Tiểu luận
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
TRONG CHỌN TẠO GIỐNG CÂY TRỒNG

Đề tài:
Detection of RAPD Polymorphisms in Gladiolus Cultivars
With Differing Sensitivities to Fusarium oxysporum f. sp.
Gladioli

Đa hình RAPD ở các giống Hoa Layơn cảm ứng khác nhau
với Fusarium oxysporum f. sp. Gladioli
bai bao fusarium.pdf
Sinh viên: Nông thị Quỳnh Anh
Lớp: CNSH K52

Mục lục
References
Results and Discussion
Materials and Methods
Introduction
Abstract

Abstract
•
Fusarium oxysporum Schlecht.Cha. F.
sp. gladioli (FOG)
là tác nhân gây bệnh cây layơn
quan trọng nhất.
•

Một trong những phương pháp
thân thiện môi trường nhất để
kiểm soát lây lan của nó là sử
dụng giống cây trồng nhạy cảm
ít nhất với tác nhân gây bệnh.

•
Tại vị trí mô nằm ở gốc thân trong nhiều
giống kháng đã sinh ra các lớp suberin ức
chế sự tăng trưởng sợi nấm.
•
Sử dụng chỉ thị phân tử RAPD phân tích bộ
gen từ 9 cây layơn lựa chọn là kháng và
nhạy cảm với FOG, tiến hành xác minh mức
độ đa hình DNA.
•
Nucleic acid tổng số khai thác được thực
hiện với phương pháp sử dụng DNA chiết
tách từ mô cây theo phương pháp
chloroform-phenol ở 3 giai đoạn sinh
trưởng.
•
thực hiện thí nghiệm bằng cách sử dụng 14
mồi với Taq polymerase và nồng độ mồi
khác nhau.

•
5 trong những đoạn mồi được thử
nghiệm không cho đa hình, 5 mồi
cho đa hình. Thông qua đó xac định

đươc một hoăc nhiều tính kháng.
Các test cho kết quả lặp lai ở cả 3
giai đoan sinh trưởng.
•
Nhân dòng các đoạn DNA đa hình
quan tâm sẽ cho thấy sự hiện diện
khác nhau của các gen đặc trưng
liên quan đến tính kháng FOG ở cây
lay ơn.
Introduction

Introduction
•
Cây lay ơn là một hoa kinh tế quan trọng,
canh tác trên toàn thế giới như là một cây
trồng trong vườn hoặc cho sản xuất hoa
cắt. Các loại nấm soilborne, Fusarium
oxysporum Schlecht: Fr F. sp. gladioli
(Massey) Snyd. Và Hans. (FOG) (Massey,
1926;. Nelson và cộng sự, 1981), gây
vàng và thối thân và củ, là chính. Nó làm
giảm chất lượng cành và hoa thương
phẩm. Nấm này được tìm thấy trên toàn
thế giới và được lan truyền qua vật liệu
nhân giống, (et al Garcia-Jimenez, 1986.).

Introduction
•
Để kiểm soát và sự lây lan của
loại nấm này, các giống cây ít

nhạy cảm với tác nhân gây bệnh,
và các hóa chất được đưa vào thí
nghiệm.
•
Điều quan trọng là tìm được
những giống cây phù hợp nhạy
cảm hay kháng để xác định sự
hiện diện của gen liên quan đến
sự biểu hiện tính kháng.

Introduction
•
Một loạt các xét nghiệm kháng FOG, chủ
yếu dựa vào xét nghiệm sinh học đã được
báo cáo bởi (Palmer và Pryor, 1958; Jones
và Jenkins, 1975; Dallavalle và Zechini
D'Aulerio năm 1994; Löffler và cộng sự,
1997; Straathof et al, 1998) Tuy nhiên, các
cơ chế kháng vẫn chưa được hiểu rõ
•
(Remotti và Loffler, 1996). đã quan sát cơ
chế xâm nhập của sợi nấm FOG vào cây và
mô chỉ qua các chu bì thân , chủ yếu là ở
gốc qua các đốt thân, và vết thương
(Dallavalle và Pisi, 1993).
•
Các mô của nhiều mẫu cây đem thí nghiệm
thể hiện kháng qua việc phản ứng với
suberization tế bào, tạo thành rào cản ngăn
chặn các tác nhân nấm.


Introduction
•
Dùng chỉ thị RAPD phân tích bộ
gen của 9 mẫu giống cây lay
ơn với mức độ kháng, mẫn
cảm khác nhau với FOG đã
được thực hiện để xác định khả
năng áp dụng phương pháp
sàng lọc ADN phân biệt mức
độ nhạy cảm và kháng ở cây
lay ơn.

Materials and Methods
•
Sử dụng mô cây lay ơn ở
đỉnh ngọn lấy mắt ngủ hay
chồi 3 khoảng cm, lá từ cây
cao 30 cm
•
Cây mẹ được trồng trong một
nhà kính chống côn trùng
trong đất tiệt trùng.

Materials and Methods
•
Tách chiết DNA
Acid nucleic tổng số được chiết xuất từ 1 g
mô tươi trong nitơ lỏng theo phương pháp
chloroform-phenol được mô tả bởi Prince et

al. (1993), ngâm trong 100 μLof1XTEbuffer
(10 mM Tris Cl [pH 8], 1 mM EDTA [pH 8]) và
pha loãng tới 20 ng / μL. Cuối cùng tập trung
trong nước deionized ( nước khử ion) vô
trùng.
1 μL DNA tổng số pha loãng này đã được
sử dụng trong các xét nghiệm khuyếch đại
mô tả dưới đây và được lưu trữ ở
1XTEbufferat-20 ° C.

Materials and Methods
•
Phân tích RAPD
•
RAPD được tạo ra bằng cách sử dụng
12 mồi khác nhau dài 10-Mers được
thiết kế từ operon của (Alameda, CA,
USA): AD14, AD18, AF07, AF13,
AG12, AL07, AL16, AM14, AM19, M18,
S05, và C08.
•
Ngoài ra, hai mồi dài 11-mer, AL16 +
và + AM14 cũng được sử dụng. Tất cả
các mồi ở nồng độ của 20 μM.

Materials and Methods
Bảng 1. RAPD hỗn hợp sử dụng.
Thành phần Mix A Mix B Mix C
Buffer (10X) (µL) 2.50 2.00 2.50
MgCl2 2mM(µL) 3.00 3.00 0.50

d-NTP 50 µM(µL) 0.50 0.50 2.00
Primer 0.2 nM (µL) 2.00 2.00 0.50
Taq 5U/µL(µL) 0.125 0.125 0.20

Materials and Methods
Thí nghiệm RAPD được lặp lại 2-4 lần của mỗi giống mẫu
trong 25 μL
Thử nghiệm riêng rẽ với 2 nồng độ dNTP và taq polymerase
(Bảng 1)
Bảng 1. RAPD hỗn hợp sử dụng.
Thành phần Mix A Mix B Mix C
Buffer (10X) (µL) 2.50 2.00 2.50
MgCl2 2mM(µL) 3.00 3.00 0.50
d-NTP 50 µM(µL) 0.50 0.50 2.00
Primer 0.2 nM (µL) 2.00 2.00 0.50
Taq 5U/µL(µL) 0.125 0.125 0.20

Materials and Methods
•
Một loạt các nhiệt độ gắn mồi (36-45 °C)
đã được thử nghiệm trước khi thiết lập các
điều kiện phản ứng tối ưu. Các điều kiện
tiêu chuẩn được sử dụng trong 45 chu kỳ
như sau:
•
94 ° C trong 1 phút,
•
38 ° C trong 1 phút,
•
72 ° C trong 2 phút,

•
biến tính ban đầu ở 94 ° C trong 2 phút,
và mở rộng ở 72 ° C trong 8 phút. Ống có
chứa các thành phần phản ứng ngoại trừ
DNA đối chứng âm.

Results and Discussion
•
Sau các thí nghiệm trên, các xét nghiệm
được thường xuyên thực hiện với tất cả
các mồi bằng cách sử dụng nồng độ các
thành phần khác nhau (Bảng 1C).
•
phân tích bằng điện di trong gel agarose
2% với 1 bộ đệm X TBE (0.09 M Tris-
borat, 0,002 M EDTA, 1 M EDTA [pH 8]),
•
Sau đó nhuộm gel với ethidium bromide
và chụp ảnh

Results and Discussion

•
Các thí nghiệm so sánh 2 Taq
polymerase (Bảng 1 A-B, Hình 1
a-b) cho thấy các băng DNA thu
được với những mảnh Stoffel
ngắn hơn (hình 1b, mồi AL16)
và nhiều hơn (hình 1b, mồi AL16
+) hơn so với thu được với cùng

một mồi và Polymed Taq (Hình
1a).
•
Đoạn Stoffel thường sản xuất
một lượng nhỏ đa hình đáng tin
cậy
•
Bởi vì điều này, chỉ sử dụng Taq
polymerase với mix A .Kết quả
thu được nhóm các vach băng
ko phân biệt rõ ràng (hình 2a)

Results and Discussion
•
Thí nghiệm được thực hiện
vớiMix C sản xuất các mẫu cũng
đã được xác định với đa hình
phân biệt rõ ràng (Hình 2b).
•
Sử dụng hỗn hợp C: 5 mồi (C08,
S05, AD18, AM19, AM14 +) không
có các cấu hình đa hình cho giống
mẫu và giai đoạn tăng trưởng khác
nhau.
•
Bốn mồi (AL7, AF07, M18, AF13)
sản xuất băng đa hình không
tương quan với mức độ nhạy cảm
FOG của mẫu thử nghiệm.


Results and Discussion
•
Năm mồi cho các cấu hình
tiêu biểu cho một hoặc
nhiều giống mẫu kháng.
Đặc biệt, các mồi AG12 đã
không tạo ra một đoạn 0,5-
kbp trong giống WP nhưng
đã tạo ra một dải chênh
lệch ở mức 2 kbp (hình 3).

Results and Discussion
•
Các đa hình hiển thị khác không liên quan
tới độ nhạy cảm của các giống thử
nghiệm. Primer AD14 (hình 4a)

Results and Discussion
•
Hình 1. hình ảnh rapd
với 3 mồi thử ngiệm dài
10-mers thử nghiệm
bằng cách sử dụng
Polymed Taqpolymerase
với mix A (a) và mix B ở
(b)
•
Một mẫu không có
(H2O),1 mẫu có (H2O)
đại diện đối chứng âm

•
1-kbp DNA ladder

Results and Discussion
Hình 2. Đa
hình cấu hình
thu được từ 6
giống cây lai ơn
sau khi khuếch
đại với mồi
AL16, AL16 +,
và AM14. (a) Sử
dụng mix B . (b)
Sử dụng mix C.

Results and Discussion

RAPD với mồi AD14(4a) , DNA của cvs WP và NL.
Kết quả cho thấy một nhóm 1.1 kb. Nhóm này cũng
thấy khi chạy rapd sử dụng DNA chiết tách từ 2 giai
đoạn sinh trưởng của cv WP. Trong khi giống NL
hiển diện nhóm 0.9kbp.
Sử dụng mồi AL16 (hình 4b), mẫu WP thiếu một
đoạn 0,7-kbp hiện diện trong tất cả các giai đoạn của
các mẫu khác. Băng 0.5-kbp chỉ xuất hiện trong tất
cả các giai đoạn của mẫu WP và trong thể không
hoạt động của mẫu NL.

Results and Discussion
•

Hình 3. Đa hình liên
quan đến tính kháng
FOG thu được từ 5 cvs
cây lai ơn sau khi
khuếch đại với mồi
AG12 trong mix C
(Bảng 1). Một mẫu
không (H2O) là đối
chứng âm.

Hình 4. hình ảnh RAPD
với 2 mồi AD14 ở (a) và
mồi AL16 ở (b) cho thấy
kết quả cơ bản giống hệt
nhau được thể hiện cho tất
cả ở cả 3 giai đoạn sinh
trưởng trong điều kiện C.
(bảng 1).
Đa hình liên quan đến
nhiều tính kháng của WP
và NL. Đối chúng âm là
H2O, và lader.
Results and Discussion