1

CÁC KỸ THUẬT TÁCH SẮC KÝ


Các kỹ thuật tách sắc ký là những phương pháp tách trong đó các thành phần của mẫu
được phân bố vào hai pha: một pha tĩnh và một pha động. Pha tĩnh có thể là một chất
rắn, cũng có thể là một chất lỏng được giữ trên một chất rắn hay một gel. Pha tĩnh có thể
được nhồi vào một cột, hoặc trải thành một lớp, hay phân tán thành một lớp phim v.v
Pha động có thể là chất khí, chất lỏng hay chất lưu siêu tới hạn (còn được gọi là chất
lỏng siêu tới hạn). Sự tách sắc ký có thể dựa trên các cơ chế khác nhau như hấp phụ,
phân bố khối lượng (hay phân chia), trao đổi ion, hoặc dựa trên sự khác nhau về các tính
chất lý hoá của các phân tử như kích thước, khối lượng, thể tích, v.v…
Phụ lục này chỉ đề cập tới các định nghĩa và phép tính các thông số thông thường trong
các kỹ thuật sắc ký, các yêu cầu thường được áp dụng cho tính phù hợp của hệ thống
sắc ký. Nguyên lý, thiết bị và phương pháp tách được trình bày trong các phương pháp
thử chung:
- Phương pháp sắc ký giấy (Phụ lục 5.1)
- Phương pháp sắc ký khí (Phụ lục 5.2)

2

- Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3)
- Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4)
- Phương pháp sắc ký rây phân tử (Phụ lục 5.5)
Định nghĩa:
Các định nghĩa sau đây được dùng trong các chuyên luận để tính toán các thông số.
Một số thiết bị có phần mềm của nhà sản xuất dùng để tính toán một vài thông số như tỷ
số tín hiệu trên nhiễu. Trong trường hợp này, người sử dụng có trách nhiệm đảm bảo
rằng các phương pháp dùng trong phần mềm đó phù hợp với yêu cầu của dược điển

này; nếu không, phải điều chỉnh cho phù hợp.
Sắc đồ
Sắc đồ là một đồ thị hay một cách trình bày khác mô tả sự thay đổi của đáp ứng của
detector (hay nồng độ của chất hay một đại lượng khác dùng làm thước đo nồng độ của
chất) theo thời gian, thể tích hay khoảng cách. Một sắc đồ lý tưởng có dạng một chuỗi
các pic kiểu Gauss trên một đường nền.
Các thông số chỉ sự lưu giữ
Thời gian lưu và thể tích lưu

3

Trong sắc ký rửa giải, sự lưu giữ của một chất có thể được biết dưới dạng thời gian lưu
t
R.
Thời gian lưu được xác định trực tiếp trên sắc đồ bởi vị trí của đỉnh pic. Từ thời gian
lưu có thể tính được thể tích lưu V
R
dựa trên công thức:

RR
tV




Trong đó:
R
t (thời gian lưu) là khoảng cách trên đường nền từ điểm tiêm mẫu đến đường thẳng
đứng kẻ từ đỉnh pic của chất ,


(tốc độ dòng) là lưu lượng của dòng pha động.
Hệ số phân bố khối lượng
Hệ số phân bố D
m
còn được gọi là thừa số dung lượng k’ hay thừa số lưu giữ k được
định nghĩa và tính theo công thức sau:

M
S
C
M
S
m
V
V
K
Q
Q
'kD 
Trong đó:
Q
S
và Q
M
lần lượt là lượng chất tan trong pha tĩnh và pha động,
V
S
và V
M
lần lượt là thể tích pha tĩnh và pha động,

K
C
là hệ số phân bố cân bằng, còn gọi là hằng số phân bố.

4

Hệ số phân bố khối lượng của một chất có thể xác định từ sắc đồ theo công thức:

M
MR
m
t
tt
'kD


Trong đó:
t
R
(thời gian lưu hay thể tích lưu), là khoảng cách trên đường nền từ điểm tiêm mẫu đến
đường thẳng đứng kẻ từ đỉnh pic của chất .
M
t (thời gian chết hay thể tích rỗng), là khoảng cách trên đường nền từ điểm tiêm mẫu
đến đường thẳng đứng kẻ từ đỉnh pic của một chất không bị lưu giữ.
Hệ số phân bố
Trong sắc ký trên gel, đặc tính rửa giải của một chất có thể biểu thị dưới dạng hệ
số phân bố K
o
và được tính theo công thức:


ot
oR
o
tt
tt
K



trong đó:
t
R
(thời gian lưu hay thể tích lưu), là khoảng cách trên đường nền từ điểm tiêm mẫu đến
đường thẳng đứng kẻ từ đỉnh pic của chất.
o
t (thời gian chết hay thể tích rỗng), là khoảng cách trên đường nền từ điểm tiêm mẫu
đến đường thẳng đứng kẻ từ đỉnh pic của một chất không bị lưu giữ.

5

t
t (thời gian lưu hay thể tích lưu), là khoảng cách trên đường nền từ điểm tiêm mẫu đến
đường thẳng đứng kẻ từ đỉnh pic của chất có thể tiếp cận đầy đủ các lỗ xốp của
pha tĩnh.
Thừa số chậm
Thừa số chậm R
F
(còn được gọi là hệ số di chuyển R
f
), được dùng trong sắc ký trên mặt

phẳng (sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy) đó là tỷ số giữa khoảng cách từ điểm chấm mẫu
đến tâm của vết sắc ký và khoảng cách từ điểm chấm mẫu đến tuyến dung môi.

a
b
R
F

Trong đó:
b là quãng đường di chuyển của chất tan,
a là quãng đường di chuyển của tuyến dung môi.
Các thông số vế sắc ký
Pic sắc ký
Pic của một chất có thể được xác định bởi diện tích pic (A), hay chiều cao pic (h), và
chiều rộng của pic ở nửa chiều cao (w
h
) hoặc chiều cao pic (h) và chiều rộng pic ở điểm
uốn (w
i
). Với các pic dạng Gauss (hình 5.8.1) ta có hệ thức:
w
h
= 1,18 w
i


6




Hình 5.8.1

Hệ số đối xứng
Hệ số đối xứng (A
s
) (hay hệ số kéo đuôi) của một pic Hình 5.8.2 được tính theo công
thức:

d
2
w
A
05,0
S

Trong đó:
w
0,05
là chiều rộng của pic ở 1/20 chiều cao của pic,

7

d là khoảng cách từ đường thẳng đứng đi qua đỉnh pic đến cạnh phía trước của pic ở
1/20 chiều cao của pic.
Khi A
s
= 1,0 thì pic hoàn toàn đối xứng (lý tưởng)

Hình 5.8.2
Hiệu năng của cột và số đĩa lý thuyết biểu kiến

Tuỳ theo kỹ thuật được sử dụng, dựa trên các dữ liệu thu được trong điều kiện đẳng
nhiệt, đẳng dòng hay đẳng mật độ, hiệu năng của cột (hay hiệu lực biểu kiến của cột),
biểu thị dưới dạng số đĩa lý thuyết biểu kiến (N), có thể tính được theo công thức dưới
đây:

2
h
R
w
t
54,5N









trong đó:

8

R
t là thời gian lưu hay thể tích lưu hay khoảng cách trên đường nền từ điểm tiêm mẫu
đến đường thẳng góc kẻ qua đỉnh pic tương ứng với chất,
h
w là chiều rộng của pic ở nửa chiều cao pic tính theo cùng đơn vị đo
R

t (thời gian, thể
tích hay khoảng cách).
Số đĩa lý thuyết biểu kiến thay đổi theo chất, theo cột cũng như theo thời gian lưu.
Các thông số về sự tách sắc ký
Độ phân giải
Độ phân giải (R
S
) giữa hai pic của hai chất được tính theo công thức:



2h1h
1R2R
S
ww
tt18,1
R



Trong đó:
1R
t và
2R
t là thời gian lưu, hay khoảng cách trên đường nền từ điểm tiêm mẫu đến
đường thẳng góc kẻ qua hai đỉnh pic tương ứng với hai chất cạnh nhau,
1h
w và
2h
w là chiều rộng của hai pic ở nửa chiều cao của pic tương ứng.

Độ phân giải lớn hơn 1,5 thì hai pic được tách đến đường nền. Công thức cho ở trên có
thể không đúng khi các pic không được tách trên đường nền.

9

Trong sắc ký trên mặt phẳng, thay cho thời gian lưu, người ta sử dụng quãng
đường dịch chuyển và độ phân giải được tính theo công thức



2h1h
1F2F
S
ww
RRa18,1
R



Trong đó:
1F
R và
2F
R là = các thừa số chậm (hay hệ số lưu giữ) của hai chất,
1h
w và
2h
w = chiều rộng của hai pic ở nửa chiều cao của pic tương ứng.
a = quãng đường dịch chuyển của dung môi
Công thức này chỉ áp dụng cho trường hợp sắc đồ các vết sắc ký trên mặt phẳng đã

được quét và chuyển sang dạng các pic sắc ký.
Tỷ số đỉnh-hõm
Tỷ số đỉnh-hõm (p/v) có thể được dùng như một thông số của tính phù hợp của
hệ thống trong phép thử các tạp chất liên quan khi hai pic không được tách đến đến
đường nền (xem hình 5.8.3).

v
p
H
H
v/p 

trong đó:

10

H
p
= chiều cao của đỉnh pic nhỏ so với đường nền ngoại suy
H
v
= chiều cao của đáy hõm tách hai pic lớn và nhỏ.



Hình 5.8.3
Độ lưu giữ tỷ đối
Độ lưu giữ tỷ đối (r), còn gọi là thừa số chọn lọc (α), có thể ước lượng theo công thức
sau:


M1R
M2R
tt
tt
r




11

Trong đó:
t
R2
là thời gian lưu của pic chất được quan tâm
t
R1
là thời gian lưu của chất đối chiếu (thường là pic của chất cần thử)
M
t = thời gian chết (hay thể tích rỗng), là khoảng cách trên đường nền từ điểm tiêm mẫu
đến đường thẳng đứng kẻ từ đỉnh pic của một chất không bị lưu giữ.
Độ lưu giữ tỷ đối chưa hiệu chính (r
G
) được tính theo công thức:
1R
2R
G
t
t
r 

Trừ khi có hướng dẫn khác, các trị giá độ lưu giữ tỷ đối cho trong các chuyên luận là độ
lưu giữ tỷ đối chưa hiệu chính.
Trong sắc ký trên mặt phẳng, các thừa số chậm (hệ số di chuyển) R
f2
và R
f1
được dùng
thay cho các thời gian lưu t
R2
và t
R1
.
Độ chụm của kết quả định lượng
Tỷ số tín hiệu trên nhiễu
Tỷ số tín hiệu trên nhiễu (S/N) ảnh hưởng đến độ chụm (precision) của kết quả
định lượng và có thể tính theo công thức:

12

h
H2
N/S 
trong đó:
H = chiều cao của pic (Hình 5.8.4) ứng với chất khảo sát trên sắc đồ thu được với dung
dịch chất đối chiếu đã định, chiều cao này được đo từ đỉnh pic đến đường nền ngoại suy
trên một khoảng bằng 20 lần chiều rộng của pic ở nửa chiều cao của pic,
h = khoảng dao động của nhiễu đường nền trên sắc đồ thu được sau khi tiêm một mẫu
trắng, khoảng dao động này được xác định trên một quãng đường bằng 20 lần chiều
rộng của pic ở nửa chiều cao của pic trên sắc đồ thu được khi tiêm dung dịch chất đối
chiếu đã định và nếu có thể thì khoảng đường này phân bố đều hai bên vị trí của pic của

chất nghiên cứu.

Hình 5.8.4

13


Độ lặp lại
Độ lặp lại của đáp ứng được biểu thị dưới dạng độ lệch chuẩn tương đối % (RSD%) của
của một dãy liên tiếp các kết quả phép tiêm và đo rồi tính theo công thức:
1n
yy
y
100
%RSD
2
i














Trong đó:
y
i
là các giá trị cá thể dưới dạng diện tích pic hay chiều cao pic hay tỷ số các diện tích
trong phương pháp chuẩn hoá,

y là trung bình của các giá trị cá thể,
n là số các giá trị cá thể.
Với một dãy lần tiêm dung dịch đối chiếu, cho những giới hạn xác định, giá trị cực đại
của độ lệch chuẩn tương đối (RSD
max
) có thể tính được theo công thức sau:

1n%,90
max
t
nKB
RSD


Trong đó:

14

K là hằng số (0,349), tính được từ biểu thức
6
t
2
6,0
K

1n%,90 

trong đó
2
6,0
là
RSD yêu cầu cho B = 1,0, sau 6 lần tiêm.
B là giới hạn trên trong xác định của chuyên luận riêng trừ đi 100 phần trăm,
n là số dung dịch đối chiếu (3 ≤ n ≤ 6)
1n%,90
t

là t trong bảng Student với mức xác suất 90 % (hai chiều) và n-1 bậc tự do.
Tính phù hợp của hệ thống
Các phép thử tính phù hợp của hệ thống là phần không thể thiếu của một phương pháp
và được dùng để đảm bảo hệ thống sắc ký có hiệu năng phù hợp. Hiệu lực biểu kiến, tỷ
số phân bố khối lượng, độ lưu giữ tỷ đối và hệ số đối xứng là những thông số thường
được dùng để đánh giá hiệu năng của cột. Các yếu tố có thể ảnh hưởng đến đặc tính sắc
ký bao gồm thành phần pha động, sức ion, nhiệt độ và pH biểu kiến của pha động, lưu
lượng, chiều dài cột, nhiệt độ và áp suất, và các đặc tính của pha tĩnh, mức biến đổi hoá
học như độ xốp (cỡ lỗ), cỡ hạt, kiểu các hạt, diện tích bề mặt riêng, và trong trường hợp
pha đảo là mức độ biến đổi hoá học (được biểu diễn dưới dạng mức độ khoá đầu (end-
capping) hay tải lượng carbon, v.v )
Các bộ phận cấu thành của máy phải có khả năng đáp ứng yêu cầu về độ chụm khi tiến
hành phép thử hay định lượng.

15

Nếu không có chỉ dẫn gì khác trong chuyên luận thì hệ thống phải đạt các yêu cầu sau
đây:

- Hệ số đối xứng của pic chính phải trong khoảng 0,8 -1,5, trừ khi có chỉ dẫn khác trong
chuyên luận. Yêu cầu này được áp dụng rộng rãi cho các phép thử và định lượng trong
các chuyên luận.
- Độ lệch chuẩn tối đa được phép cho các lần tiêm lặp lại của dung dịch đối chiếu không
được vượt quá các trị giá cho trong bảng 5.8.1. Yêu cầu này chỉ áp dụng cho các phép
định lượng và không áp dụng cho phép thử tạp chất liên quan. Giới hạn phát hiện pic
(ứng với tỷ số tín hiệu trên nhiễu là 3) là nhỏ hơn giới hạn có thể bỏ qua của các tạp
chất liên quan. Giới hạn định lượng của pic (ứng với tỷ số tín hiệu trên nhiễu là 10) thì
nhỏ hơn hoặc bằng giới hạn có thể bỏ qua của các tạp chất liên quan.
Bảng 5.8.1. Yêu cầu về độ lặp lại

Số lần tiêm
3 4 5 6
B (%) Độ lệch chuẩn tối đa được phép

16

2,0 0,41 0,59 0,73 0,85
2,5 0,52 0,74 0,92 1,06
3,0 0,63 0,89 1,10 1,27

Yêu cầu về tính phù hợp của hệ thống cho các chuyên luận không có trong Dược điển
Việt Nam: Trừ khi có chỉ dẫn riêng trong chuyên luận, độ lệch chuẩn tối đa được phép
cho các lần tiêm lặp là 2,0%. Yêu cầu này chỉ áp dụng cho các phép định lượng.
Điều chỉnh các điều kiện sắc ký
Để thoả mãn các tiêu chí trong yêu cầu về tính phù hợp của hệ thống, mà không làm
thay đổi cơ bản phương pháp, có thể điều chỉnh các thông số sắc ký trong phạm vi nêu
trong bảng cho dưới đây để tham khảo. Các điều kiện sắc ký đã được thẩm định trong
quá trình xây dựng chuyên luận. Các phép thử tính phù hợp của hệ thống được đưa vào
để đảm bảo yêu cầu về tách cho phép thử hay phép định lượng đạt chất lượng mong

muốn. Tuy nhiên, vì pha tĩnh chỉ được mô tả một cách chung chung, và trên thị trường
lại có nhiều loại pha tĩnh có những đặc tính sắc ký khác nhau, nên có thể cần điều chỉnh
một số điều kiện sắc ký để đạt các yêu cầu của tính phù hợp của hệ thống. Đặc biệt
trong phương pháp sắc ký pha đảo, việc thay đổi các thông số sắc ký không phải lúc nào

17

cũng cho kết quả tách thoả đáng. Trong trường hợp này, có thể phải thay cột khác cùng
loại, ví dụ một cột silicagel gắn C18 khác mà có thể cho kết quả mong muốn.
Với các thông số quan trọng, việc điều chỉnh được xác định rõ ràng trong chuyên luận
để đảm bảo tính phù hợp của hệ thống.
Nên tránh điều chỉnh nhiều thứ một lúc vì có thể gây tác động tích luỹ trên hiệu năng
của hệ thống.
Sắc ký lớp mỏng và sắc ký giấy
Thành phần pha động: lượng thành phần dung môi nhỏ có thể điều chỉnh
%
30

nồng
độ tương đối hay
2

% nồng độ tuyệt đối tuỳ theo cái nào lớn hơn. Ví dụ với dung môi
thành phần nhỏ cỡ 10% của pha động thì thay đổi 30% tương đối nghĩa là nồng độ trong
khoảng 7-13% trong khi thay đổi 2% nồng độ tuyệt đối nghĩa là nồng độ trong khoảng
8-12%; như vậy khoảng theo nồng độ tương đối lớn hơn; nếu thành phần dung môi nhỏ
là 5% thì thay đổi 30% tương đối nghĩa là trong khoảng 3,5-6,5% và thay đổi 2% nồng
độ tuyệt đối nghĩa là trong khoảng 3-7%, trong trường hợp này khoảng theo nồng độ
tuyệt đối lớn hơn. Không thành phần dung môi nào được thay đổi lớn hơn 10% nồng độ
tuyệt đối.

pH của thành phần nước trong pha động: chỉ điều chỉnh thay đổi

0,2 đơn vị pH trừ
khi có chỉ dẫn khác trong chuyên luận, hay thay đổi

1 đơn vị pH khi nghiên cứu các
chất trung tính.

18

Nồng độ muối trong thành phần đệm của pha động: được thay đổi

10%
Thể tích mẫu chấm sắc ký điều chỉnh trong khoảng 10-20% của thể tích quy định nếu
sử dụng bản mỏng cỡ hạt nhỏ (2-10 µm).
Khoảng dịch chuyển của tuyến dung môi không được dưới 50mm và với bản mỏng
hiệu năng cao thì không được dưới 30 mm.
Sắc ký lỏng
Thành phần pha động lượng thành phần dung môi nhỏ có thể điều chỉnh
%
30

nồng
độ tương đối hay
2

% nồng độ tuyệt đối tuỳ theo trị số nào lớn hơn. (Xem ví dụ ở
trên). Không thành phần dung môi nào được thay đổi lớn hơn 10% nồng độ tuyệt đối.
Nồng độ muối trong thành phần đệm của pha động: Được thay đổi


10%.
Bước sóng detector không được điều chỉnh.
Pha tĩnh:
Chiều dài cột:

70%
Đường kính trong của cột:

25%
Cỡ hạt: Giảm tối đa 50% và không được phép tăng.
Lưu lượng pha động:

50%. Khi trong chuyên luận cho thời gian lưu của pic chính, thì
phải thay đổi lưu lượng dung môi nếu đã thay đổi đường kính trong của cột. Không

19

được giảm lưu lượng dung môi nếu trong chuyên luận sử dụng số đĩa lý thuyết biểu kiến
trong phần đánh giá chất lượng.
Nhiệt độ

10%, tối đa là 60
o
C.
Thể tích tiêm có thể giảm nếu giới hạn phát hiện và độ lặp lại của các pic được xác định
là thoả đáng.
Rửa giải gradient Cấu hình của thiết bị dùng có thể thay đổi đáng kể độ phân giải, thời
gian lưu và thời gian lưu tỷ đối đã nêu trong phương pháp. Nếu điều này xảy ra thì có
thể do thể tích dung môi cư trú (dwell volume) quá lớn. Thể tích dung môi cư trú là thể
tích giữa điểm hai dung môi rửa giải gặp nhau và điểm đầu cột.

Sắc ký khí
Pha tĩnh:
Chiều dài cột:

70%
Đường kính trong của cột:

25%
Cỡ hạt: giảm tối đa 50% và không được phép tăng
Bề dày lớp phim: giảm 50% đến tăng 100%.
Lưu lượng pha động:

50%.
Nhiệt độ

10%

20

Thể tích tiêm có thể giảm nếu giới hạn phát hiện và độ lặp lại của các pic được xác định
là thoả đáng.
Định lượng
Đáp ứng detector: Độ nhạy của detector là tín hiệu đầu ra khi một đơn vị nồng độ hay
một đơn vị khối lượng trong pha động đi vào detector. Hệ số đáp ứng tương đối của
detector, thường được gọi là hệ số đáp ứng, biểu thị độ nhạy của một detector đối với
một chất chuẩn. Hệ số hiệu chỉnh là nghịch đảo của hệ số đáp ứng.
Phương pháp chuẩn ngoại. Nồng độ các thành phần cần phân tích được xác định bằng
cách so sánh (các) đáp ứng pic của dung dịch thử với đáp ứng pic của chất đối chiếu.
Phương pháp chuẩn nội. Chất chuẩn nội phải là một chất có thể tách khỏi chất khảo sát.
Thêm cùng lượng chuẩn nội vào dung dịch thử và dung dịch chất đối chiếu. Chất chuẩn

nội không được có phản ứng với khảo sát, phải bền và không chứa tạp có thời gian lưu
tương tự thời gian lưu chất khảo sát. Nồng độ chất khảo sát được xác định dựa vào việc
so sánh tỷ số diện tích pic (hay chiều cao pic) giữa chất khảo sát và chuẩn nội trong
dung dịch thử với tỷ số diện tích pic (hay chiều cao pic) giữa chất khảo sát và chuẩn nội
trong dung dịch chất đối chiếu.
Quy trình chuẩn hoá, còn gọi là phương pháp chuẩn hoá. Hàm lượng phần trăm của
một hay nhiều thành phần trong chất thử được tính bằng cách xác định diện tích một pic
hay nhiều pic dưới dạng % của tổng diện tích tất cả các pic trừ các pic của dung môi hay
thuốc thử và các pic ở dưới mức có thể bỏ qua.

21

Quy trình hiệu chuẩn, còn gọi là phương pháp đường chuẩn. Xác định mối quan hệ
giữa tín hiệu đo được hay đánh giá được (y) và lượng (nồng độ, khối lượng, vv.) của
chất (x) rồi tính hàm hiệu chuẩn (phương trình đường chuẩn). Tính kết quả phân tích từ
tín hiệu của chất phân tích (được đo hay được đánh giá) theo phương pháp hàm số
ngược.
Trong các chuyên luận thường cho các phương pháp định lượng khác nhau như phương
pháp chuẩn ngoại, phương pháp chuẩn nội, quy trình chuẩn hoá (phương pháp đường
chuẩn) nhưng ít khi dùng quy trình chuẩn hoá (phương pháp chuẩn hoá). Trong các
phép thử tạp chất liên quan, người ta dùng hoặc phương pháp chuẩn ngoại với một
dung dịch đối chiếu, hoặc dùng quy trình chuẩn hoá. Tuy vậy trong cả hai phương pháp
chuẩn ngoại và chuẩn hoá, nếu phải pha loãng một dung dịch chất thử để so sánh thì hệ
số đáp ứng của các tạp chất liên quan phải xấp xỉ đáp ứng của bản thân chất phân tích
(hệ số đáp ứng 0,8-1,2), nếu không thì phải dùng hệ số hiệu chỉnh.
Khi trong chuyên luận có quy định phép thử các tạp chất liên quan là tổng các tạp chất
hay khi phải định lượng một tạp chất thì điều quan trọng là phải chọn một ngưỡng thích
hợp và các điều kiện thích hợp cho việc lấy tích phân các diện tích pic. Trong các phép
thử như vậy thì ngưỡng bỏ qua (nghĩa là các diện tích pic dưới ngưỡng này không được
tính đến) thường là 0,05%. Như thế, ngưỡng đặt cho hệ thống thu thập dữ liệu ít nhất

phải là nửa ngưỡng bỏ qua. Việc lấy tích phân các diện tích pic của các tạp không được
tách hoàn toàn khỏi pic chính nên được thực hiện theo phương pháp ngoại suy từ hõm
tới hõm (vạch tiếp tuyến). Các pic của dung môi hoà tan mẫu cũng được bỏ qua.

22