§Ò tμi:

§¸nh gi¸ hiÖu qu¶ t¸ch chiÕt AND cña vi khuÈn trùc tiÕp
tõ ph©n





Chñ nhiÖm ®Ò tμi: TS. NguyÔn Vò Trung

1
Đặt vấn đề

Tiêu chảy là một trong những vấn đề quan trọng về sức khỏe, đặc biệt đối
với trẻ em trên toàn thế giới. Tiêu chảy chiếm vị trí thứ hai về tỷ lệ tử vong ở trẻ
em dới 5 tuổi do mắc các bệnh nhiễm khuẩn (chỉ sau nhiễm khuẩn đờng hô
hấp). Tiêu chảy còn là nguyên nhân quan trọng gây suy dinh dỡng, ảnh hởng
đến sự tăng trởng của trẻ. ớc tính mỗi năm có khoảng 4 -10 triệu trờng hợp
tử vong do tiêu chảy, trong đó phần lớn là trẻ dới 5 tuổi. Số trẻ em bị bệnh tiêu
chảy chiếm khoảng 22% tổng số trẻ em nằm viện [2]. Từ khi thành lập Chơng

trình Quốc gia Phòng chống Bệnh tiêu chảy năm 1982, số lợt tiêu chảy hàng
năm trên mỗi trẻ đã giảm xuống, từ 2,2 lợt năm 1985 xuống còn 1,8 lợt năm
1990, và 1,3 lợt năm 2003. Tỷ lệ tử vong do tiêu chảy cũng giảm 2,4% ; 1,4%
và 0,7% trong lần lợt các năm 1986-1987, 1990-1991, và 2003 [8].
Có nhiều tác nhân vi sinh vật gây tiêu chảy nh vi khuẩn, vi rút, ký sinh
trùng. Trong đó, các căn nguyên vi khuẩn đóng vai trò quan trọng. Một số vi
khuẩn hay gây tiêu chảy thờng gặp là Salmonella spp; Shigella spp;
Escherichia coli gây tiêu chảy (Diarrheagenic Escherichia coli-DEC). Đặc biệt
gần đây, vai trò của DEC đang thu hút đợc sự quan tâm của các bác sĩ lâm
sàng và các nhà vi sinh.
Có nhiều phơng pháp xác định các căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy:
Phơng pháp định danh kinh điển sử dụng các tính chất sinh vật hóa học và
ngng kết với kháng huyết thanh đặc hiệu; Phơng pháp thử nghiệm trên động
vật thí nghiệm; Phơng pháp miễn dịch; Phơng pháp sử dụng kỹ thuật nuôi cấy
trên tế bào; Các phơng pháp sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử nh lai ADN,
phản ứng khuyếch đại gen - Polymerase Chain Reaction (PCR). Trong số các
phơng pháp trên, PCR rất hay đợc dùng vì kỹ thuật này có độ nhạy và độ đặc
hiệu rất cao [8]. Tuy nhiên cho tới nay, phần lớn các qui trình sử dụng PCR để
xác định các vi khuẩn nói chung và vi khuẩn gây tiêu chảy nói riêng, đều thông
qua bớc cấy bệnh phẩm phân trên các môi trờng đặc, rồi tiến hành chọn lựa
các khuẩn lạc để tách chiết ADN của vi khuẩn cho phản ứng PCR. Nh vậy, cần

2
ít nhất 24-30 giờ để phát hiện đợc sự có mặt của vi khuẩn gây tiêu chảy trong
phân [33].
Trên lâm sàng, việc xác định nhanh các căn nguyên vi khuẩn có ý nghĩa rất
quan trọng trong chẩn đoán và lựa chọn chế độ điều trị thích hợp cho bệnh
nhân. Nếu có thể sử dụng kỹ thuật PCR với ADN tách chiết trực tiếp từ phân sẽ
giúp cho qui trình xác định căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy chỉ còn vài giờ.
Điều này sẽ góp phần quan trọng trong quá trình chẩn đoán và điều trị. Chính vì

vậy, chúng tôi tiến hành đề tài "Đánh giá hiệu quả tách chiết ADN của vi
khuẩn trực tiếp từ phân" với 2 mục tiêu sau:
1. Phát triển qui trình tách chiết ADN của E. coli gây tiêu chảy trực tiếp từ
phân.
2. Đánh giá hiệu quả tách chiết ADN trực tiếp từ phân.


















3
CHƯƠNG I
Tổng quan
1.1. Tình hình bệnh tiêu chảy
1.1.1. Trên thế giới
Tiêu chảy có tỷ lệ mắc và tử vong đứng hàng thứ hai sau nhiễm khuẩn
đờng hô hấp cấp tính ở trẻ em. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, hằng năm, trên thế

giới có khoảng 1 tỷ lợt ngời bị tiêu chảy và 4 -10 triệu trờng hợp tử vong,
phần lớn ở trẻ dới 5 tuổi [2].
1.1.2. ở Việt Nam
Tiêu chảy là nguyên nhân quan trọng gây suy dinh dỡng và ảnh hởng
đến sự tăng trởng của trẻ. Theo các nghiên cứu gần đây, bệnh tiêu chảy ở nớc
ta đứng vị trí hàng đầu trong 10 bệnh phổ biến nhất, và là nguyên nhân gây tử
vong đứng hàng thứ hai ở trẻ em do mắc các bệnh nhiễm khuẩn (chỉ sau nhiễm
khuẩn đờng hô hấp). Số trẻ em bị bệnh tiêu chảy chiếm khoảng 22% tổng số
trẻ em nằm viện [6, 8, 9].

1.2. Các căn nguyên vi sinh vật gây tiêu chảy
Các căn nguyên vi sinh vật gây tiêu chảy thờng gặp là vi rút, vi khuẩn và
ký sinh trùng. Một số nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ phân lập đợc căn nguyên vi
sinh vật gây tiêu chảy vào khoảng 70% các trờng hợp tiêu chảy [5, 15]. Trong
số các tác nhân vi khuẩn gây tiêu chảy, E. coli đã đợc quan tâm từ rất lâu. Tỷ
lệ phân lập đợc các DEC từ bệnh phẩm phân trong một số nghiên cứu từ 22%
đến 30%, có nơi tới 60,3%. Tỷ lệ này cao hơn so với các căn nguyên khác nh
Shigella spp., 4,7-6,1%; Salmonella spp., 0,9-6%; Campylobacter spp., 7%;
Bacteroides fragilis sinh độc tố ruột 7,3%. Điều này cho thấy vai trò quan trọng
của DEC trong bệnh tiêu chảy [2].
Theo một số tác giả nớc ngoài, DEC đóng vai trò rất quan trọng trong
bệnh tiêu chảy ở trẻ dới 5 tuổi. Tỷ lệ phân lập và xác định đợc DEC trong các
nghiên cứu ở ác-hen-ti-na là 33,5%; Ni-giê-ria 60,3%; Mông Cổ 28,1% [17].

4
ở Việt Nam, một số công trình nghiên cứu đã cho thấy vai trò của DEC
trong gây bệnh tiêu chảy. Tỷ lệ phân lập đợc DEC theo Hoàng Tiến Mỹ (1997)
là 28,94% [10]; Đỗ Thị Thu Hơng (2001), 24,9% [7] và Nguyễn Vũ Trung
(2002) 22,5% [5]
1.3. E. coli và bệnh tiêu chảy do E. coli

E. coli sống ở đại tràng của ngời và nhiều động vật khác nhau. Vi khuẩn
theo phân ra ngoài và hiện diện trong đất, nớc và không khí. Tuy nhiên, một số
chủng E. coli có những yếu tố độc lực đặc biệt giúp chúng có khả năng gây các
bệnh lý khác nhau. Vào những năm 40 của thế kỉ trớc, ngời ta xác định đợc
khả năng nhiễm trùng đờng tiêu hoá, gây tiêu chảy của E. coli [2].
Dựa trên đặc điểm lâm sàng của bệnh tiêu chảy, dịch tễ học, typ huyết
thanh và sự có mặt của các yếu tố độc lực, DEC đợc chia làm 5 nhóm chính:
1.3.1. EPEC
Chủng E. coli gây bệnh đờng ruột loại này đợc phát hiện vào năm
1948 bởi Bray và Giles [28].
* Yếu tố độc lực và cơ chế gây bệnh
- EPEC gây tổn thơng mô học dạng bám và gây thoái hoá (A/E). Sự bám
của vi khuẩn vào tế bào biểu mô niêm mạc ruột làm thoái hoá các vi nhung
mao, tác động gây rối loạn quá trình hấp thu nớc và điện giải.
- Cơ chế gây tiêu chảy:
+ Tác động của EPEC trên niêm mạc ruột dẫn đến đứt gãy các sợi actin
trong lõi của vi nhung mao. Các vi nhung mao của các tế bào biểu mô bị thoái
hoá, mất diềm bàn chải, gây kém hấp thu ở lòng ruột.
+ Mặt khác, khi nồng độ Ca
++
trong tế bào tăng sẽ ức chế quá trình hấp
thu ion Na
+
và kích thích quá trình bài tiết Cl
-
.
+ Sự thay đổi trong cơ chế vận chuyển của các ion trong tế bào, và do đáp
ứng với các phản ứng làm giảm khả năng vận chuyển màng, đã dẫn đến tăng
tính thấm của tế bào biểu mô ruột [28].




5
* Bệnh cảnh lâm sàng
- Thời kỳ ủ bệnh ngắn, khoảng 9-12 giờ (nghiên cứu trên ngời tình
nguyện) [28].
- Bệnh cảnh lâm sàng thờng là tiêu chảy phân toàn nớc, không có nhầy
và máu; có thể kèm theo nôn và sốt nhẹ.
1.3.2. ETEC
* Yếu tố độc lực và cơ chế gây bệnh
Khả năng gây bệnh của ETEC liên quan đến hai yếu tố độc lực là khả
năng bám, c ngụ ở niêm mạc ruột và sản sinh độc tố.
- Yếu tố bám dính:
+ ETEC bám một cách đặc hiệu lên các receptor trên tế bào màng nhầy
biểu mô ruột. Quá trình này đợc thực hiện thông qua một số yếu tố trung gian
nh CFA, yếu tố kháng nguyên trên bề mặt E. coli.
+ Các gen mã hoá cho CFA nằm trên plasmid, và plasmid này chứa đồng
thời các gen mã hoá cho các độc tố ruột không chịu nhiệt-labile toxin (LT) và
chịu nhiệt-stable toxin (ST).
- độc tố ruột:
Gồm độc tố ruột LT và độc tố ST. Cả hai đều mang tính chất của ngoại
độc tố. Một chủng ETEC có thể chỉ có LT, hoặc ST hoặc cả 2 [35].
* Bệnh cảnh lâm sàng
- Thời gian ủ bệnh từ 14 - 50 giờ. Bệnh có thể diễn biến nhẹ, tự khỏi.
- Biểu hiện lâm sàng thờng đột ngột với tiêu chảy phân toàn nớc, không
có nhầy, máu; ít khi kèm theo nôn và sốt.
1.3.3. EIEC
* Yếu tố độc lực và cơ chế gây bệnh
EIEC gây bệnh bằng cách xâm nhập niêm mạc ruột. Cơ chế xâm nhập
của EIEC thông qua plasmid pInv có trọng lợng phân tử 140 MDa, trong đó,

chứa một số các gen mxi, spa mã hoá cho những protein cần thiết cho quá trình
gây bệnh gồm Ipa A, Ipa B, Ipa C và Ipa D.

6
- Cơ chế gây bệnh: EIEC xâm nhập vào tế bào biểu mô đại tràng, làm
tiêu huỷ các hạt vùi trong không bào, nhân lên trong nguyên tơng và chúng
xâm lấn sang các tế bào biểu mô kế cận. Kết quả, tại niêm mạc đại tràng xảy ra
phản ứng viêm, gây nên các tổn thơng khu trú và có thể còn dẫn đến những tổn
thơng dạng loét.
* Bệnh cảnh lâm sàng
- Thời gian ủ bệnh ngắn từ 10 - 18 giờ (quan sát trên những ngời tình
nguyện và các vụ dịch) [28].
- Vi khuẩn xâm lấn niêm mạc ruột gây triệu chứng giống hội chứng lỵ,
phân ít thờng lẫn nhầy và máu.
- ở những bệnh nhân nhiễm chủng EIEC sinh độc tố ruột, bệnh cảnh lâm
sàng chỉ biểu hiện đơn thuần của một tiêu chảy phân nớc.
1.3.4. EHEC
* Yếu tố độc lực và cơ chế gây bệnh.
EHEC gây bệnh qua 2 cơ chế chính là: Gây tổn thơng mô bệnh học
giống EPEC và sinh độc tố ruột.
- Cơ chế sinh độc tố ruột:
+ Các chủng EHEC tiết ra các độc tố có tác dụng gây độc tế bào Vero
nên còn đợc gọi là Verotoxin. Mặt khác, nó tơng tự nh độc tố Shiga nên còn
có tên khác là Shiga-like-toxin, ký hiệu Stx.
+ Stx là một protein có tính kháng nguyên mạnh, mang tính chất của một
ngoại độc tố, có các gen mã hoá nằm trên nhiễm sắc thể. Có hai loại Stx: Stx1
và Stx2 [29].

- Cơ chế gây bệnh:
+ Cơ chế gây tiêu chảy: Sau khi gắn vào tế bào, độc tố ruột của EHEC đi

vào trong tế bào, chuyển tới bộ Golgi, sau đó đợc vận chuyển tới lới nội sinh
chất. Tại đó, nó ức chế quá trình tổng hợp protein trong bào tơng (làm chết các
tế bào này). Stx huỷ hoại một cách có chọn lọc trên các tế bào mang chức năng
hấp thu, và bảo tồn các tế bào bài tiết vùng kẽ. Cơ chế này kết hợp với tổn
thơng A/E làm tăng tính thẩm thấu của ruột, dẫn đến tiêu chảy

7
* Bệnh cảnh lâm sàng
EHEC gây tiêu chảy phân có hoặc không có máu, hội chứng HUS
(Heamolytic Uremic Syndrome) là biểu hiện của bộ ba triệu chứng: suy thận
cấp - giảm tiểu cầu - thiếu máu tán huyết.
1.3.5. EAEC
Là loại E. coli có kiểu cách bám dính kết tập trên tế bào Hep-2. Đây là
loại DEC mới đợc phát hiện và nghiên cứu trong 20 năm gần đây.
* Yếu tố độc lực và cơ chế gây bệnh
- Phần lớn các yếu tố độc lực của EAEC nằm trên một plasmid có trọng
lợng phân tử 60 MDa. Plasmid này có vai trò quan trọng trong kiểu cách bám
dính kết tập (aggregative adherence) của EAEC, ký hiệu là plasmid AA-pAA.
- Cơ chế gây bệnh của EAEC có 3 giai đoạn: Bám dính, tiết nhày và gây
độc tế bào.
* Bệnh cảnh lâm sàng
- Thời gian ủ bệnh khoảng 7-22 giờ [28].
- Biểu hiện lâm sàng là tiêu chảy phân nhiều nớc lẫn nhiều nhầy, sốt nhẹ
và thờng không nôn.
* Các phơng pháp xác định E. coli gây tiêu chảy trong phòng thí nghiệm
- Thử nghiệm trên môi trờng nuôi cấy tế bào (cho EAEC), trên môi
trờng nuôi cấy phân lập SMAC (cho EHEC), trên chuột lang (cho EIEC), quai
ruột thỏ (cho ETEC)
- Thử nghiệm tạo váng trên bề mặt môi trờng canh thang Muller-
Hinton. Đây là thử nghiệm đơn giản, rẻ tiền (cho EAEC).

- Phơng pháp miễn dịch (cho EHEC, EIEC, ETEC, EPEC)
- Mẫu dò ADN: Thờng sử dụng đoạn nucleotide pCVD432 trên plasmid
pAA (cho EAEC); Stx1,2 (cho EHEC), gen ial, ipaH (cho EIEC) [43].
- Kỹ thuật PCR: Thiết kế đoạn mồi nhằm khuyếch đại đoạn nucleotide
pCVD432 có chiều dài 630bp trên plasmid pAA (cho EAEC), các gen Stx1 và
Stx2, pVCD419, Hly (cho EHEC); lt, st (cho ETEC); eae, bfp (cho EPEC) [13,
22].

8
1.4. PCR trong xác định DEC
Sự ra đời của kỹ thuật PCR đã đa lại một cuộc cách mạng trong việc nghiên
cứu, phân tích gen và hệ gen. Trớc đây, khó khăn lớn nhất trong việc phân tích
gen nằm ở chỗ, chúng là những đơn vị rất nhỏ, số lợng ít trong một hệ gen
phức tạp và khổng lồ. Kỹ thuật PCR ra đời đã thay đổi tất cả, giúp chúng ta có
thể tạo ra một số lợng lớn các bản sao của một đoạn ADN mong muốn [12].
Phản ứng PCR dựa trên nguyên lý tổng hợp ADN trong tế bào, trong đó
ADN đợc nhân lên theo cơ chế bán bảo tồn. Về nguyên tắc, để bắt đầu quá
trình tổng hợp ADN, hai sợi ADN làm khuôn mẫu bị tách ra dới tác dụng của
nhiệt độ. Hai đoạn oligonucleotide từ 20-40 nucleotid gọi là mồi, sẽ gắn vào các
vị trí bổ xung trên đoạn ADN khuôn mẫu.

Sơ đồ hóa Nguyên lý kỹ thuật PCR
1. Giai đoạn biến tính. 2. Giai đoạn gắn mồi.
3. Giai đoạn kéo dài mồi. 4. Sau khi hoàn thành chu kỳ đầu tiên.

Trong điều kiện của PCR, hai mồi sẽ đợc kéo dài về hai phía, tạo ra
đoạn ADN mới bổ xung với đoạn khuôn mẫu. Với một cặp mồi đặc hiệu, một

9
đoạn ADN nào đó sẽ đợc tổng hợp sau mỗi chu kỳ của PCR. Việc thao tác

đợc thực hịên trực tiếp trên chất liệu di truyền (đặc biệt trên các gen của vi
khuẩn) để khuyếch đại một đoạn ADN đặc hiệu lên hàng triệu hay hàng tỷ lần
trong thời gian ngắn [12].
Nhìn chung các tác giả đều có chung một nhận xét là kỹ thuật PCR đa
mồi có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, và có ý nghĩa thiết thực, không chỉ trong
chẩn đoán phòng thí nghiệm mà còn hỗ trợ trong điều trị và dự phòng tiêu chảy.
Trên thế giới, đã có nhiều tác giả nghiên cứu áp dụng kỹ thụât PCR trong xác
đinịh và phân loại DEC sử dụng các cặp mồi nhằm khuyếch đại đoạn nucleotide
pCVD432 có chiều dài 630bp trên plasmid pAA (cho EAEC), các gen Stx1 và
Stx2, pVCD419, Hly (cho EHEC); lt, st (cho ETEC); eae, bfp (cho EPEC); ial,
ipaH (cho EIEC) [13, 22].
Tuy nhiên, các ứng dụng kỹ thuật PCR thờng phải phối hợp với bớc
nuôi cấy bệnh phẩm trên môi trờng đặc. Qui trình này cần ít nhất 18-24 giờ
cho vi khuẩn mọc sau khi cấy bệnh phẩm. Trên thực tế lâm sàng, nhiều bệnh lý
tiêu chảy tiến triển rất nhanh, trong khi do phải chờ đợi kết quả xét nghiệm,
việc quyết định phơng hớng điều trị gặp rất nhiều khó khăn. Điều này cho
thấy, việc xác định nhanh căn nguyên gây tiêu chảy có ý nghĩa rất quan trọng.
Phát triển và hoàn thiện một qui trình PCR xác định nhanh vi khuẩn từ
bệnh phẩm phân là vấn đề cần thiết. Nó giúp giải quyết việc xác định nhanh các
căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy, giúp bác sĩ lâm sàng và dịch tễ có các biện
pháp xử lý và điều trị kịp thời - thích hợp. Tuy nhiên, vấn đề cơ bản là tách chiết
ADN của vi khuẩn trực tiếp từ phân để sử dụng cho phản ứng PCR.
Tuy nhiên, sự có mặt của một số chất trong phân nh sắc tố mật, muối
mật, polysaccharid, các chất cặn bã, xơ từ thức ăn đã tiêu hoá , một số chất cha
đợc biết sẽ có thể ức chế phản ứng PCR, làm giảm đáng kể độ nhạy và độ
đặc hiệu của kỹ thuật. Vấn đề đặt ra ở đây là làm sao tách chiết và tinh sạch
đợc ADN của các chủng E. coli
gây tiêu chảy trực tiếp từ bệnh phẩm.
Đã có một số phơng pháp tách chiết và tinh sạch ADN trực tiếp từ phân
nh phơng pháp tách chiết dùng ethanol; phơng pháp sắc ký lỏng cao áp;


10
phơng pháp dùng bi thuỷ tinh hoặc bi silic [8]. Đơn cử nh phơng pháp
dùng phenol và chloroform của Viện quân y Mỹ (AFRIMS) [38]. Qui trình cụ
thể cũng khá phức tạp. Hiện nay trên thị trờng có một số bộ kit thơng phẩm
nh bộ sinh phẩm QIAamp DNA Stool Mini Kit của hãng QIAGEN [34].
Trong bộ kit này để tách chiết ADN của vi khuẩn trực tiếp từ phân, các nhà sản
xuất đã đa ra qui trình gồm có các bớc sau:
- Ly giải 200mg (hoặc 2ml) mẫu phân trong 1,4ml dung dịch ASL. Tế
bào vi khuẩn và những tế bào bệnh lý khác trong phân, đợc ly giải đồng nhất ở
70
o
C trong 5 phút (nếu cần thiết có thể tăng lên 95
0
C).
- Hấp phụ tạp chất: sử dụng 1 viên InhibitEX đợc cung cấp trong bộ kit,
để hấp phụ hết những chất ức chế phản ứng PCR.
- Thuần khiết DNA:
+ Sử dụng Proteinase K, Buffer AL, ethanol để làm biến tính protein.
+ Gắn kết ADN lên một màng silica-gel có sẵn trong ống QIAamp.
+ Rửa màng bằng dung dịch Buffer AW1, Buffer AW2 để loại bỏ
những chất không thuần khiết.
+ Sử dụng dung dịch Buffer AE để hoà tan ADN gắn trên màng.
Tuy nhiên, các phơng pháp này hoặc là quá phức tạp, hoặc quá đắt và
chỉ thực hiện đợc ở những phòng xét nghiệm đợc trang bị máy móc hiện đại.
Vì thế, một phơng pháp tách chiết ADN trực tiếp từ phân đơn giản, nhanh,
hiệu quả và ít tốn kém sẽ có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong hoàn cảnh ở Việt
Nam, là chìa khoá đối với kỹ thuật PCR xác định nhanh và trực tiếp các chủng
E. coli gây tiêu chảy cũng nh các vi khuẩn khác trực tiếp từ phân.









11
CHƯƠNG II
Đối tợng, vật liệu, v phơng pháp nghiên cứu

2.1. Đối tợng
- Các chủng DEC mẫu do GS Andrej Weitraub, Viện Karolinska Thụy Điển
cung cấp:
DEC Chủng chuẩn Gen đích
ETEC ATCC 35401
el
t
B, estA
EHEC ATCC 43890
v
t
1, eaeA
EHEC ATCC 43889
vt2, eaeA
EPE
C
ATCC 43887
eaeA, bfpA
EIE

C
ATCC 43893
ial
EAEC 97R* Chủn
g
có đoạn
p
CVD432 trên
p
AA
E. coli
ATCC 11775 Chủn
g
khôn
g
có
g
en độc lực
Các chủng này đợc lu giữ trong Ngân hàng của Đề án Bảo tồn nguồn gen Vi
sinh vật y học.
2.2. Vật liệu
2.2.1. Vật liệu dùng cho nuôi cấy và xác định vi khuẩn
- Môi trờng dùng trong nuôi cấy và phân lập vi khuẩn: Sorbitol Mac Conkey
(SMAC), Deoxycholate Citrat Agar (DCA).
- Các loại tube, đĩa petri

2.2.2. Sinh phẩm, hoá chất, và máy móc dùng trong PCR
2.2.2.1. Sinh phẩm, hóa chất




12
- Cặp mồi (primer) đặc hiệu cho các E. coli gây tiêu chảy (Invitrogen-Mỹ)
Primer
Gen
đích
Số truy cập
trong ngân hàng
gen
Trình tự
Sản phẩm
(bp)
LT
eltB
S60731
5
TCTCTATGTGCATACGGAGC
3

322
5
CCATACTGATTGCCGCAAT
3
ST
estA
M34916
5
GCTAAACCAGTA
G
A

GGTCTTCAAAA
3

147
5
CCCGGTACA
G
A
GCAGGATTACAACA
3

VT1
vt1
AF461172
5
GAAGAGTCCGTGGGATTACG
3

130
5
AGCGATGCAGCTATTAATAA
3

VT2
vt2
AY143337
5
ACCGTTTTTCAGATTTT
G
A

CACATA
3
298
5
TACACAGGAGCAGTTTCAGACAGT
3
eae
eaeA
AE005595
5
CACACGAATAAACTGACTAAAATG
3
376
5
AAAAACGCTGACCCGCACCTAAAT
3
SHIG
ial
[11]
5
CTGGTAGGTATGGTGAGG
3
320
5
CCAGGCCAACAATTATTTCC
3
bfpA
bfpA
U27184
5

TTCTTGGTGCTTGCGTGTCTTTT
3
367
5
TTTTGTTTGTTGTATCTTTGTAA
3
EA
pCVD
X81423
5
CTGGCGAAAGACTGTATCAT
3
630
5
CAATGTATAGAAATCCGCTGTT
3
- Đệm, nớc khử ion
- PCR master mix (Epicentre-Đức) trong đó có dung dịch đệm, dNTPs, MgCl
2
,
Taq polymerase (Invitrogen-Mỹ).
- Thạch Agarose dùng trong điện di gel của hãng BBL
- Ethidium bromide dùng để nhuộm gel.
- TAE (Tris Acetate EDTA).
- PBS (Phosphate Buffer Saline).
2.2.2.2. Dụng cụ và máy móc
- Máy điều nhiệt tự động GenAmp PCR System 9700 AB (Applied Biosystem,
Mỹ).
- Máy ly tâm lạnh (Beckman, Mỹ)
- Bộ điện di ngang Horizonđ58 (Gibco-BRL, Mỹ).

- Máy soi và chụp gel Geldoc (BioRad, Mỹ).

13
2.3. Phơng pháp nghiên cứu
Phơng pháp thực nghiệm trong phòng thí nghiệm

2.3.1. Kiểm tra chủng
* Kiểm tra bằng phơng pháp định danh kinh điển
- Kiểm tra độ thuần của các chủng E. coli bằng cách cấy trên môi trờng
SMAC. Độ thuần của chủng đợc đánh giá bằng hình thái khuẩn lạc, hình thể
và tính chất bắt màu của vi khuẩn trên tiêu bản nhuộm Gram [4].
* Kiểm tra các chủng E. coli bằng phản ứng PCR đơn mồi
- Tiến hành tách chiết ADN từ vi khuẩn qua cấy phân (Theo quy trình của Viện
Karolinska- Thụy Điển) [23].
+ Dùng que cấy lấy vi khuẩn từ đĩa môi trờng SMAC cho vào 500 l nớc
cất khuấy đều bằng máy Vortex để tạo thành huyền dịch vi khuẩn có độ đục
Macfarland 4 (tơng đơng với nồng độ 10
9
vi khuẩn/ml).
+ Đun sôi cách thủy trong 20 phút để giải phóng ADN.
+ Ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 10 phút.
+ Chuyển phần nớc nổi (chứa ADN khuôn mẫu) sang ống Eppendorf mới.
+ ADN khuôn mẫu này đợc bảo quản trong tủ -20
0
C nếu không tiến hành
phản ứng ngay.
- Kiểm tra các chủng E. coli bằng phản ứng PCR đơn mồi
+ Các thành phần tham gia phản ứng PCR đơn mồi gồm (theo qui trình
khuyến cáo của Epicentre, Canada.
Nớc đã khử ion 6,5 l

PCR master mix 12,5 l
Primer forward (2,5 mM) 1,5 l
Primer reverse (2,5 mM) 1,5 l
ADN khuôn mẫu 3,0 l
Tổng cộng 25,0 l
+ Cho các mẫu vào máy PCR với chu kỳ nhiệt nh sau:
. 01 chu kỳ 96
0
C/4 phút
. 30 chu kỳ: 94
0
C/30 giây, 50
0
C/30 giây, 72
0
C/30 giây
. 01 chu kỳ: 72
0
C/7phút
. Giữ ở 4
0
C.

14
+ Điện di các sản phẩm sau khi chạy PCR trên gel agarose 1,2% với dung
dịch đệm là TAE [12].
Các mẫu thực nghiệm đợc điện di song song cùng với chứng âm và dơng.
Luôn có thang ADN chuẩn để đối chiếu kết quả khi đọc.
+ Nhuộm ADN và đọc kết quả
. Bản gel sau khi điện di đợc ngâm trong dung dịch Ethidium Bromide

1% pha trong nớc cất (trong 10 phút), sau đó vớt bản gel ra ngâm vào nớc cất
10 phút để khử ethidium bromide bám không đặc hiệu vào thạch. Sau khi
nhuộm, các vạch ADN trên bản gel sẽ phát sáng dới ánh đèn cực tím.
. Đọc kết quả bằng máy GelDoc (BioRad) với phần mềm chuyên dụng.
2.3.2. Chuẩn bị mẫu phân
- Sử dụng 10 bệnh phẩm phân bình thờng (5 mẫu từ trẻ em và 5 mẫu từ ngời
lớn), trộn đều. Lấy 1 ăng bệnh phẩm đầy cấy lên trên môi trờng SMAC, để
37
0
C, 16-18 giờ.
- Sau khi có các khuẩn lạc mọc, lấy que cấy chạm vào tất cả các khuẩn lạc trên
đĩa cấy, hòa vào 500 l nớc cất. Đun sôi cách thuỷ 100
0
C trong 20 phút để giải
phóng ADN.
- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, loại bỏ cặn. Nớc nổi chứa ADN dùng
làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR.
- Tiến hành kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho từng DEC (Phần 2.3.1)
- Chọn 10 mẫu phân có kết quả âm tính sau 3 lần chạy PCR liên tiếp. Đây là 10
mẫu phân đợc coi là không có E. coli gây tiêu chảy.
- Trộn đều các mẫu phân này, chia nhỏ thành các phần 200mg. Bảo quản trong
tủ 20
0
C.
- Sử dụng các mẫu phân này trong quá trình:
+ Phát triển và hoàn thiện qui trình tách chiết ADN của E. coli trực tiếp từ phân.
+ Tối u hoá hệ thống PCR đa mồi.





15
2.3.3. Phát triển qui trình tách chiết ADN của DEC trực tiếp từ phân
2.3.3.1. Phát triển qui trình
- Đầu tiên, qui trình đợc thực hiện với chủng chuẩn EAEC, do đây là loại
E. coli gây tiêu chảy gặp với tỷ lệ cao nhất trong số 5 loại E. coli gây tiêu chảy
có thể gặp trong bệnh phẩm.
Dựa vào một số nghiên cứu trớc đây [23, 26, 44] chúng tôi dự kiến qui trình
nh sau:
- Ly tâm với tốc độ thấp để loại bỏ các chất có kích thớc lớn trong phân.
- Ly tâm với tốc độ cao hơn để lấy vi khuẩn và loại bỏ các chất hoà tan trong
phân.
- Đun huyền dịch vi khuẩn để giải phóng ADN.
- Ly tâm lấy nớc nổi chứa ADN làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR.
Các bớc thực hiện của qui trình:

+ Bớc 1: 200 mg phân đợc hoà vào huyền dịch vi khuẩn có độ đục
Macfarland bằng 4 (tơng đơng với nồng độ 10
9
vi khuẩn/ml).
+ Bớc 2: Ly tâm huyền dịch phân ở bớc 1 với tốc độ 1000 vòng/phút trong 5
phút. Lấy nớc nổi.
+ Bớc 3: Nớc nổi từ bớc 2 đợc tiếp tục ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút
trong 10 phút. Lấy nớc nổi.
+ Bớc 4: Nớc nổi từ bớc 3 tiếp tục đợc ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút
trong 10 phút. Lấy cặn.
+ Bớc 5: Hoà cặn sau khi thu đợc vào 300 l nớc cất, trộn đều, đun cách
thuỷ 100
0
C trong 20 phút.

Làm lạnh ngay sau khi đun bằng cách cho Eppendorf vào khay đá vụn.
Ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 15 phút.
Nớc nổi chứa ADN, dùng làm ADN khuôn mẫu cho phản ứng PCR.
2.3.3.2. Hoàn thiện qui trình
- Lặp lại các bớc 2, 3, 4 của qui trình trên từ 1 đến 4 lần.

16
- Tất cả các ADN sau tách chiết trong quá trình hoàn thiện, đều đợc chạy phản
ứng PCR đơn mồi xác định EAEC theo hớng dẫn của bộ sinh phẩm Epicentre,
Canada (Phần 2.3.1).
2.3.4. Đánh giá hiệu quả tách chiết ADN trực tiếp từ phân
2.3.4.1. Đánh giá kết quả PCR
Hiệu quả tách chiết ADN đợc đánh giá dựa vào độ dày của băng ADN trên kết
quả điện di sản phẩm PCR. Để thuận tiện cho việc đánh giá, chúng tôi đa ra
quy ớc đánh giá kết quả nh sau:

Tính chất băng ADN trên thạch điện di
Đánh giá kết quả
Không có băng ADN
(-)
Băng ADN mờ hoặc chấm hạt thành hàng
(+)
Băng ADN nhỏ hoặc vừa, nhìn rõ
(++)
Băng ADN lớn, đậm nhìn rất rõ
(+++)

2.3.4.2. Định lợng ADN của vi khuẩn tách đợc từ mẫu phân
Sử dụng quang phổ kế (Spectrophotometer-Beckman). Phơng pháp này dựa
vào sự hấp thu ánh sáng tử ngoại ở bớc sóng 260 và 280 nm của các bazơ nitơ.

Nồng độ ADN trong mẫu đợc tính theo công thức:
C= A
260
x 50 (
g/ml)

Trong đó: C: nồng độ ADN cần xác định.
A
260
: giá trị mật độ quang ở bớc sóng 260nm.
50: hệ số đo OD của ADN sợi đôi.
Độ sạch của ADN đợc đánh giá thông qua tỷ số OD
260
/OD
280
.
ADN đợc coi là sạch nếu tỷ số này nằm trong khoảng 1,8 - 2,0 [34].
+ Đánh giá dựa vào một số tiêu chuẩn sau:
1. Phản ứng PCR cho kết quả tốt nhất (+++).
2. Nồng độ ADN cao hơn 100 g/ml.
Theo một số tác giả [12, 25, 41] lợng ADN khuôn mẫu dùng cho một
phản ứng PCR khoảng 100-500 ng đối với đoạn ADN mẫu từ nhiễm sắc thể.
Trong nghiên cứu này, một số đoạn gen cần phát hiện của DEC nằm cả ở

17
plasmid và nhiễm sắc thể. Chúng tôi lấy giá trị trung bình khoảng 300 ng. Theo
qui trình của Epicentre (lợng ADN khuôn mẫu là 3l/phản ứng), thì nồng độ
ADN khuôn mẫu cần tối thiểu là 100 ng/l tơng đơng với 100 g/ml.
3. Độ tinh sạch của ADN đạt từ 1,8-2,0.
Qui trình sau khi đã hoàn thiện sẽ đợc dùng để

:
- Đánh giá mức độ lặp lại
- áp dụng qui trình đã tối u với các loại DEC khác
Qui trình PCR

+ Phản ứng PCR đa mồi
(Theo qui trình của Nguyễn Vũ Trung và cộng sự [5])
- Các thành phần tham gia phản ứng PCR đa mồi gồm (theo Epicentre, Canada):
+ Nớc đã khử ion
1,5 l
+ PCR master mix
12,5 l
+ 8 cặp Primer (2,5 mM mỗi cặp)
8 l
+ ADN khuôn mẫu 3,0 l 3 l
Tổng cộng
25,0 l

- Cho các mẫu vào máy PCR với chu kỳ nhiệt nh sau:
+ 01 chu kỳ 96
0
C/4 phút
+ 30 chu kỳ: 94
0
C/30 giây, 50
0
C/30 giây, 72
0
C/30 giây.
+ 01 chu kỳ: 72

0
C/7 phút
+ Giữ ở 4
0
C.
+ Thực hiện phản ứng PCR đa mồi với nồng độ DNA khuôn mẫu thay đổi
Trong nghiên cứu của mình, Nguyễn Vũ Trung và cộng sự đã tối u hoá
hệ thống PCR đa mồi xác định E. coli gây tiêu chảy, sử dụng ADN tách từ
khuẩn lạc [30]. Điểm khác nhau cơ bản giữa qui trình xác định DEC trong
nghiên cứu của chúng tôi so với nghiên cứu của Nguyễn Vũ Trung, là ADN
đợc sử dụng cho phản ứng PCR. Nghiên cứu của chúng tôi sử dụng ADN tách
chiết trực tiếp từ phân.

18
Nồng độ và độ tinh sạch của ADN phụ thuộc vào phơng pháp tách chiết.
Chính vì vậy trong nghiên cứu này, tối u hoá hệ thống PCR đa mồi thực chất là
tối u hoá nồng độ ADN sử dụng cho phản ứng PCR.
Để tối u hoá nồng độ ADN sử dụng cho phản ứng PCR chúng tôi tiến hành
nh sau:
- Pha lần lợt các chủng chuẩn E. coli gây tiêu chảy EAEC, EHEC, HIEC,
EPEC, và ETEC vào 1 ml nớc cất để có độ đục Macfarland 4 (tơng đơng với
10
9
vi khuẩn/ml).
- Trộn 1 ml từng huyền dịch trên với 200 mg phân đã đợc xác định không có
E. coli gây tiêu chảy
- Tách chiết ADN theo qui trình đã hoàn thiện (Phần 2.3.3.2).
- Mỗi thử nghiệm cho một chủng đợc lặp lại 10 lần.
- Dung dịch ADN tách chiết từ các chủng DEC, đợc định lợng bằng quang phổ
kế. Tính nồng độ ADN trung bình ban đầu sau khi tách chiết.

- Phản ứng PCR đa mồi xác định E. coli gây tiêu chảy trong điều kiện thay đổi
nồng độ ADN khuôn cho một phản ứng, đợc tiến hành với:
Nồng độ ban đầu; 0,5 g; 100 ng; 10 ng; 1 ng; 100 pg; 10 pg; 1 pg để tìm ra
lợng ADN khuôn tối u cho mỗi cặp mồi sủ dụng.
- Các thành phần tham gia phản ứng đều giống nhau.
- Luôn có chứng âm và Dơng đi kèm khi làm phản ứng để kiểm tra kết quả.
+ Xác định độ lặp lại của PCR
- Độ lặp lại đợc tính bằng số phản ứng PCR cho kết quả giống nhau trên tổng
số lần lặp lại.
2.4. Phân tích số liệu
Các số liệu đợc quản lý và phân tích bằng chơng trình SPSS 12.0
2.5. Thời gian nghiên cứu:
Từ tháng 8 năm 2007 đến tháng 12 năm 2008.
2.6. Địa điểm nghiên cứu
- Bộ môn Vi sinh- Trờng Đại học Y Hà Nội.
- Khoa Xét nghiệm Viện Các bệnh Truyền nhiễm và Nhiệt đới Quốc gia.

19
CHƯƠNG III
kết quả nghiên cứu

3.1. Kết quả kiểm tra các chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu
Các chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu đợc kiểm tra bằng:
Nuôi cấy- phân lập và PCR.
Bảng 3.1. kết quả kiểm tra các chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu
bằng phơng pháp định danh kinh điển
STT Chủng vi khuẩn Kết quả kiểm tra
1 ETEC ATCC 35401
E
. coli

2 EHEC ATCC 43890
E. coli
3 EHEC ATCC 43889
E. coli
4 EPEC ATCC 43887
E
. coli
5 EIEC ATCC 43893
E. coli
6 EAEC 97R
E. coli
7
E. coli ATCC 11775 E. coli
Nhận xét Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy:
7 chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu đã đợc kiểm tra và đúng với tên
trong lý lịch chủng của Đề án Lu giữ Nguồn gen Vi sinh Y học.
Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra các chủng E. coli gây tiêu chảy bằng kỹ thuật
PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho từng chủng

STT
E
. coli
gây tiêu chảy
Tên chủng
kiểm tra
Cặp mồi sử dụng Kết quả
kiểm tra
Primer
Gen
đích

Sản phẩm
(bp)

1 ETEC ATCC 35401
LT
eltB
322
+
ST
estA
147
2 EHEC ATCC 43890
VT1
vt1
130
+
eae
eaeA
376

ATCC 43889
VT2
vt2
298
eae
eaeA
376

3 EPEC ATCC 43887
eae

eaeA
376

+
bfpA
bfpA
367
4 EIEC ATCC 43893
SHIG
ial
320
+
5 EAEC 97R
EA
pCVD
630
+
6
E. coli
ATCC 11775
Với từn
g
cặ
p
mồi trên
-


20
Nhận xét

Kết quả ở Bảng 3.2 cho thấy:
Các chủng E. coli gây tiêu chảy (DEC) có phản ứng PCR với các cặp mồi đặc
hiệu, riêng rẽ cho từng chủng cho kết quả dơng tính. Chủng E. coli ATCC
11775 không gây tiêu chảy cho kết quả âm tính.

1 2 3 4 5 6 7 8

1: Ladder 100b
p
2: EAEC 630b
p
3: EIEC 320b
p
4: ETEC
147bp 322bp
5: EHEC 43889
298bp và 376bp
6: EHEC43890
130bp và 376bp

7: EPEC 376b
p
367bp
8:
E
. coli
ATCC11775
Hình 1. Kết quả PCR từng chủng DEC với các cặp mồi đặc hiệu
3.2. Kết quả chuẩn bị mẫu phân
Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra các mẫu phân bằng kỹ thuật PCR

STT Mẫu phân Kết quả PCR với 8 cặp mồi đặc hiệu cho DEC
1 1 Âm tính
2 2 Âm tính
3 3 Âm tính
4 4
Â
m tính
5 5 Âm tính
6 6 Âm tính
7 7 Âm tính
8 8
Â
m tính
9 9 Âm tính
10 10 Âm tính
Nhận xét Kết quả ở Bảng 3.3 cho thấy, PCR kiểm tra 10 mẫu phân cho kết quả
âm tính, các mẫu phân này không có DEC.
3.3. Kết quả phát triển và hoàn thiện qui trình tách chiết ADN của DEC
trực tiếp từ phân
3.3.1. Tối u lợng nớc cất để hoà tan 200 mg phân
- 200 mg mẫu phân đã chuẩn bị cho vào các tube nhựa chứa 1, 2, 3, 4 và 5 ml
nớc cất. Lắc trên máy lắc đến khi phân đợc hoà tan thành một huyền dịch.

21
- Lặp lại thử nghiệm 10 lần. Kết quả thử nghiệm nh sau:
Bảng 3.4. Kết quả tối u hoá lợng nớc cất để hoà tan 200 mg phân
Lần
thử nghiệm
Lợng nớc cất hoà tan 200 mg phân và kết quả hoà tan phân
1ml 2ml 3ml 4ml 5ml

1


Không
hoà tan hết
phân



Không
hoà tan hết
phân



Hoà tan
hết
phân




Hoà tan
hết
phân



Hoà tan
hết

phân

2
3
4
5
6
7
8
9
10
Nhận xét Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy:
Lợng nớc cất tối thiểu phải là 3ml mới đủ để hoà tan hết 200 mg phân.
3.3.2. Phát triển qui trình
- Sử dụng chủng EAEC 97R, cấy trên môi trờng SMAC, lấy khuẩn lạc hoà với
nớc cất tạo huyền dịch vi khuẩn có độ đục Macfarland bằng 4 (nồng độ vi
khuẩn tơng đơng với 10
9
vi khuẩn /ml) để bắt đầu thực hiện qui trình ly tâm.
- Theo thiết kế ban đầu: Nh mô tả trong phần 2.3.3.1
Bảng 3.5. Kết quả PCR dùng ADN tách chiết theo thiết kế ban đầu
(sử dụng cặp mồi EA)
1000 v/p
trong 10 phút
3000 v/p
trong 10 phút
12000 v/p
trong 10 phút
Kết quả
PCR đơn mồi



1 lần
1 lần

1 lần
+
y
ếu
2 lần
-
3 lần
-
4 lần
-
5 lần
-


2 lần
1 lần

1 lần
+
y
ếu
2 lần
-
3 lần
-

4 lần
-
5 lần
-


3 lần
1 lần

1 lần
-
2 lần
-
3 lần
-
4 lần
-
5 lần
-
1 lần
-

22

4 lần
2 lần
1 lần
-
3 lần
-

4 lần
-
5 lần
-


5 lần
1 lần

1 lần
-
2 lần
-
3 lần
-
4 lần
-
5 lần
-
Nhận xét Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy:
- Với qui trình thiết kế ban đầu, phần lớn kết quả PCR qua các lần thử
nghiệm đều âm tính.
- Khi thực hiện ly tâm 1000 vòng/phút trong 10 phút từ 1 -2 lần, tiếp theo
là 3000 vòng/phút từ 1 - 5 lần, và 1 lần ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút,
kết quả PCR dơng tính yếu.
Sau khi thử nghiệm nhiều lần bằng cách thay đổi tốc độ, thời gian và số
lần ly tâm. Dựa vào kết quả PCR, chúng tôi đã thay đổi qui trình tách chiết
ADN của EAEC trực tiếp từ phân nh sau:
- Bớc 1: 200 mg phân đợc hoà với 1ml huyền dịch vi khuẩn có độ đục
Macfarland 4 (tơng đơng với 10

9
vi khuẩn /ml), và 2ml nớc cất, trộn đều
trên máy lắc.
- Bớc 2: Ly tâm huyền dịch phân ở bớc 1 với tốc độ 1000 vòng/phút trong 10
phút cho lắng các thành phần có kích thớc lớn. Lấy nớc nổi.
- Bớc 3: Nớc nổi từ bớc 2 đợc ly tâm tiếp với tốc độ 2000 vòng/phút trong
10 phút để lắng các thành phần có kích cỡ trung bình. Lấy nớc nổi.
- Bớc 4: Nớc nổi từ bớc 3 đợc ly tâm tiếp với tốc độ 4000 vòng/phút trong
10 phút để lắng vi khuẩn. Loại bỏ nớc nổi và lấy cặn.
- Bớc 5: Cho thêm vào cặn 500 l nớc cất, lắc đều trên máy lắc. Ly tâm với
tốc độ 4000 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ nớc nổi
- Bớc 6: Cho 300 l nớc cất vào cặn thu đợc ở bớc 5. Đun sôi cách thuỷ
100
0
C trong 20 phút.
- Bớc 7: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 20 phút, loại bỏ cặn.
Nớc nổi chứa ADN dùng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR.

23
3.3.3. Hoàn thiện qui trình
Để hoàn thiện qui trình ly tâm và tách chiết ADN trực tiếp từ phân của
EAEC, chúng tôi tiến hành lặp lại 1 4 lần các bớc 2, 3, 5 của qui trình trên.
Cụ thể là 84 lần tách chiết ADN trực tiếp từ phân theo sơ đồ 1, gồm:
- 1 đến 4 lần ly tâm với tốc độ 1000 vòng trong 10 phút.
- 1 đến 4 lần ly tâm với tốc độ 2000 vòng trong 10 phút.
- 1 đến 4 lần ly tâm với tốc độ 4000 vòng trong 10 phút.
Sau đó lặp lại thử nghiệm 3 lần để lấy kết quả trung bình.
Mục đích là lựa chọn qui trình hoàn thiện đạt các tiêu chuẩn sau: phản
ứng PCR cho kết quả tốt nhất (+++); nồng độ ADN cao hơn 100 g/ml, độ tinh
sạch của ADN đạt từ 1,8-2,0 và tốn ít thời gian nhất.


24

S¬ ®å 1: Hoµn thiÖn qui tr×nh ly t©m vµ t¸ch chiÕt ADN
trùc tiÕp tõ ph©n
Ph©n
1 lÇn 1000rpm
2 lÇn 1000r
p
m
3 lÇn 1000rpm
4 lÇn 1000rpm
1lÇn 2000rpm
2 lÇn 2000rpm
lÇ
3 lÇn 2000rpm 4 lÇn 2000rpm
1 lÇn 2000rpm 2 lÇn 2000rpm 3 lÇn 2000rpm 4 lÇn 2000rpm
1 lÇn 2000rpm 2 lÇn 2000rpm 3 lÇn 2000rpm 4 lÇn 2000rpm
1 lÇn 2000rpm 2 lÇn 2000rpm 3 lÇn 2000rpm 4 lÇn 2000rpm
1 lÇn 4000rpm
2 lÇn 4000rpm
Ç
3 lÇn 4000rpm
Ç
4 lÇn 4000rpm
Ç
1 lÇn 4000rpm
2 lÇn 4000rpm
3 lÇn 4000rpm
4 lÇn 4000rpm

1 lÇn 4000rpm
2 lÇn 4000rpm
3 lÇn 4000rpm
4 lÇn 4000rpm
1 lÇn 4000rpm
2 lÇn 4000rpm
3 lÇn 4000rpm
4 lÇn 4000rpm
1 lÇn 4000rpm
2 lÇn 4000rpm
3 lÇn 4000rpm
4 lÇn 4000rpm
1 lÇn 4000rpm
2 lÇn 4000rpm
3 lÇn 4000rpm
4 lÇn 4000rpm
1 lÇn 4000rpm
2 lÇn 4000rpm
3 lÇn 4000rpm
4 lÇn 4000rpm
1 lÇn 4000rpm
2 lÇn 4000rpm
3 lÇn 4000rpm
4 lÇn 4000rpm
1 lÇn 4000rpm
2 lÇn 4000rpm
3 lÇn 4000rpm
4 lÇn 4000rpm
1 lÇn 4000rpm
2 lÇn 4000rpm

3 lÇn 4000rpm
4 lÇn 4000rpm
1 lÇn 4000rpm
2 lÇn 4000rpm
3 lÇn 4000rpm
4 lÇn 4000rpm
1 lÇn 4000rpm
2 lÇn 4000rpm
3 lÇn 4000rpm
4 lÇn 4000rpm
1 lÇn 4000rpm
2 lÇn 4000rpm
3 lÇn 4000rpm
4 lÇn 4000rpm
1 lÇn 4000rpm
2 lÇn 4000rpm
3 lÇn 4000rpm
4 lÇn 4000rpm
1 lÇn 4000rpm
2 lÇn 4000rpm
3 lÇn 4000rpm
4 lÇn 4000rpm
1 lÇn 4000rpm
2 lÇn 4000rpm
3 lÇn 4000rpm
4 lÇn 4000rpm