92
nhiễm sắc có kích thước nhỏ hơn nhiều so với các thể nhiễm sắc bình thường và thường có
dạng cầu nhỏ gọi là thể nhiễm sắc bổ sung hay còn gọi là thể nhiễm sắc B.
7.4.3 Kiểu nhân
ở các cơ thể sinh sản hữu tính trong tế bào sôma đều có bộ thể nhiễm sắc lưỡng bội
(diploide) và được ký hiệu 2n. Bộ thể nhiễm sắc lưỡng bội do sự tập hợp từ hai bộ đơn bội
(haploide) (gặp ở tế bào sinh dục) và được ký hiệu là n. Bộ thể nhiễm sắc khác nhau về chất
lượng và tạo thành một thể thống nhất toàn vẹn được gọi là Jenôm (genom). Do đó trong giao
tử của loài lưỡng bội có một Jenôm còn trong tế bào sôma có 2 Jenôm.
Số lượng thể thể nhiễm sắc thay đổi từ loài này sang loài khác nhất là trong quá trình tiến
hóa. Thông thường số lượng thể nhiễm sắc tăng lên so với số lượng thể nhiễm sắc khởi thủy.
Số lượng thể nhiễm sắc khởi thủy được gọi là số lượng thể nhiễm sắc cơ bản và được ký hiệu
là X nó tương ứng với số lượng thể nhiễm sắc trong các giao tử của các loài lưỡng bội. Hiện
tượng tăng số lượng thể nhiễm sắc như vậy gọi là hiện tượng đa bội. Các cơ thể đó gọi là thể
đa bội (polyploide). ở các loài đa bội chứa nhiều Jenôm. Ví dụ đối với giống Lúa mì
(Triticum) có các loài với số lượng thể nhiễm sắc tương ứng 14, 28, 42 như vậy số lượng thể
nhiễm sắc đơn bội tương ứng của chúng: 7, 14, 21. Số lượng thể nhiễm sắc cơ bản của chúng
là A = 7 và công thức thể nhiễm sắc được viết như sau:
2n = 2x = 14 (loài chứa 2 Jenôm);
2n = 4x = 28 (loài chứa 4 Jenôm);
2n = 6x = 42 (loài chứa 6 Jenôm).
Trong thiên nhiên một số cơ thể xuất hiện do không có quá trình thụ tinh gọi là đơn tính
sinh (apomixic) nên chúng có số lượng thể nhiễm sắc đơn bội. Các cơ thể đơn bội như thế
không có khả năng sinh sản bằng con đường hữu tính ví dụ như cây Bồ công anh (Taraxacum
officinale) thuộc họ Cúc (Asteraceae).
Trong thế giới thực vật mỗi loài đều có một bộ thể nhiễm sắc đặc trưng về số lượng, hình
dạng và kích thước. Vì vậy người ta đã sử dụng chúng làm tiêu chuẩn phân loại. Các thành
tựu nghiên cứu thể nhiễ
m sắc đã góp phần hết sức quan trọng để hoàn thiện và chính xác hóa

các sơ đồ phân loại hiện có. Nhờ vậy đã giải quyết được nhiều vấn đề mà bằng phương pháp
so sánh hình thái không thể giải quyết được.
Hiện nay khi khoa học di truyền học ngày càng thâm nhập vào hệ thống học, ngoài các chỉ
số về số lượng thể nhiễm sắc có khi chẳng có ý nghĩa gì hết vì nhiều loài cùng một họ thậm
chí một chi có số lượng thể nhiễm sắc giống nhau, người ta tiến tới sử dụng chỉ tiêu về kiểu
nhân (caryotype) và xây dựng nên sơ đồ thể nhiễm sắc (idiogramme) hay biểu đồ nhân
(caryogramme) để so sánh và đánh giá.
Kiểu nhân là tập hợp tất cả các đặc tính số lượng, chất lượng của bộ thể nhiễm sắc (Số
lượng, kích thước, hình thái và cấu trúc thể nhiễm s
ắc). Biểu đồ nhân là hình ảnh cụ thể của
chính bộ thể nhiễm sắc được sắp xếp theo một thứ tự nhất định từng đôi tương đồng một từ
thể nhiễm sắc tâm giữa, tâm lệch đến tâm mút và cuối vùng là thể nhiễm sắc SAT. Biểu đồ
nhân có thể dựa vào ảnh chụp hoặc dựa vào bản vẽ và sắp xếp theo hai cách: 1/ tất cả các thể
nhiễm sắc được đặt mút dưới của các thể nhiễm sắc nằm trên một đường thẳng và 2/ đặt các
tâm động của các cặp thể nhiễm sắc nằm trên một đường thẳng. Trong hai cách thì cách thứ 2
được sử dụng phổ biến nhất.


93
Biểu đồ thể nhiễm sắc hay còn gọi là thể nhiễm sắc đồ là dựa vào biểu đồ nhân rồi mô hình
hóa lên bằng các đường thẳng có chiều dài, chiều rộng cũng như vị trí tâm động tương ứng
với thể nhiễm sắc thực như trên biểu đồ nhân.
Ví dụ : Kiểu nhân một loài Cúc (Anthemis ruthenica M.B. như sau:2 đôi M (Tâm giữa), 5
đôi Sm (Tâm lệch) và 2 đôi A-SAT (Tâm mút với các thể kèm) (Nguyễn Nghĩa Thìn, 1980): 2
M + 5 Sm + 2A-SAT.
7.5 Phương pháp phân loại izoenzym
7.5.1 Định nghĩa izoenzym
Enzym hay izoenzym là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học ở
trong cơ thể sống hoặc ở ngoài tế bào khi có đủ điều kiện cho các phản ứng đó xảy ra.
Izoenzym là thuật ngữ để chỉ các biến dạng của enzym, các dạng tồn tại trong quần thể tự

nhiên, là kết quả của các phản ứng gây ra sự thay đổi các axit amin trong cấu trúc bậc một của
chuỗi polypeptide. Cấu trúc này lại do trật tự của các nucleotid trong gen quy định. Chính vì
vậy khi sử dụng phương pháp điện di trên gen agarose, tinh bột thủy phân, polyacrylamid
cùng với việc phối hợp nhuộm hóa tế bào cho phép ta phát hiện các biến dạng khác nhau của
phân tử enzym.
Bởi vậy việc sử dụng các dẫn liệu về đa hình các izoenzym không những hiểu biết gen của
cá thể mà biết mức độ dị hợp của quần thể. Mặt khác mỗi biến dạng phân tử enzym là một
“marker” của gen. Vì vậy nó được sử dụng cho loài. Trong nội bộ loài, việc sử dụng các dẫn
liệu đa hình thông qua tần số alen của các locut cũng có thể chỉ ra tính chất đặc trưng cho các
vùng phân bố của loài. Trên cơ sở như vậy người ta dùng izoenzym để phân biệt các cá thể
thuộc các đơn vị phân loại giữa các thứ hoặc giữa các loài, giữa các loài đồng hình, loài chị
em
Phương pháp phân tích tính đa hình của izozym là một trong những phương pháp phân loại
ở mức độ phân tử do nó đã tiếp cận với những sản phẩm trực tiếp của quá trình dịch m• di
truyền.
Nhờ tính rõ ràng của kết quả và sự đa hình của các hệ enzym được sử dụng, kết quả phân
tích mang độ chính xác cao và tin cậy.
Nó được sử dụng rộng r•i trong việc nghiên cứu mối quan hệ trong và ngoài loài, góp phần
xây dựng mối quan hệ xác thực trong hệ thống học của sinh giới, là công cụ đắc lực hỗ trợ
cho các nhà phân loại trong trường hợp các khóa phân loại hình thái không đủ để giải quyết
vấn đề. Tất nhiên cũng cần nói rõ phương pháp này dù nó có phản ảnh bản chất di truyền của
loài hay bất kỳ một taxôn nào khác nhưng nó không thể thay thế cho phương pháp phân loại
truyền thống. Nó sẽ giúp cho việc hoàn chỉnh và làm chính xác cách phân loại truyền thống
trên cơ sở dựa vào các dấu hiệu hình thái bên ngoài. Mỗi sự thay đổi của gen đều được thể
hiện qua tính đa dạng của các izoenzym nhưng chưa chắc các biến đổi đó đã được di truyền
lại cho các thế hệ mai sau. Vì vậy phải tìm, phải sàng lọc và lựa chọn những biến đổi nào đặc
trưng cho loài. Đấy mới là điều quan trọng. Chính vì vậy phương pháp này chỉ ra cho ta thấy
mức độ đa dạng của các gen bên trong và qua đó giúp cho ta biết mối quan hệ huyết thống
giữa các taxôn.





94

7.5.2 Phương pháp phân tích izozym bằng kỹ thuật điện di
Phương pháp này được sử dụng rộng r•i trong nghiên cứu hệ thống học bởi 5 lý do sau:
1. Mẫu cần phân tích rất nhỏ
2. Một lần phân tích được nhiều mẫu
3. Các chất dùng cho chạy điện di không quá đắt tiền
4. Dụng cụ chạy điện di khá phổ biến
5. Kết quả thu được phản ảnh gián tiếp sự có mặt của các alen trong cơ thể đối tượng
nghiên cứu.
Tuy nhiên cũng cần chỉ rõ kết quả trên trước hết có ý nghĩa lớn để đánh giá mối quan hệ họ
hàng giữa các taxôn, còn việc sử dụng phương pháp này cũng như các phương pháp phân tích
ADN dùng trong phân loại không phải đơn giản. Việc nhận dạng và suy luận kết quả của phép
phân tích điện di cần phải tuân theo những nguyên tắc đặc thù và đòi hỏi các nhà nghiên cứu
phải am hiểu các phạm trù trong phân loại học, am hiểu đối tượng mà mình nghiên cứu và
phải có quá trình nghiên cứu lâu dài trên cơ sở lấy phương pháp phân loại bằng hình thái làm
cơ sở. Về giá trị phân loại của hai phương pháp này có tính hiện thực chỉ khi nào nghiên cứu
một cách đầy đủ và trọn vẹn một taxôn nào đấy. Trên cơ sở đó mới tìm ra các marker đặc
trưng có ý nghĩa trong phân loại. Nếu chỉ phân tích từng phần của một taxôn và không phân
tích có tính hệ thống thì những số liệu đó chỉ mới nói lên tính đa dạng của taxôn đó hay chỉ
dừng lại xem xét mối quan hệ họ hàng ở mức tương đối mà thôi và nếu tách phương pháp này
khỏi phương pháp phân loại hình thái như một số nhà sinh học phân tử đã làm lại là một sai
lầm không thể chấp nhận.
7.5.2.1 Kỹ thuật điện di
Điện di là một kỹ thuật sắc ký được sử dụng rộng r•i để tách một hỗn hợp các hợp chất có
khả năng ion hóa. Điện di trên gel kết hợp dựa vào điện tích và quá trình tách dựa vào kích
thước phân tử của các đối tượng tham gia điện di. Một quá trình điện di cơ bản gồm các bước

sau:
* Chuẩn bị mẫu cho phép điện di: Do sự xuất hiện và hàm lượng của các izoenzym là
khác nhau ở các bộ phận trong cơ thể, các trạng thái phát triển, điều kiện môi trường. Cần
phải nghiên cứu để tìm ra vật liệu phù hợp cho việc tách mẫu ban đầu. Mẫu phải được bảo
quản trong điều kiện tránh sự phân huỷ của izoenzym.
* Đổ gel: Tùy theo độ giống nhau của các izoenzym mà chọn nồng độ gel đảm bảo có
độ phân giải cao nhất đối với hệ izoenzym cần nghiên cứu.
* Chuẩn bị dung dịch đệm: Dựa vào tài liệu tham khảo cũng như kinh nghiệm thực tế để
chuẩn bị các dung dịch đệm có nồng độ và giá trị pH phù hợp và chính xác để đảm bảo kết
quả phân tích sẽ lặp lại.
* Lựa chọn các thông số về dòng điện, thế năng của nguồn điện di và thời gian chạy
mẫu.
* Cắt lát gel: Trong trường hợp chạy gel tinh bột, người ta cắt lát các lớp gel từ tấm gel
dày ban đầu. Các lớp này có thể dùng để nhuộm với các chất nhuộm màu đặc hiệu khác nhau.
* Nhuộm gel hay hiện gel: Sau phép chạy điện di, các izozym chưa thể nhìn thấy mà
phải làm cho chúng phát màu nhờ những phản ứng được xúc tác bởi các enzym đó. Kết quả


95
của bước này phụ thuộc rất nhiều vào tính chất của hỗn hợp phản ứng và điều kiện ủ cho phản
ứng xảy ra như pH, nhiệt độ, cơ chất, tác nhân nhuộm,…
7.5.2.2 Đọc kết quả nghiên cứu
Để phục vụ cho nghiên cứu phân loại, việc xử lý thông tin sau khi chạy điện di cần phải
dựa trên những kiến thức về di truyền học tiến hóa. Đây là phần rất quan trọng vì kết quả điện
di chỉ là một hình ảnh chết nếu người nghiên cứu không hiểu được tương quan hệ nội hàm
giữa các sản phẩm izoenzym và cấu trúc các alen trong hệ gen m• hóa cho các sản phẩm
izoenzym. Đọc kết quả điện di có thể hiểu là quá trình xây dựng bảng tương quan giữa vị trí
của các băng điện di và số alen quy định các izoenzym.
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra cấu trúc khác nhau của phân tử enzym có thể biểu hiện trên
điện di đồ là khác nhau. Xét một số trường hợp cụ thể sau:

a. Trường hợp phân tử enzym có cấu trúc monomer do một alen trên một locut gen gồm
hai alen điều khiển, thì những cá thể đồng hợp tử trội mang kiểu gen AA và đồng hợp tử lặn
mang kiểu gen aa sẽ có một băng (pattern), còn cá thể dị hợp tử mang kiểu gen Aa sẽ có hai
băng (hình 7.15a).
b. Trong trường hợp phân tử enzym là monomer, locut gen chứa ba alen đồng trội thì
những cá thể đồng hợp tử mang kiểu gen AA, aa, a’a’ có một băng, còn cá thể dị hợp tử Aa,
Aa’ và aa’ có biểu hiện bởi hai băng (hình 7.15b).
c. Trong trường hợp phân tử enzym là dimer thì mỗi locut sẽ liên quan tới hai sợi
polypeptide, giả sử có hai alen A và a, mỗi alen m• cho một chuỗi polypeptide, sự phân ly của
kết quả điện di được minh họa trong hình 7.15c.
Trong hình 7.15 ta thấy cá thể dị hợp tử (Aa) mang 3 băng, trong đó có một băng là biểu
hiện của mức di truyền trung gian, là kết quả của sự kết hợp giữa hai chuỗi polypeptide do hai
alen khác nhau của một locut gen kiểm soát.
d. Trường hợp phân tử enzym có cấu trúc tetramer, nghĩa là phân tử này do 4 chuỗi
polypeptide tạo thành. Trong trường hợp này các cá thể đồng hợp tử biểu hiện một băng, còn
cá thể dị hợp tử biểu hiện 5 băng trên điện di đồ. Ta đặt giả thiết alen A tổng hợp chuỗi
polypeptide a và gen a tổng hợp chuỗi polypeptide b, cá thể lai biểu hiện 5 băng tương ứng
(hình 7.15d).
Trong một số trường hợp phân tử enzym do một locut gen có hai alen kiểm soát trong đó
có một alen có hoạt tính và biểu hiện màu còn alen thứ hai không biểu hiện màu gọi là alen
không (null allele) thì trên điện di đồ sẽ có 3 dạng kiểu hình, một dạng biểu hiện một băng
nhuộm màu rõ nét, một dạng không biểu hiện là các cá thể đồng hợp tử, còn dạng có băng
nhạt màu và mảnh là các cá thể dị hợp tử (hình 7.16).


7.5.2.3 Tính tần số alen
Sau khi xác định sự biểu hiện của các alen ta sẽ phân tích tần số của chúng trong đối tượng
nghiên cứu theo các công thức sau:
Khi số alen là 2 (A, a), tần số xuất hiện




96

Với AA, Aa, aa là số cá thể mang kiểu gen tương
ứng, N là số cá thể mang phân tích * 25 và đảm bảo
thỏa m•n hệ số *2.
Khi số alen là 3 (A, a, a1), tần số xuất hiện cũng
được tính tương tự

Tính hệ số tương đồng di truyền I hay khoảng cách
di truyền D:
Theo tác giả Nei hệ số tương đồng di truyền được
tính như sau:
trong đó:
XA ,YB là các tần số của alen tương ứng.
Ví dụ: Quần th
ể muỗi QTx có:
Tần số A = 0,46 Tần số alen a= 0,54
Quần thể muỗi QTx có:
Tần số alen A= 0,88 Tần số alen =
0,12
Từ đó ta tính được :
Mức độ giống nhau về mặt di truyền là: 0,745.
Từ hệ số tương đồng trên, khoảng cách di truyền D
được tính theo công thức: .
7.5.2.4 Lập cây chủng loại phát sinh dựa trên
hệ số tương đồng I
Là phương pháp tính toán mối quan hệ huyết thống
c

ủa các nhóm tham gia quá trình phân loại. Từ giá trị I
thu được của các nhóm khác nhau người ta lập bảng
và xây dựng cây chủng loại phát sinh.
Nếu I >
0,5 thì các
nhóm nghiên
cứu thuộc về một loài, sự khác biệt của hệ Izozym chỉ
mang ý nghĩa biến dị trong loài.
Nếu I<0,5 thì có thể sơ bộ kết luận đó là hai loài
riêng biệt.



Ví dụ: Có 5 loài ký hiệu là L1, L2, L3, L4, L5
Có hệ số I giữa 2 loài.
Quy thành nhóm như sau:
L2 L3 L4 L5
L1
0,48 0,36 0,35 0,27
L2
0,83 0,12 0,03
L3
0,05 0,01
AA Aa aa
Tr−êng hîp a



AA Aa’ a’a’ Aa a’a aa
Tr−êng hîp b




AA Aa aa
Tr−êng hîp c



AA aa Aa
Tr−êng hîp d






Hình 7.15. Sơ đồ kết quả điện di
AA Aa aa





Hình 7.16.
Sơ đồ kết quả điện di alen không


97
L4
0,53

Ở đây ta thấy giữa L2 L3 có số lớn nhất (0,83) - có quan hệ gần nhất được quy thành 1
nhóm:
L2/3 L4 L5
L1
0,42 0,35 0,27
L2
0,085 0,02
L4
0,53
Để tìm tiếp mối quan hệ giữa L4/5 và L1/2/3 ta cần nhóm tiếp như sau:
L4/5
L1
0,31
L2/3
0,05 → 0,18
Cây chủng loại phát sinh của 5 loài trên được lập như sau:

7.6 Phương pháp phân loại bằng ADN
Từ thập kỷ tám mươi của thế kỷ XIX việc phát triển các chỉ thị ADN hay còn gọi là dấu
phân tử đã được tiến hành. Đó là các chỉ thị về đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP,
Botstein và cs, 1980); Đa hình các đoạn ADN nhân ngẫu nhiên (RAPD, Wiliam và cs.1990);
Tiểu vệ tinh (microsatellite, Litt và Luty, 1989) hay còn gọi là sự lặp lại các chuỗi đơn giản
(SSR, Jacob và cs, 1991) và đa hình độ dài các đoạn nhân chọn lọc (AFLP, Zabeau và Vos,
1993).
7.6.1 Kỹ thuật phản ứng trùng hợp - PCR
Nguyên lý: dùng một đoạn gen hay mẫu rất nhỏ ADN rồi sử dụng kỹ thuật PCR để nhân
lên gấp bội dùng trong nghiên cứu.
Các nguyên liệu cần thiết:
* ADN đích hay ADN khuôn
* ADN polymerase bền nhiệt (Taq, Vent, Pfu…)

* Một hay nhiều đoạn mồi (primer) nghèo nucleotid
* Bốn loại Didesoxyribonucleotidtriphosphate (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
* Đệm phản ứng chứa MgCl2.
Các bước tiến hành: Mỗi một chu kỳ tiến hành theo 3 bước sau:
* Biến tính: dùng nhiệt độ 90 - 95oC trong 30 giây đến vài phút để tách ADN khuôn
thành 2 sợi đơn.
* Lai hay bắt cặp mồi: nhiệt độ hạ xuống 50 - 70oC trong 30 giây đến vài phút để cho
các mồi nghèo nucleotid bắt cặp với các sợi đơn tại các trình tự bổ sung.


98
* Kéo dài chuỗi: tăng nhiệt lên 72oC trong 30 giây đến vài phút để cho ADN
polymerase bền nhiệt tổng hợp sợi mới theo nguyên tắc bổ sung.
Chu kỳ thường được lặp lại 25 - 30 lần và lúc đó số lượng sẽ tăng lên 106 lần số lượng ban
đầu.
Từ phương pháp này người ta đã bổ sung, cải tiến tạo ra nhiều phương pháp khác nhau gọi
là các dấu hiệu chỉ thị (marker).
7.6.2 Phân loại dựa trên kỹ thuật cắt giới hạn - RFLP
Đây là kỹ thuật sử dụng các enzym cắt hạn chế, cắt ADN thành các đoạn nhỏ có độ dài
khác nhau. Khi hai hoặc nhiều cá thể được so sánh với một đoạn dò RFLP thì có thể có sự
khác nhau về độ dài các đoạn cắt. Sự khác nhau này gọi là sự đa hình. Các đoạn này có thể di
truyền và được sử dụng như các dấu phân tử. Dựa trên số đoạn ADN tương đồng của các
băng điện di để xác định sự giống nhau hay mối quan hệ họ hàng gần gũi.
Phương pháp tiến hành:
* Tách ADN
* Cắt ADN thành những đoạn nhỏ nhờ các enzym giới hạn
* Phân tích các đoạn ADN bằng điện di trên gel
* Chuyển các đoạn ADN sang một màng lọc
* Hiển thị các đoạn ADN bằng công cụ thăm dò hay đánh dấu phóng xạ
* Phân tích các kết quả.

Thuận lợi của phương pháp này: kết quả có khả năng thực hiện giữ ở các phòng thí
nghiệm; các chỉ thị RFLP thường chỉ ra sự kế thừa tương đồng của các dị hợp tử có thể nhận
ra từ đồng hợp tử; có khả năng phân biệt ở mức độ loài, quần thể hay cá thể và phương pháp
đơn giản.
Tuy nhiên áp dụng phương pháp này có một số hạn chế: tốn nhiều thời gian, chi phí cao;
hầu hết công việc phân tích cần đến đánh dấu phóng xạ nên bị phụ thuộc nơi tiến hành công
việc.
7.6.3 Phân loại dựa trên kỹ thuật nhân ngẫu nhiên ADN đa hình - RAPD
Phương pháp này dựa trên phản ứng PCR, sử dụng một hay hai đoạn mồi tự ý ngắn 6-10
bazơ để nhân một đoạn ADN gi•n xoắn nào đó và có thể phân tách và hiển thị bằng điện di
trên gel.
Quá trình được thực hiện trên máy PCR, PTC-100 (MJ Research Inc. Mỹ). Các phản ứng
được thực hiện trong thể tích 25 *l chứa 10 - 25 ng ADN genom, 2,5 *l đệm PCR có nồng độ
gấp 10 lần (đệm PCR x 10), 0,2 mM mồi, 200 mM dNTP, 1,5mM MgCl2 và 0,5 đơn vị Taq
ADN polymerase.
Phản ứng
được thực hiện theo 3 bước:
* Biến tính ADN ở 94oC trong 1 - 3 phút
* Lai: hạ nhiệt xuống 35oC trong 1 phút
* Kéo dài chuỗi: tăng nhiệt lên 72oC trong 2 - 5 phút.
Các sản phẩm RAPD được phân tích bằng điện di trên gen agaroza 1%. Kết quả cho các
băn khác nhau. Từ đó tiến hành đánh giá mối quan hệ của hai taxôn nào đó.


99
Kỹ thuật này có ưu điểm là phát hiện nhanh chóng các dấu hiệu; kỹ thuật đơn giản, không
liên quan đến phương pháp lai và chụp ảnh phóng xạ; chỉ cần một lượng cực nhỏ ADN và chi
phí thấp.
7.6.4 Phân loại dựa trên kỹ thuật nhân đoạn AFLP
Kỹ thuật AFLP là kết hợp giữa kỹ thuật RAPD và nhân đoạn PCR được tiến hành theo các

bước sau:
* Cắt ADN genom bằng enzim cắt giới hạn EcoR1 và Msel: Để làm việc này, lấy 0,3
mg ADN ủ 2 giờ ở 37oC với 3 đơn vị EcoR1 and 3 đơn vị Msel, 6 ml dung dịch điện có nồng
độ gấp 5 lần (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM MgAc, 250 mM KAc).
* Gắn các đoạn cắt với đoạn tiếp hợp: Sau khi cắt, lấy 10 ml hỗn hợp dùng để gắn (1ml
đoạn tiếp hợp EcoR1 (5 pmol/ml) và 1 ml đoạn tiếp hợp Msel (50 pmol/ml), 1ml 10 mM
ATP, 1ml T4 ADN ligase và 4 ml nước cất vô trùng) cho vào 20 ml ADN đã được cắt. Phản
ứng gắn được thực hiện ở 20oC trong 3 giờ. Sau khi gắn các tiếp hợp, ADN được làm lo•ng
10 lần và giữ ở -20oC.
* Nhân đoạn bước đầu: Trước khi nhân chọn lọc các đoạn ADN đã gắn các tiếp hợp
được nhân bước đầu với các mồi tiền nhân EcoR1 (5’-GACTGCGTACCAATTC-3’) và Msel
(5’GATGAGTCCTGAGTAA3’). Dung dịch phản ứng nhân bước đầu gồm 5ml ADN đã gắn
tiếp hợp và pha lo•ng 10 lần và 25 ml hỗn hợp tiền nhân (0,5 ml mồi tiền nhân EcoR1 (100
ng/ml), 0,5 ml mồi tiền nhân Msel (100 ng/ml), 1,3ml 5mM dNTP, 3ml 10 x đệm PCR, 1,2
ml 50 mM MgCl2, 0,2 ml 5 đơn vị/ml Taq ADN polymerase, và 18,3 ml nước cất vô trùng).
Phản ứng nhân được thực hiện bằng 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 30 giây ở 94oC, 1 phút ở
56oC, 1 phút ở 72oC.
* Nhân chọn lọc: Việc nhân chọn lọc các đoạn ADN đã được gắn tiếp hợp và nhân bước
đầu được tiến hành với việc sử dụng các mồi có 2 hoặc 3 nucleotide chọn lọc.
Các mồi chọn lọc EcoR1 có chuỗi nucleotide chung là 5GACTGCGTACCAATT3’ còn
các mồi chọn lọc Msel có chuỗi nucleotide chung là 5’GATGAGTCCGAGTAA-3’. Các mồi
chọn lọc khác nhau ở chỗ ngoài chuỗi nucleotide chung chúng có từ 1 đến 3 nucleotide chọn
lọc. Chẳng hạn EcoR1-C, EcoR1-CT, EcoR1-CAT hay Msel-A, Msel-AG, Msel-GC.
Nhân chọn lọc được thực hiện trong 12ml dung dịch gồm 6 ml hỗn hợp phản ứng (1,25 ml
10 x đệm PCR, 0,6 ml 50 mM MgCl2, 0,6 ml 5 mM dNTP, 0,5 ml mỗi lo
ại mồi chọn lọc, 0,1
ml 5 đơn vị Taq ADN polymerase và 3 ml nước cất vô trùng). Phản ứng nhân chọn lọc được
thực hiện bằng 36 chu kỳ như sau: 1 chu kỳ gồm gi•n xoắn ở 94oC trong 30 giây, gắn mồi ở
65oC trong 1 phút và kéo dài mồi ở 72oC trong 2 phút; tiếp theo là 12 chu kỳ với nhiệt độ gắn
mồi giảm 0,7oC sau mỗi chu kỳ; cuối cùng là 23 chu kỳ với nhiệt độ gắn mồi là 56oC.

Các sản phẩm nhân chọn lọc
được phân lập bằng điện di trên gel polyacrylamide biến tính
5%. Điện di được tiến hành với dòng điện công suất ổn định 75W trong 2 giờ. Sau điện di gel
được nhuộm bằng nitrate bạc.
Ưu điểm của kỹ thuật này là: Độ nhạy cao; tái thực hiện; ứng dụng rộng r•i; phân biệt được
dị hợp tử. Tuy nhiên có một số hạn chế: chi phí cao; yêu cầu kỹ thuật nghiêm ngặt và phải sử
dụng chất phóng xạ.
7.6.5 Phân loại dựa trên kỹ thuật tiểu vệ tinh là các đoạn ADN ngắn có một số
lượng các chuỗi nucleotid lặp lại - SSR


100
Kỹ thuật SSR được thực hiện bằng phản ứng PCR của ADN genom với các mồi SSR.
Các chuỗi lặp lại này thường có một đến sáu nucleotid. SSR được khám phá và sử dụng
đầu tiên ở người, hiện nay được dùng để lập bản đồ phân tử người, động vật và một số thực
vật. SSR cũng được sử dụng để nghiên cứu đa dạng di truyền ở động vật và thực vật, cũng
như mối quan hệ giữa các quần thể và cá thể trong loài. Các alen SSR thường hơn kém nhau
một số nucleotit xác định nên có thể điện di đồng thời sản phẩm nhân bản bốn locut trong
cùng một đường chạy, nhờ đó tiết kiệm thời gian và chi phí.
Ưu điểm: phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện, có tính lặp lại cao… Đây là công cụ
hữu hiệu trong nghiên cứu mối quan hệ huyết thống.


101
Chương 8
Nguồn gốc và phân loại Cây Có hoa (Anthophyta)
hay cây Hạt kín (Angiospermae)
− Những tính chất cây có hoa:
− Có mạch gỗ điển hình
− Yếu tố rây và các tế bào kèm trong phloem

− Túi phôi tám nhân
− Thụ tinh kép
− Noãn đóng kín
− Nội nhũ 3n.
Mạch gỗ không phải chỉ có ở tất cả Angiospermae mà có một vài cây có hoa không có mạch gỗ.
Túi phôi tám nhân. Thế hệ thể giao tử thường đơn giản hóa hơn và tiêu giảm hơn so với cây Hạt trần.
Thể giao tử đự
c cái ở có hoa thường bé và rất hiệu quả với sự phân chia tế bào tương đối ít. Cây có
hoa có thụ tinh kép tức là một tinh tử kết hợp với nhân của trứng cho ra hợp tử 2n và hợp tử hình
thành phôi; một tinh tử khác kết hợp với hai nhân trung tâm (nhân thứ cấp) trong túi phôi và cho ra nội
nhũ 3n, tức là mô dinh dưỡng của hạt. Sự thụ tinh kép như thế là đặc trưng riêng của cây có hoa mà
không có nhóm nào có. Trong cây có hoa các lá bào tử lớn chuyên hóa mạnh (lá noãn) nó bao lấy noãn
sau đó noãn phát triển thành hạt. Đây là nét độc đáo: hạt được bao kín và vì thế có tên là cây Hạt kín.
Hạt phấn dính và nảy mầm trên bề mặt đầu nhụy tạo thành ống phấn và ống phấn đã mang nhân tinh
trùng tới nhân trứng nằm trong túi phôi của noãn. Trái lại, ở Hạt trần hạt phấn nảy mầm ngay lỗ noãn
và trực tiếp kết hợp với noãn mà không phải nảy mầm trên đầu nhụy. Đó là s
ự khác biệt và đặc điểm
quan trọng của nhóm cây có hoa. Nhiều tính chất sinh sản độc đáo của cây có hoa bao gồm chu trình
sống rút ngắn và hữu hiệu có thể đã đóng góp cho những thắng lợi trong giới thực vật.
Cây có hoa có một số tính chất chung:
Vị trí tương đối của nhị và lá noãn không thay đổi;
Vị trí lá noãn luôn luôn ở cao nhất trên trục hoa;
Cách sắp xếp của hoa gồm lá đài, cánh tràng, bộ nhị và b
ộ nhụy không thay đổi trong toàn bộ cây
có hoa;
Cấu trúc của một nhị là ổn định với 4 ô trong hai cặp;
Hạt phấn một rãnh trong một số Hai lá mầm và toàn bộ Một lá mầm là giống nhau;
Mạch gỗ và ống rây giúp cho cây có hoa vận chuyển có hiệu quả cao để thích nghi với các vùng
khô hạn;
Hệ gân tự do giúp cho mở rộng bề mặt quang hợp của lá. Đó là những lý do giúp cho cây có hoa

thống trị trên Trái Đất.
Cây có hoa là một nhóm tự
nhiên có những tính chất chung làm cho nó có tính độc đáo so với
các thực vật có mạch khác (Cronquist, 1968, 1981 ; Stebbins, 1974; Takhtajan, 1969 - 1987). Những
tính chất chung đó làm cho cây có hoa được coi như là có nguồn gốc đơn nguyên có nghĩa là cây có


102
hoa xuất phát từ những loài tổ tiên chung. Những biến đổi tiến hóa giống nhau có thể xảy ra những
hướng song song có quan hệ họ hàng với nhau tạo ra những đặc điểm mà ngày nay coi là một ngành
có hoa đa dạng nhất, tiến bộ nhất và thích ứng cao nhất (Cronquist, 1965; Krassilov, 1977).
8.1 Hoá thạch, thời gian xuất hiện và đa dạng hóa của thực vật Có hoa
Các nhà cổ thực vật đã cố gắng một cách thắng lợi để xác định tổ tiên của cây có hoa và ba giả
thuyết đã được xây dựng để giải thích những khiếm khuyết đó (Hughes, 1976).
1/ Không có đầy đủ các bằng chứng hóa thạch và thiếu hóa thạch của hoa
2/ Lịch sử tiến hóa lâu dài và chậm chạp của cây có hoa
3/ Sự tiến hóa của cây có hoa đầu tiên ở vùng cao cách xa đồng bằng mà ở đó có các hóa thạch
tồn đọng.
Những giả thuyết gọi là “chạy trốn” đó đã dẫn một số nhà thực vật đề nghị rằng cây có hoa bắt
nguồn từ đầu Trung sinh hoặc ngay cả cuối Cổ sinh và chúng đã trải qua đa dạng hóa vào giai đoạn
Aptian - Albian vào Crêta dưới (xem bảng 8.1). Tuy nhiên sau khi xem xét lại những bằng chứng ủng
hộ giả thuyết đó, Wolfe, Doyle và Page (1975) đã tìm được “nguồn gốc cây có hoa từ
đầu Crêta”.
Những bằng chứng hóa thạch đã chỉ ra rằng cây có hoa bắt nguồn từ đầu Crêta khoảng 130 - 135 triệu
năm trước.
ở trầm tích Crêta cổ, các hóa thạch cây có hoa bị lu mờ bởi Dương xỉ và Hạt trần cho tới cuối
Crêta hóa thạch cây có hoa chiếm ưu thế. Những hạt phấn một rãnh đầu tiên đặc trưng cho Hai lá mầm
nguyên thủy và Một lá mầm xuất hiện ở thời kỳ
Barremian của Crêta dưới. Hạt phấn ba rãnh đặc trưng
cho Hai lá mầm tiến bộ được tìm thấy đấu tiên ở các tảng đá Aptian hơi trẻ hơn. Độ gặp phấn thể hiện

rõ ràng và đa dạng ở Crêta. Tuy nhiên, hạt phấn của cây có hoa nguyên thủy hầu như ít tách biệt với
hạt phấn Hạt trần. Vào thời điểm sớm, cây có hoa tách thành Một lá mầm và Hai lá mầm xảy ra rất
chậm ch
ạp trong hệ thực vật ở cạn mà hệ thực vật đó ưu thế là Dương xỉ và Hạt trần. Sự tiến bộ của
hạt phấn từ kiểu nguyên thủy trong lớp cổ đến kiểu tiến bộ hơn trong trầm tích trẻ đã chỉ ra cho các
nhà thực vật là cây có hoa trải qua sự đa dạng hóa lớn suốt Crêta (Raven and Axelrod, 1974; Wolfe,
Doyle and Page, 1975). Vào giai đoạn Turonian và Coniacian, hạt phấn cây có hoa phong phú hơn bào
tử Dương xỉ và hạt phấn Hạt trần. Vào giai đoạn Maestrichtian số lượng các họ, chi hiện đại được tìm
thấy hạt phấn và lá. Đó là Magnoliales, Hamamelidales, Ranunculales, Theales và một số ít Một lá
mầm xuất hiện cuối Crêta. Sự tiến hóa và đa dạng hóa của cây có hoa tiếp tục vào thời Cenozoic. Hoá
thạch tìm thấy ở tầng Eocene (Crepet, Dilcher and Potter, 1974). Mặc dù có một số bằng chứng có thể
cổ hơn, hạt phấ
n Compositae xuất hiện cuối Oligoxen (Muller, 1970). Hạt phấn kiểu tương đối tiến bộ
giống như Verbenaceae hiện đại (Trib. Compostae) tìm thấy ở trầm tích Mioxen.


Bảng 8.1. Các thời đại địa chất
10
6
năm Đại Thời Kỷ Giai đoạn Tuổi năm 10
6
Đệ tứ
Holocen
Pleistocen
2,5
Neocen
Pliocen
Miocen
12
Oligocen 25

Thượng 38
Trung 46

Eoce
n
Hạ
50





65


Tân
Sinh


Đệ tam

Paleocen
Paleocen
54


103
Maestrichtian
70
Campanian

80
Santonian
85
Coniacian
90




Thượng
Turonian Cenomania
n
100
Albian
110
Aptian
122
Barremian
125
Hauterivian
127
Vanlaginian
130





Crêta




Hạ
Ryazanian
132
Jura
135





Trung
Sinh
Triat













135
180

225
270
350
405
440
500
600


Cổ Sinh
Permi
Cacbon
Devôn
Silua
Ocđô
Cambri






Chỉ một vài thông báo về gỗ Hai lá mầm tìm thấy đầu Crêta. Đó là những kiểu gỗ nguyên thủy và
không có ở các cây có hoa tiến bộ. Những nghiên cứu lá ở Crêta cho thấy tính đa dạng tăng trong suốt
Crêta. Điều đó chứng minh sự chuyển tiếp từ kiểu lá phổ biến ở một số Magnoliales hiện nay đến
những dấu hiệu hình thái tương tự Rosidae (Hickey and Doyle, 1977).
8.2 Tổ tiên thực vật Có hoa
Bằng chứng về hình thái cổ thực vật cho rằng tất cả cây có hạt sinh ra từ nhóm lớn các loại
Dương xỉ và giống như Dương xỉ dị bào tử. Nguồn gốc đơn nguyên cây có hoa dựa trên bằng chứng
nghiên cứu so sánh cả Hạt trần và cây có hoa có thể liên quan với Dương xỉ qua Gymnospermae tổ

tiên của cây có hoa (Beck, 1900). Thuật ngữ Gymnospermae mô tả dạng sống và không dành cho
nhóm liên kết; Gymnospermae là Thông, Tuế, Dương xỉ có hạt , nó liên quan với nhau, nh
ưng
Gymnospermae cũng dành cho các Địa tiền lớn có mang hạt trần. Các nhóm khác nhau của Hạt trần
được xem xét một cách nghiêm túc như là mầm mống của thực vật có hoa.
Không có bằng chứng cho rằng phân ngành Hạt trần là tổ tiên của ngành có hoa. Một thời kỳ nào
đó, phân ngành Gnetophytina có hoa đơn tính được xem nó tiêu giảm thành dạng đuôi sóc như các họ
Salicaceae, Betulaceae coi như là dạng nguyên thủy. Cấu trúc của hoa nhóm đơn hoa bì với hoa có
một vòng bao hoa giống với cấu trúc sinh sản củ
a Gnetophytina, nhưng bất kỳ sự giống nhau giữa các
cấu trúc cơ quan sinh sản của chúng đều là những ví dụ về sự đồng quy.
Phân ngành Tuế là nhóm cổ, phát triển mạnh trong thời kỳ Cacbon và nó có ba lớp: Dương xỉ có
hạt, á tuế và Tuế. Lớp Tuế có thể tiến hóa từ Dương xỉ có hạt. Tuế là nhóm khác gốc có thể không
phải là tổ tiên của cây có hoa. á tuế có lá đại bào tử có cuống không giống với lá noãn c
ủa có hoa.
Chính vì thế nó được loại bỏ ra khỏi tổ tiên của ngành có hoa. Caytoniales của lớp Dương xỉ có hạt có
noãn gần được bao kín trong một túi nhỏ được xem xét do một vài tính chất quá chuyên hóa nên
không thể là tổ tiên (Thorne,1976). Tuy nhiên Stebbins (1974) tin tưởng sự tương đồng tồn tại giữa


104
noãn ngành có hoa và cấu trúc túi của Caytoniales. Cấu trúc hai vỏ không bình thường của noãn cây
có hoa có lẽ được giải thích như cái túi nhỏ.
Những nhóm Hạt trần khác đã bị loại bỏ, Dương xỉ có hạt với những tính chất nguyên thủy chung
và sự đa dạng lớn giữ lại như là tổ tiên có thể. Rất có thể nhóm chưa chuyên hóa chưa biết đến của
Dương xỉ có hạt đại Trung sinh xuất hiện rất s
ớm vào Crêta cho ra cây có hoa đầu tiên (Thorne, 1976).
Bộ Dương xỉ có hạt Lyginopteridales phong phú nhất trong thời cacbon nhưng phát triển mạnh trong
thời Jura trước khi tuyệt chủng.
Dương xỉ có hạt có lá kép lông chim lớn, gân rõ. Thân của chúng đơn độc hay phân cành với

vòng tượng tầng. Dương xỉ có hạt là cùng gốc với hai dạng lá bào tử lớn và bào tử nhỏ riêng biệt. Hạt
thuộc kiểu nguyên thủy với dạng giao tử cái lớn. Noãn sinh ra ở mép lá, mạch gỗ chưa có nh
ưng điều
đó không quan trọng kể từ khi mạch xuất hiện trong nhiều nhóm cây có mạch khác nhau do sự tiến
hóa đồng qui. Việc mở rộng mạnh mẽ trong Jura, Dương xỉ có hạt xuất hiện ở thời kỳ nào đó cho ra
cây có hạt đầu tiên có thể gọi là Thực vật có hoa.
Theo Cronquist (1968) coi các cây có các tính chất của cây có hoa có thể tiến hóa từ tổ tiên
Dương xỉ có hạt, có thể chúng là Dương xỉ có hạt nằ
m dưới sức ép chọn lọc đảm bảo sinh sản có hiệu
quả hoặc rút ngắn chu trình sống trong vùng nhiệt đới có mùa khô hạn, đáp ứng lý thuyết đó được thể
hiện qua các hóa thạch tìm thấy trong cuối Jura và đầu Crêta.
8.3 Các cây có hoa đầu tiên
Khi thiếu các tư liệu hóa thạch, vấn đề thú vị cần phải xây dựng lại cây có hoa giả thuyết. Một vài
nhà thực vật coi dạng cây thảo là tiến bộ và cho cây bụi hay cây gỗ nhỏ là dạng đầu tiên. Có một vài
bằng chứng được sử dụng đã ủng hộ điều đó: 1/ Sự cản trở điều kiện hóa gỗ trong Hạt trần (liên quan
đến cây tổ tiên), 2/ Mối t
ương quan của dạng cây gỗ với các tính chất sinh sản nguyên thủy và 3/ Sự
có mặt của cây gỗ không có mạch trong một số đại diện Magnoliales.
Lá cây có hoa sớm nhất phải là lá đơn, thường xanh, nguyên, mọc cách, gân lông chim, nhẵn và
có lá kèm (Takhtajan, 1964). Hickey (1973) đã phát triển hệ thống phân loại của kiến trúc lá Hai lá
mầm đã chỉ ra sự tiến hóa của chúng.
Lý thuyết cổ điển cho rằng hoa nguyên thủy là đơn độc tận cùng, lưỡng tính, đối x
ứng toả tròn, có
nhiều lá bao hoa (tepal), nhiều nhị, nhiều lá noãn xếp xoắn trên một trục dài, bao hoa dày, dạng lá, nhị
rộng và dạng lá; lá noãn lớn thiếu vòi và đầu nhụy ở đỉnh; noãn đảo, lớn, hạt có hai vỏ.

Hình 8.2.
Magnolia campbellii (Magnoliaceae)
Sự sắp xếp các nhị và các lá noãn. b) Nhị. c) Hạt. d) Lát cắt dọc hạt (chú ý phôi nhỏ) (J.Hutchinson, 1973)





105

Hình 8.3.
Ngày đầu hoa Magnolia grandifolia, loài cánh cứng (Trichiotinus piger) ăn gai ở đầu nhụy.
Chú ý cánh tràng trong một phần bao lấy bộ nhụy. Cánh cứng vào hoa chỉ sau khi mở. Sau đó vì
cánh tràng mở hòan toàn, đầu nhụy có màu nâu và không nhận phấn (ảnh L.B.Thein.)


Hình 8.4.
Hoa Magnolia grandifolia cuối ngày thứ 2. Đầu nhị nâu, nhị rơi xuống.
Khi đầu nhụy nhận được phấn hoặc phấn mở, cánh tràng cuốn lại giữ thức ăn
cho cánh cứng
Theo Takhtajan (1964) nhị cây có hoa đầu tiên lớn giống lá, hạt phấn nằm thành dải ở bên sâu
trong bề mặt phiến lá với 3 vết lá.
Noãn sinh ra ở mép hay rải rác trên bề mặt của lá bào tử lớn mở. Lá bào tử lớn giống lá non và
cuộn lại theo gân chính với các lá noãn bên trong. Trong quá trình phát triển lá bào tử lớn tiêu giảm


106
tạo thành lá noãn. Lá noãn là lá bào tử lớn tức là cấu trúc dạng lá biến đổi mang noãn. Trong cây có
hoa đầu tiên mép lá noãn không dính ở thời gian thụ phấn. Như vậy, trên bề mặt đầu nhụy ở đấy hạt
phấn nẩy mầm là dọc theo mép nguyên. Các rãnh này thu hẹp dần và hướng tập trung ở đỉnh tạo thành
bộ nhụy điển hình (hình 8.1 – 8.4).
Takhtajan (1969) đề nghị rằng noãn đảo trong đó lỗ noãn quay lại phía rốn là nguyên thủy có
trong cây có hoa đầu tiên. Tác giả
dựa trên kết luận này liên quan đến sự phân bố các noãn đảo trong
các họ nguyên thủy. Các cây có hoa đầu tiên có hai lớp vỏ bao quanh phôi và sau này tạo thành áo hạt.

Các họ Ranales có những tính chất nguyên thủy với noãn không có nhân lớn nhiều tế bào và túi
phôi 8 nhân. Nội nhũ lớn gặp trong nhiều họ có tính chất nguyên thủy. Một số nhà thực vật cho rằng
cây có hoa đầu tiên có phôi nhỏ trong nội nhũ giàu chất sừng (Copious), phôi này giống phôi và ngoại
nhũ Magnolia. Thụ tinh kép có ở cây có hoa nguyên thủ
y gặp lại trong tất cả Angiospermae.
Trong một vài cây có hoa tiến bộ như bộ Đậu (Fabales), nội nhũ không có hoặc một số khác thực
hiện chức năng dự trữ đó bằng lá mầm. Số lá mầm hay lá hạt trong các cây có hoa đầu tiên chưa biết
nhưng các nhà hình thái đồng ý rằng Một lá mầm tiến lên từ Hai lá mầm.
8.4 Mối quan hệ của cây có hoa với động vật (Hình 8.5)
Các nhà sinh học hiện nay nhận thấy rằng cây có hoa có quan hệ gần gũi với động vật trong quá
trình tiến hóa.


Hình 8.5.
Sự thích ứng tỏa tròn của tự thụ phấn bởi các kiểu phấn khác nhau ở Phlox (Polemoniaceae) (Stebbins, 1974)
8.4.1 Sự thụ phấn