Phương pháp phổ khối lượng potx
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (183.19 KB, 6 trang )
Phương pháp phổ khối lượng
Mô hình cơ bản của một khối phổ kế.
Phương pháp phổ khối là một kĩ thuật dùng để đo
đạc tỉ lệ khối lượng-trên-điện tích của ion; dùng thiết
bị chuyên dụng là khối phổ kế. Kĩ thuật này có nhiều
ứng dụng, bao gồm:
Xác định các hợp chất chưa biết bằng cách dựa
vào khối lượng của phân tử hợp chất hay từng
phần tách riêng của nó
Xác định kết cấu chất đồng vị của các thành
phần trong hợp chất
Xác định cấu trúc của một hợp chất bằng cách
quan sát từng phần tách riêng của nó
Định lượng lượng hợp chất trong một mẫu dùng
các phương pháp khác (phương pháp phổ khối
vốn không phải là định lượng)
Nghiên cứu cơ sở của hóa học ion thể khí (ngành
hóa học về ion và chất trung tính trong chân
không)
Xác định các thuộc tính vật lí, hóa học hay ngay
cả sinh học của hợp chất với nhiều hướng tiếp
cận khác nhau.
Một khối phổ kế là một thiết bị dùng cho phương
pháp phổ khối, cho ra phổ khối lượng của một mẫu
để tìm ra thành phần của nó. Có thể ion hóa mẫu và
tách các ion của nó với các khối lượng khác nhau và
lưu lại thông tin dựa vào việc đo đạc cường độ dòng
ion. Một khối phổ kế thông thường gồm 3 phần: phần
nguồn ion, phần phân tích khối lượng, và phần đo
đạc.
Ví dụ về cách hoạt động
Các hóa chất khác nhau thì có khối lượng phân tử
khác nhau. Dựa vào đó, khối phổ kế sẽ xác định chất
hóa học nào có nằm trong mẫu. Ví dụ, muối NaCl
hấp thụ năng lượng (năng lượng hấp thụ tùy theo
nguồn ion, ví dụ MALDI năng lượng là tia laser) tách
ra thành các phân tử tích điện, gọi là ion), trong giai
đoạn đầu của phương pháp phổ khối. Các ion Na
+
, Cl
-
có trọng lượng nguyên tử khác biệt. Do chúng tích
điện, nghĩa là đường đi của chúng có thể được điều
khiển bằng điện trường hoặc từ trường. Các ion được
đưa vào buồng gia tốc và đi qua một khe vào miếng
kim loại. Một từ trường được đưa vào buồng đó. Từ
trường sẽ tác động vào mỗi ion với cùng một lực và
làm trệch hướng chúng về phía đầu đo. Ion nhẹ hơn
sẽ bị lệnh nhiều hơn ion nặng vì theo định luật
chuyển động của Newton gia tốc tỉ lệ nghịch với khối
lượng của phân tử. Đầu đo sẽ xác định xem ion bị
lệnh bao nhiêu, và từ giá trị đo này, tỉ lệ khối lượng-
trên-điện tích của ion có thể được tính toán. Từ đó,
có thể xác đinh được thành phần hóa học của một
mẫu gốc. Trên thực tế thì hai ion Na
+
và Cl
-
sẽ không
được đo trong cùng một lần, vì các máy đo chỉ có thể
nhận ra ion điện tích dương hoặc điện tích âm nên
nếu máy khối phổ kế được điều chỉnh để đo các ion
điện tích dương thì chỉ có ion Na
+
là được nhận ra bởi
máy. .Một trong những tính năng lớn của khối phổ
lượng là có thể tìm thấy cấu tạo không gian của phân
tử ví dụ phân tử C
7
H
14
O
2
có thể là acid hoặc ester
Và khả năng phát hiện ra hợp chất với độ nhậy cực
cao từ 10
-6
dến 10
-12
gram. Dưới đây là một khối phổ
(electrospray)của phân tử Kaempferol-rhamnose-
rhamnose-glucose(m/z 741) trong loại cỏ thaliana,
phân tích với 5.10
-6
L (nếu dùng máy MALDI thì chỉ
cần 0,5.10
-6
L).
Ứng dụng sinh học
Khối phổ của protein
Protein và các phân mảnh peptit
Protein mà các nhà nghiên cứu sinh học quan tâm
thường là sự kết hợp phức tạp của nhiều protein và
phân tử khác nhau, cùng tồn tại trong một môi trường
sinh học. Điều này đặt ra hai vấn đề chính. Thứ nhất,
hai kĩ thuật ion hóa dùng cho các phân tử lớn chỉ làm
việc tốt khi mà hỗn hợp từ các thành phần có cấu tạo
gần giống, trong khi trong các mẫu sinh học, các
protein khác nhau thường là có lượng khác biệt nhau
lớn. Nếu hỗn hợp được ion hóa dùng phương pháp
phun ion hay MALDI, thì những protein dạng mà dư
thừa nhiều có xu hướng giảm tín hiệu so với những
cái ít dư thừa hơn. Vấn đề thứ hai, quang phổ khối từ
hỗn hợp phức tạp là rất khó để nghiên cứu do có quá
nhiều thành phần phức hợp. Đó là vì với tác động của
enzym, một protein tạo ra hàng loạt sản phẩm peptit.
Để giải quyết vấn đề này, hai phương pháp được sử
dụng rộng rãi để phân mảnh protein, hay các sản
phẩm peptit từ sự tác động của enzym. Phương pháp
đầu tiên sẽ phân mảnh toàn bộ protein và được gọi là
điện chuyển gel hai chiều (2-DE: two-dimensional
gel electrophoresis). Phương pháp thứ hai, ghi sắc
lỏng hiệu suất cao (HPLC) được dùng với các phân
mảnh peptit sau khi protein phân tách bởi tác động
của enzym. Trong một số tình huống, có thể cần phải
kết hợp cả hai phương pháp.
Các vết gel được xác định trên 2D Gel thường là
thuộc về một protein. Nếu cần biết định danh của
protein đó, thì có thể xem xét vết gel đó. Khối peptit
kết quả từ tác động của enzym lên protein có thể
được xác định bằng khối phổ dùng lấy dấu khối
peptit. Nếu thông tin này không cho phép xác định
danh tính của protein một cách chính xác, các peptit
của nó có thể xem là thuộc về đo phổ khối tandem.
Việc xác định đặc tính của hỗn hợp protein dùng
HPLC/MS còn được gọi là shotgun proteomics và
mudpit. Một hỗn hợp là kết quả của sự tác động của
enzym lên hỗn hợp protein sẽ được phân mảnh theo
một hay hai bước bằng ghi sắc lỏng. Chất tách rửa từ
giai đoạn ghi sắc có thể hoặc là trực tiếp đưa vào máy
đo phổ khối thông qua ion hóa phun điện tử (ESI),
hay tách ra thành một loạt các vết nhỏ để sử dụng sau
này trong phân tích khối bằng MALDI.
Xác định Protein
Có 2 cách chính trong khối phổ để xác định protein.
Lấy dấu khối peptit (PMF) dùng khối của các
peptit đã phân giải làm đầu vào để tìm kiếm
trong CSDL của các khối đã biết trước từ danh
sách các protein đã biết. Nếu một chuỗi protein
trong danh sách tham khảo trùng khớp với giá trị
thử nghiệm thì có lí do để tin rằng protein đó có
tồn tại trong mẫu gốc.
Tandem MS đang trở thành một phương pháp thử
nghiệm phổ biến để xác định protein. Phân ly do
va chạm (CID) được dùng trong các ứng dụng
chính để khởi tạo một tập các phân mảnh từ một
ion peptit cụ thể. Quá trình phân tách chủ yếu
dựa vào các chế phẩm phân tách để bẻ gãy liên
kết peptit. Vì sự đơn giản của việc phân tách này,
nó có thể dùng khối của các phân mảnh quan sát
được để so trùng CSDL của các khối đã biết với
một hay nhiều chuỗi peptit.
