực vật việc giải trình tự gen mã
hoá rARN 5,8S cũng như một số vùng gen khác như ITS1,
ITS2, microsatellite... là một trong những công cụ hữu hiệu
của phân loại phân tử.[3]

Việc phân loại loài Trà hoa vàng Camellia petelotii ở Vườn


Quốc gia Tam Đảo cho đến này vẫn tồn tại hai ý kiến trái
ngược nhau: 1 ý kiến cho rằng loài Trà này và loài Trà
Camellia chrysantha ở Trung Quốc chỉ là một, ý kiến khác
lại cho rằng 2 loài này là khác nhau và loài Trà Camellia
petelotii là loài đặc hữu của Việt Nam, chỉ có ở Vườn Quốc
gia Tam Đảo. Đến nay 2 ý kiến này vẫn chưa đi đến thống
nhất, vì vậy việc sử dụng phương pháp phân loại phân tử
đối với trường hợp này là cần thiết và sẽ góp phần đưa đến
thống nhất việc phân loại lồi Trà Camellia petelotii.

Trong bài này chúng tơi trình bày kết quả nghiên cứu về
nhân gen mã hoá rARN 5,8S ở lồi Trà Camellia petelotii
nhằm mục đích phục vụ cho các nghiên cứu phân loại phân
tử tiếp theo.

2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

2.1. Nguyên liệu

Mẫu lá của loài Camellia petelotii ở Vườn Quốc gia Tam


Đảo do TS. Trần Ninh, bộ môn Thực vật, khoa Sinh học,
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên cung cấp.

Các hố chất và dụng cụ thí nghiệm do các hãng Sigma,
Bio - Rad,... cung cấp đủ tiêu chuẩn cho nghiên cứu.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ thực vật của
Samuel S. M. Sun và cộng sự (1994) [6] có 1 vài thay đổi
cho phù hợp với đối tượng.

- Phương pháp phát hiện và kiểm tra độ sạch của ADN
bằng điện di trên gel agarose. [5]

- Phương pháp nhân gen mã hoá rARN 5,8S bằng kĩ thuật
PCR. [5]

3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Tách chiết ADN tổng số từ lá Camellia petelotii



Chúng tôi đã tiến hành tách chiết ADN theo qui trình sau:

Nghiền 0,75g lá trong Nitơ lỏng, bổ sung 5ml đệm chiết ở
600C (CTAB 2%, NaCl 1,4M,  - mercaptoetanol 0,2%,
EDTA 20mM, Tris - HCl 100mM).
Ủ mẫu ở 600C trong 30 phút, bổ sung hỗn hợp Chloroform
: Isoamylalcohol (24: 1), trộn đều.

Ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
Thu pha trên, tủa trong cồn tuyệt đối, rửa tủa bằng cồn 800.

Hoà tan tủa bằng đệm TE.

Kết quả kiểm tra sự có mặt của AND tổng số được thẻ hiẹn
trên hình 1.


Hình 1: ADN tổng số chưa loại ARN của lồi Camellia
petelotii

Qua hình 1 ta thấy xuất hiện 1 băng ADN đậm có kích
thước khoảng 23.1 kb. Kích thước này phù hợp với kích
thước ADN tổng số ở thực vật chứng tỏ trong dịch chiết có
chứa ADN tổng số. Tuy nhiên băng ADN cịn chưa gọn và
phía dưới cịn có vệt sáng ARN, vì vậy chúng tơi đã tiến
hành loại ARN bằng RNase. Kết quả thể hiện trên hình 2.


Hình 2: ADN tổng số đã loại ARN của lồi Camellia
petelotii


M: Marker - ADN ở cắt bằng Hind III
Giếng 1, 2: ADN tổng số đã loại ARN

Qua hình 2 ta thấy băng ADN tổng số sau khi loại ARN
đậm và gọn hơn, đồng thời vệt sáng ARN phía dưới đã
hồn tồn biến mất. Điều đó chứng tỏ ARN trong dịch chiết
đã được loại bỏ hồn tồn.

3.2. Nhân gen mã hố rARN 5,8S bằng kĩ thuật PCR


Để nhân được đoạn gen mã hoá rARN 5,8S của lồi
Camellia petelotii cần phải có cặp mồi đặc hiệu gen mã hoá
rARN 5,8S của chi Camellia. Cặp mồi này được thiết kế
dựa trên việc so sánh trình tự gen ADNr 5,8S cuả 2 lồi
trong chi Camellia đã được cơng bố trên mạng Internet:
Camellia fascicularis và Camellia nitidissima.
Cf: Camellia fascicularis
Cn: Camellia nitidissima

Hình 3: So sánh trình tự nucleotit của đoạn gen mã hố
rARN 5,8S ở 2 lồi Trà Camellia fascicularis và Camellia
nitidissima


Các trình tự này được xử lý nhờ phần mềm PC - GEN và
qua đó có được cặp mồi có kí hiệu và trình tự như sau:

HP1 (mồi xi)


: 5' GCC CGC CGG GAG CGC GCC

CG 3'
HP2 (mồi ngược) : 5' GGC CTC CCG AGA CGG CGC
GG 3'

Sử dụng cặp mồi này chúng tôi đã tiến hành phản ứng PCR
với các thành phần và chu trình nhiệt như sau:

* Thành phần của phản ứng PCR:

* Chu trình nhiệt:


Hình 4: Phổ điện di sản phẩm PCR
L: Ladder - Thang ADN chuẩn 100 bp

Giếng 1: Sản phẩm PCR

Kết quả của phản ứng PCR được thể hiện trên hình 4.

Qua hình 4 ta thấy chỉ xuất hiện 1 băng ADN duy nhất,
đậm, gọn có kích thước gần 500bp, phù hợp với kích thước


mà chúng tơi dự kiến trong q trình thiết kế mồi. Như vậy
có thể nói với cặp mồi này chúng tơi đã nhân thành cơng
đoạn gen mã hố rARN 5,8S ở loài Trà Camellia petelotii.


4. KẾT LUẬN

1. Đã tách chiết được ADN tổng số của loài Trà Camellia
petelotii. Sản phẩm ADN thu được đủ hàm lượng và độ
sạch cho các nghiên cứu tiếp theo.

2. Đã nhân được đoạn gen mã hố rARN 5,8S ở lồi Trà
Camellia petelotii với cặp mồi thiết kế đặc hiệu cho chi
Camellia.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Trần Ninh (2001), Kết quả nghiên cứu phân loại các loài
Trà hoa vàng của Việt Nam, Báo cáo tại Hội thảo các loài
Trà hoa vàng ở Việt Nam.
2. Albert L. Lehninger, David L. Nelson, Michael M. Cox
(1993), Principles of biochemistry, Worth publishers.


3. David V. Jobes, Lconard B. Thien (1997), "A Conserved
Motif in the 5,8S ribosomal RNA gene is a useful
diagnostic marker for plant internal transcribed spacer
(ITS) sequences", Plant moleculer biology reporter, (15),
pp. 326 - 331.
4. Pauline Nicholson (1997), "extraction of DNA from
plant system", Life science news, (23), pp 12 - 14.
5. Sambrook J. , Fritsch E. F., Maniatis T. (1989),
Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
6. Samuel S. M. Sun (1994), Methods in plant moleculer
biology and agricultural biotechnology, Asian Vegetable

Research and Developement Center, Taiwan.

SUMMARY

The 5.8S rDNA amplification of the yellow tea species Camellia petelotii - in Tam Dao national park.

Nguyen Thi Nga, Nguyen Van Mui, Truong Quoc
Phong


Faculty of Biology HaNoi University of Science

Up to now, biologists in the world haven't been agreed be
of classifying the yellow tea species - Camellia petelotii
yet. Some scientists think that Camellia petelotii and
Camellia chrysantha belong to only one species, others
think they are two different species and Camellia petelotii
is endemic to Viet Nam. Traditional identification methods
can't give out the final opion to stop this argument.
Therefore, it's neccessary to classify by the modern
molecular biology techniques. Sequencing 5.8S rDNA is
one of those techniques.
In this article, we expound our results in the 5.8S rDNA
amplification of the yellow tea species - Camellia petelotii
- in Tam Dao national park in order to serve molecular
classification techniques.

We have extracted total genomic DNA from the leaves of
Camellia petelotii by the method of Samuel S. M. Sun
(1994) with some small modifications. The total genomic

DNA product we have obtained is enough quantity and


purification to research in molecular biology. Then we used
this total genomic DNA as the template to amplify 5.8S
rDNA by PCR technique. The 5.8S rDNA specific pair of
primers in this reaction have designed based on known 5.8S
rDNA sequence of two species in Camellia genus which
have been published on the Internet. Using this pair of
primers, we have amplified 5.8S rDNA of Camellia
petelotii with the length approximately 500bp.

Người thẩm định nội dung khoa học: PGS. Trịnh Đình Đạt.
SO SÁNH KIỂU NHÂN CỦA LỒI ANOPHELES
DIRUS Ở ĐẢO HẢI NAM VÀ ANOPHELES DIRUS
PEYTON HARRISON 1979 Ở VIỆT NAM Ngô Giang
LiênĐại học khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội
1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Anopheles dirus là một trong những vectơ truyền sốt rét
chính ở Việt Nam và Đơng Nam Á. Phần lớn các lồi muỗi
truyền sốt rét là một phức hợp lồi (chứa ít nhất từ hai đến
nhiều lồi đồng hình). Các lồi đồng hình này rất giống
nhau về hình thái nhưng thực chất chúng cách ly sinh sản


và thường có đặc điểm sinh học, sinh thái học, tập tính
khác nhau do đó vai trị truyền sốt rét khơng như nhau vì
vậy sự đáp ứng với các biện pháp phịng chống cũng khác
nhau [2,8]. Xác định được chính xác các thành viên của

phức hợp lồi có một ý nghĩa cho các nghiên cứu về di
truyền học, sinh thái học, tập tính, vai trị dịch tễ cũng như
trong việc lựa chọn các biện pháp phịng chống thích hợp.

2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Đối tượng nghiên cứu

2.2. Phương pháp thu thập và xử lý mẫu

Anopheles dirus trong nghiên cứu này được PCG.TS
Nguyễn Văn Kim khoa nghiên cứu sốt rét chợ Rẫy thành
phố Hồ Chí Minh đem từ đảo Hải Nam Trung Quốc về sau


đó TS Trần Đức Hinh bộ mơn cơn trùng viện Sốt rét, Ký
sinh trùng và Côn trùng đem trứng về ni tại phịng ni
của viện cho các nghiên cứu. Các muỗi cái sau khi hút máu
được ép đẻ và nuôi theo từng gia đình. Một số bọ gậy tuổi 4
dùng để nghiên cứu kiểu nhân, số khác dùng để chạy điện
di. Sử dụng phương pháp nhiễm sắc thể nguyên phân của
Baimai [2,3], tiêu bản nhiễm sắc thể sau khi để tủ ấm (370)
trong 24 giờ đã được nhuộm bằng Giêm sa và được bảo
quản trong hộp đựng tiêu bản [1,2].

Các ảnh nhiễm sắc thể được chụp trên máy ảnh Olympus
BH2, dùng film Technical Pal Film có độ nhạy phù hợp [4].

3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.


3.1 Kết quả nghiên cứu

Theo sơ đồ nghiên cứu lồi đồng hình (sơ đồ 1) các cá thể
Anopheles dirus được thu thập từ Hải Nam Trung Quốc
được xử lý và phân phối cho những nghiên cứu về hình
thái, di truyền tế bào, sinh hố và tập tính.


Sơ đồ về nghiên cứu lồi đồng hình

Sử dụng phương pháp làm tiêu bản nhiễm sắc thể nguyên
phân cho thấy Anopheles dirus cũng như các lồi muỗi
khác có kiểu nhân (2n = 6) bao gồm 3 cặp nhiễm sắc thể
[2,5]. Hai cặp thuộc về nhiễm sắc thể thường, một cặp
thuộc về nhiễm sắc thể giới tính. Cặp nhiễm sắc thể thường
lớn nhất là cặp có tâm lệch (submetacentric) cặp thứ hai
ngắn hơn có đặc trưng tâm giữa (metacentric). Cặp giới
tính (X và Y đều là tâm nút) chúng đồng hình ở con cái
(XX) à dị hình ở con đực (XY) [4].


Phân tích gần 1500 phiếu trung kì từ hơn 200 mẫu ni
theo gia đình chúng tơi nhận thấy Anopheles dirus ở Hải
Nam Trung Quốc cũng có sự đa hình về nhiễm sắc thể giới
tính. Có năm biến dị: ba biến dị thuộc về nhiễm sắc thể X
và hai biến dị thuộc về nhiễm sắc thể Y đã được tìm thấy
sau hơn 20 đợt phân tích (xem bảng tổng kết số mẫu đã
được xử lý).

Bảng tổng kết số mẫu đã được xử lí


Các biến dị này đều là tâm mút khác nhau chủ yếu về số
lượng cũng như sự phân bố và đặc điểm của những băng dị


nhiễm sắc [3]. Trong ba nhiễm sắc thể X được phân tích,
nhiễm sắc thể X1 chỉ có 2 băng trong khi đó X2 và X3 lại có
3 băng. Ngồi ra độ dài của nhiễm sắc thể cũng là một đặc
điểm được xem là một chỉ tiêu để phân biệt [3,5] (hình 1)

Hình 1: Sơ đồ hố bộ nhiễm sắc thể của Anopheles dirus

Các nhiễm sắc thể Y trên tiêu bản nhuộm màu được dễ
dàng phân biệt với nhiễm sắc thể X bởi đặc điểm hầu như
là dị nhiễm sắc. Tính đa hình của nhiễm sắc thể Y thể hiện


ở độ dài của nhiễm sắc thể (nhiễm sắc thể) : Y1 nhỏ như
một dấu chấm trên tiêu bản còn Y2 có độ dài gấp 4 lần
nhiễm sắc thể Y1 và có thể đo được dễ dàng bằng trắc vi vật
kính (hình 2)

Hình 1 - 4: Nhiễm sắc thể kỳ giữa nguyên phân tế bào não
bọ gậy tuổi 4 Anopheles dirus Hải Nam Trung Quoc).
1 - 2: X1X2 (con cái; 3: X3Y2 (con đực) 4: X2Y1 (con đực)


3.2 Thảo luận

Anopheles dirus là một phức hợp loài bao gồm 7 thành viên

khác nhau về kiểu nhân [1,4] về mức độ khơng hồ hợp di
truyền qua phép lai [2,3] và sự khác biệt ADN và các đặc
điểm sinh học khác [1,7]. Sự phân bố rộng rãi của
Anopheles dirus ở Đông Nam Á khiến cho nhiều nhà
nghiên cứu mất nhiều cơng sức để xác định thành viên của
phức hợp lồi. Những thành viên này được tìm thấy từ tây
Ấn Độ qua lục địa, Đông Nam Á đến đảo Côn Sơn Việt
Nam, đảo Hải Nam Trung Quốc và Đài Loan [1,3]. Lồi A
chỉ có mặt ở vùng trung tâm và Đơng bắc Thái Lan, loài D
phân bố theo biên giới Thái Burmese và phía bắc của vùng
tây Pennisula. Lồi B chiếm ưu thế ở phía nam của
Pennisula. Lồi C được tìm thấy ở phần giữa phía đơng của
Pennisula. Lồi E được tìm thấy ở Ấn Độ và lồi F chỉ xuất
hiện ở biên giới Thái Lan - Mã Lai theo Baimai 1988 [3].


Phân tích kiểu nhân của Anopheles dirus ở Hải Nam Trung
Quốc cho thấy kết quả có nhiều điểm tương đồng với kiểu
nhân của dirus A Peyton và Harrison 1979. Loài Anopheles
dirus A đã được nghiên cứu nhiều ở Thái Lan [1] và gần
đây đã được đề cập ở Việt Nam theo Ngơ Giang Liên 1996
[6]. Theo nhiều cơng trình nghiên cứu đã được cơng bố lồi
A này truyền sốt rét mạnh ở Thái Lan vì vậy những biện
pháp phịng chống đã sử dụng ở Thái Lan, Trung Quốc có
thể áp dụng đối với Việt Nam, Lào, Camphuchia là những
nước có cùng vectơ truyền sốt rét. Tuy nhiên để có những
kết luận chính xác về lồi cần phải tiến hành thêm các
nghiên cứu về AND (thông qua kỹ thuật PCR, RAPD PCR) [7,8,9,10]. Vì trong khn khổ của một bài báo, kỹ
thuật này sẽ được giới thiệu tiếp trong số ra tới của tạp chí.


LỜI CẢM ƠN

Chúng tơi xin bày tỏ lời cảm ơn đến tập thể cán bộ Viện
sốt rét, Ký sinh trùng và Côn trùng Trung ương đã tạo điều
kiện thuận lợi về việc sử dụng mẫu để hoàn thành nghiên
cứu trên.


TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Baimai.V, 1988 Geographical distribution and bitting
bihaviour of four species of The Anopheles dirus complex
(Diptera culicidae / in Thai Lan. J. Med. Dubl. Mlth Vol.
19: 157 - 158
2. Baimai.V., Harbach R.E and Supratman Sukowati, 1988.
Cytogenetic evidene for two sibling species within the
current concept of the malario vector Anopheles
leicophyrus in Socetheast Asia. Journal of The American
mosquito control asscociation. Vol 4 N0 1: 44 - 50.
3. Baimai, V., R. Rattanarithikul, U. Kijchalao and C.
A1998. of Thailand and Southeast Asia. II. The Maculatus
Group, Neocellia Series, subgenus Cellia. Mosq. Syst. 25:
116 - 123.
4. Baimai, V., R. G. Andre, B. A. Harrison, U. Kijchalao
and L. Panthusiri. 1987. Crossing and chromosomal
evidence for two additional sibling species within the taxon
Anopheles dirus Peyton and Harrison (Diptera: Culicidae)
in Thailan. Rroc. Entomol. Soc. Wash. 89: 157 - 166



5. Lien, n.G., T.G. Hoc nand T.D. Dat. 1992. Study on
mitotic karyotypes of the species complex of anopheles
minimus Theobald 9Diptera: Culicidae) in Vietnam, p. 511.
ln: Proc. XIX Int. Congr. Entomol. [Abstract].
6. Ngô Giang Liên / 1996 Nghiên cứu một số đặc điểm di
truyền của một số loài muỗi truyền sốt rét tại một số địa
điểm của Việt Nam. Luận án TS Khoa Sinh học, Đại học
khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội
7. Marchuk, D., Drumm, M., Saulino, A. and Collins, F.S.
(1991) Construction of T - Vectors, a rapid and general
system for direct cloning of unmodified PCR products.
Nucl Acids Res 19: 1154
8. Wikerson, R.C., Parsons, T.J., Albright, D.G., Kleln,
T.A. and Braun, M.J. (1993) Random amplified
polymorphic DNA (RAPD) markers distinguish cryptic
mosquito species (Diptera: Cullcidae: Anopheles). Insect
Molec Biol 1: 205 - 211
9. (1993) Genetic analysis using random amplified
polymorphic DNA markers. Meth Enzymol 218: 704 - 740
10. Zheng, L., Collins, F.11., Kumar, V. and Kafatos, F.C.
(1993) A detailed genetic map for the X chromosome of the


malaria vector An. gambiae. Science 261: 605 - 608.

SUMMARY

Metaphase karyotypes of Anopheles dirus of Hainam
island , China and Anopheles Peyton Harrison 1979 of
Khanh Phu, Vietnam


Ngo Giang Lien
Faculty of Biology, Hanoi University of Science
.
The healthy mosquito specimens were reared individually
in the laboratory at Institute of Malaria , Hanoi. The brain
ganglia of fourth-instar larvae were used for metaphase
chromosome preparation employing a modified method as
described by Baimai. The air-dried slides were stained with
Giemsa and mounted in Permount for permanent
preparations.The best metaphase spreads of mitotic
karyotypes were photographed with Kodak Technical Film
using an Olympus photomicroscope with a green filter and