SO SÁNH ĐA HÌNH AFLP GIỮA HAI NHÓM CÁ
TRA (Pangasius hypophthalmus) CÓ TRỌNG LƯỢNG
PHÂN BIỆT.

Nguyễn Thu Thuý, Nguyễn Thị Diệu Thuý, Nguyễn Văn
Cường
Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ
Việt Nam
MỞ ĐẦU

Cá tra (Pangasius hypophthalmus) là loài cá có giá trị kinh
tế cao và được nuôi trồng phổ biến ở khu vực Đông nam á
[4]. ở Việt Nam, cá tra được nuôi nhiều ở các tỉnh Đồng
bằng sông Cửu Long. Thời gian gần đây, cá được di giống
thuần hoá nuôi ở một số tỉnh phía Bắc. Cá thương phẩm có
giá trị trên thị trường cả trong và ngoài nước. Hiện cả nước
có trên 14 doanh nghiệp xuất khẩu cá tra, ba sa với kim
ngạch hàng năm trên 60 triệu USD [7]. Nâng cao hiệu suất
nuôi trồng để tăng lợi nhuận luôn là mục tiêu của các nhà
sản xuất. Bên cạnh những nghiên cứu nhằm tăng hiệu quả
sinh sản, dinh dưỡng, việc cải tạo giống để tạo những dòng
cá có năng suất cao được chú trọng. Chương trình lai tạo,
chọn giống truyền thống luôn đóng vai trò chủ đạo trong
cải tạo giống. Tuy nhiên, để nâng cao hiệu quả chọn lọc,
trong thời gian gần đây, nghiên cứu lập bản đồ gen và phát
triển chỉ thị di truyền phân tử được chú ý phát triển. ở cá
nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) đã xác định được 19 chỉ thị
phân tử loại I, 243 các chỉ thị phân tử loại II, 1 chỉ thị EST
[8]. Trong số các phương pháp di truyền phân tử, AFLP
(Amplified Fragment Length Polymorphism ) là phương
pháp có nhiều ưu điểm, đặc biệt cho phép tuyển chọn đồng

thời trên toàn bộ hệ gen và tạo ra một số lượng lớn chỉ thị
có thể chuyển đổi thành chỉ thị đặc hiệu vị trí đơn giản
(simple locus-specific markers) mà không cần biết trước
thông tin của trình tự đặc hiệu đó. Phát triển chỉ thị AFLP
liên quan tính trạng quan tâm có thể dựa trên sự phân bố
ngoại hình của hai quần thể đối lập nhau [2] hoặc dựa trên
đa hình di truyền ở hai nhóm cá thể đối lập nhau [5].
Phương pháp sau có ưu điểm không cần thiết lập bản đồ di
truyền và tạo ra các phả hệ đặc biệt, nên thích hợp cho phát
hiện vị trí tính trạng định lượng (QTL) trực tiếp từ các quần
đàn thương phẩm có tuổi thành thục dài như cá tra (2-3
năm). Với mục đích phát triển chỉ thị AFLP trực tiếp từ
quần đàn thương phẩm, chúng tôi tiến hành phân tích đa
hình AFLP giữa hai nhóm cá tra có trọng lượng cực lớn và
cực nhỏ.


NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Nguyên liệu:

Mẫu cá tra được thu từ trung tâm Cái Bè – Tiền Giang,
được bảo quản trong cồn 70
0
, ở 4
0
C cho đến khi sử dụng
(Mẫu do Viện Nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản I cung cấp).
Từ 282 mẫu cá, chọn 10 mẫu có trọng lượng lớn nhất
(trung bình là 3,9 gam) và 10 mẫu có trọng lượng nhỏ nhất

(trung bình là 2,2 gam).

Tách chiết ADN:

ADN cá tra được tách chiết chủ yếu theo Fetzner [3]. Cụ
thể: khoảng 50 mg mẫu được rửa sạch cồn bằng 0,9 ml đệm
TLE (10 mM Tris; 0,1 mM EDTA; pH 8.0). Thêm vào 0,9
ml đệm phá tế bào (10 mM Tris; 100 mM EDTA; 2% SDS,
pH 8.0). Bổ sung 5µl enzyme protease K (20 mg/ml), ủ
55
0
C trong 14-16 giờ. Để mẫu ở nhiệt độ phòng và bổ sung
4µl RNAase A (10mg/ml), ủ 37
0
C trong 30 phút. Thêm vào
0,3 ml dung dịch kết tủa protein (7,5 mM Ammonium
Acetate), trộn đều và ủ trong đá 30 phút. Ly tâm 2 lần để
loại tủa protein và thu dịch ADN. Kết tủa ADN bằng 0,9 ml
isopropanol, để -20
0
C trong 3 giờ, ly tâm thu tủa ADN. Rửa
ADN bằng 0,75 ml cồn 70
0
. Hòa tan ADN trong 100µl
đệm TLE. Bảo quản ở 4
0
C để sử dụng cho các thí nghiệm
tiếp theo.

Kỹ thuật AFLP:


AFLP cơ bản được tiến hành theo Liu và cs [6]. Các bước
chính của phương pháp được tóm tắt như sau: ADN được
cắt bằng 2 enzyme EcoRI và MseI: 300 ng ADN, 3U
enzyme EcoRI và MseI ở 37
0
C trong 2 giờ. Sau đó, các
đoạn ADN cắt ra được gắn vào các adapter của EcoRI và
MseI nhờ enzyme T4 ADN ligase trong 3 giờ ở 20
0
C. Các
đoạn ADN tạo ra trước hết được khuếch đại bằng PCR sử
dụng mồi tiền chọn lọc (preselective primer) sau đó là mồi
chọn lọc (selective primer)
Bảng 1: Trình tự các adapter và mồi được sử dụng trong
phân tích AFLP


Phân tích sản phẩm AFLP: sau PCR, một thể tích
formamide dye được thêm vào phản ứng. Mẫu được biến
tính bằng nhiệt ở 95
0
C trong 3 phút, và đặt ngay vào đá.
Sản phẩm AFLP được điện di trên gel polyacrylamide biến
tính (19:1 acrylamide:bisacylamide; 7,5 M urea; 0,5 X TBE
buffer ). Bản gel được cố định trong axit axêtic 10%,
nhuộm trong bạc nitơrat 1%, hiện trong natricacbônat 2,5%
và cố định lại trong axit axêtic 10% [1].



KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

ADN hệ gen từ hai nhóm cá tra có trọng lượng lớn và nhỏ
được tách chiết. Kết quả đánh giá trên điện di agarose cho
thấy chất lượng ADN đạt tiêu chuẩn cho các phân tích tiếp
theo.

Để chuẩn bị khuôn ADN cho AFLP, ADN hệ gen được cắt
đồng thời bởi 2 enzyme giới hạn EcoRI có trình tự nhận
biết 6 base pair (G(AATTC) và MseI có trình tự nhận biết 4
base pair (T(TAA). Thành công của kỹ thuật AFLP phụ
thuộc vào sự cắt hoàn toàn của phản ứng cắt và chất lượng
ADN. Các đoạn ADN tạo ra được gắn với các adapter
EcoRI và MseI để tạo thành khuôn cho phản ứng khuyếch
đại sau này, đồng thời ngăn cản sự tái kết hợp giữa các
đoạn ADN vừa được tạo ra. Trước hết, một số đoạn ADN
tạo ra được nhân lên nhờ phản ứng PCR sử dụng mồi tiền
chọn lọc (PSP - preselective primers). PSP chứa các trình
tự: i) bổ trợ với adapter; ii) bổ trợ với trình tự nhận biết của
enzyme giới hạn; iii) một nucleotid. Các đoạn ADN mà
nucleotid liền kề với trình tự nhận biết của enzyme giới hạn
bổ trợ với nucleotid của PSP sẽ được nhân lên (theo xác
suất một phần tư số đoạn ADN sẽ được nhân lên). Tương
tự, các đoạn ADN mà 3 nucleotid tiếp theo liền kề với trình
tự nhận biết của enzyme giới hạn bổ trợ với 3 nucleotid của
mồi chọn lọc (SP - selective primers) sẽ được nhân lên.
Theo xác suất qua 2 lần PCR, 1/256 số đoạn ADN sẽ được
nhân lên. Đối với các cá thể mang đột biến tại các nucleotid
bổ trợ với PSP và SP (so với mẫu chuẩn), các đoạn AND sẽ
không được nhân lên. Do đó, trên bản điện di tại các vị trí

trên không xuất hiện băng.

54 tổ hợp mồi được sử dụng để phân tích đa hình AFLP của
hai nhóm cá tra có trọng lượng lớn và nhỏ. Mỗi tổ hợp mồi
tạo ra từ 27 đến 94 băng, trung bình là 55 băng trên một tổ
hợp mồi. Trong đó, cao nhất là tổ hợp mồi E-ACC/M-
CAG: 94 băng/mẫu, và thấp nhất là tổ hợp mồi E-ACG/M-
CTG: 27 băng/mẫu. Trong 54 tổ hợp mồi nghiên cứu, 11 tổ
hợp mồi không tạo băng AFLP và 43 tổ hợp mồi tạo 204
băng AFLP. Tỷ lệ băng đa hình giữa các mẫu cá tra là
1,35% cho thấy sự đa hình AFLP giữa các mẫu trong cùng
loài thấp. Kết quả này cũng phù hợp với phân tích của Liu
và cs [6] tiến hành trên cá tra Mỹ (Ictalurus punctatus và
Ictalurus. furcatus). Tỷ lệ băng đa hình trong cùng loài I.
punctatus là 3,4 %, ở I. furcatus dao động từ 1,7% -3,3%
[6]. Đa hình AFLP của tổ hợp mồi E-ACA/M-CAG giữa 2
nhóm cá lớn và nhỏ được thể hiện ở hình 1.

Hình 1. Đa hình AFLP giữa nhóm cá lớn và nhóm cá
nhỏ của tổ hợp mồi E-ACA/M-CAG
1,2: Băng AFLP xuất hiện ở cả 2 nhóm cá với tần số
khác nhau


Tổng cộng có 204 băng AFLP được tạo ra từ 43 tổ hợp
mồi, trung bình là 4,74 băng AFLP/mồi. Tần suất xuất hiện
các băng AFLP ở hai nhóm cá tra là khác nhau nên chúng
tôi đã tính tần số khác biệt giữa hai nhóm. Kết quả được thể
hiện ở bảng 2.


Bảng 2: Tần số khác biệt của các băng AFLP giữa hai
nhóm cá tra


Những băng AFLP có tần số khác biệt trên 50% được thể
hiện ở bảng 3.


Bảng 3: Các băng AFLP có tần số khác biệt trên 50 %.



Kết quả trên cho thấy, chỉ có 8 băng AFLP có tần số khác
biệt trên 50%, chiếm 3,92% tổng số băng AFLP. Để kiểm
tra mức độ ổn định và tin cậy của các băng AFLP, chúng
tôi đã tiến hành phân tích các băng AFLP này với số lượng
mẫu lớn hơn (18 mẫu). Kết quả cho thấy, băng AF 6-1 của
tổ hợp mồi E-AGG/M-CTT và băng AF 7-4 của tổ hợp mồi
E- ACC/M-CAA đạt độ chênh lệch giữa 2 nhóm cá thí
nghiệm là 56% và 50%. Do có tính ổn định tương đối, rõ
nét và ưu thế cho nhóm cá có trọng lượng nhỏ, hai băng
AFLP này được tách dòng và đọc trình tự nhằm mục đích
xây dựng 2 chỉ thị AFLP liên quan tới tính trạng tăng
trưởng của cá tra.


KẾT LUẬN

Phân tích đa hình AFLP cá tra bằng 54 tổ hợp mồi chọn lọc
cho thấy tỷ lệ đa hình trong loài tương đối thấp, trung bình

1,35%. Tuy nhiên, tỷ lệ này đủ tin cậy trong việc xác định
các chỉ thị liên quan tính trạng có ý nghĩa kinh tế.

So sánh đa hình AFLP giữa 2 nhóm cá tra có trọng lượng 2
cực cho thấy 8 băng AFLP có tần số khác biệt trên 50%.
Tuy nhiên chỉ có 2 băng: AF 7-4 của tổ hợp mồi E-
ACC/M- CAA và AF 6-1 của tổ hợp mồi E-AGG/M-CTT
có tính ổn định, và vẫn giữ được tỷ lệ này khi kiểm tra trên
số lượng mẫu lớn hơn. Hai băng này sẽ được sử dụng để
tuyển chọn lại trong quần đàn.


Lời cảm ơn:
Tác giả xin chân thành cảm ơn TS. Phạm Anh Tuấn, Viện
Nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản I, Bộ Thuỷ sản đã cung
cấp mẫu cá tra. Công trình được hoàn thành với sự hỗ trợ
kinh phí của chương trình Khoa học Công nghệ KC 04-01.


TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bassam, B.J., G. Caerano-Anolles., P.M. Greshoff.
(1991). Fast and sensitive silver staining of ADN in
polyacrylamide gels. Anal. Biochem 196, 80.
2. Darvasi, A., M. Soller. (1994). Selective ADN pooling
for determination of linkage between a molecular marker
and a quantitative trait locus. Genetics 138, 1365-1373
3. Fetzner, J. W., Jr. (1999). Extracting high quality DNA
from shed reptile skins: A simplified method. Biotechnique
26(6), 1052-1054.

4. Hogan, S.Z., P.B. May. (2002). Twenty-seven new
microsatellites for the migratory Asian catfish family
Pangasiidae. Molecular Ecology 2, 38-41.
5. Lander, E.S., D. Botstein. (1989). Mapping Mendelian
factors underlying quantitative traits using RFLP linkage
maps. Genetics 121, 185-199
6. Liu, Z.J., A.P. Nichols, P. Li., R.A. Dunham. (1998).
Inheritance and usefulness of AFLP markers in channel
catfish (Ictalurus punctatus), blue catfish (Ictalurus
furcatus), and their F1, F2, and backcross hybrids. Mol.
Gen. Genet 258, 260-268.
7. L. Cường. (2003). Cá tra, ba sa được xét thưởng xuất
khẩu. Báo Người Lao Động, 4-11-2003 VL
8. Waldbieser, G.C., B.G. Bosworth., D.J. Nonneman.,
W.R. Wolters. (2001). A microsatellite-based genetic
linkage map for Chanel catfish, Ictalurus punctatus.
Genetics 158, 727-734


SUMMARY

COMPARISON OF AFLP POLYMORPHISM
BETWEEN TWO WEIGHT EXTREME GROUPS OF
CATFISH (Pangasius hypophthalmus)

Amplified fragment length polymorphism (AFLP), is a
DNA fingerprinting technique based on restriction of
genomic DNA and subsequent selective PCR amplication.
AFLP has advantages over other marker systems such as:
simultaneously screen the whole genome and produce a

large number of markers without probe or previous
sequence information. AFLP bands can be genetically
linked to a given trait or phenotype and are typically
inherited in Mendelian fashion. The identification of linked
AFLP loci and subsequent conversion to simple
codominant locus-specific markers represents a useful tool
for marker assisted selection. In order to develop AFLP
markers to assist fish famers in selective breeding of
aquacultural species, an analysis on growth performance
trait in two high - extreme and low - extreme groups of
catfish (Pangasius hypophthalmus) using AFLP technique
has been carried out. Twenty extreme animals of weight
(10 fish having the highest weight - high group and 10 fish
having the lowest - low group) were selected for this study
from 282. These samples were screened by AFLP using 54
primer combinations. The results of analysis showed that
an average of 55 AFLP bands per primer combination per
sample were produced. No AFLP fragment was produced
from 11 primer combinations, 43 combinations produced
204 fragments, with an averrage of 4.74 bands per
combination. The level of intraspecific genetic diversity is
low, 1.35%. Comparison of AFLP polymorphism between
two extremes groups of weight, eight AFLP fragments
markedly differing in the frequency distribution (>= 50%)
were found. Out of which 2 fragments (AF 6-1 and AF 7-4)
are more stable and highly reproducible. These bands will
be identified and use to screen on individuals samples.


Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Nguyễn Kim

Độ